20/11/2017 1 Cromatografia Gasosa GC/MS Processos de Derivatização j. oliveira fernandes – FFUP/REQUIMTE Cromatografia Gasosa j. oliveira fernandes CROMATOGRAFIA Conjunto de técnicas afins de separação que consistem na separação dos componentes de uma mistura de substâncias por distribuição/repartição de cada composto entre duas fases: Fase estacionária Constituída por uma substância sólida ou líquida aderente a um meio de suporte sólido poroso, com grande superfície específica Fase móvel Constituída por um fluido (líquido ou gasoso), imiscível com a fase estacionária e que se move ao longo desta 2
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Cromatografia GasosaGC/MS
Processos de Derivatização
j. oliveira fernandes – FFUP/REQUIMTE
Cromatografia Gasosaj. oliveira fernandes
CROMATOGRAFIA
Conjunto de técnicas afins de separação que consistem na separação dos componentes de uma mistura de substâncias por
distribuição/repartição de cada composto entre duas fases:
Fase estacionária
Constituída por uma substância sólida ou líquida aderente a um meio
de suporte sólido poroso, com grande superfície específica
Fase móvel
Constituída por um fluido (líquido ou gasoso), imiscível com a fase
estacionária e que se move ao longo desta
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A separação das diversas substâncias tem como base um fenómeno
de migração diferencial, resultante da diferente afinidade de cada
composto para com as duas fases
Fase móvel
Fase estacionária
Soluto BSoluto A
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CROMATOGRAFIA - SEPARAÇÃO
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CROMATOGRAFIA - SEPARAÇÃO
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TIPOS DE CROMATOGRAFIA(de acordo com o mecanismo de separação)
Tipo de
cromatografia Fase móvel Fase estacionária Processo de distribuição
Adsorção
L
GS Adsorção
Partilha
L
GL Partilha
Troca iónica L S Reacção química reversível
Exclusão L S Crivagem molecular
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Tipo de cromatografia no qual a fase móvel é um gás, inerte ou não reactivo, e a
fase estacionária corresponde a uma camada microscópica de um líquido ou de
um polímero agarrado a um suporte sólido, no interior de um tubo de vidro ou
metálico, designado por coluna.
As substâncias atravessam a coluna no estado gasoso, sendo o papel do gás
que constitui a fase móvel o de promover o arrastamento das mesmas.
A migração diferencial dos diferentes analitos é conseguida à custa das
diferentes tensões de vapor e da diferente interacção com a fase estacionária,
sendo a interacção entre os compostos e a fase móvel considerada
desprezável
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TIPOS DE CROMATOGRAFIA(de acordo com o tipo de fase móvel)
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Sempre que os compostos a analisar sejam gases à PTN ou sempre que seja
possível vaporizá-los por aumento de temperatura (até ± 400ºC) sem que se
degradem quimicamente
Alternativa:
Derivatização das substâncias a analisar
Quando é que se pode recorrer à cromatografia gasosa?
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Gas Usage Comments
Helium General carrier or make-up gas Excellent but expensiveCannot be used with ECD except with another make-up gas
Nitrogen General make-up gas or packed column carrier gas
CheapNot good for capillary carrier gas as gives long run times
Hydrogen Carrier gas for capillary columnsCombustion gas for FID, NPD and FPD
CheapHighly explosive - needs oven trip sensor and careful ventingBest carrier gas for capillary GC
Air Combustion gas for FID, NPD and FPD
Cheap and readily available
CROMATOGRAFIA GASOSA - GASES
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Filtros de gases
Oxigénio
Humidade
Hidrocarbonetos
CROMATOGRAFIA GASOSA - GASES
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CROMATOGRAFIA GASOSA - INJECTOR
� Colocação rápida da amostra na fase móvel sem arrastamento (tailing) ou
dispersão
� Temperatura de injecção correcta e suficientemente alta para vaporizar
instantaneamente todos os compostos presentes na amostra sem que ocorra
decomposição ou condensação
� Estrutura que permita uma boa precisão (melhor que 1%)
� Ausência de contaminações
� Ausência de perda de amostra por adsorção ou fuga
Consiste em submeter o analito (saído da coluna cromatográfica) a uma primeira
etapa de ionização/fragmentação/separação e, posteriormente, seleccionar um
dos fragmentos obtidos (tendo em conta a sua intensidade e especificidade) e
submetê-lo a uma 2ª etapa de ionização/fragmentação/separação. No final
utiliza-se o registo cromatográfico de um dos fragmentos obtidos nesta 2ª etapa
para fazer a quantificação do composto.
