Page 1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ƯNG DỤNG KY THUẬT NUÔI
CÂY MÔ SEO TAO DICH HUYÊN PHU CÂY
Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHÂN
HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2003-2007
Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ THU
Thành phố Hồ Chí Minh
Thang 9/2007
Page 2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**************************
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ƯNG DỤNG KY THUẬT NUÔI
CÂY MÔ SEO TAO DICH HUYÊN PHU CÂY
Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHÂN
HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE
Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS. BUI VĂN LỆ HOÀNG THỊ THU
TS. PHAN PHƢƠC HIÊN
ThS. QUÁCH NGÔ DIÊM PHƢƠNG
Thành phố Hồ Chí Minh
Thang 9/2007
Page 3
iii
LƠI CAM ƠN
Khoa luân này đƣơc hoàn thành vơi s ư quan tâm giup đơ rất nhiêu cua cac
thây cô, cac anh chi và cac ban . Em xin gƣi lơi cam ơn chân thanh đên:
PGS.TS Bui Văn Lê , ngƣơi đa tân tinh hƣơng dân va tao moi điêu kiên đê
em thƣc hiên khoa luân nay.
Thac sĩ Quach Ngô Diễm Phƣơng, ngƣời trưc tiếp hƣơng dẫn, chỉ day và
luôn động viên em trong những hoàn cảnh kho khăn nhất. Đê tài này đƣơc hoàn
thành vơi rất nhiêu nhiệt tình và tâm huyết cua chi. Cảm ơn chi vì tất cả.
Em cảm ơn Tiến sĩ Phan Phƣơc Hiên, những chỉ day và giup đơ cua thầy đã
giup em rất nhiêu trong qua trình thưc hiện đê tài.
Thac sĩ Kiêu Phƣơng Nam, ngƣời luôn gơi ý và cho em những lời khuyên bổ
ích.
Em cam ơn anh Điên , anh Hoang , anh Cƣơng va cac anh chi phong săc ky ,
Viên Công nghê Sin h hoc va Công nghê Môi trƣơng , ĐH Nông Lâm TP . HCM.
Cảm ơn vì những giup đơ nhiệt tình cua cac anh chi trong suốt thời gian chung em
thƣc tâp.
Cảm ơn anh Bình cung toàn thê cac ban sinh viên năm tƣ trƣờng ĐH Khoa
hoc Tư nhiên , ĐH Mơ luôn săn sang giup đơ va đông viên tôi nhƣng luc găp kho
khăn trong đê tai.
Cảm ơn lơp CNSH 29 thân yêu va cac ban thân đa cung tôi chia se tât ca
nhƣng nôi buôn vui suôt bôn năm đai hoc.
Và trên hết , con cam ơn bô m e, chi gai và em trai yêu quý đã luôn chăm lo ,
ung hộ, tin tƣơng con , cảm ơn cả nhà vì đã cho con chô dưa vững chăc nhất trong
cuôc sông.
Thang 9/2007
Hoàng Thi Thu
Page 4
iv
TÓM TẮT
Đê tai nghiên cƣu “Khao sat kha năng ƣng dung ky thuât nuôi cây mô
sẹo, tao dịch huyền phu cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhân hơp chât
anthraquinone” đƣơc tiên hanh tai trai thưc nghiệm sinh hoc, Đai hoc Khoa hoc
Tư nhiên , Đai hoc Quôc gia thành phố Hồ Chí Minh va phòng săc ky , Viên Công
nghê Sinh hoc va Công nghê Môi trƣơng , Đai hoc Nông Lâm, thành phố Hồ Chí
Minh tƣ thang 3/2007 đến hết thang 8/2007.
Kêt qua thu đƣơc:
- Mô seo tƣ mâu lơp mong tê bao cây D. burmanni Vahl đƣơc hinh thanh
trên môi trƣơng khoang cơ ban Gamborg’s B5 bô sung: NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2
mg/l), đƣơng 20 g/l, PVP (1,25 mg/l) ở pH 5,8, trong điêu kiên u tôi.
- Cac ky thuât săc ký cột , săc ky ban mong đƣơc sƣ dung nhăm cô lâp va ly
trích hơp chất anthraquinone trong cây D. burmanni in vitro. Hơp chât nay đ ƣơc sư
dung nhƣ chất tham chiếu đê đinh lƣơng anthraquinone trong cac thành phần khac
nhau cua cây Drosera burmanni Vahl.
- Kêt qua đinh lƣơng anthraquinone băng ky thuât HPLC cho thây : hàm
lƣơng anthraquinone trong rê la 3,03% so vơi trong lƣơng khô, nhiêu hơn trong thân
la (2,78%); ở cây không co săc tố đo là 2,8% trong khi ơ cây co săc tô đo la 0,78%;
trong sinh khôi huyên phu tê bao la 0,02% ( so vơi trong lƣơng tƣơi ), trong khi
không thây co sƣ hiên diên cua anthraquinone trong dich môi trƣơng .
Page 5
v
SUMMARY
The thesis “Study on application of callus and suspension cultures in
Drosera burmanni Vahl to produce anthraquinone compound” was carried out
at Plant Biotechnology lab, University of Natural Sciences; and Chromatography
room, Research Institute for Biotechnology and Enviromental Technology,
University of Agriculture and Forestry, HCM city from March to August, 2007.
Results:
- Callus of D. burmanni Vahl was cultured successfully by using
Gamborg’s B5 medium (modified) supplemented with NAA (0,2 mg/l),
2,4-D (0,2 mg/l), succrose (20g/l), PVP (1,25 mg/l), pH was adjusted to
5,8 before autoclaving.
- Column Chromatography and Thin Layer Chromatography were used to
purify anthraquinone compound in D. burmanni. This compound was
used as authentic sample for HPLC technique.
- Roots of D. burmanni contained 3,01% dry weight (DW) of anthraquinone,
larger than 2,78% in leaves.
- Anthraquinone content of red-leaf D. burmanni Vahl took 0,78% of DW,
compared with 2,78% DW in green-leaf trees.
- Biomass of D. burmanni’s suspension contained 0,02% of fresh weight of
anthraquinone, while no quantifiable amounts of anthraquinone has been
found in spent medium.
Ho Chi Minh city, September, 2007.
Hoang Thi Thu
Page 6
vi
MỤC LỤC
CHƢƠNG TRANG
Trang tƣa ..................................................................................................................... .i
Lơi cam ơn ................................................................................................................. iii
Tom tăt ..................................................................................................................... iv
Summary ..................................................................................................................... v
Muc luc ..................................................................................................................... vi
Danh sach cac chƣ viêt tăt .......................................................................................... ix
Danh sach cac hinh ..................................................................................................... x
Danh sach cac sơ đồ và biêu đồ ................................................................................ xii
Danh sach cac bang .................................................................................................. xiii
Chƣơng1: MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đê ....................................................................................................... 1
1.2. Muc tiêu .......................................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ............................................................................................................ 2
1.4. Ý nghĩa đê tài .................................................................................................. 2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.1. Tổng quan vê Drosera burmanni Vahl .......................................................... 3
2.1.1. Vi trí phân loai................................................................................................ 3
2.1.2. Phân bố ........................................................................................................... 3
2.1.3. Mô tả hình thai ............................................................................................... 4
2.1.4. Đặc tính sinh hoc ............................................................................................ 6
2.1.5. Đặc điêm sinh thai .......................................................................................... 7
2.1.6. Thành phần hoa hoc ....................................................................................... 8
2.1.7. Phƣơng phap nhân giống .............................................................................. 11
2.1.8. Tầm quan trong ............................................................................................ 12
2.1.8.1. Ý nghĩa vê sinh thai ...................................................................................... 12
2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hoa thưc vât ................................................. 12
2.1.8.3. Gía tri dƣơc tính ........................................................................................... 12
2.1.8.4. Ứng dung trong công nghiệp ........................................................................ 14
2.1.8.5. Gía tri kinh tế................................................................................................ 15
2.1.9. Cac nghiên cứu trong và ngoài nƣơc ............................................................ 16
2.2. Tổng quan vê ky thuât nuôi cấy huyên phu tế bào đê thu nhân
hơp chất thứ cấp ........................................................................................................ 17
2.2.1. Khai niệm hơp chất thứ cấp ......................................................................... 17
2.2.2. Nuôi cấy mô seo ........................................................................................... 18
2.2.2.1. Khai niệm mô seo ......................................................................................... 18
2.2.2.2. Ứng dung cua nuôi cấy mô seo .................................................................... 19
2.2.3. Nuôi cấy dich huyên phu .............................................................................. 19
2.2.3.1. Khai niệm huyên phu tế bào ......................................................................... 19
2.2.3.2. Nguyên tăc tao huyên phu ............................................................................ 19
Page 7
vii
2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sư tao huyên phu tế bào ............................... 20
2.2.3.4. Cac phƣơng phap nuôi cấy huyên phu hiện nay ......................................... 20
2.2.3.5. Cac điêu kiện nuôi cấy dich tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất
cac hơp chất thứ cấp .................................................................................................. 22
2.2.4. Cac phƣơng phap gia tăng sư sản xuất hơp chất thứ cấp trong nuôi
cấy huyên phu ........................................................................................................... 22
2.2.4.1. Tối ƣu hoa điêu kiện nuôi cấy ..................................................................... 22
2.2.4.2. Chon loc dòng tế bào co khả năng sản xuất cao ......................................... 22
2.2.4.3. Bổ sung tiên chất ......................................................................................... 22
2.2.4.4. Cố đinh tế bào ............................................................................................. 23
2.2.4.5. Cảm ứng sư phân hoa mô ............................................................................ 23
2.2.4.6. Nhân tố cảm ứng (elicitor) .......................................................................... 23
2.3. Cac ky thuât sư dung trong bài luân văn .................................................... 24
2.3.1. Phƣơng phap ly trích – thu nhân hơp chất .................................................. 24
2.3.1.1. Săc ký cột .................................................................................................... 24
2.3.1.2. Săc ký nhanh cột khô (Dry Column Flash Chromatography) ..................... 26
2.3.1.3. Săc ký lơp mong điêu chế ........................................................................... 27
2.3.2. Ky thuât săc ký long cao ap HPLC trong đinh lƣơng hơp chất thứ cấp ..... 28
Chƣơng 3: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 31
Thời gian và đia điêm thưc hiện ................................................................................ 31
3.1. Nuôi cấy mô seo, tao dich huyên phu ......................................................... 31
3.1.1. Vât liệu ........................................................................................................ 31
3.1.2. Phƣơng phap ................................................................................................ 33
3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sat ảnh hƣởng cua thành phần khoang và
nồng độ đƣờng lên sư phat triên cua mẫu cấy lơp mong .......................................... 33
3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sat sư kết hơp 2 loai hormone thích hơp cho
việc kích ứng tao mô seo ........................................................................................... 34
3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sat nồng độ thích hơp cua 2,4-D khi kết hơp
vơi NAA (0,2 mg/l) đê cảm ứng tao mô seo ............................................................. 35
3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sat ảnh hƣởng cua cac kiêu nuôi cấy lên sư
tăng sinh khối mô seo và tao dich huyên phu ........................................................... 36
3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sat sư ảnh hƣởng cua anh sang lên sư
hình thành săc tố đo cua mô seo................................................................................ 37
3.2. Ly trich va cô lâp hơp chât anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 38
3.2.1. Vât liệu ........................................................................................................ 38
3.2.2. Phƣơng phap ................................................................................................ 39
3.3. Đinh lƣơng hơp chất anthraquinone trong cac nguyên liệu
nuôi cấy in vitro khac nhau bằng phƣơng phap săc ký long cao ap HPLC .............. 40
3.3.1. Vât liệu ........................................................................................................ 40
3.3.2. Phƣơng phap ............................................................................................... 40
3.3.2.1. Xac đinh điêu kiện, thông số ky thuât thích hơp......................................... 40
3.3.2.2. Xây dưng đƣờng chuẩn ............................................................................... 41
Page 8
viii
3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sat ảnh hƣởng cua cach xư lý mẫu trong
đinh lƣơng hơp chất anthraquinone ........................................................................... 41
3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sanh hàm lƣơng hơp chất anthraquinone trong
cac bộ phân khac nhau cua cây in vitro .................................................................... 43
3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sanh hàm lƣơng hơp chất anthraquinone trong
cac mẫu cây co săc tố đo và mẫu không co săc tố đo ............................................... 44
3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xac đinh hàm lƣơng anthraquinone trong mẫu
dich huyên phu đã tao đƣơc từ thí nghiệm 4 ............................................................ 45
3.4. Xư lý thống kê ............................................................................................. 45
Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................................................................. 46
4.1. Nuôi cấy mô seo tao dich huyên phu ........................................................... 46
4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sat ảnh hƣởng cua thành phần khoang và
nồng độ đƣờng lên sư phat triên cua mẫu cấy lơp mong .......................................... 46
4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sat sư kết hơp 2 loai hormone thích hơp cho
việc kích ứng tao mô seo ........................................................................................... 48
4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sat nồng độ thích hơp cua 2,4-D khi kết hơp
vơi NAA (0,2 mg/l) đê cảm ứng tao mô seo ............................................................. 49
4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sat ảnh hƣởng cua cac kiêu nuôi cấy lên sư
tăng sinh khối mô seo và tao dich huyên phu ........................................................... 54
4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sat sư ảnh hƣởng cua anh sang lên sư
hình thành săc tố đo cua mô seo................................................................................ 56
4.2. Ly trich va cô lâp hơp chât anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 58
4.3. Đinh lƣơng hơp chất anthraquinne trong cac nguyên liệu nuôi cấy
in vitro khac nhau bằng phƣơng phap săc ký long cao ap HPLC ............................. 59
4.3.1. Xây dưng đƣờng chuẩn ............................................................................... 59
4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sat ảnh hƣởng cua cach xư lý mẫu trong đinh
lƣơng hơp chất anthraquinone ................................................................................... 61
4.3.3. Thí nghiệm 7: So sanh hàm lƣơng hơp chất anthraquinone trong
cac bộ phân khac nhau cua cây in vitro .................................................................... 62
4.3.4. Thí nghiệm 8: So sanh hàm lƣơng hơp chất anthraquinone trong
cac mẫu co săc tố đo và mẫu không co săc tố đo ...................................................... 64
4.3.5. Thí nghiệm 9. Xac đinh hàm lƣơng anthraquinnone trong mẫu
dich huyên phu đã tao đƣơc từ thí nghiệm 4 ............................................................. 66
Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ................................................................... 68
5.1. Kết luân ....................................................................................................... 68
5.1.1. Nuôi cấy mô seo tao dich huyên phu .......................................................... 68
5.1.2. Đinh lƣơng hơp chất anthraquinone bằng săc ký long cao ap HPLC ......... 68