As vantagens do processo residem na grande diminuição dos possíveis
interferentes resultante do aumento da especificidade do fragmento usado para
a quantificação. Desta forma é possível aumentar a probabilidade de
identificação inequívoca do composto e, simultaneamente, aumentar
ligeiramente a sensibilidade , dada a acentuada diminuição do sinal
correspondente à linha de base.
GC/MS-MS
GC-MSj. oliveira fernandes
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GC/MS-MS
Na prática, os aparelhos de GC/MS-MS do tipo quadrupolo, correspondem aos
habitualmente designados triplos quadrupolos. No 1º tem lugar a separação dos
fragmentos formados após a 1ª etapa de ionização. No 2º (na realidade um
hexapolo) tem lugar a “focagem” do fragmento seleccionado, a que se segue
uma 2ª etapa de ionização efectuada com recurso ao “bombardeamento” do
fragmento seleccionado com um gás, geralmente árgon (daí o nome de célula de
colisão geralmente usado). No 3º tem lugar a separação dos fragmentos
formados na sequência do 2º processo de ionização.
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GC-MSj. oliveira fernandes
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GC/MS-MS
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CROMATOGRAFIA GASOSA - RESUMO
Técnica cromatográfica usada em Química Analítica para
separar e analisar (qualitativa e quantitativamente)
compostos que possam ser vaporizados sem
decomposição
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CROMATOGRAFIA GASOSA - RESUMO
Grande poder de separação
Rapidez da análise
Pequenas quantidades de amostra
Bons sistemas de detecção
Análise quantitativa
Identificação de compostos desconhecidos (GC/MS)
VANTAGENS
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CROMATOGRAFIA GASOSA - RESUMO
Compostos voláteis
Compostos que podem ser convertidos em compostos voláteis de uma forma rápida e reprodutível
Compostos passíveis de serem analisados por GC
Regra geral, a quase totalidade dos compostos orgânicos com MM até 1000 podem ser analisados por GC.
Não podem ser analisados por GC
Compostos ionizadosPolímeros
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CROMATOGRAFIA GASOSA - RESUMO
Os extractos sujeitos a análise devem ser o mais “limpos” possíveis
de forma a garantir a reprodutibilidade analítica
(“ausência” de água, “ausência” de gordura, “ausência” de
proteínas, “ausência” de açúcares livres)
Por esse motivo, muitas amostras requerem processos de
preparação muito demorados
DESVANTAGENS
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Em GC não é possível a injecção directa das amostras, mesmo quando
elas são líquidas como é o caso dos vinhos, devido à degradação da
performance cromatográfica provocada pela presença de:
Água
Compostos não voláteis
(açúcares, ácidos e bases não voláteis, material de origem proteica,
aminoácidos, polifenóis, etc.)