5.2. Đê nghi ........................................................................................................ 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70
PHỤ LỤC
Page 9
ix
DANH SACH CAC CHƢ VIÊT TĂT
2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid
BAP : 6-benzylaminopurine
CRD : Completely Randomized Design (Hoàn toàn ngẫu nhiên)
ctv : cộng tac viên
HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Săc ky long ao ap)
IAA : 3-indolyl-acetic acid
IBA : 3-indolebutyric acid
MS : Murashige & Skoog, 1962
NAA : naphthalene acetic acid
PVP : poly vinyl pyrrolidone
TCL : Thin Cell Layer (Lơp mong tê bao)
TLC : Thin Layer Chromatography (Săc ky ban mong)
Page 10
x
DANH SACH CÁC HINH
TRANG
Hình 2.1. Khu vưc phân bố cua Drosera burmanni Vahl trên thế giơi .................. 4
Hình 2.2. Hình thai cua Drosera burmanni Vahl .................................................... 4
Hình 2.3. La D. burmanni ........................................................................................ 5
Hình 2.4. D. burmanni Vahl ngoài tư nhiên. ........................................................... 7
Hình 2.5. Cấu truc hoa hoc cua một số flavonoid và flavonoid glucoside ............ 10
Hình 2.6. Môt sô loai Drosera co gia tri kinh tế cao trên thế giơi ......................... 15
Hình 2.7. Hệ thống nuôi cấy gian đoan qui mô nho trên cac may lăc ................... 21
Hình 2.8. Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm ........................................... 21
Hình 2.9. Săc ky côt ............................................................................................... 24
Hình 2.10. Mô hinh săc ky nhanh côt khô ............................................................. 26
Hình 2.11. Săc ký lơp mong ................................................................................... 27
Hình 2.12. Sơ đô hoat đông cac bô phân cua may HPLC ...................................... 29
Hình 3.1. Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro ................................................ 31
Hình 4.1. Mô seo đƣơc hinh thanh tƣ mâu lơp mong cây D.burmanni trên
môi trƣơng Gamborg’s B5 bô sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D vơi
nông đô thay đôi ..................................................................................................... 52
Hình 4.2. Mô seo đƣơc hinh thanh tƣ mâu lơp mong long thân cây
D. burmanni trên môi trƣơng Gamborg’s B5 bô sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D
vơi nông đô thay đôi ............................................................................................... 53
Hình 4.3.A. Mô seo nuôi trong môi trƣờng long lăc .............................................. 55
Hình 4.3.B. Cum tế bào quan dƣơi kính hiên vi 40X. ........................................... 55
Hình 4.3.C. Tế bào đơn quan dƣơi kính hiên vi 40X .............................................. 55
Hình 4.4. Anh hƣởng cua anh sang lên sư hình thành săc tố đo cua
mô seo cây D. burmanni ........................................................................................ 57
Hình 4.5. Săc ký đồ HPLC cua anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm ................... 60
Hình 4.6. Săc ký đồ HPLC cua anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm ................... 60
Page 11
xi
Hình 4.7. Săc ký đồ HPLC cua anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm ................... 60
Hình 4.8. Săc ký đồ HPLC cua anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm ................... 60
Hình 4.9. Săc ký đồ HPLC cua anthraquinone tham chiếu ở ơ 70 ppm ................ 60
Hình 4.10. Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni đƣơc xư lý theo
quy trình A. ............................................................................................................ 61
Hình 4.11. Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni đƣơc xư lý theo
quy trình B .............................................................................................................. 61
Hình 4.12. Săc ký đồ HPLC cua mẫu rễ cây D. burmanni Vahl ........................... 63
Hình 4.13. Săc ký đồ HPLC cua mẫu thân la cây D. burmanni Vahl .................... 63
Hình 4.14. Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni Vahl co săc tố đo. .......... 65
Hình 4.15. Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni Vahl không
co săc tố đo. ............................................................................................................ 65
Hình 4.16. Săc ký đồ HPLC cua mẫu dich môi trƣờng sau khi loc
sinh khối tế bào ...................................................................................................... 66
Hình 4.17. Săc ký đồ HPLC cua sinh khối tế bào từ dich huyên phu. ................... 66
Page 12
xii
DANH SACH CAC SƠ ĐÔ VÀ BIÊU ĐÔ
TRANG
SƠ ĐÔ
Sơ đô 2.1. Con đƣơng tông hơp cac hơp chât thƣ câp ơ thƣc vât ........................ 18
Sơ đô 3.1. Quy trình ly trích và cô lâp hơp chất anthraquinone .......................... 39
Sơ đô 3.2. Quy trinh xƣ ly mâu ............................................................................ 42
Sơ đô 3.3. Quy trinh xƣ ly dich huyên phu .......................................................... 45
Sơ đô 3.4. Quy trinh ly trich va cô lâp hơp chât anthraquinone (kêt qua) ........... 58
BIÊU ĐÔ
Biêu đô 4.1. Tỷ lệ mẫu lơp mong sống trên cac loai môi trƣờng khac
nhau sau 14 ngày nuôi cấy ................................................................................... 46
Biêu đô 4.2. Khối lƣơng mô seo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy .... 54
ĐÔ THI
Đồ thi 4.1. Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone
tham chiếu và gia tri diện tích peak ..................................................................... 59
Page 13
xiii
DANH SACH CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 2.1. Cac loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và
7-methyljuglone ..................................................................................................... 8
Bảng 2.2. Cac Naphthoquinone vi lƣơng đƣơc tach chiết từ Drosera ................... 9
Bảng 2.3. Dƣơc tính và một số hoat tính ứng dung khac cua
dich chiết Drosera ............................................................................................... .13
Bảng 3.1. Bố trí nghiệm thức khảo sat ảnh hƣởng thành phần khoang
và nồng độ đƣờng lên sư phat triên mẫu cấy lơp mong ....................................... 33
Bảng 3.2. Bố trí nghiệm thức khảo sat sư kết hơp 2 loai hormone
thích hơp cho việc kích ứng tao mô seo ............................................................... 34
Bảng 3.3. Bố trí nghiệm thức khảo sat nồng độ thích hơp cua 2,4-D
khi kết hơp vơi NAA (0,2 mg/l) đê cảm ứng tao mô seo ..................................... 35
Bảng 3.4. Bố trí nghiệm thức khảo sat ảnh hƣởng cua cac kiêu nuôi cấy
lên sư tăng sinh khối mô seo ................................................................................ 36
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm khảo sat ảnh hƣởng cua anh sang
lên sư hình thành săc tố đo ở mô seo ................................................................... 37
Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong
cac bộ phân khac nhau cua cây in vitro ............................................................... 43
Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong mẫu
cây co săc tố đo và không co săc tố đo ................................................................ 44
Bảng 4.1. Tỷ lệ mẫu sống ở cac nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy ................... 46
Bảng 4.2. Anh hƣởng cua thành phần khoang lên sư phat triên cua
mẫu cấy lơp mong ................................................................................................ 47
Bảng 4.3. Anh hƣởng cua nồng độ đƣờng lên sư phat triên cua mẫu cấy
lơp mong ............................................................................................................. 48
Bảng 4.4. Tỷ lệ tao mô seo trên cac môi trƣờng sư dung kết hơp 2
loai hormone khac nhau ....................................................................................... 48
Page 14
xiv
Bảng 4.5. Tỷ lệ mẫu tao seo trên cac môi trƣờng khac nhau sau 21
ngày nuôi cấy ....................................................................................................... 49
Bảng 4.6. Khối lƣơng mô seo tăng từ 1 mg mô seo ban đầu sau 21 ngày
nuôi cấy trên cac kiêu nuôi cấy khac nhau ......................................................... 54
Bảng 4.7. Kết quả ảnh hƣởng anh sang lên sư hình thành săc tố đo ở mô seo .... 56
Bảng 4.8. Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak ............. 59
Bảng 4.9. Kết quả so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong cac bộ phân khac
nhau cua cây in vitro ............................................................................................ 62
Bảng 4.10. Kết quả so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong cac mâu co va
không co săc tô đo ................................................................................................ 64
Bảng 4.11. Kêt qua đinh lƣơng anthraquinnone trong mẫu dich huyên phu ....... 66
Page 15
1
Chƣơng 1
MƠ ĐÂU
1.1. Đặt vấn đề
Ngay từ buổi sơ khai, con ngƣời đã biết sư dung thưc vât không chỉ làm
nguồn thưc phẩm mà còn cho nhiêu muc đích khac, đặc biệt là trong y hoc. Ngƣời
ta sư dung một số loai thưc vât tƣơi đê đăp lên vết thƣơng hoặc thưc vât khô đê săc
thuốc tri bệnh. Cach đây hơn một thế kỷ, dưa vào y hoc cổ truyên cac nhà khoa hoc
đã phat triên cac quy trình cho phép tao ra nhiêu loai thuốc từ cac hơp chất thứ cấp
chiết xuất từ cây trồng. Vơi tiến bộ khoa hoc, cac phân tư hoa hoc trong cây đã
đƣơc tổng hơp nhân tao đê sản xuất dƣơc phẩm. Tuy nhiên việc tổng hơp nhân tao
còn gặp nhiêu kho khăn do con đƣờng tổng hơp cac chất này vẫn chƣa đƣơc làm
sang to.
Từ những năm đầu thâp niên 70 cua thế kỷ XX đến nay, cac nhà khoa hoc đã
công bố hàng loat cac công trình nghiên cứu vê nuôi cấy tế bào đơn cua nhiêu loài
thưc vât nhằm thu nhân sản phẩm thứ cấp. Nhƣ vây việc ap dung cac ky thuât công
nghệ sinh hoc dưa trên cac phƣơng phap nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào in vitro
không những gop phần vào việc sản xuất và thu nhân mà còn giup ta đảm bảo đƣơc
một cach chu động số lƣơng cac hơp chất co gia tri tri liệu.
Ở Việt Nam, ngƣời ta đã thu thâp đƣơc 3 loài Drosera trong đo Drosera
burmanni Vahl gần đây đã đƣơc nghiên cứu vê việc thu nhân hơp chất quinone từ
nuôi cấy in vitro, khảo sat hoat tính sinh hoc cua hơp chất này cũng nhƣ nhân giống
thành công bằng tao chồi trưc tiếp.
Page 16
2
Do đo đê hƣơng tơi tư động hoa việc thu nhân và chu động tăng sinh lƣơng
chất quinone đã đƣơc nghiên cứu thành công, đê tài:
“KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ƯNG DỤNG KY THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO
TẠO DỊCH HUYỀN PHU CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN
HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE ”
đã ra đời.
1.2. Mục tiêu
Khảo sat khả năng tao mô seo từ cây Drosera burmanni Vahl.
Khảo sat khả năng tao dich huyên phu tế bào cây Drosera burmanni Vahl.
Khảo sat hàm lƣơng hơp chất quinone thu đƣơc từ nuôi cấy dich huyên phu.
1.3. Yêu cầu
Tao đƣơc mô seo và khởi đầu tao dich huyên phu cây D. burmanni Vahl.
Phân tích đinh tính và đinh lƣơng đƣơc hàm lƣơng anthraquinone trong từng
thành phần khac nhau và trong dich huyên phu cây D. burmanni bằng may
HPLC.
1.4. Ý nghĩa của đề tài:
Ý nghĩa khoa hoc: đây là một bƣơc tiến quan trong và cần thiết trong qui
trình ứng dung ky thuât nuôi cấy tế bào D. burmanni Vahl đê thu nhân hơp
chất quinone.
Ý nghĩa thưc tiễn: cung cấp quy trình tao mô seo, dich huyên phu D.
burmanni Vahl cho muc tiêu thu nhân quinone
Page 17
3
Chƣơng 2
TÔNG QUAN TAI LIÊU
2.
2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl
2.1.1. Vị trí phân loai
Theo hệ thống phân loai thưc vât cua Takhtajan [14]:
Giơi: Plantae (Thưc vât).
Ngành: Magnoliophyta (Ngoc lan).
Lơp: Magnoliopsida (Ngoc lan).
Phân lơp: Rosidae (Hoa hồng).
Bộ: Nepenthales.
Ho: Droseraceae.
Giống: Drosera.
Loài: Drosera burmanni Vahl.
Tên tiếng Anh: burmese sundew.
Tên thông thƣờng: cây băt ruồi, co troi gà, bèo đất, trƣờng lệ burman.
2.1.2. Phân bố
Drosera burmanni Vahl đƣơc tìm thấy ở đông băc nƣơc Úc, Ấn Độ, Trung
Quốc, Nhât, Sri Lanka và Đông Nam Á nhƣ Malaysia, Myanmar, Thai Lan,Việt
Nam . . .(Hình 2.1) [33], [34].
Ở Việt Nam, Drosera burmanni Vahl đƣơc tìm thấy ở Thai Nguyên, Thanh
Hoa, Nghệ An, Hà Tĩnh, khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣơc Bưu tỉnh Bà
Ria Vũng Tàu [1] và ở khu du lich sinh thai Băc Bình, Bình Thuân.
Page 18
4
h
Hình 2.1: Khu vưc phân bố cua Drosera burmanni Vahl trên thế giơi [30].
2.1.3. Mô tả hình thái
Drosera burmanni Vahl là loài cây co, cao 5 - 30 cm, co nhiêu màu săc khac
nhau: xanh la, xanh đâm, xanh co anh vàng vơi lông tuyến màu đo hay toàn cây
màu đo [6], [15], [33], [35].
Hình 2.2: Hình thai cua Drosera burmanni Vahl [33], [35].
Thân (Hình 2.2 A, B, C)
Thân không phân nhanh, rất ngăn, co khi chỉ cao 1 cm khi tăng trƣởng trong
bong râm, không hình thành thân cu dƣơi đất. Thân mang nhiêu phat hoa [31].
Ghi chú
Khu vưc phân bố cua
Drosera burmanni Vahl
Khu vưc không co sư hiện
diện cua Drosera burmanni
Vahl
A
F E D
C B
Page 19
5
Lá (Hình 2.3)
La hình muông, xếp thành hình hoa thi quanh thân, phiến la dài khoảng 1,2
cm, rộng khoảng 0,4 cm, mặt la phu đầy lông tuyến.
La co tua cuốn vơi những giot keo ở đầu goi là dich nhầy, côn trung dính vào
và bi bẫy trong dich này. Sau đo chất này sẽ tiêu hoa côn trung măc bẫy. Tua cuốn
trên la uốn cong vê phía con mồi bằng tính hƣơng tiếp xuc cua no. Drosera
burmanii Vahl là một trong những loài co chuyên động tua cuốn nhanh nhất [37].
Hình 2.3: La D. burmanni [42].
A: La; B: Cac tua cuốn.
C, D: Cấu truc một tua cuốn.
Tua cuốn là lông tiết đƣơc tao bởi một cuống dài, nho, co cấu truc đa bào và
đầu mut tua cuốn đƣơc tao bởi 2 lơp tế bào tuyến. Chất keo dính đƣơc tiết ra từ cac
tuyến xuyên qua lơp biêu bì gian đoan.
Rễ
Hệ thống rễ tƣơng đối đơn giản: rễ chum nhƣng chỉ co một vài nhanh. Chung
đƣơc goi là rễ giả vì chỉ co cơ quan hut nƣơc, cung cấp nƣơc cho cây.
Hoa (Hình 2.2 D, E)
Cây ra hoa thang 3 - 4. Hoa đêu, lƣơng tính, nho, co nhiêu màu săc từ tím
nhat tơi vàng nhat, màu đo, hồng và trăng. Hoa nằm trên một cuống chung dài, moc
A
D C
B
Page 20
6
thẳng goc từ chồi nach hay chồi đỉnh goi là phat hoa. Phat hoa cao 5 - 6 cm, môi
phat hoa co từ 5 đến 25 hoa, hop thành chum hình bò cap. Hoa đối xứng tròn, la đài
5, canh hoa 5, tiêu nhuy 5, noãn sào một buồng, đính phôi trăc mô, bầu 5 la noãn
hàn liên nhau bởi mép bên [9], [14].
Hoa nở nhiêu thời điêm khac nhau, tuy thuộc vào từng giai đoan phat triên
cua cây. Hoa thƣờng nở vào buổi sang. Môi ngày nở một bông băt đầu từ nu thấp
nhất (nu đƣơc hình thành sơm nhất). Hầu hết hoa tư thu phấn nhờ côn trung. Nếu sư
thu phấn không diễn ra, hat phấn và nhuy sẽ tư thu phấn khi hoa khép canh.
Hat (Hình 2.2 F)
Hat thu đƣơc sau một tuần từ khi hoa nở. Hat nằm trong nang hat. Nang hat
tròn, gồm 5 mảnh, chứa nhiêu hat. Nang hat còn non co màu xanh, nang hat chín co
màu đen. Hat màu đen, đƣờng kính 0,1 mm.
2.1.4. Đặc tính sinh học
Hình thức sinh sản
Cây sinh sản bằng hai hình thức hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng
cach nảy chồi con từ chồi bên hay từ đỉnh sinh trƣởng. Sinh sản hữu tính bằng hat.
Phƣơng thức bắt mồi
Hình thức: Sư dung dich nhầy đê băt dính con mồi (flypaper traps).
Cơ chế: Cac lông tuyến bao phu khăp bê mặt la co vai trò nhƣ một cai bẫy
nho. Cac keo dính tiết ra từ lông tuyến nhìn nhƣ những giot sƣơng và không bi khô
đi trong anh mặt trời (vì vây mà loài cây này còn đƣơc goi là “sundew”). Giot keo
dính này tac động nhƣ những giấy băt mồi (flypaper). Cac giot keo thƣờng không
độc và co hƣơng thơm, nhờ vây no thu hut con mồi đâu xuống bê mặt la và băt dính
chung. Khi đo những lông tuyến nhay cảm vơi protein sẽ uốn cong, từ từ cuộn con
mồi lai và đẩy no vào giữa la. Tuyến tiết trên bê mặt la luc này sẽ ngừng tiết keo
dính mà tiết nhiêu enzyme thuy phân tiêu hoa con mồi. La sẽ hấp thu chất dinh
dƣơng mà cây không thê lấy từ môi trƣờng nghèo dinh dƣơng [25], [34], [35].
Page 21
7
2.1.5. Đặc điểm sinh thái
Hình 2.4: D. burmanni Vahl ngoài tư nhiên [3], [40].
Đất đai
Cây co thê sống đƣơc ở hầu hết cac điêu kiện: đất đầm lầy, soi, cat, đất acid
[37].
Đất trồng Drosera: hôn hơp ¾ đất mun + ¼ cat, cat sach hoặc cat trộn bột
than gô.
Độ ẩm
Độ ẩm từ trung bình đến cao (50 - 80%). Độ ẩm thấp hơn sẽ làm mất giot
keo dính đầu lông tiết.
Nhiệt độ
Cây sống đƣơc ở nhiệt độ 5 - 35OC, nhiệt độ thích hơp nhất 18 - 25
OC. Dƣơi
5 O
C cây ngừng phat triên.
Ánh sáng
Cây thích hơp vơi anh sang trưc tiếp, tối thiêu từ 6 - 8 giờ chiếu sang một
ngày. Khi cây sống ở nơi co cƣờng độ anh sang cao thì toàn bộ cây sẽ chuyên sang
màu đo. Nếu cây không nhân đu anh sang thì tua cuốn sẽ co màu xanh.
Page 22
8
2.1.6. Thành phần hóa học
Nhiêu hơp chất naphthoquinone và cac flavonoid đã đƣơc cô lâp, xac đinh
cấu truc và đinh lƣơng trong cây Drosera ngoài thiên nhiên cũng nhƣ in vitro.
Naphthoquinone
Cac loai Drosera thƣờng sản sinh 2 loai naphthoquinone chính là plumbagin
và 7-methyljuglone (Bảng 2.1) [21]. Ngoài ra còn co cac naphthoquinone vi lƣơng
khac nhƣ droserone, hydroxydroserone và nhiêu naphthoquinone glucoside (Bảng
2.2) mà không thê tìm thấy trong cac loài cây khac [29].