Isolamento/Enriquecimento dos
compostos de interesse
Extracção
Transformação dos compostos fixos
(não voláteis) em compostos voláteisDerivatização
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Os compostos a analisar devem:
� Apresentar volatilidade suficiente, de forma a permitir asua deslocação ao longo da coluna cromatográfica
� Possuir estabilidade térmica
� Apresentar um bom comportamento cromatográfico
CROMATOGRAFIA GASOSA - EXIGÊNCIAS
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RAZÕES DA REDUZIDA VOLATILIDADE DE ALGUNS COMPOSTOS
Moléculas muito grandes apresentam reduzida
volatilidade devido às grandes forças de dispersão intra-
moleculares, responsáveis por manter a molécula intacta
Moléculas pequenas podem apresentar reduzida
volatilidade devido às intensas forças de atracção inter-
moleculares entre grupos polares
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RAZÕES DO MAU COMPORTAMENTO CROMATOGRÁFICO DE ALGUNS COMPOSTOS
Os compostos polares, mesmo quando dotados de suficiente
volatilidade para serem analisados directamente, apresentam
geralmente mau comportamento cromatográfico pois têm
tendência para serem adsorvidos em pontos localizados do
sistema cromatográfico (injector e coluna)
Peak Tailing
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PEAK TAILING
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PEAK TAILING
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DERIVATIZAÇÃO ANALÍTICA
Processos de modificação química de compostos, usados para a
produção de derivados suficientemente voláteis e dotados de
propriedades adequadas para a sua análise cromatográfica
A + D A-D
D = Reagente de derivatização A = Analito de interesse
A-D = Composto com boas propriedades cromatográficas
Se a transformação de A em A-D for quantitativa e reprodutível, a análise (detecção e quantificação) de A pode ser feita indirectamente pela análise de A-D
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PROCESSOS DE DERIVATIZAÇÃO - OBJECTIVOS
1. Permitir a análise de compostos cujas propriedades não permitem a sua análise directa
� Conferir volatilidade a compostos não voláteis
� Conferir estabilidade a compostos termicamente lábeis
2. Melhorar o comportamento cromatográfico de alguns compostos
� Obtenção de picos cromatográficos de melhor qualidade (menos tailing)
� Eliminação de picos duplos provenientes do mesmo composto
� Separação de compostos com comportamento cromatográfico muito semelhante (isómeros)
3. Aumentar a sensibilidade e/ou especificidade de alguns compostos em relação a determinado tipo de detectores
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REACÇÕES DE DERIVATIZAÇÃO MAIS USADAS EM GC
� Sililação
� Alquilação
� Esterificação
� Acilação
� Formação de derivados cíclicos
� Condensação de aminas primárias c/ compostos carbonílicos – formação de Bases de Schiff
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REACÇÕES DE SILILAÇÃO
R-H + (CH3)3-Si-X R-Si-(CH3)3 + HX
Consistem na substituição de um hidrogénio reactivo presente num grupo polar por um grupo alquilsilil, como trimetilsilil (TMS) ou
t-butildimetilsilil (t-BDMS)
R-H + (CH3)3-C-Si-X R-Si-C-(CH3)3 + HX
CH3
CH3CH3
CH3
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� Constituem um dos mais populares métodos de derivatização decompostos previamente à sua análise por GC
� Praticamente todos os grupos funcionais que podem interferir coma análise por GC devido à sua ausência de volatilidade sãopassíveis de ser sililados
� A reactividade dos diferentes grupos funcionais para com um dadoreagente sililante segue geralmente a seguinte ordem:
álcool > fenol > ác. carboxílico > amina > amida
� Para cada grupo funcional, em particular alcoóis e aminas, edevido a impedimento estérico, a ordem de reactividade é:
primário > secundário > terciário
REACÇÕES DE SILILAÇÃO
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REAGENTES DE SILILAÇÃO
Trimetilclorosilano
Hexametildissilazano
N,O-Bis-TMS-acetamida
N,O-Bis-TMS-trifluoroacetamida
N-Metil-N-TMS-trifluoroacetamida
TMCS
HDMS
BSA
BSTFA
MSTFA
(CH3)3-Si-Cl
(CH3)3-Si-NH-Si-(CH3)3
CH3-CN-Si-(CH3)3
O-Si-(CH3)3
CF3-CN-Si-(CH3)3
O-Si-(CH3)3
Si-(CH3)3
CF3-CO-NCH3
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� Os reagentes sililantes são facilmente hidrolisados pela água, o que exige
� grandes cuidados na sua conservação
� que as reacções tenham lugar na ausência total de água
� Os derivados formados são também muito sensíveis à presença de água
� Normalmente, é necessária a presença de solventes com grandecapacidade de solvatação (piridina, acetonitrilo, etc.)