Bảng 2.1: Cac loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone [21]
Plumbagin 7 Methyljuglone
D. andersoniana
D. auriculata
D. binata
D. bulbosa
D. capensis
D. capillaris
D. cistiflora
D. dichotoma
D. erythrorhiza
D. intermedia
D. longifolia
D. lunata
D. macrophylla
D. madagascariensis
D. microphylla
D. modesta
D. natalensis
D. peltata
D. adelae
D. aliciae
D. aliciae x capensis
D. anglica
D. auriculata
D. burkeana
D. burmanii
D. capensis
D. cistiflora
D. cuneifolia
D. dielsiana
D. filiformis
D. hamiltonii
D. hilaris
D. indica
D. intermedia
D. longifolia
D. longifolia x rotundifolia
Page 23
9
D. platypoda
D. prolifera
D. pygmaea
D. regia
D. rotundifolia
D. slackii
D. stolonifera, spp. Rupicola
D. venusta
D. villosa
D. madagascariensis
D. ramentacea
D. regia
D. rotundifolia
D. spathulata
D. stolonifera, spp. Stolonifera
D. tracii
D. trinervia
D. villosa
Bảng 2.2: Cac Naphthoquinone vi lƣơng đƣơc tach chiết từ Drosera [21]
Naphthoquinone Loài Kiêu nuôi cấy
Droserone
Hydroxydroserone
Biramentaceonea
Droserone-5-glucoside
Rossoliside
Hydroxydroserone-5-glucoside
2-Methylnaphtazarin-5-O-
glucosideb
D. whittakeri
D. rotundifolia
D. whittakeri
D. rotundifolia
D. ramentaceae
D. rotundifolia
D. rotundifolia
D.spatulata
D.rotundifolia
D.rotundifolia
D.spatulata
In vivo
In vivo
In vivo
In vivo
In vivo
In vivo
In vivo
In vitro
In vitro
In vivo
In vitro
In vitro
a: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiết với dung môi hữu cơ.
b: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiêt với dung môi methanol.
Page 24
10
Cấu truc hoa hoc cua cac naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside tach
chiết từ cac loài Drosera [21].
R1 R2 R3 R4 R5
[1] CH3 H H H OH 7-Methyljuglone
[2] H H CH3 H OH Plumbagin
[3] H H CH3 OH OH Droserone
[4] OH H CH3 OH OH Hydroxydroserone
[5] H H CH3 OH OGlc Droserone-5-glucoside
[6] OH H CH3 OH OGlc Hydroxydroserone-5-gluside
R6 R7
[7] CH3 H Rossoliside
[8] H CH3 2-Methyl-hydrojuglone-4-glucoside
Flavonoid
Drosera chứa phổ rất rộng cac flavonoid, flavonoid glucoside nhƣ quercetin,
isoquercetin, kaempferol, astragalin, hyperin, gossypin và gossypitrin [20].
Quercetin Kaempferol
Myricetin Hyperin
Hình 2.5: Cấu truc hoa hoc cua một số flavonoid và flavonoid glucoside [29].
R4
O
O
R2
R3
R5
R1
OH
OGlc
R7
OH
R6
Page 25
11
2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống
Nhân giống tự nhiên [3]
Nhân giống bằng cách gieo hạt
Thời gian gieo hat tốt nhất là cuối mua đông. Hat đƣơc gieo trên hôn hơp đất
trồng thích hơp. Tốt nhất nên giữ hat trong điêu kiện mat và ẩm khoảng 6 tuần. Sau
đo cho hat vào châu đất co boc tui nhưa và đê trong điêu kiện sang. Đến khi hat nảy
mầm thì bo tui nhưa ra và trồng cac cây con vào châu lơn.
Nhân giống bằng cách cắt rễ
Cây băt ruồi co thê đƣơc nhân giống từ cac rễ dày. Lấy những rễ khoe từ cây
me, căt thành đoan dài 5 cm và đặt nằm ngang trên hôn hơp đất dày 6 cm, phu
chung vơi l lơp đất dày 1 cm. Boc những châu đất này lai và đặt trong điêu kiện
sang. Khi cây mơi băt đầu moc lên thì không boc nữa. Nhân giống bằng phƣơng
phap căt rễ tốt nhất vào đầu mua tăng trƣởng cua cây.
Nhân giống bằng cách cắt lá
Thời gian nhân giống tốt nhất là vào đầu mua tăng trƣởng cua cây. La đƣơc
căt ở cuống la rồi đặt lên trên hôn hơp đất và cat sao cho lông tuyến hƣơng lên. Giữ
cuống la ngâp trong đất nhƣng không phu lên cac lông tuyến. Boc châu đất lai và
giữ trong điêu kiện sang. Sư phat triên cua cây xảy ra trong vài tuần.
Nhân giống bằng cây mầm
Vào mua thu, cây sẽ sản sinh ra những cây bé xíu (cây mầm). Thu thâp
những cây mầm này và trồng thành những cây mơi. Một cach đê thu thâp cây mầm
là giữ những châu chứa cây trut ngƣơc xuống 1 tờ giấy và dung tăm gat cây mầm ra
khoi cây me. Gieo chung trên hôn hơp đất. Cây sẽ moc rễ và phat triên thành cây
trƣởng thành.
Nhân giống in vitro
Hầu hết những nghiên cứu trên thế giơi vê nuôi cấy mô Drosera đêu cho
thấy nhiêu loài Drosera co tiêm năng nhân giống rất cao khi đƣơc nuôi cấy trong
điêu kiện in vitro thích hơp. Cho đến nay, rất nhiêu loài Drosera đã đƣơc nuôi cấy
Page 26
12
in vitro thành công. Hầu hết hat, la kết cum nhƣ hoa, la tach biệt, đôi khi cả rễ, hoa
và mầm cũng đƣơc sư dung làm mẫu cấy đê thiết lâp quy trình nuôi cấy mô.
Trong nƣơc và trên thế giơi đã co nhiêu nghiên cứu vê nhân giống in vitro
cây D. burmanni Vahl. Cây sinh trƣởng tôt nhất trên môi trƣờng MS 1/2
(Murashige Skoog, vơi lƣơng khoang cơ bản giảm một nưa), bổ sung than hoat tính
và casein hydrosylate 100 mg/l [3].
2.1.8. Tầm quan trọng
2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh thái
Drosera burmanni Vahl thƣờng moc ở đất chua, vung bac màu nên là loài
chỉ thi cho vung đất chua, bac màu [14], [37].
2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật
Ho Droseraceae là một đối tƣơng điên hình cho cac nghiên cứu vê qua trình
tiến hoa ở thưc vât, bao gồm những thí nghiệm vê phat triên và sinh lý hoc nhằm
nghiên cứu vai trò chuyên biệt cua cac chất điêu hòa sinh trƣởng thưc vât trong tiến
hoa hình thai ở mức vĩ mô. Bên canh đo, giống Drosera bao gồm rất nhiêu loài
thích nghi vơi từng điêu kiện môi trƣờng khac nhau nên rất thích hơp cho những
nghiên cứu vê sư thích nghi cấu truc và chức năng (bao gồm dinh dƣơng từ côn
trung và sư sản sinh mầm) trong cac điêu kiện môi trƣờng khac nhau. Ngoài ra, hat
phấn cua giống cây này đƣơc tổ chức cố đinh thành bộ bốn, là trang thai chuyên tiếp
từ hình thức giao phấn sang tư thu phấn trong qua trình tiến hoa cua hệ thống thu
phấn ở thưc vât.
2.1.8.3. Giá trị dƣợc tính
Cho đến nay đã co nhiêu nghiên cứu chứng minh tiêm năng vê gia tri dƣơc
tính cua Drosera (Bảng 2.3). Trong đo quan trong nhất là cac quinone, đặc biệt là
plumbagin, 7-methyljuglone và cac flavonoid.
Cac hơp chất quinone đƣơc tìm thấy co khả năng chữa cac căn bệnh hô hấp ở
ngƣời nhƣ: hen suyễn, viêm phổi, ho gà và lao. Chung cũng co khả năng chống lai
cac virus, nấm, khuẩn và chống ung thƣ. Tiêu biêu trong nhom này là plumbagin và
7-methyljuglone [29].
Page 27
13
Ngoài quinone, cac flavonoid ly trích từ Drosera cũng co gia tri dƣơc tính
cao nhƣ khả năng ức chế enzyme và chống oxi hoa. Một số flavonoid co ảnh hƣởng
lơn đến chức năng cua hệ miễn dich. Tiêu biêu nhom này co thê kê đến quercetin và
myricetin. Chung là những chất ức chế hiệu quả cac enzyme glyoxylase mà những
enzyme này giữ vai trò rất quan trong trong việc điêu hòa sư phân chia tế bào bằng
cach giải độc -ketoaldehyde. Trong y dƣơc, quercetin đƣơc sư dung đê ngăn ngừa
và điêu tri ung thƣ, no cũng co khả năng ức chế hoat tính gây đột biến gen cua
benzopyrene, một hydrocacbon nhiêu nhân thơm gây ung thƣ tiêu biêu.
Bảng 2.3: Dƣơc tính và cac hoat tính ứng dung khac cua dich chiết Drosera [29]
HOẠT TÍNH TÀI LIỆU THAM KHẢO
Chống lão hoa và xơ cứng động mach Grieve (1959)
Ức chế độc tô Harborne (1982)
Chống hen suyễn Frenzer (1980)
Chống ung thƣ Kreher và ctv (1990); Fujii và ctv (1992)
Ngừa thai, pha thai Bhargava (1984); Bhagava và ctv (1985)
Chống nhiễm nấm Békésiova (1997)
Ngừa hui, phong Bokemo (1984)
Chống vi khuẩn Lloyd và ctv (1994); Fujii và ctv (1992)
Chống đột biến Farr và ctv (1985); Durga và ctv (1992)
Ngừa giun lãi Fetterer và ctv (1991)
Chống co thăt Juniper và ctv (1989)
Chống virut Walt (1972)
Tim mach Itoigawa và ctv (1991)
Dung làm my phẩm Slack (1980)
Miễn nhiễm Kreher và ctv (1990)
Diệt côn trung Gujar và ctv (1988); Joshi và ctv (1989)
Chống vi trung lao Gundidza và ctv (1990)
Chống ho gà Weiss (1991); Ragazzi và ctv (1993)
Page 28
14
Ở Vân Nam (Trung Quốc) Drosera burmanni Vahl (tên thông thƣờng là cẩm
đia la) đƣơc dung đê chữa bệnh viêm ruột, li, sƣng, đau hong, ho do phổi nong,
khac ra mau, đổ mau mũi và trẻ em bi cam tích. Ở Quảng Tây, cây dung đê tri đòn
ngã, tổn thƣơng và bệnh mê đay [15].
Năm 1958 - 1959, bệnh viện Vinh dung D. burmanni Vahl dƣơi nhiêu dang
khac nhau (rƣơu thuốc, xi-rô, thuốc hãm, thuốc cao) đê chữa bệnh ho gà [2].
Drosera burmanni Vahl cũng đƣơc công nhân là co gia tri trong việc chữa
cac bệnh kiết li, lao hach, cam tích (suy dinh dƣơng nhƣng bung chƣơng to ở trẻ
em) [9], [10].
2.1.8.4. Ưng dụng trong công nghiệp
Ở một số nơi trên thế giơi, dich chiết Drosera đƣơc dung làm đông tu sữa do
giàu hàm lƣơng acid hữu cơ và enzyme. Ngoài ra săc tố cua một số loài Drosera
còn đƣơc dung đê nhuộm vải [39].
Page 29
15
2.1.8.5. Giá trị kinh tế
Sư đa dang vê giống loài, sư la măt vê hình thai khiến Drosera đem lai gia tri
kinh tế rất cao trong thi trƣờng hoa cảnh thế giơi (Hình 2.6) [42].
Hình 2.6: Môt sô loai Drosera co gia tri kinh tế cao trên thế giơi [42].
D. brevicornis D. aliciae D. capensis D. capensis
D. paleacea D. sewelliae D. pulchella D. pulchella
D. villosa D. villosa D. fimbriata
D. fimbriata
D. binata
D. binata
D. falconeri
D. erythrorhiza
Page 30
16
2.1.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
Trong nƣớc
Đô Đăng Gia p (2003) đã khảo sat, thu thâp, thuần dƣơng và thư nghiệm in
vitro những loài cây băt mồi ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣơc Bưu [1].
Trần Thi Bích Chiêu (2004) khảo sat vòng đời và tai tao chồi từ phat hoa cây
Drosera burmanni Vahl [13].
Quach Ngô Diễm Phƣơng (2006) hoàn thiện qui trình nuôi cấy in vitro cây
Drosera indica L và khảo sat hoat tính sinh hoc cua hơp chất naphthoquinone co
hoat tính sinh hoc đƣơc tach chiết từ cây [12].
Hồ Thuy Bích Tuyên (2006) ly trích và khảo sat hoat tính sinh hoc cua hơp
chất quinone từ cây Drosera burmanni Vahl nuôi cấy in vitro [3].
Nguyên Đai Hai (2006) đa n uôi cây mô cây băt ruôi (Drosera burmanni
Vahl) và khảo sat hoat tính khang khuẩn cua hơp chất chiết thô plumbagin [5].
Thế giới
K. Javaram và M. N .V Prasad (2005) đã công bố nhân nhanh chồi cây
Drosera burmanni Vahl trong môi trƣờng MS co bổ sung 2 mg/l Kn và 1 mg/l BA.
Sư tai sinh cây hoàn chỉnh từ phat hoa cũng đƣơc quan sat trên môi trƣờng vơi nồng
độ Kinetin thấp hơn (1 mg/l). Sư ra rễ cũng đƣơc thưc hiện thành công trên môi
trƣờng MS cơ bản [24].
Mejia Hersikorpi và cac cộng sư (2002) đã nhân giống thành công cây
Drosera rotundifolia từ la cua no và tao ra đƣơc cum chồi đat 20 - 30 chồi trên môi
trƣờng MS co bổ sung 0,45 mg/l BA và 0,37 mg/l NAA [5].
Kawiak A., Krolika A. và Lojokowska E. tai sinh D. anglica, D. binata đat
số chồi lơn nhất trên môi trƣờng Vacin và Went không co chất điêu hòa sinh
trƣởng, đối vơi D. anglica là môi trƣờng Fast bổ sung 0,05 M 6-benzyladenine
(BA) và 0,005 M -napthaleneacetic acid (NAA), còn môi trƣờng nhân chồi tối ƣu
cho D. cuneifolia MS 1/2 bổ sung 0,2 M BA và 0,2 M NAA. Môi trƣờng long
làm gia tăng đang kê khả năng nhân chồi cua mẫu cấy D. anglica và D. binata [25].
Page 31
17
Ingrid L. I. Hook (2001) đã nuôi cấy D. binata, D. rotundifolia, D. capensis
trong cả môi trƣờng MS long và co agar; nuôi cấy dich huyên phu D. rotundifolia
trên môi trƣờng Gamborg’s B5; nuôi dich huyên phu D. capensis trong môi trƣờng
MS và McCowns Woody Plant (McC) [23].
Jozep Nahalka và cộng sư đã tao mô seo và nuôi cấy thành công dich huyên
phu đê thu nhân plumbagin từ cây Drosophyllum lusitanicum trên môi trƣờng MS
bổ sung 1 mg/l IBA và 0,5 mg/l NAA [28].
2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phu tế bào để thu nhận hợp chất
thứ cấp
2.2.1. Khái niệm hợp chất thứ cấp
Hơp chất thứ cấp hay sản phâm trao đổi bâc hai là những sản phẩm đƣơc tao
ra trong tế bào nhờ cac qua trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào, sau đo chung
thoat ra khoi tế bào đi ra môi trƣờng ngoài.
Phần lơn cac sản phẩm bâc hai thƣờng không co nhiêu ý nghĩa sinh lý đối
vơi bản thân tế bào . Qua trình tao ra cac sản phẩm bâc hai chỉ thông qua những cơ
chế chuyên hoa rất tư nhiên cua tế bào, cũng co thê do sư sai lệch vê thông tin di
truyên trong tế bào dẫn đến hiện tƣơng sinh tông hơp thừa [7].
Cac loai hơp chất thứ cấp bao gồm những nhom chính sau:
Cac hơp chất trao đổi thứ cấp chứa nitrogen gồm: alkaloid, cac độc
chất chứa nitơ đã đƣơc glycosyl hoa, cac amino acid không phải
protein,…
Cac chất trao đổi co phenol, isoprenoid, cac polyketide.
Con đƣờng tổng hơp ra chung đƣơc trình bày trong sơ đồ 2.1 [43].
Page 32
18
Hình cac nhom hơp chất thứ cấp chính trong thưc vât
Sơ đồ 2.1: Con đƣờng tổng hơp cac nhom hơp chất thứ cấp chính ở thưc vât [43].
2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo
2.2.2.1. Khái niệm mô sẹo
Mô seo là một khối tế bào không co tổ chức, hình thành từ cac mô hoặc cơ
quan đã phân hoa dƣơi điêu kiện đặc biệt (vết thƣơng, xư lý vơi cac chất điêu hòa
sinh trƣởng thưc vât…).
Mô seo co thê đƣơc kích thích tao ra trong ống nghiệm bằng cach đƣa một
mẫu nho cua cây lên môi trƣờng vô trung co bổ sung hormone. Dƣơi tac dung cua
cac hormone kích thích nội sinh hoặc cac hormone nhân tao, qua trình trao đổi chất
Page 33
19
cua tế bào sẽ thay đổi và băt đầu hoat động phân bào. Vì vây khi co sư mất cân bằng
vê cac nồng độ hormone sinh trƣởng trong thưc vât thì mô seo hình thành. Khối mô
seo co khả năng tai sinh thành cây hoàn chỉnh trong điêu kiện môi trƣờng không co
chất kích thích tao mô seo [7].
2.2.2.2. Ưng dụng của nuôi cấy mô sẹo
- Nhân giống in vitro cac loài thưc vât mà phƣơng phap nhân giống đỉnh sinh
trƣởng ít hiệu quả hay kho thưc hiện.
- Nghiên cứu qua trình hình thành cơ quan.
- Làm nguồn nguyên liệu đê nuôi cấy tế bào đơn cho chon loc dòng tế bào.
- Thu nhân cac sản phẩm hoat chất thứ cấp co hoat tính sinh hoc cao.
- Nuôi cấy huyên phu tế bào.
2.2.3. Nuôi cây dich huyên phu
2.2.3.1. Khái niệm huyền phu tế bào
Huyên phu tế bào là một môi trƣờng long đƣơc lăc liên tuc, trong đo co sư
hiện diện cua cac tế bào soma cô lâp hoặc những cum nho cac tế bào co khả năng
sinh phôi co thê tai sinh thành một thưc vât nguyên ven [7].
2.2.3.2. Nguyên tắc tao huyền phu
Huyên phu đƣơc tao ra từ những mảnh mô seo trong một môi trƣờng long
đƣơc lăc liên tuc. Muốn cho huyên phu đƣơc tốt thì phải tao đƣơc mô seo tốt tức là
mô seo phải bao gồm cac tế bào co khả năng sinh phôi. Trong qua trình tao huyên
phu, những điêu kiện sinh trƣởng nhƣ môi trƣờng dinh dƣơng, anh sang, nhiệt độ
hay thành phần cac chất kích thích cũng tƣơng tư nhƣ luc tao mô seo hoặc nếu co
thay đổi thì chỉ thay đổi rất ít.
Trong môi trƣờng long, từ mô seo co thê phong thích ra những tế bào riêng
lẻ hay những cum tế bào từ vài chuc đến cả trăm tế bào giup tăng diện tích hấp thu
cac chất dinh dƣơng trong môi trƣờng nuôi cấy. Ngoài ra hoat động cua may lăc
cũng giup cho sư trao đổi khí giữa môi trƣờng và tế bào đƣơc thuân lơi hơn.
Một huyên phu tế bào đƣơc cho là lý tƣởng khi no là một dich min, hầu nhƣ
gồm những yếu tố co khả năng sinh phôi, noi cach khac là những tế bào cô lâp hay
Page 34
20
hơp thành từng nhom nho từ vài đến khoảng 20 tế bào co khả năng duy trì tính toàn
năng và tiến hoa thành phôi soma trên môi trƣờng tai sinh trong điêu kiện thích hơp.
2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tao huyền phu tế bào [7]
- Hệ thống nuôi cấy.
- Ánh sang, nhiệt độ.
- Mât độ tế bào khởi đầu.
- Môi trƣờng nuôi cấy.
- Vai trò cua cac chất điêu hòa sinh trƣởng thưc vât
- Sư tăng trƣởng và cấy chuyên huyên phu tế bào.
- Điêu kiện môi trƣờng.
- Cum tế bào trong dich huyên phu.
2.2.3.4. Các phƣơng pháp nuôi cấy huyền phu hiện nay [6], [20]
Co nhiêu phƣơng phap nuôi cấy huyên phu tế bào khac nhau đã đƣơc phat
triên, nhƣng co hai phƣơng phap chính :
Nuôi cấy gián đoan
Tế bào thưc vât đƣơc nuôi trong một thê tích (100 ml - 10 lít) hôn hơp môi
trƣờng. Trong giai đoan phat triên cua tế bào, số lƣơng tế bào ban đầu gia tăng cho
đến khi dinh dƣơng trong môi trƣờng can kiệt hoặc co sư tích lũy chất trao đổi đến
mức kìm hãm. Cac môi trƣờng nuôi cấy quy mô nho đƣơc chuyên động liên tuc trên
may lăc hay trong bình phản ứng đƣơc phối trộn đêu. Môi trƣờng trong bình chứa
thƣờng chiếm 1/5 thê tích. May lăc đƣơc điêu chỉnh ở vân tốc 30 - 180 vòng/phut
biên độ 3 cm. Phƣơng phap này đƣơc sư dung rộng rãi trong phòng thí nghiệm.
Nhƣơc điêm cua phƣơng phap là không sư dung trong nghiên cứu dài han vê
sư phat triên tế bào và sư trao đổi chất, kho nhân đƣơc sư ổn đinh trong sản xuất.
Cac tế bào nuôi cấy gian đoan không đồng nhất vê kích thƣơc và cấu tao. Đê
đảm bảo yêu cầu nuôi cấy phải cấy chuyên thƣờng xuyên quần thê tế bào vào môi
trƣờng mơi sau những khoảng thời gian bằng nhau.
Page 35
21
Hình 2.7: Hệ thống nuôi cấy gian đoan qui mô nho trên cac may lăc [44].
Nuôi cấy liên tục
Đây là một phƣơng phap quan trong đƣơc dung đê sản xuất hơp chất sơ cấp
hay thứ cấp trên quy mô lơn. Ky thuât này đòi hoi phải co hệ thống thiết bi phức
tap. Sư chuyên động cua môi trƣờng nuôi cấy lơn trong cac bồn phản ứng sinh hoc
đƣơc thưc hiện bằng cach khuấy vơi một turbin và (hoặc) suc không khí vô trung
vào môi trƣờng từ dƣơi đay. Phƣơng phap nuôi cấy này cho phép giữ vô trung cả hệ
thống trong một thời gian dài.
Hình 2.8: Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm [45].
Page 36
22
2.2.3.5. Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất các
hợp chất thứ cấp
- Chất điêu hòa sinh trƣởng (hormone thưc vât) bao gồm cac auxin nhƣ:
IAA, NAA, 2,4-D ; cac cytokinin nhƣ: BAP, kinetin…
- Nguồn đam.
- Nguồn carbon.
- Ánh sang.
- Cac yếu tố khac: pH môi trƣờng, nồng độ phosphate, cac loai khí (O2, CO2, …)
2.2.4. Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy
huyền phu [22]
Cac phƣơng phap gia tăng sư sản xuất hơp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyên
phu co thê kê đến:
2.2.4.1. Tối ƣu hoá điều kiện nuôi cấy
Khả năng tổng hơp cac hơp chất thứ cấp cua tế bào co thê chiu ảnh hƣởng
bởi nhiêu yếu tố vât lý (nhƣ nhiệt độ, độ thông khí, tốc độ lăc, anh sang, pH…) và
hoa hoc (nhƣ chất điêu hoà tăng trƣởng thưc vât), thành phần cac chất trong môi
trƣờng nuôi cấy…Tuỳ từng loai tế bào mà sư đap ứng vơi cac yếu tố kê trên sẽ khac
nhau. Khi xac đinh đƣơc điêu kiện nuôi cấy tối ƣu thì sư sản xuất và tích luy cac
hơp chất thứ cấp trong tế bào in vitro sẽ cao hơn so vơi cây trồng ngoài thiên nhiên.
Phƣơng phap này đã đat đƣơc thành công lơn trong trƣờng hơp cua shikonin
và berberine [31].
2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao
Hệ thống tế bào nuôi cấy là một quần thê tế bào co nhiêu kiêu gen khac
nhau, do đo cac đặc tính sinh lý cua tế bào sẽ khac nhau. Phƣơng phap chon loc
dòng tế bào là một ky thuât hữu hiệu đê tăng sản lƣơng cac hơp chất thứ cấp.
2.2.4.3. Bổ sung tiền chất
Sư bổ sung cac tiên chất hữu cơ xuất phat từ quan niệm cho rằng những hơp
chất này co thê là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu cua một con đƣờng sinh
tổng hơp cac sản phẩm thứ cấp nào đo. Sư bổ sung cac tiên chất cua qua trình sinh
Page 37
23
tổng hơp cac hơp chất thứ cấp mong muốn vào môi trƣờng nuôi cấy giup nâng cao
hiệu quả sản xuất cua tế bào trong một số trƣờng hơp xac đinh. Phƣơng phap này sẽ
co gia tri khi gia thành cua cac tiên chất không qua đăt.
2.2.4.4. Cố định tế bào
Trong li nh vưc nuôi cấy tế bào thưc vât đê thu nhân cac sản phẩm thứ cấp,
việc cố đinh tế bào giup kéo dài thời gian sư dung, đặc biệt là trong cac hệ thống
phản ứng sinh hoc. Mặt khac, những tế bào cố đinh ít bi tac động bởi điêu kiện môi
trƣờng hơn so vơi tế bào tư do. Tế bào cố đinh thƣờng là những tế bào co khả năng
tiết cac sản phẩm thứ cấp ra môi trƣờng ngoài. Tế bào ở trang thai cố đinh đôi khi
tao ra đƣơc cac hơp chất thứ cấp co sản lƣơng cao hơn tế bào ở trang thai lơ lững tư
do. Cac chất đƣơc sư dung đê cố đinh tế bào là agarose, carageenan, alginate, agar,
cac sơi propylen,… Sư cố đinh tế bào giup tăng sản xuất cac hơp chất thứ cấp
nhƣng cũng không loai trừ khả năng chính những chất cố đinh lai là tac nhân kích
thích sư sản xuất cac hơp chất thứ cấp.
2.2.4.5. Cảm ứng sự phân hoá mô
Dich treo tế bào thƣờng đƣơc sư dung đê thu nhân cac sản phẩm thứ cấp.
Tuy nhiên, gần đây, nhiêu nghiên cứu đã thành công trong việc nuôi cấy những mô
đã phân hoa nhƣ nuôi cấy thân, chồi, hay rễ tơ,…nhằm thu nhân hơp chất thứ cấp.
Cac nghiên cứu chứng minh rằng co mối quan hệ mât thiết giữa sư sản xuất cac hơp
chất thứ cấp vơi sư phân hoa tế bào và sư phat sinh hình thai cua thưc vât.
2.2.4.6. Nhân tô cam ƣng (elicitor)
Theo Rhoberts và Shuler (1999), tiến trình cảm ứng biêu hiện gene cua cac
enzyme xuc tac tổng hơp cac chất biến dƣơng thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thưc vât
đƣơc biết đến nhƣ là sư cảm ứng (elicitation) [26]. Elicitation trong sản suất hơp
chất thứ cấp cua tế bào thưc vât xảy ra do sư tiếp xuc giữa tế bào thưc vât vơi cac
biotic và abiotic elicitor. Thuât ngữ “elicitor” đƣơc sư dung đầu tiên cho cac tac
nhân kích thích bất kỳ dang phản ứng phòng vệ nào cua cây vơi cac bệnh lý xuất
hiện trên đồng ruộng. Thưc vât co thê sản xuất ra cac chất khang sinh biến dƣơng
thứ cấp nhƣ cac phytoalexin trong cac phản ứng chống lai sư tấn công cua vi khuẩn.
Page 38
24
Hình 2.9: Săc ky côt [47].
Do đo, cac vi sinh vât (đặc biệt là nấm và cac thành phần cua chung) đã đƣơc sư
dung rộng rãi đê cảm ứng sản xuất hơp chất thứ cấp trong tế bào thưc vât [18].
2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn
2.3.1. Phƣơng pháp ly trích - thu nhận hợp chất [8]
2.3.1.1. Sắc ký cột
Luân văn sư dung hệ thống săc ký cột hở vơi chất hấp thu là silica gel trong
qui trình ly trích và thu nhân hơp chất anthraquinone (Hình 2.9).
Khái niệm
Săc ký cột hở là một hệ thống vât lý trong đo co một cột đƣơc nap chặt chẽ
bởi một chất hấp thu và co một pha long di động chảy xuyên ngang qua. Tuy thuộc
và loai chất hấp thu đê nap cột và pha động, ngƣời ta phân biệt một số cơ chế tach:
săc ký hấp thu, săc ký phân chia, săc ký trao đổi ion, săc ký loc gel, săc ký ai lưc…
Nguyên tắc của sắc ký cột
Săc ký cột căn cứ trên khả năng mà phân tư chất tan co thê tƣơng tac vơi
pha tĩnh. Những tƣơng tac này sẽ lần lƣơt làm châm sư di chuyên cua những chất
tan khac nhau, khi chung di chuyên xuyên qua chất hấp thu đê ra khoi cột. Cac
Page 39
25
tƣơng tac giữa chất tan vơi pha động và pha tĩnh co thê là nối hydrogen, nối Val der
Waal, tƣơng tac lƣơng cưc - lƣơng cưc, tƣơng tac acid - bazơ, sư tao phức. . .
Chất hấp thụ silica gel
Silica gel là polimer ba chiêu cua những tứ diện oxid silicon SiO2.H2O. Đây
là những nguyên liệu co lô rông. Hat silica gel sư dung cho săc ký cột co diện tích
bê mặt khoảng 100 - 800 m2/g, đƣờng kính hat trung bình là 40 - 200 m và cac lô
rông trên bê mặt co đƣờng kính trung bình 40 - 300 A0.
Trên bê mặt cac hat silica gel co mang những nhom silanol-OH. Đây là trung
tâm hoat động co thê tao nên những nối hydrogen manh vơi những hơp chất đƣơc
săc ký. Vì thế, những hơp chất nào co khả năng tao nối hydrogen manh hơp chất đo
sẽ bi silica gel giữ manh lai trong cột. Nhƣ vây những hơp chất phân cưc manh co
chứa nhom chức acid carboxilic, amin, amid sẽ hấp thu manh vào silica gel trong
khi những hơp chất kém phân cưc nhƣ alkan, terpen (những hơp chất không chứa
cac nhom chức co thê tao nối hydrogen) sẽ ít bi giữ. Ngoài ra một hơp chất co thê bi
silica gel giữ lai manh hay yếu còn phu thuộc vào độ phân cưc cua dung môi ly giải.
Nguyên tắc cơ bản khi sử dụng sắc ký cột
Lưa chon dung môi giải ly: trong loai săc ký cột hấp thu, hơp chất không
phân cưc sẽ đƣơc ly giải khoi cột trƣơc, hơp chất phân cưc đƣơc giải ly sau. Thông
thƣờng ngƣời ta băt đầu bằng dung môi không phân cưc đê loai tƣơng đối cac hơp
chất không phân cưc ra khoi cột và tăng dần độ phân cưc cua dung môi giải ly đê
đuổi cac hơp chất co tính phân cưc manh hơn. Nhƣng nếu thay đổi dung môi phân
cưc hơn một cach đột ngột sẽ làm gãy cột.
Kích thƣơc cột và lƣơng mẫu chất: Kích cơ cua cột tuy thuộc vào số lƣơng
mẫu chất cần phân tach. Kích thƣơc cột cần đat tỷ lệ vê chiêu cao – đƣờng kính là
8:1. Trong lƣơng chất hấp thu và trong lƣơng mẫu phải tuân theo một tỷ lệ tƣơng
ứng. Trung bình thì trong lƣơng chất hấp thu phải lơn hơn 25 - 50 lần trong lƣơng
cua mẫu cần săc ký (tính theo trong lƣơng). Tuy nhiên, vơi những hôn hơp mà cac
hơp chất không dễ dàng tach riêng thì cần sư dung cột lơn hơn vơi số lƣơng chất
hấp thu nhiêu hơn (lơn hơn 100 - 500 lần).
Page 40
26
Hình 2.10: Mô hinh săc ky nhanh côt khô [8].
2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry – Column Flash Chromatography) [8]
Khái niệm
Săc ký nhanh cột khô là một biến đổi cua săc ký cột nhanh, sư dung ap suất
kém đê gia tăng vân tốc ly giải cua pha động. Ky thuât này khac vơi săc ký nhanh là
cột săc ký đƣơc rut khô sau môi phân đoan thu đƣơc.
Chất hấp thụ
Sư dung silica gel loai dung cho săc ký lơp mong (Merk 60H hoặc 60 G; tức
40 - 15 m hoặc alumina loai dung cho săc ký lơp mong (10 m, diện tích bê mặt
riêng lơn: 500 m2.g
-1).
Mô tả hệ thống
- Phễu loc xốp bằng thuy tinh. Độ xốp cua lô thuộc loai 3 hoặc loai D. Phễu
co đu kích cơ lơn nho (loai 100; 150; 250; 500 ml…) thích hơp vơi lƣơng mẫu cần
săc ký (Bảng 1.4).
- Bình tam giac.
- Hệ thống tao ap suất bằng vòi nƣơc (20 - 70 mmHg; chỉ cần ap suất vừa
phải).
Page 41
27
2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế [8]
Khái niệm
Săc ký lơp mong còn goi là săc ký phẳng (planar chromatography), là ky
thuât phân bố răn - long, trong đo pha động là chất long đƣơc cho đi ngang qua một
lơp chất hấp thu trơ (ví du silica gel hay alumina) chất hấp thu này đƣơc trang thành
một bản mong, đêu, phu lên một nên phẳng nhƣ tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm
plastic.
Do chất hấp thu đƣơc trang thành một lơp mong nên phƣơng phap này goi là
săc ký bản mong.