� Colunas cromatográficas contendo fases estacionárias com hidrogéniosactivos (p. ex. Carbowax) são incompatíveis com derivados sililados
� Quando se usa o detector FID, pode haver um decréscimo gradual dasensibilidade devido à deposição de um aerossol de dióxido de silicone
REACÇÕES DE SILILAÇÃO - CARACTERÍSTICAS
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REACÇÕES DE ALQUILAÇÃO
Consistem na substituição por um grupo alquilo do hidrogénio reactivo presente em grupos polares
Ácidos R - COOH Ésteres R - COOR′
Alcoóis R - OH Éteres R - OR′
Fenóis Ar - OH Éteres aromáticos Ar - OR′
Aminas R - NH2 N-alquilaminas R – NH R′
Amidas R -CONH2 N-alquilamidas R - CONHR′
Tióis R -SH Tioéteres R -SR′
R - O(N,S)-H R' - X R - O(N,S) - R' + HX
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REACÇÕES DE ALQUILAÇÃO
� São usadas principalmente para a derivatização de compostos com hidrogéniosacídicos: ácidos e fenóis
� À medida que diminui o carácter ácido dos hidrogénios activos, maior tem deser a força do reagente alquilante e mais drásticas as condições a usar, o quelimita a selectividade e a aplicabilidade do método
� Existem muitos processos de derivatização bietápicos (para aminoácidos, p.ex.) , em que se faz uma esterificação prévia dos grupos carboxílicos seguida deuma derivatização dos outros grupos funcionais com outro tipo de reagentes
� Os derivados alquílicos, em especial os ésteres, são geralmente muito estáveis
� Algumas reacções podem ter lugar em meio aquoso
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ESTERIFICAÇÃO DE ÁCIDOS – PROCESSOS MAIS COMUNS
� Aquecimento (30 min a 70ºC) com um álcool (metanol, etanol ou butanol) napresença de HCl 3M
� Aquecimento até ebulição e sob refluxo, durante poucos minutos, com umasolução a 14% de BF3 em metanol (ou butanol). No final, os ésteres devem serextraídos com um solvente apolar (n-heptano, p. ex.)
� Reacção com diazometano – CH2N2
� Reacção com dialquilacetais (dimetilformamida-dimetilacetal, p. ex.)
� Reacção com Hidróxido de tetrabutilamónio
N-CH
O-CH3
O-CH3CH3
CH3
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ALQUILAÇÃO DE HISTAMINA COM BROMETO DE PENTAFLUOROBENZILO
A reacção tem lugar à temperatura de 40°C durante 60 min, num meio reaccional constituído por acetonitrilo, isopropanol e uma pequena
quantidade de diisopropiletilamina
++
HN N
CH2CH2NH2
HN N
CH2CH2NH2
HN N
CH2CH2NH2
HN N
CH2CH2NH2
N N
CH2CH2N
N N
CH2CH2N
+ 3 HBr
3 C6F5CH2Br
C6F5CH2 CH2
C6F5
C6F5
CH2
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REACÇÕES DE ACILAÇÃO
Envolvem a introdução de um grupo acilo numa molécula com um átomo de hidrogénio reactivo
R-O(N,S)-H + R'-C-X
O
R-O(N,S)- C-R'
O
+ HX
Mais raramente, podem envolver a adição de um grupo acilo a uma dupla ligação
C C R'-C-X
O
+ X-C-C- C-R'
O
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REACÇÕES DE ACILAÇÃO
� A acilação de álcoois, fenóis, aminas e tióis melhora consideravelmente o comportamento cromatográfico de compostos com as referidas funções
� Confere estabilidade a grupos muito susceptíveis a oxidação (p. ex. grupos fenólicos das catecolaminas)
� Possibilita a análise de moléculas com muitas funções polares como os açúcares e os aminoácidos
� Permite a separação de compostos difíceis de separar na forma não derivatizada
� É uma das vias mais usadas para a introdução nas moléculas de átomos de halogéneos, o que permite grandes ganhos de sensibilidade quando se usa o detector ECD (e com utilidade também quando a análise é feita por sistemas de GC-MS)
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REACÇÕES DE ACILAÇÃO – TIPOS DE REAGENTES
R-C-Cl
O
R-C
R-C
O
O
O
Haletos de Acilo