Một hơp chất tinh chất khi săc ký bản mong sẽ cho một vết, vơi gia tri Rf
không đổi trong một hệ dung môi ly giải xac đinh, bởi bảng săc ký cua một lô sản
xuất nhất đinh.
Vơi: Khoảng cach di chuyên cua hơp chất
Rf =
Khoảng đƣờng di chuyên cua dung môi
Gia tri Rf không bao giờ lơn hơn 1 và thay đổi tuy theo: loai chất hấp thu
dung đê trang bản mong, thành phần dung môi giải ly, độ bão hòa dung môi, ky
thuât ly giải.
Hình 2.11: Săc ký lơp mong [46].
Page 42
28
Ƣu điểm
Ƣu điêm cua săc ký bản mong điêu chế vơi săc ký cột là: nhanh, dễ tìm đƣơc
dung môi thích hơp đê giải ly tach tốt cac chất; cac vung co chứa chất cần thiết sẽ tu
lai thành lơp mong dễ dàng phat hiện, dễ dàng cô lâp chất. Sở dĩ săc ký lơp mong
tach tốt là nhờ tỷ lệ lơn giữa “chất tach : chất hấp thu silica gel” (1:1000 đến 1:
10.000) trong khi tỷ lệ này ở săc ký cột là 1:50.
Nhƣợc điểm
Chỉ sư dung đƣơc săc ký điêu chế khi hôn hơp chất cần tach chỉ chứa khoảng
4 thành phần chính và co trong lƣơng nho vài trăm miligram; còn nếu co một mẫu
chất vài gram thì nên sư dung săc ký cột vì cac bảng săc ký điêu chế rất đăt tiên.
2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lƣợng hợp chất thứ cấp
Nguyên tắc
Nguyên tăc cua ky thuât săc ký long cao ap HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) dưa trên sư phân bố cua chất tan giữa hai chất long không trộn
lẫn vào nhau khi cho một chất long di chuyên (pha động) qua một chất long đứng
yên (pha tĩnh). Pha tĩnh bi hấp thu trên bê mặt chất răn (chất mang). Thông thƣờng
pha tĩnh là dung môi phân cưc, pha động thƣờng là nƣơc hoặc dung môi hữu cơ.
Đôi khi pha tĩnh là cac chất long ít phân cưc luc đo pha động phải là dung môi ít
phân cưc hơn.
Page 43
29
Các bộ phận chính của máy HPLC
Ưng dụng của sắc ký lỏng cao áp
Phƣơng phap HPLC co khả năng tach cac chất đặc thu nhƣ:
- Cac hơp chất cao phân tư, ion thuộc đối tƣơng nghiên cứu y hoc, sinh hoc.
- Cac hơp chất tư nhiên không bên, cac chất kém bên nhiệt, cac chất dễ nổ.
- Tach cac acid nucleic, dƣơc phẩm, steroit, vitamine, chất bảo quản thưc
phẩm, chất bảo vệ thưc vât, cac phenol, cac hydrocacbon trong dầu mo…
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ hoat động cac bộ phân cua may HPLC
Page 44
30
Ƣu điểm
Ngoài những ứng dung rộng rãi đã nêu ở trên, HPLC còn co những ƣu điêm
hơn săc ký long cổ điên nhƣ tốc độ nhanh, độ tach tốt, độ nhay cao, cột tach dung
đƣơc nhiêu lần, mẫu chất thu lai dễ dàng vì hầu hết cac detector không pha huy
mẫu.
Nhƣợc điểm
Xét vê đầu tƣ trang thiết bi lẫn phí tổn vân hành, HPLC là một ky thuât đăt tiên.
Page 45
31
Chƣơng 3
3. VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP
Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: từ thang 3/2007 đến hết thang 8/2007.
Đia điêm: cac thí nghiệm nuôi cấy mô đƣơc thưc hiện tai trai thưc nghiệm
sinh hoc, Đai hoc Khoa hoc Tư nhiên, Đai hoc Quôc gia thành phố Hồ Chí Minh.
Cac thí nghiệm đinh lƣơng hơp chất anthraquinone trong cây D. burmanni
Vahl đƣơc thưc hiện tai phòng săc ky, Viên Công nghê Sinh hoc và Công nghệ môi
trƣơng, Đai hoc Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh.
3.1. Nuôi cây mô seo, tao dịch huyền phu
3.1.1. Vật liệu
Nguồn giống
Nguyên liệu dung cho thí nghiệm là cây Drosera burmanni Vahl, do phòng
công nghệ sinh hoc thưc vât, Đai hoc Khoa hoc Tư nhiên thành phố Hồ Chí Minh
cung cấp. Cac mẫu thí nghiệm đồng nhất vê mặt di truyên (Hình 3.1).
Hình 3.1: Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro.
Page 46
32
Môi trƣờng
- Môi trƣờng muối khoang MS (Murashige Skoog, 1962) (Phu luc 1) vơi
thành phần khoang đa lƣơng giảm 1/2 (ký hiệu là MS 1/2) bổ sung:
- Đƣờng: 30 g/l.
- Agar: 7 g/l.
- Than hoat tính: 1 g/l.
- Casein hydrosylate: 100 mg/l.
- pH = 5,8 ± 0,1 (trƣơc khi hấp khư trung).
- Hấp khư trung bằng autoclave ở 1210 C, 1 atm, 20 phut.
- Môi trƣờng muối khoang Gamborg’s B5 (phu luc) bổ sung :
- Vitamin B1= 0,4 mg/l.
- Vitamin B6 = 0,5 mg/l.
- Vitamin PP = 0,5 mg/l.
- PVP = 1,25 mg/l.
- Casein hydrosylate: 100 mg/l.
- Hormone tăng trƣởng thưc vât: NAA, 2,4-D, BA, IBA co nồng độ thay đổi.
Điều kiện nuôi cấy
- Thời gian chiếu sang: 16 giờ/ngày.
- Cƣờng độ chiếu sang: 3000 lux.
- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 22 – 250 C.
- Độ ẩm trung bình: 70 %.
Trang thiết bị và dụng cụ
- Trang thiết bi: tu cấy vô trung, nồi hấp vô trung, may đo pH, cân phân tích.
- Dung cu: chai nƣơc biên, đĩa petri, dao, kep cấy,…
Page 47
33
3.1.2. Phƣơng pháp
3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ
đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng
Mục đích thí nghiệm
Xac đinh thành phần khoang và nồng độ đƣờng thích hơp đê duy trì sư phat
triên cua mẫu cấy lơp mong TCL.
Bố trí nghiệm thức
Thí nghiệm đƣơc bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, gồm 12
nghiệm thức, môi nghiệm thức gồm 20 mẫu và đƣơc lâp lai ba lần. Kết quả là tri số
trung bình cua 3 lần lâp lai.
Bảng 3.1: Bố trí nghiệm thức khảo sat ảnh hƣởng thành phần khoang và nồng độ
đƣờng lên sư phat triên mẫu cấy lơp mong
Loai môi trƣờng Nồng độ đƣờng (g/l)
5 10 20 30
MS A1 A2 A3 A4
MS 1/2 A5 A6 A7 A8
Gamborg’s B5 A9 A10 A11 A12
Chỉ tiêu theo dõi
Theo dõi kết quả sau 14 ngày dưa trên chỉ tiêu là tỷ lệ (%) số mẫu còn sống.
Chỉ tiêu này đƣơc xac đinh theo công thức:
Số mẫu còn sống
Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100
Tổng số mẫu cấy
Phƣơng pháp tiến hành
Cac bộ phân gồm thân, la non (lơp la thứ nhất hay thứ hai) và phat hoa cua
cây Drosera burmanni Vahl in vitro đƣơc căt thành cac lơp mong (từ 0,2 - 0,5 mm),
cấy vào cac nghiệm thức nhƣ đã bố trí.
Page 48
34
3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loai hormone thích hợp cho việc
kích ứng tao mô sẹo
Mục đích thí nghiệm
Tìm sư kết hơp cua cac loai hormone thích hơp nhất cho việc tao mô seo.
Bố trí nghiệm thức
Thí nghiệm đƣơc bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố,
gồm 3 nghiệm thức. Môi nghiệm thức tiến hành trên 45 mẫu và đƣơc lâp lai 3 lần,
kết quả là tri số cua 3 lần lâp lai.
Bảng 3.2: Bố trí nghiệm thức khảo sat sư kết hơp 2 loai hormone thích hơp cho
việc kích ứng tao mô seo
Cac loai hormone
kết hơp (mg/l)
NAA (0,2)
2,4-D (0,1)
[12], [23]
NAA (0,5)
IBA (1)
[28]
NAA (1)
BA (0,2)
[5]
Nghiệm thức
B1 B2 B3
Chỉ tiêu theo dõi
Theo dõi kết quả sau 14 ngày nuôi cấy dưa trên chỉ tiêu là tỷ lệ mẫu cấy tao
mô seo, vơi:
Tỷ lệ mẫu cấy tao mô seo
Tỷ lệ mẫu tao mô seo (%) = x 100
Tổng số mẫu cấy
Cách thực hiện
- Mẫu căt lơp mong cây D. burmanni Vahl đƣơc đƣa vào cac nghiệm thức
trong đo môi trƣờng co thành phần khoang và nồng độ đƣờng tối ƣu vơi mẫu cấy
lơp mong đã tìm đƣơc từ thí nghiệm 1.
- Ủ tối trong cac thung carton.
Page 49
35
3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp của 2,4-D khi kết hợp với
NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tao mô sẹo
Mục đích thí nghiệm
Tìm nồng độ thích hơp cua 2,4-D khi kết hơp vơi NAA (0,2 mg/l) đê cảm
ứng tao mô seo bằng phƣơng phap lơp mong tế bào TCL.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố, gồm 6
nghiệm thức trên môi loai vât liệu, môi nghiệm thức thưc hiện trên 12 mẫu và đƣơc
lâp lai 3 lần. Kết quả là tri số cua 3 lần lặp lai.
Bảng 3.3: Bố trí nghiệm thức khảo sat nồng độ thích hơp cua 2,4-D khi kết hơp
vơi NAA (0,2 mg/l) đê cảm ứng tao mô seo
Vât liệu đầu Nồng độ 2,4-D (mg/l)
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Phat hoa TCL C1 C2 C3 C4 C5 C6
Thân TCL C1’ C2’ C3’ C4’ C5’ C6’
La TCL C1” C2” C3” C4” C5” C6”
Chỉ tiêu theo dõi
Ghi nhân kết quả sau 21 ngày nuôi cấy vơi cac chỉ tiêu sau:
- Tỷ lệ mô seo tao thành
- Hình thai mô seo
Vơi Số mẫu tao seo
Tỷ lệ mẫu tao seo (%) = x 100
Tổng số mẫu cấy
Phƣơng pháp tiến hành
Mẫu căt lơp mong cua phat hoa, thân, la non đƣơc đƣa vào môi trƣờng co
nồng độ 2,4-D thay đổi và u tối 21 ngày trong cac thung carton.
Page 50
36
3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng
sinh khối mô sẹo
Mục đích
Tìm kiêu nuôi cấy thích hơp cho việc tăng sinh khối mô seo.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣơc bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố và
gồm 3 nghiệm thức. Môi nghiệm thức tiến hành trên 1 bình, 3 lần lâp lai. Kết quả là
gia tri trung bình cua 3 lần lâp lai.
Bảng 3.4: Bố trí nghiệm thức khảo sat ảnh hƣởng cua cac kiêu nuôi cấy lên sư tăng
sinh khối mô seo
Kiêu nuôi cấy Răn Ban răn Long tĩnh Long lăc
Nghiệm thức D1 D2 D3 D4
Chỉ tiêu theo dõi
Chỉ tiêu theo dõi là khối lƣơng mô seo gia tăng sau 21 ngày nuôi cấy quy vê
1 mg. Chỉ tiêu này đƣơc tính bằng công thức:
Δm = [(m21 - m0)/m0] (mg)
Trong đo :
Δm: khối lƣơng mô seo tăng từ 1mg ban đầu.
m0: khối lƣơng mô seo ban đầu.
m21: khối lƣơng mô seo sau 21 ngày nuôi cấy.
Phƣơng pháp tiến hành
Mô seo đƣơc cấy vào môi trƣờng vơi cac kiêu nuôi cấy khac nhau, bổ sung
hormone tăng trƣởng là 2,4-D và NAA vơi sư kết hơp hai nồng độ tối ƣu ở thí
nghiệm 3. Cac mô seo này đêu đƣơc cân khối lƣơng trƣơc khi cấy. Sau 21 ngày
nuôi cấy cân lai khối lƣơng mô seo và ghi nhân kết quả.
Cac kiêu nuôi cấy gồm:
- Kiêu nuôi cấy dang răn: môi trƣơng co bổ sung agar (7 g/l).
Page 51
37
- Kiêu nuôi cấy ban răn: môi trƣờng long, co bông gòn làm gia thê, không
lăc.
- Kiêu nuôi cấy long tĩnh: môi trƣờng long, không lăc.
- Kiêu nuôi cấy long lăc: môi trƣơng long, lăc vơi tốc độ 150 vòng/phut.
3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hinh thanh săc
tô đo của mô sẹo
Mục đích: Bƣơc đầu ghi nhân ảnh hƣởng cua anh sang lên sư hình thành săc
tố đo ở mô seo.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣơc bố trí theo kiêu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố
gồm 2 nghiệm thức. Môi nghiệm thức thưc hiện trên 10 mẫu mô seo, lâp lai 3 lần.
Kết quả là tri số trung bình cua 3 lần lâp lai.
Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sat ảnh hƣởng cua anh sang lên sư hình thành
săc tố đo ở mô seo
Điêu kiện nuôi cấy Chiếu sang 16h/ngày Ủ tối hoàn toàn
Nghiệm thức E1 E2
Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhân tỷ lệ hình thành săc tố đo ơ mô se o sau 21 ngày
nuôi cây.
Số mô seo hình thành săc tố đo
Tỷ lệ mô seo hình thành săc tố đo (%) = x 100
Tổng số mẫu cấy
Phƣơng pháp tiến hành
Cac mô seo đƣơc nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung hormone NAA và 2,4-D
ở nồng độ kết hơp tối ƣu (Thí nghiệm 3) trong hai điêu kiện u tối hoàn toàn và chiếu
sang 16 giờ/ ngày.
Page 52
38
3.2. Ly trich va cô lâp hơp chât anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl
3.2.1. Vật liệu
Nguồn mẫu
- Cây D. burmanni Vahl in vitro.
Hóa chất
- Silica gel (Merck)
- Benzene (Trung Quốc)
- Chloroform (Trung Quốc)
- Ether dầu hoa (Trung Quốc)
- Diethyl ether (Trung Quốc)
- Methanol (Trung Quốc)
- Thuốc thư Borntraeger ( KOH 5% trong methanol).
Trang thiết bị và dụng cụ
- Thiêt bi: may cô quay chân không , tu hut hoa chất, tu sấy, côt săc ky, săc
ký bản mong (Merck) …
- Dung cu: giấy loc, ống vi quản, chai bi, đũa thuy tinh, bao tay, khẩu trang,..
Page 53
39
3.2.2. Phƣơng pháp tiến hành
Hơp chất anthraquinone đƣơc ly trích và cô lâp theo quy trình cua Hồ Thi
Bích Tuyên (2006) [3].
Sơ đô 3.1: Quy trình ly trich va cô lâp hơp chât anthraquin one.
Hơp chât anthraquinone sau khi ly trich va tinh chê đƣơc sƣ dung lam chât
tham chiêu trong cac thi nghiêm đinh lƣơng băng HPLC .
Cây tƣơi
Cây khô
Bột cây
Cao thô ethanol
Sấy ở 500C
Nghiên
Ngâm dầm trong ethanol ít nhất 24 giờ,
Loc, cô quay chân không.
Săc ký nhanh cột khô vơi đơn dung
môi benzene
Săc ký cột ƣơt
vơi hệ dung môi
ether dầu hoa:chloroform (95:5)
Phân đoan cao benzene
Phân đoan chứa hơp chất
anthraquinone
Săc ký bản mong điêu chế nhiêu lân
Hệ dung môi benzene:chloroform (3:7)
Hơp chất anthraquinone
tinh khiết tƣơng đối
Page 54
40
3.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu nuôi cấy in
vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC
3.3.1. Vât liêu
Nguôn mâu
- Cây D. burmanni Vahl cac loai.
- Dich huyên phu cây D. burmanni Vahl tao đƣơc từ thí nghiệm 4.
Hóa chất
- Methanol (Prolabo)
- Acid acetic (Merck)
- Triethylamine (Merck)
- Anthraquinone (đa đƣơc ly trích va tinh chê trong phần 3.2.)
Trang thiêt bi va dung cu
- Thiêt bi : may săc ký long cao ap (HPLC), may đanh song siêu âm, may
nghiên mẫu khô, tu sấy, may ly tâm , cân phân tich,…
- Dung cu: giấy loc, đầu loc 0,2 m, cối sứ, bao tay, khẩu trang,…
3.3.2. Phƣơng phap
So sanh trưc tiếp diện tích peak cua mẫu thư vơi diện tích peak cua mẫu
anthraquinone tham chiếu tƣơng ứng co nồng độ xac đinh. Yêu cầu cua phƣơng
phap này là việc tiến hành săc ký HPLC mẫu tham chiếu và mẫu thư phải tiến hành
trong cung điêu kiện săc ký và vê nguyên tăc thời gian thưc hiện hai mẫu không
cach xa nhau.
3.3.2.1. Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp
Dưa trên cac thông số , điêu kiện mà Qua ch Ngô Diễm Phƣơng (2006) [12]
đã sư dung đê khảo sat hàm lƣơng plumbagin trong cây D. indica L bằng HPLC,
chung tôi đã chon cac điêu kiện thông số thích hơp đê chay HPLC nhƣ sau:
- Cột C18 ODS-Hypersil (25 cm x 4 mm).
- Pha động: 55% methanol, 45% acid acetic (0,02 M) đƣơc điêu chỉnh đến
pH 6 bằng triethylamine [17].
- Tốc độ dòng 0,4 ml/l.
Page 55
41
- Nhiệt độ cột bằng nhiệt độ phòng.
- Detector phat hiện ở bƣơc song ở 254 nm.
3.3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn
Cân chính xac khối lƣơng anthraquinone và pha loãng trong methanol tuyệt
đối thành cac nồng độ sau 14 ppm, 28 ppm, 42 ppm, 56 ppm, 70 ppm. Tiến hành
săc ký đê thu đƣơc cac peak chuẩn ở cac nồng độ trên. Xây dưng đƣờng chuẩn
tuyến tính biêu hiện sư biến thiên cua nồng độ anthraquinone theo diện tích peak.
3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định
lƣợng hợp chất anthraquinone
Mục đích
- Tìm cach xư lý mẫu thích hơp cho qui trình chay HPLC.
Bố trí nghiệm thức
- Hai mẫu đƣơc xư lý theo hai cach A và B (Sơ đồ 3.2) đƣơc đem đinh lƣơng
bằng HPLC.
Chỉ tiêu theo dõi
- Theo dõi khả năng tao tín hiệu trong săc ký đồ cua 2 mẫu đƣơc xư lý theo
quy trình A và B.
Phƣơng pháp tiến hành
- Cây D. Burmanni Vahl in vitro đƣơc chia thành hai nhom.
- Một nhom đƣơc xư lý theo quy trình A, một nhom xư lý theo qui trình B
trƣơc khi chay HPLC (Sơ đồ 3.2).
Page 56
42
u
Sơ đồ 3.2. Quy trình xư lý mẫu [32].
Page 57
43
3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các
bộ phận khác nhau của cây in vitro
Mục đích
- Xac đinh bộ phân cho lƣơng anthraquinone nhiêu nhất.
Bố trí thí nghiệm
Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong
cac bộ phân khac nhau cua cây in vitro
Chỉ tiêu theo dõi
- Ghi nhân săc ky đô và so sanh hàm lƣơng anthraquinone (% so vơi trong
lƣơng khô) trong mẫu thân la và mẫu rễ, theo công thƣc:
m1
Hàm lƣơng anthraquinone (%) = x 100
m2
Vơi:
m1: trong lƣơng hơp chất anthraquinone trong dung dich mẫu đem đo (mg).
m2: trong lƣơng khô mẫu đem đo (mg).
Phƣơng pháp tiến hành
- Cây in vitro đƣơc chia thành hai phần: phần thân la và phần rễ.
- Cây tƣơi môi loai đƣơc xư lý theo quy trình thích hơp tìm đƣơc từ thí
nghiệm 6.
- Tiến hành đinh lƣơng bằng HPLC.
Mẫu đinh lƣơng Mẫu thân la Mẫu rễ
Nghiêm thƣc X1 X2
Page 58
44
3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các
mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ
Mục đích
- Bƣơc đầu tìm hiêu mối liên hệ giữa săc tố đo cua cây và hàm lƣơng hơp
chất quinone.
Bố trí nghiệm thức
Bảng 3.7: Bố trí thí nghiệm so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong mẫu cây
co săc tố đo và không co săc tố đo
Mẫu phân tích Mẫu co săc tố đo Mẫu không co săc tố đo
Nghiêm thƣc Y1 Y2
Chỉ tiêu theo dõi
- Ghi nhân săc ký đồ và so sanh diện tích peak, hàm lƣơng anthraquinone cua
hai mẫu cây co và không co săc tố đo.
Phƣơng pháp tiến hành
- Cây D. burmanni đƣơc chia làm 2 loai: loai co săc tố đo và không co săc tố
đo.
- Cây tƣơi môi loai đƣơc xư lý theo quy trình xư lý mẫu thích hơp tìm đƣơc
từ thí nghiệm 6.
- Tiến hành đinh lƣơng bằng HPLC
Page 59
45
3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu dịch
huyền phu đã tao đƣợc từ thí nghiệm 4
Mục đích.
- Đinh lƣơng sơ bộ anthraquinone trong mẫu dich huyên phu.
Cách xử lý mẫu
Sơ đồ 3.3: Quy trình xư lý dich huyên phu.
3.4. Xử lý thống kê
Số liệu thu đƣơc từ tất cả cac thí nghiệm đƣơc xư lý thống kê bằng phần
mêm Stagraphic 7.0.
Dich huyên phu
Sinh khối tế bào
và mô seo
Dich môi trƣờng
Xac tế bào và
mô seo Dich chiết
Đinh lƣơng bằng
HPLC
Loc qua đầu loc
0,2 m
Đinh lƣơng bằng
HPLC
Loc qua đầu loc
0,2 m
Đanh song siêu âm
30 phut
Nghiên trong
methanol tuyệt đối
3 lần
Ly tâm
Page 60
46
Chƣơng 4
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
4.
4.1. Nuôi cấy mô sẹo tao dịch huyền phu
4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng
độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng
Tỷ lệ sống cua cac mẫu lơp mong từ cây D. burmanni trên cac môi trƣờng
khac nhau sau 14 ngày nuôi cấy đƣơc ghi nhân ở bảng 4.1, và biêu đồ 4.1.
Bảng 4.1: Tỷ lệ mẫu sống ở cac nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy
Loai môi trƣờng Nồng độ đƣờng (g/l)
5 10 20 30
MS 16,67 11,67 11,67 10
MS 1/2 8,33 18,33 11,67 18,33
Gamborg’s B5 13,33 20 36,67 13,33
Kêt qua trich tư phu luc 2.1
Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ mẫu lơp mong sống trên cac loai môi
trƣờng khac nhau sau 14 ngày nuôi cấy.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12
Nghiêm thưc
Ty lê
mâ
u s
ôn
g (
%)
Page 61
47
Nhận xét
Từ kết quả ở bảng 4.1, chung tôi tiến hành phân tích thống kê cho từng yếu
tố nhƣ sau:
Về thành phần khoáng
Thống kê bảng 4.2 cho thấy co sư khac biệt co ý nghĩa giữa việc sư dung môi
trƣờng Gamborg’s B5 vơi 2 loai môi trƣờng MS và MS 1/2. Môi trƣờng Gamborg’s
B5 cho tỷ lệ mẫu sống trung bình cao nhất (20,83%) và thấp nhất là môi trƣờng MS,
vơi tỷ lệ mẫu sống trung bình là 12,5%. Kết quả này cũng phu hơp vơi một số
nghiên cứu trên thế giơi chon môi trƣờng Gamborg’s B5 là môi trƣờng cơ bản đê
tao mô seo ở một số loài Drosera [12], [23].
Bảng 4.2: Anh hƣởng thành phần khoang lên sư phat triên cua mẫu cấy lơp mong
Loai môi trƣờng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu sổng
MS
MS 1/2
Gamborg’s B5
1, 2, 3, 4
5, 6, 7, 8
9,10,11, 12
12,50 a
14,17a
20,83 b
Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống
nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05).
Về nồng độ đƣờng
Qua bảng 4.3, chung tôi nhân thấy ở nồng độ đƣờng 20 g/l mẫu lơp mong
sống và phat triên đƣơc (20% mẫu sống) trong khi ở nồng độ đƣờng qua cao và qua
thấp mẫu mô đêu chết. Một đặc điêm thƣờng gặp ở phƣơng phap lơp mong tế bào là
mẫu mô kha nhay cảm vơi ap suất thẩm thấu. Ghi nhân thưc tế cho thấy, khi sư
dung nồng độ đƣờng cao cac mẫu mô sẽ bi chết đen và co xu hƣơng hơi co lai do
mất nƣơc.
Bên canh đo, kết quả bảng 4.1 và biêu đồ 4.1 cũng cho thấy tỷ lệ mẫu sống
thấp nhất ở nghiệm thức A5 (8,33%) (khi kết hơp sư dung loai môi trƣờng MS 1/2
vơi nồng độ đƣờng 5 g/l); trong khi tỷ lệ mẫu sống cao nhất ở nghiệm thức A11
(36,67 %) (Môi trƣờng Gamborg’s B5 vơi nồng độ đƣờng 20 g/l).
Page 62
48
Bảng 4.3: Anh hƣởng cua nồng độ đƣờng lên sư phat triên cua mẫu cấy lơp mong
Nồng đồ đƣờng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu sổng
5
10
20
30
1, 5, 9
2, 6, 10
3, 7, 11
4, 8, 12
12,78 a
16,67 b
20,00 c
13,89 ab
Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau
không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05).
Nhƣ vây khi kết hơp cả hai yếu tố ảnh hƣởng đến mẫu mô chung tôi chon
đƣơc môi trƣờng tốt nhất cho mẫu cấy lơp mong cây băt ruồi là môi trƣờng
Gamborg’s B5 vơi nồng độ đƣờng 20 g/l.
4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loai hormone thích hợp cho việc
kích ứng tao mô sẹo
Sau 2 tuần nuôi cấy, kết quả sư hình thành mô seo từ lơp mong tế bào cây D.
burmanni vahl trên môi trƣờng co nồng độ đƣờng và thành phần khoang chon từ thí
nghiệm 1, bổ sung cac loai hormone khac nhau đƣơc ghi nhân và trình bày trong
bảng 4.4.
Bảng 4.4: Tỷ lệ tao mô seo trên môi trƣờng co kết hơp 2 loai hormone khac nhau
Cac loai hormone
kết hơp (mg/l)
NAA (0,2)
2,4-D (0,1)
NAA (0,5)
IBA (1)
NAA (1)
BA (0,2)
Tỷ lệ mẫu tao seo 25,17 c 2,93
b 0
a
Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về
mặt thống kê (p < 0,05).
Nhận xét
Kết quả từ bảng 4.4 cho thấy co sư khac biệt rất co ý nghĩa vê mặt thống kê
giữa cac nghiệm thức sư dung hormone NAA/2,4-D; NAA/IBA; NAA/BA. Trong
đo sư kết hơp 2 loai NAA/BA cho kết quả thấp nhất (không co sư tao thành mô seo
mà chỉ co sư hình thành chồi trưc tiếp từ cac mẫu thân) và sư kết hơp 2 loai
hormone NAA/2,4-D cho kết quả tao mô seo tốt nhất (25,56%).
Page 63
49
Sư kết hơp cung luc 2 loai auxin đê tao mô seo ở một số loài Drosera đã
đƣơc ghi nhân trong một số nghiên cứu cả trong và ngoài nƣơc [12], [23], [28].
Thông thƣờng mô seo đƣơc tao thành khi co sư tac động đồng thời cua cả 2 loai
hormone auxin và cytokinin, trong đo hàm lƣơng auxin nhiêu hơn. Tuy nhiên ở một
số đối tƣơng, lƣơng auxin nội sinh thấp, mẫu mô cần lƣơng lơn hơn auxin đê cảm
ứng hình thành mô seo.
Tổng hơp cac ghi nhân và phân tích, chung tôi chon sư kết hơp 2 loai
hormone NAA/2,4-D cho việc cảm ứng hình thành mô seo từ lơp mong cac bộ phân
cây D. burmanni Vahl.
4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp của 2,4-D khi kết hợp với
NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tao mô sẹo
Bảng 4.5: Tỷ lệ mẫu tao seo trên cac môi trƣờng khac nhau sau 21 ngày nuôi cấy
Loai vât
liệu đầu
Nghiệm
thức
Nồng độ
2,4-D
(mg/l)
Tỷ lệ
mẫu tao
seo
Hình thai mô seo
Phát
hoa
C1 0 5,53 Mô seo hơi phình, đặc.
(Hình 4.1A)
C2 0,1 22,23 Mô seo xôp, đo, ít.
(Hình 4.1B)
C3 0,2 52,77 Mô sẹo xôp, vàng xanh, phình
to (Hình 4.1C).
C4 0,3 36,10 Mô seo xôp, vàng xanh.
C5 0,4 19,47 Mô seo hơi chai.
C6 0,5 22,23 Mô seo chai cứng (Hình 4.1D).
Thân
C1’ 0 0 Mẫu cấy hoa nâu.
C2’ 0,1 38,90 Mô seo vàng xanh, phần mẫu
cảm ứng ít (Hình 4.2A).
Page 64
50
C3’ 0,2 72,23
Mô sẹo xôp , vàng trăng có ít
đốm đỏ, phình to (Hình 4.2 B,
E).
C4’ 0,3 55,53 Mô seo xôp, vàng xanh vài mẫu
co đốm đo
C5’ 0,4 50 Mô seo vàng trăng, co đốm đo
hơi đặc . (Hình 4.2C).
C6’ 0,5 22,23 Mô seo vàng xanh, hơi chai cứng
(Hình 4.2D).
Lá
C1” 0 8,30 Mô seo đo, phần mâu cam ƣng it
(Hình 4.1E)
C2” 0,1 16,70 Mô seo xôp, màu vàng xanh
nhƣng ít.
C3” 0,2 27,77 Mô sẹo xôp, màu vàng xanh,
phình to (Hình 4.1F).
C4” 0,3 22,23 Mô seo đăc, màu vàng xanh xen
đôm đo (Hình 4.1G)
C5” 0,4 13,90 Mô seo vàng xanh co đốm đo ,
hơi chai cứng.
C6” 0,5 13,90 Mô seo đo, chai cứng.
(Hình 4.1H)
Kêt quả được trich từ phu luc 2.3
Nhận xét
Kết quả bảng 4.5 cho thấy, đối vơi cả 3 loai vât liệu đầu tỷ lệ mẫu tao mô seo
đêu thấp nhất ở nghiệm thức co môi trƣờng chỉ bổ sung NAA (0,2 mg/l). Trong khi
ở nghiệm thức bổ sung NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l) tỷ lệ tao seo lơn nhất ở cả
3 loai mẫu: 52,77% ở mẫu phat hoa TCL, 72,23% ở mẫu thân TCL, 27,77% ở mẫu
la TCL.
Page 65
51
Cac auxin đƣơc biết đến là co khả năng kích thích manh sư phân chia tế bào,
nên chung thƣờng đƣơc sư dung nhƣ loai hormone sơ cấp đê sản xuất mô seo. Cac
auxin thông dung hiện nay bao gồm IAA, IBA, NAA, 2,4-D co mức độ ảnh hƣởng
tăng dần, trong đo 2,4-D là chất sư sung hiệu quả nhất trong trong việc hình thành
mô seo [16]. Cac kết quả thưc nghiệm cũng cho thấy 2,4-D thƣờng cảm ứng tao mô
seo xốp hơn là NAA. Điêu này co lẽ là do 2,4-D cảm ứng sư phân chia tế bào manh,
cac tế bào phân chia liên tuc trong thời gian ngăn không kip đê tổng hơp vât chất
nên no thƣờng long lẻo. Vì muc đích thí nghiệm là tao mô seo đê nuôi dich huyên
phu vê sau (cần mô seo xốp) và do không đu thời gian đê dò nồng độ cua cả hai loai
hormone, chung tôi chon 2,4-D là loai hormone chính đê tao mô seo.
Bên canh đo bảng kết quả 4.5 cũng cho thấy, cac mẫu lơp mong từ long thân
cho tỷ lệ tao seo lơn nhất trong khi cac mẫu la thấp nhất. Kết quả này co lẽ là do đặc
điêm hình thai cua cây D. burmanni Vahl: bê mặt la cua chung mang nhiêu tua cuốn
khiến chung kho tiếp xuc vơi môi trƣờng; cac tua cuốn này lai chứa chất nhầy và
nhiêu loai enzyme thƣờng gây ảnh hƣởng không tốt đến cac mẫu mô.
Vơi những nhân xét trên, chung tôi chon nồng độ kết hơp tối ƣu cho việc tao
mô seo là NAA 0,2 mg/l và 2,4-D 0,2 mg/l cho moi loai vât liệu đầu từ lơp mong
cây D. burmanni Vahl.
Page 66
52
Phat hoa TCL
A: 2,4-D (0 mg/l)
B: 2,4-D (0,1 mg/l)
C: 2,4-D (0,2 mg/l)
D: 2,4-D (0,5 mg/l)
La TCL
E: 2,4-D (0 mg/l)
F: 2,4-D (0,2 mg/l)
G: 2,4-D (0,3 mg/l)
H: 2,4-D (0,5 mg/l)
Hình 4.1: Mô seo đƣơc hình thành từ mẫu lơp mong cây
D. burmanni Vahl trên môi trƣờng Gamborg’s B5, bổ
sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng độ thay đổi:
Page 67
53
Hình 4.2: Mô seo đƣơc hình
thành từ mẫu lơp mong long thân
cây D. burmanni Vahl trên môi
trƣờng Gamborg’s B5, bổ sung
NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng
độ thay đổi:
A: 0,1 mg/l
B: 0,2 mg/l
C: 0,4 mg/l
D: 0,5 mg/l
E: 0,2 mg/l (quan sat dƣơi
KHV 10 X)
Page 68
54
4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng
sinh khối mô sẹo và tao dịch huyền phu
Bảng 4.6: Khối lƣơng mô seo tăng từ 1 mg mô seo ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy
trên cac kiêu nuôi cấy khac nhau
Kiêu nuôi cấy Răn Ban răn Long tĩnh Long lăc
Độ tăng khối lƣơng
mô seo (mg) 2,01
a 2,35
b 1,97
a 2,91
c
Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau không có sự
khác biệt về mặt thống kê (p > 0.05)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
D1 D2 D3 D4
Kiêu nuôi cây
Đô
tăn
g k
hô
i lư
ơn
g m
ô s
eo
(m
g)
Nhận xét
Bảng 4.6 và biêu đồ 4.2 cho thấy co sư khac biệt rất co ý nghĩa vê mặt thống
kê ở độ tăng khối lƣơng mô seo trên 4 kiêu nuôi cấy khac nhau. Độ tăng khối lƣơng
mô seo ở kiêu nuôi cấy long lăc là tốt nhất 291% khối lƣơng ban đầu, kế đến là
kiêu nuôi cấy ban răn 235%, môi trƣờng răn 201%, cuối cung là môi trƣờng long
tĩnh 197%.