R-C-
O
NN
Anidridos ácidos Acilimidazóis
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REACÇÕES DE ACILAÇÃO� As reacções de acilação exigem muitas vezes aquecimento, com uma duração
que pode variar, em regra, entre os 15 e os 60 minutos
� Os haletos de acilo são muito reactivos, sendo os escolhidos no caso de moléculas difíceis de acilar por impedimentos de ordem estérica
� Exigem a presença de uma base no meio reaccional para neutralizar o ácido formado
� Os anidridos não apresentam tantos problemas pois dão origem a um ácido carboxílico resultante do próprio anidrido
� Em qualquer dos casos, o excesso de derivatizante deve ser removido, o que implica um processo extractivo no final da derivatização
� O acetilimidazol e outros reagentes acilantes com grupos dadores de natureza básica são os escolhidos quando se trata de moléculas que se degradam em meio ácido
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-C
O
O
OF3C -C
F3C
O
O
OF3C-F2C-C
F3C-F2C-C
O
O
OF3C-F2C-F2C-C
F3C-F2C-F2C-C
Anidrido Trifluoroacético
Anidrido Pentafluoropropiónico
Anidrido Heptafluorobutírico
REACÇÕES DE ACILAÇÃO – ANIDRIDOS FLUORADOS
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REACÇÕES DE ACILAÇÃO – ANIDRIDOS FLUORADOS
DerivadoNº de grupos derivatizado
Incremento de massa
Trifluoroacetil1
2
3
4
5
96
192
288
384
480
Pentafluorpropionil1
2
3
4
5
146
292
438
584
730
Heptafluorobutiril1
2
3
4
5
196
392
588
784
980
� As reacções de derivatização são levadas a cabo em escala muito pequena.O equipamento a usar tem, por isso, de ser adaptado a escala “micro”
� Geralmente, o material a analisar está presente em quantidades vestigiais.Por isso, todos os cuidados devem ser tomados para evitar contaminaçõesou perdas de amostra
� Os reagentes usados são, quase sem excepção, extremamente reactivos,dada a necessidade das reacções serem rápidas e quantitativas. Esse factoimplica cuidados especiais
� na conservação dos reagentes
� no seu manuseamento
DERIVATIZAÇÃO ANALÍTICACONSIDERAÇÕES DE NATUREZA PRÁTICA
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DERIVATIZAÇÃO ANALÍTICACONSIDERAÇÕES DE NATUREZA PRÁTICA
� Antes de qualquer análise dos compostos de interesse, é essencial aexecução de ensaios em branco, de forma a conhecer-se os picosresultantes apenas dos reagentes usados
� Mesmo no caso de reacções quantitativas e com aceitável grau dereprodutibilidade, o uso de padrões internos adequados é essencial para aobtenção de bons resultados analíticos
� É aconselhável reservar uma coluna cromatográfica para cada tipo dereagentes derivatizantes usado. O excesso de reagente pode levar aprocessos de derivatização “on-column” de resíduos não-voláteis aíacumulados, com o consequente aparecimento de picos “fantasmas”,muitas vezes difíceis de eliminar
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HHCl
O
O C
CH
CH
CH CH NHNH--RR +
O
O C
CH3
CH3
CH CH2RR--NHNH +
CH
CH CH
CH
CO Cl
CH3
CH CH2
CH3
CO Cl
O
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DERIVATIZAÇÃO DE AMINAS COM CLOROFORMATO DE ISOBUTILO
A reacção tem lugar à temperatura ambiente durante 10 min, num meio reaccional constituído pela amostra (1 mL), tolueno (1 mL) e
tamponado a pH 12 (1 mL de sol. tampão de fosfatos 0,5 M)
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DERIVATIZAÇÃO DE AMINAS COM CLOROFORMATO DE ISOBUTILO
1. Centrifugação da amostra (ausência de processo extractivo)
2. Derivatização com cloroformato de isobutilo, por meio de um
processo bifásico (água/tolueno)
� Processo de derivatização (com extracção simultânea)
� Eliminação do excesso de reagente
3. Análise dos derivados obtidos por GC-MS em modo de monitorização