Biểu đồ 4.2: Khối lƣơng mô seo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21
ngày nuôi cấy.
Page 69
55
Hình 4.3. A: Mô seo nuôi trong môi trƣờng long lăc.
B: Cum tế bào quan sat dƣơi kính hiên vi 40X.
C: Tế bào đơn quan sat dƣơi kính hiên vi 40X.
Nhƣ vây, ở cac môi trƣờng dang long mô seo dễ hấp thu chất dinh dƣơng
hơn môi trƣờng dang răn. Tuy nhiên môi trƣờng ở dang long tĩnh do cac mẫu mô
seo hoàn toàn ngâp trong dich môi trƣờng, thiếu oxi nên sau một thời gian chung
ngừng tăng trƣởng và co dấu hiệu bi hoa đen. Trai lai, ở kiêu nuôi cấy long lăc, mô
seo vừa hấp thu chất dinh dƣơng dễ dàng vừa co sư trao đổi khí tốt hơn nên trong
lƣơng mô seo tăng lơn nhất.
Bên canh đo, nhân thấy rằng khi mô seo đƣơc nuôi cấy trong môi trƣờng
long mà co thêm chuyên động lăc liên tuc, cac mô seo xốp sẽ bi tach rời, tao cac
cum tế bào và tế bào đơn trong dich nuôi cấy. Đây chính là dang khởi đầu cua dich
huyên phu tế bào (Hình 4.3). Tuy nhiên do giơi han vê thời gian thưc hiện chung tôi
chƣa nghiên cứu đƣơc những yếu tố khac đê tối ƣu hoa dich huyên phu này mà mơi
chỉ ở bƣơc đầu tao đƣơc dich huyên phu.
Tom lai qua thí nghiệm trên chung tôi chon kiêu nuôi cấy long lăc là kiêu
nuôi cấy tốt nhất đê tăng sinh khối mô seo cũng nhƣ tao dich huyên phu tế bào.
.
A
C B
Page 70
56
4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hinh thành
săc tô đo của mô sẹo
Bảng 4.7: Kết quả ảnh hƣởng anh sang lên sư hình thành săc tố đo ở mô seo
Điêu kiện nuôi cấy Chiếu sang 16h/ngày Ủ tối hoàn toàn
Tỷ lệ mẫu mô seo co săc tố đo 100 a 0
b
Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về
mặt thống kê (p < 0.05).
Nhận xét
Kết quả ở bảng 4.7 và hình 4.4 cho thấy 100% cac mẫu mô seo đƣơc nuôi
trong điêu kiện chiếu sang đêu co săc tố đo trong khi nuôi hoàn toàn trong tối thì
không thấy co sư hình thành săc tố đo.
Kết quả này bƣơc đầu cho thấy mối liên hệ giữa anh sang vơi săc tố đo ở cây
băt ruồi và giải thích đƣơc một phần lý do ngoài tư nhiên cây D. burmanni thƣờng
co màu đo hơn so vơi cây nuôi cấy mô.
Cac loai săc tố ở thưc vât ngày càng đƣơc sư dung rộng rãi trong nhiêu lĩnh
vưc nhƣ công nghiệp nhuộm, màu thưc phẩm và cả dƣơc phẩm. Do vây, việc tìm ra
điêu kiện hình thành săc tố đo trên mô seo cây băt ruồi sẽ là tiên đê cho những
nghiên cứu sau trong việc điêu khiên săc tố đo ở cây băt ruồi vơi nhiêu ứng dung
hữu ích.
Page 71
57
Hình 4.4: Anh hƣởng cua anh sang lên sư hình thành săc tố đo
cua mô seo cây D. burmanni.
A, C, E: Mô seo đƣơc nuôi trong điêu kiện chiếu sang 16 giờ/ngày.
B, D, F: Mô seo nuôi trong điêu kiện u tối hoàn toàn.
A B
C D
E F
B
B
Page 72
58
Săc ký cột ƣơt
Hệ dung môi
ether dầu hoa:chloroform (95:5)
4.2. Ly trich va cô lâp hơp chât anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl
Sơ đô 4.1: Quy trinh ly trích và cô lâp hơp chất anthraquinone.
Thuốc thư
Borntraeger
Săc ký cột khô vơi
dung môi benzene
Đinh tính anthraquinone trong cac
phân đoan bằng săc ký bản mong
-Sấy ở 500C, xay thành bột min
-Ngầm dầm trong ethanol
-Cô quay
Cây D. burmanni
in vitro
Cao thô ethanol
Phân đoan
cao benzene
Săc ký điêu chế nhiêu lân
vơi hệ dung môi
benzene:chloroform (3:7)
Hơp chất anthraquinone
Page 73
59
Hơp chất anthraquinone sau khi đƣơc cô lâp từ sơ đô 4.1, sẽ đƣơc sư dung
nhƣ chất tham chiếu cho cac thí nghiệm đinh lƣơng bằng HPLC vê sau, vơi độ tinh
khiết ƣơc tính đat khoảng 70%.
4.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro
khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC
4.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn
Bảng 4.8: Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak
Nồng độ chất tham chiếu
(ppm)
Diện tích peak
(mAU*S)
14 67,75
28 140,87
42 218,84
56 294,46
70 361,14
Kêt qua đươc trich từ phu luc 3
Đồ thị 4.1: Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone
tham chiếu và gia tri diện tích peak.
y = 5.2884x - 5.5029
R2 = 0.9994
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 20 40 60 80
Nồng độ (ppm)
Diệ
n t
ích
pea
k (
mA
U*
S)
Page 74
60
Hình 4.9: Săc ký đồ HPLC cua
anthraquinone tham chiếu ở 70 ppm.
Hình 4.5: Săc ký đồ HPLC cua
anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm
.ppm
Hình Error! No text of specified style in
document..1. Sắc ký đồ HPLC của
anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm
Hình 4.6: Săc ký đồ HPLC cua
anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm
ppm
Hình Error! No text of specified style in
document..1. Sắc ký đồ HPLC của
anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm
Hình 4.7: Săc ký đồ HPLC cua
anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm
pm
Hình Error! No text of specified style in
document..1. Sắc ký đồ HPLC của
anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm
Hình 4.8: Săc ký đồ HPLC cua
anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm
pm
Hình Error! No text of specified style in
document..1. Sắc ký đồ HPLC của
anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm
Page 75
61
Đƣờng chuẩn đƣơc xây dưng co hệ số tƣơng quan giữa nồng độ chất tham
chiếu và diện tích peak là R2 ~ 1. Đây là một gia tri đang tin cây đê khẳng đinh rằng
nồng độ anthraquinone trong một mẫu chất co mối quan hệ tuyến tính vơi gia tri
diện tích peak trong điêu kiện chay HPLC nhất đinh. Mối quan hệ này đƣơc thê
hiện bằng phƣơng trình y = 5,2884x – 5,5029. Do đo đƣờng chuẩn này đƣơc sư
dung đê tính hàm lƣơng anthraquinone trong cac mẫu cần phân tích ở cac thí
nghiệm sau.
4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣơng
hợp chất anthraquinone
Hình 4.10: Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni đƣơc xư lý theo quy trình A.
Hình 4.11: Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni đƣơc xư lý theo quy trình B.
anthraquinone
Page 76
62
Qua ghi nhân săc ký đồ (Hình 4.10, 4.11) cua hai mẫu cây đƣơc x ư lý theo 2
cach A, B (Sơ đồ 3.2) chung tôi rut ra cac nhân xét sau:
Cac mẫu cây qua giai đoan sấy khô trƣơc khi xư lý mẫu sẽ cho cac tín hiệu
kết quả HPLC rõ ràng hơn cac mẫu cây tƣơi: ở cac mẫu cây tƣơi co xuất hiện tƣơng
peak đôi trong khi cac mẫu khô thì không. Nguyên nhân cua hiện tƣơng này là do
cac chất nhơt trong mẫu tƣơi tao độ nhơt cao cho dung dich săc ký. Độ nhơt này ảnh
hƣởng đến tốc độ ly giải cua cột cũng nhƣ độ hấp thu cua mẫu phân tích. Ở cac mẫu
khô giai đoan sấy đã làm mất đi phần lơn chất nhơt trong cây nên kết quả ghi nhân
cải thiện đang kê.
Do giơi han đê tài chƣa đu thời gian đê tối ƣu hơn nữa quy trình xư lý mẫu
nhằm loai bơt cac chất không quan tâm trong mẫu đinh lƣơng, kết quả săc ký đồ
còn lẫn nhiêu tap chất. Tuy nhiên, quy trình xư lý mẫu B sẽ làm tiên đê đê co thê
nghiên cứu hơn nữa cach loai tap sau này.
4.3.3. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ
phận khác nhau của cây in vitro
Bảng 4.9: Kết quả so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong cac bộ phân khac nhau
cua cây in vitro
Mẫu phân tích Mẫu thân la Mẫu rễ
Trong lƣơng khô (mg) 300 300
Thê tích dung dich phân tích (ml) 60 70
Y= gia tri diện tích peak (mAU*S) 728,70 682,27
X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 138,83 130,05
Hàm lƣơng anthraquinone (% so vơi trong lƣơng khô) 2,78 3,03
Page 77
63
Hình 4.12: Săc ký đồ HPLC cua mẫu rễ cây D. burmanni Vahl.
Hình 4.13: Săc ký đồ HPLC cua mẫu thân la cây D. burmanni Vahl.
Kêt qua ơ bang 4.9 và săc ký đồ hì nh 4.12, 4.13 cho thây hơp chât
anthraquinone hiên diên trong tât ca cac bô phân cua cây D. burmanni vơi ham
lƣơng tƣơng ứng là 2,78% (so vơi trong lƣơng khô ) ở mẫu thân la và 3,03% ở mẫu
rê. So sanh vơi nhƣng công bô trƣơc đây vê ham lƣơng cac hơp chât quinone ơ môt
sô loai Drosera thì hàm lƣơng này kha cao : theo Repcak và Galambosi (1994) [27],
hàm lƣơng 7-methyljuglone trong cây D. rotundifolia là 2,7% trong lƣơng khô và
trong cây D. anglica là 2,1%; Krenn (1995) [21] cũng cho biết hàm lƣơng
plumbagin trong 2 mẫu D. peltata là 0,569% và 0,305% so vơi trong lƣơng khô;
anthraquinone
anthraquinone
Page 78
64
hàm lƣơng plumbagin trong 11 mẫu D. madagascariensis dao động trong khoảng
0,002 - 0,01% so vơi trong lƣơng cây khô.
Tom la i, kêt qua nay cho thây tiêm năng rât cao cua viêc nuôi cây in vitro
cây D. burmanni Vahl trong thu nhân hơp chât quinone.
Bên canh đo , bảng 4.9 cũng cho thấy hàm lƣơng anthraquinone trong rễ lơn
hơn trong thân la . Kêt qua nay đa mơ ra môt hƣơng nghiên cƣu co nhiêu tiêm năng
trong thu nhân hơp chât thƣ câp : nuôi cây rê . Ky thuât nuôi cấy rễ t hƣc vât , nhăm
thu nhân cac hơp chât co nhiêu trong rê , đa đƣơc ap dung kha thanh công trên thê
giơi, chăng han nhƣ năm 2001, Verma va ctv đa sƣ dung Agrobacterium rhizogenes
đê kích thích tao rễ khi nuôi cấy Plumbago zeylanica giup thu đƣơc hàm lƣơng
plumbagin cao gâp 2,5 lân so vơi khi nuôi cây ơ điêu kiên binh thƣơng [30].
4.3.4. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các
mẫu có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ
Bảng 4.10: Kết quả so sanh hàm lƣơng anthraquinone trong cac mâu co va không
co săc tố đo
Mẫu phân tích Mẫu co săc tố
đo
Mẫu không co
săc tố đo
Trong lƣơng khô (mg) 300 300
Thê tích dung dich phân tích (ml) 60 60
Y= gia tri diện tích peak (mAU*S) 201,13 734,68
X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 39,07 139,96
Hàm lƣơng anthraquinone (% so vơi trong lƣơng
khô)
0,78 2,80
Page 79
65
Hình 4.14: Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni Vahl co săc tố đo.
Hình 4.15: Săc ký đồ HPLC cua mẫu cây D. burmanni Vahl không co săc tố đo.
Bảng 4.10 và hình 4.14, 4.15 cho thấy, hàm lƣơng anthraquinone trong cac
mẫu cây co săc tố đo chỉ chiêm 0,78% so vơi trong lƣơng khô, trong khi ở cây
không co săc tố đo là 2,8%. Kết quả này cũng trung hơp vơi công bố cua Repcak và
Galambosi (1994) trên cây D. rotundifolia và D. anglica: ở những ca thê co nhiêu
săc tố đo hàm lƣơng cac quinone sẽ rất thấp [29]. Do vây nêu đƣơc nghiên cƣu tiêp
vê muc tiêu thu nhân hơp chât anthraquinone , chung ta nên tiến hành khảo sat điêu
khiên viêc ƣc chê tao săc tô đo trong cây.
anthraquinone
anthraquinone
Page 80
66
4.3.5. Thí nghiệm 9: Xác định hàm lƣợng anthraquinnone trong mẫu dịch
huyền phu đã tao đƣợc từ thí nghiệm 4
Bảng 4.11: Kêt qua đinh lƣơng anthraquinnone trong mẫu dich huyên phu
Mẫu phân tích Dich môi trƣờng Sinh khối tế bào
Trong lƣơng tƣơi (mg) 22.000 600
Thê tích dung dich phân tích (ml) 20 20
Y= gia tri diện tích peak (mAU*S) 0 21,70
X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 0 5,14
Hàm lƣơng anthraquinone (% so vơi trong
lƣơng tƣơi)
0 0,02
Hình 4.16: Săc ký đồ HPLC cua mẫu dich môi trƣờng sau khi loc sinh khối tế bào.
Hình 4.17: Săc ký đồ HPLC cua sinh khối tế bào từ dich huyên phu.
anthraquinone
Page 81
67
Ghi nhân từ bảng 4.11, hình 4.16, 4.17 cho thấy không co sư hiện diện cua
anthraquinone trong dich môi trƣờng mà chỉ co trong sinh khối tế bào, điêu này
chứng to anthraquinone co lẽ là một hơp chất thứ cấp nội bào.
So sanh vơi một số nghiên cứu trên thế giơi vê sản xuất cac hơp chất quinone
bằng nuôi cấy huyên phu tế bào, thì kết quả này kha thấp (chỉ chiêm 0,02% so vơi
trong lƣơng tƣơi) trong khi ở nuôi cấy huyên phu cây D. muscipula sư sản xuất
plumbagin đat 2,59%, và ở cây D. capensis sư sản xuất 7-methyljuglone cũng đat
0,33% [23]. Tuy nhiên , kêt qua nay la do chung ta chƣa ap dung cac điêu kiên tôi
ƣu trong nuôi cây huyên phu nhƣ : anh sang, nhiêt đô, tôc đô lăc, chƣa điêu khiên ƣc
chê hinh thanh săc tô đo,…
Page 82
68
Chƣơng 5
KÊT LUÂN - ĐỀ NGHỊ
5.
5.1. KẾT LUẬN
Từ cac kết quả thu đƣơc, chung tôi rut ra một số kết luân sau:
5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo tao dịch huyền phu
Môi trƣờng cơ bản thích hơp nhất đê tao mô seo từ mẫu căt lơp mong là môi
trƣờng khoang Gamborg’s B5 và nồng độ đƣờng là 20 g/l.
Sư kết hơp hai loai hormone NAA và 2,4-D sẽ thích hơp nhất đê cảm ứng tao
mô seo. Vơi nồng độ kết hơp tối ƣu là NAA (0,2 mg/l )/2,4-D (0,2 mg/l).
Cac mô seo xốp khi đƣơc nuôi trong môi trƣờng ở dang long kết hơp chuyên
động lăc liên tuc (long lăc) sẽ tao dich huyên phu tế bào, đồng thời là kiêu nuôi cấy
làm tăng sinh khối mô seo nhanh nhất.
Khi nuôi trong điêu kiện chiếu sang 16 giờ/ngày, cac mô seo đêu hoa đo.
5.1.2. Định lƣợng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC
Mẫu đinh lƣơng cho kết quả HPLC vơi cac tín hiệu tốt hơn nếu đƣơc sấy khô
khi xư lý.
Hàm lƣơng anthraquinone trong rễ là 3,03%, lơn hơn trong thân la: 2,78 %
so vơi trong lƣơng khô.
Hàm lƣơng anthraquinone trong cây co săc tố đo (0,78% so vơi trong lƣơng
khô) ít hơn trong cây không co săc tố đo (2,8%)
Lƣơng anthraquinone đƣơc tao ra bằng nuôi cấy dich huyên phu chiêm 0,02
% so vơi trong lƣơng khô và tâp trung trong sinh khối tế bào, không tiết hoặc tiết rất
ít ra môi trƣờng bên ngoài
Page 83
69
5.2. ĐỀ NGHỊ
Khảo sat thêm cac điêu kiện điêu khiên việc tao săc tố đo trong nuôi cấy D.
burmanni Vahl.
Cảm ứng tao rễ D. burmanni Vahl nhăm nghiên cƣu tao nguôn nguyên liêu
co hàm lƣơng hơp chất anthraquinone cao .
Tôi ƣu hoa cac điêu kiên nuôi cấy dich huyên phu tế bào đê thu nhân lƣơng
lơn hơn anthraquinone bao gồm cac yếu tố: hormone, anh sang, tốc độ lăc…
Nghiên cƣu tƣ đông hoa nuôi cây sinh khôi tê bao D. burmanni Vahl trong
cac bình nuôi cấy điêu khiên tư động nhƣ bioreactor .
Thư nghiệm cac phƣơng phap tăng sinh hơp chât anthraquinone trong nuôi
cây dich huyên phu , tê bao đơn nhƣ:
- Chon loc dòng tế bào cho năng suất cao.
- Bổ sung tiên chất.
- Sƣ dung cac nhân tô cam ƣng (elicitor).
- Gây đôt biên,…
Tìm cac điêu kiện đê tối ƣu quy trình đinh lƣơng anthraquinone bằng ky
thuât HPLC
Page 84
70
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
1. Đỗ Đăng Giap , 2003. Khảo sát, sưu tập, thuần dưỡng và thử nghiệm in vitro
trên những loài cây bắt mồi ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước
Bửu. Khóa luận cử nhân khoa học, Đai học Khoa học Tự nhiên, Đai hoc
Quôc gia TP. Hồ Chí Minh.
2. Đỗ Tất Lợi , 1999. Cây thuôc va vi thuôc Viêt Nam . Nhà xuất bản Y học , TP.
Hô Chi Minh.
3. Hô Thuy Bich Tuyên , 2006. Ly trich va khao sat hoat tinh sinh hoc cua hơp
chât quinone tư cây Drosera burmanni Vahl nuôi cây in vi tro. Khóa luận cử
nhân khoa hoc . Đai hoc Khoa hoc Tƣ nhiên , ĐH Quôc gia TP. Hô Chi
Minh.
4. Lê Trân Đƣc. Cây thuôc Viêt Nam – trông, hái, chê biên, tri bệnh đau đầu.
5. Nguyên Đai Hai , 2006. Nuôi cây mô cây băt ruôi (Drosera burmanni Vahl),
khảo sát hoạt tinh kháng khuân cua hơp chât chiêt thô Plumbagin . Luân văn
tôt nghiêp ky sƣ công nghê sinh hoc, ĐH Nông Lâm, TP. HCM.
6. Nguyên Đƣc Lƣơng , 1998. Công nghê sinh hoc , Đai hoc Ky thuât , TP. Hô
Chí Minh.
7. Nguyên Đƣc Lƣơng , Lê Thi Thuy Tiên , 2002. Công nghê tê bao . Nhà xuất
bản Đai học Quôc gia, TP. Hô Chí Minh. 376 trang.
8. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2001. Các phương pháp nhận danh, trich ly và cô
lập các hơp chât hữu cơ. Giáo trình cao học chuyên ngành Hóa hữu cơ , Đai
học Khoa học Tự nhiên, TP. HCM.
Page 85
71
9. Nguyễn Thanh Bảo, 2003. Vi khuân học, Bộ Y tế , ĐH Y-Dƣợc TP . Hô Chi
Minh, tr. 40-93.
10. Pham Hoàng Hộ, 1993. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Giáo dục , TP. Hô
Chí Minh.
11. Pham Hoàng Hộ, 1994. Cây có vi thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Y học ,
TP. Hô Chi Minh.
12. Quách Ngô Diễm Phƣơng , 2006. Khảo sát hơp chât naphthoquinone có hoạt
tinh sinh học đươc tách chiêt tư cây bắt ruồi Drosera indica L . nuôi cây in
vitro. Luân văn thac sy khoa hoc. Đai hoc Khoa hoc Tƣ nhiên, Đai hoc Quôc
gia TP. Hô Chi Minh.
13. Trân Thi Bich Chiêu , 2004. Khảo sát vong đơi và tái tạo chồi tư phát hoa cây
băt ruôi in vitro (Drosera burmanni Vahl). Khóa luận cử nhân khoa học . Đai
học Khoa học Tự nhiên, TP. Hô Chi Minh.
14. Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến, 1978. Phân loại thực vật bậc cao, Nhà xuất
bản Giáo dục, TP. HCM, tr. 342-346.
15. Võ Văn Chi, Trần Hợp, 1999. Cây cỏ có ich ở Việt Nam. Nhà xuất bản Giao
dục, TP. Hô Chi Minh, tr. 342-346.
16. Vu Văn Vụ, 1999. Sinh ly thưc vât ưng dung. Nhà xuất bản Giáo dục.
Tài liệu tiếng Anh:
17. Crouch I. J., Finnie J. F., van Staden J., 1990. Studies on the isolation of
plumbagin from in vivo and in vitro grown Drosera species. Plant Cell Tiss
Org Cult 21: 78-82.
Page 86
72
18. Dicosmo F., Misawa M., 1985. Elicitation secondary metabolismin plant cell
cultures.Trends Biotechnol 3: 318-322.
19. Dipanjan G., 2003, Project Lifescape – 11: Hunter Plants. Resonance: 64 –
70.
20. George E. F., 1993. Plant propagation on by tissue culture, Biotechnology
exegietics Ltd: 14-25.
21. Harborne J. B., 1967. Comparative biochemistry of flavonoid-IV.
Phytochemistry 6: 1415-1428.
22. Hazra B., Sarma D. M., Sanyal U., 2004. Seperation methods of quinonoid
constituents of plants used in Oriental traditional medicines. Journal of
Chromatography B 812: 259-275.
23. Hook L. I. Ingrid, 2001. Naphthoquinone contents of in vitro cultured
plants and cell suspensions of Dionaea muscipula and Drosera species.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture 67 (3): 281-285.
24. Jayaram K., Prasad M. N. V., 2005. Rapidly in vitro multipled Drosera as
reliable source for plumbagin bioprospection. Current science 89: 447-448.
25. Kawiak A., Krolicka A., LoJkowska E., 2003. Direct regeneration of
Drosera from leaf explants and shoot tips. Plant cell, Tissue and Organ
Culture 75: 211-214.
26. Ketchum R. E. B., Gibson D. M., Croteau R. B., Shuler M. L., 1999. The
kinetics of taxoid accumulation in cell suspension cultures of Taxus
following elicitation with methyljasmonate. Biotechnology Bioeng 62: 97-
105.
Page 87
73
27. Kitanov G. M., Pashankov P. P., 1994. Quantitative investigation on the
dynamics of plumbagin in Plumbago europea L. roots and herb by HPLC.
Pharmazie 49 (6): 462.
28. Nahálka J ., Blanárik P ., Geimeiner P ., Matúsová E ., Partlová I ., 1996.
Production of plumbagin by cell suspension cultures of Drosophyllum
lusitanium Link. Journal of Biotechnology 49: 153-161.
29. Samaj J., Blehová A., Repcák M., Ovecka M., and Bobák M., 1999.
Drosera Species (Sundew): In vitro culture and the production of plumbagin
and other secondary metabolites. Biotechnology in Agriculture and Forestry 43:
105-135.
30. Verma P.C., Singh D., Rahman L.u., Gupta M.M., Banerjee S., 2002. In
vitro-studies in Plumbago zeylanica: rapid micropropagation and
establishment of higher plumbagin yielding hairy root cultures. Journal of
Plant Physiology 159: 547-552.
31. Verpoorte R., Van der Heijden R., Hoge J. H. C., and Hoopen H. J. G.,
1994. Plant cell biotechnology for production of secondary metabolites.
Pure & Appl. Chem 66: 2307-2310.
32. Wu-Che Weng and Shuenn-Jyi Sheu, 1999. Separation of Anthraquinones
by Capillary Electrophoresis and High-Performance Liquid
Chromatography. Journal of High Resolution chromatography 23: 134-148.
Tài liệu từ internet:
33. http://www.carnivorousplants.org/ICPS Seed Bank.html.
34. http://sea.unep-wcmc.org/isdp/Taxonomy/tax-species-
result.cfm?Genus=Drosera&Species=burmanni&source=plants&tabname=
all~main
Page 88
74
35. http://dionee.gr.free.fr/bulletin/txt/d_45_d.htm&h=414&w=621&sz=71&tb
nid=6A16urs1FQA_hM:&tbnh=89&tbnw=134&hl=vi&start=10&prev=/im
ages%3Fq%3DDrosera%Burmanni%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%261r
%3D%26sa%3DG
36. http://www.efloras.org./florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=210000486
37. http://www.answers.com/main/ntquery?method=4&dsid=2222&dekey=Sun
dew&gwp=8&curtab=2222_1&linktext=Drosera
38. http://www.thegardenhelper.com/sundew.htm
39. http://www.rdrop.com/contents/descriptions.htm.
40. http://florabase.calm.wa.gov.au/science/timage/3093ic1.jpg&imgrefurl=http
://florabase.calm.wa.gov.au/browse/flora%3Ff%3D143%26level%3Ds%26i
d%3D3093&h=384&w=512&sz=36&hl=vi&start=2&um=1&tbnid=N4xmzI
41. http://www.ctu.edu.vn/coursewares/supham/phanloaitv/ch5(3).htm
42. http://www.plantarara.com/carnivoren_galerie/drosera/drosera.htm
43. http://www.uky.edu/~dhild/biochem/26/lect26.html
44. http://www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/shaker.gif
45. http://www.cf.gu.se/digitalAssets/736125_Bioreactor.jpg
Page 89
75
46. http://www.waters.com/WatersDivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-
5LTGBH
47. http://www.uni-
regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/
Keusch/D-CC-e.htm
48. http://www.utricularia.de/bilder/drosera/burmanni_DROS63_004.html
Page 90
PHỤ LỤC
Phụ lục 1
Thành phần môi trƣờng nuôi cây thƣc vât
Đơn vi: mg/l
Phụ lục 2
Phụ lục 2.1: Thí nghiệm 1
Analysis of Variance for ASTTTHU.KETQUA - Type III Sums of Squares
Thành phần MS
(Murashige and Skoog,
1962)
Gamborg’s B5 (1968)
ĐA LƢỢNG
NH4NO3
(NH4 )2 SO4
KNO3
CaCl2.2H2 O
MgSO4.7H2 O
KH2PO4
NaH2PO4.H2O
VI LƢỢNG
FeSO4.7 H2O
NaEDTA
MnSO4. 4H2O
MnSO.H2O .
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4 .2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
VITAMINS
Myo-inositol
Nicotinic acid
Pyridoxine.HCl
Thiamine.HCl
Glycine
1.650
1.900
440
370
170
27,8
37,26
22,3
8,6
6,2
0,83
0,25
0,025
0,025
100
0,5
0,5
0,1
2,0
134
2.500
150
250
130,5
27,8
37,26
10
2,0
3,0
0,75
0,25
0,025
0,025
100
1,0
1,0
10
Page 91
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:ASTTTHU.LOAIMOITRU 466.66667 2 233.33333 25.846 .0000
B:ASTTTHU.NONGDODUON 280.55556 3 93.51852 10.359 .0001
INTERACTIONS
AB 1111.1111 6 185.18519 20.513 .0000
RESIDUAL 216.66667 24 9.0277778
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 2075.0000 35
--------------------------------------------------------------------------------
0 missing values have been excluded.
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Table of Least Squares Means for ASTTTHU.KETQUA
--------------------------------------------------------------------------------
95% Confidence
Level Count Average Stnd. Error for mean
--------------------------------------------------------------------------------
GRAND MEAN 36 15.833333 .5007710 14.799547 16.867120
A:ASTTTHU.LOAIMOITRU
1 12 12.500000 .8673608 10.709429 14.290571
2 12 14.166667 .8673608 12.376095 15.957238
3 12 20.833333 .8673608 19.042762 22.623905
B:ASTTTHU.NONGDODUON
1 9 12.777778 1.0015420 10.710204 14.845351
2 9 16.666667 1.0015420 14.599093 18.734240
3 9 20.000000 1.0015420 17.932426 22.067574
4 9 13.888889 1.0015420 11.821315 15.956463
AB
1 1 3 16.666667 1.7347217 13.085524 20.247809
1 2 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809
1 3 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809
1 4 3 10.000000 1.7347217 6.418857 13.581143
2 1 3 8.333333 1.7347217 4.752191 11.914476
2 2 3 18.333333 1.7347217 14.752191 21.914476
2 3 3 11.666667 1.7347217 8.085524 15.247809
2 4 3 18.333333 1.7347217 14.752191 21.914476
3 1 3 13.333333 1.7347217 9.752191 16.914476
3 2 3 20.000000 1.7347217 16.418857 23.581143
3 3 3 36.666667 1.7347217 33.085524 40.247809
3 4 3 13.333333 1.7347217 9.752191 16.914476
-------------------------------------------------------------------------------
Page 92
Multiple range analysis for ASTTTHU.KETQUA by ASTTTHU.NONGDODUON
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count LS Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 9 12.777778 X
4 9 13.888889 XX
2 9 16.666667 X
3 9 20.000000 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference +/- limits
1 - 2 -3.88889 2.92399 *
1 - 3 -7.22222 2.92399 *
1 - 4 -1.11111 2.92399
2 - 3 -3.33333 2.92399 *
2 - 4 2.77778 2.92399
3 - 4 6.11111 2.92399 *
--------------------------------------------------------------------------------
denotes a statistically significant difference.
Multiple range analysis for ASTTTHU.KETQUA by ASTTTHU.LOAIMOITRU
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count LS Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 12 12.500000 X
2 12 14.166667 X
3 12 20.833333 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference +/- limits
1 - 2 -1.66667 2.53225
1 - 3 -8.33333 2.53225 *
2 - 3 -6.66667 2.53225 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
Phụ lục 2.2: thí nghiệm 2 One-Way Analysis of Variance
--------------------------------------------------------------------------------
Data: LOAIHOR.KETQUA
Level codes: LOAIHOR.LOAIHORMON
Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 1136.2867 2 568.14333 504.767 .0000
Within groups 6.7533 6 1.12556
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 1143.0400 8
0 missing value(s) have been excluded.
Page 93
Table of means for LOAIHOR.KETQUA by LOAIHOR.LOAIHORMON
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 25.166667 .7666667 .6125236 24.106540 26.226793
2 3 2.933333 .7333333 .6125236 1.873207 3.993460
3 3 .000000 .0000000 .6125236 -1.060127 1.060127
--------------------------------------------------------------------------------
Total 9 9.366667 .3536407 .3536407 8.754602 9.978731
Multiple range analysis for LOAIHOR.KETQUA by LOAIHOR.LOAIHORMON
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
3 3 .000000 X
2 3 2.933333 X
1 3 25.166667 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference +/- limits
1 - 2 22.2333 2.12025 *
1 - 3 25.1667 2.12025 *
2 - 3 2.93333 2.12025 *
--------------------------------------------------------------------------------
Muc luc 2.3: Thi nghiêm 3
One-Way Analysis of Variance
--------------------------------------------------------------------------------
Data: PHATHOA.ketqua
Level codes: PHATHOA.nghiemthuc
Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 3922.5044 5 784.50089 22.714 .0000
Within groups 414.4533 12 34.53778
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 4336.9578 17
Table of means for PHATHOA.ketqua by PHATHOA.nghiemthuc
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 5.533333 2.7666667 3.3930212 .304514 10.762153
2 3 22.233333 2.7666667 3.3930212 17.004514 27.462153
3 3 52.766667 2.7666667 3.3930212 47.537847 57.995486
4 3 36.100000 2.8000000 3.3930212 30.871181 41.328819
5 3 19.466667 2.7666667 3.3930212 14.237847 24.695486
6 3 22.233333 5.5333333 3.3930212 17.004514 27.462153
--------------------------------------------------------------------------------
Total 18 26.388889 1.3851951 1.3851951 24.254232 28.523545
Page 94
Multiple range analysis for PHATHOA.ketqua by PHATHOA.nghiemthuc
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 5.533333 X
5 3 19.466667 X
2 3 22.233333 X
6 3 22.233333 X
4 3 36.100000 X
3 3 52.766667 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference +/- limits
1 - 2 -16.7000 10.4576 *
1 - 3 -47.2333 10.4576 *
1 - 4 -30.5667 10.4576 *
1 - 5 -13.9333 10.4576 *
1 - 6 -16.7000 10.4576 *
2 - 3 -30.5333 10.4576 *
2 - 4 -13.8667 10.4576 *
2 - 5 2.76667 10.4576
2 - 6 0.00000 10.4576
3 - 4 16.6667 10.4576 *
3 - 5 33.3000 10.4576 *
3 - 6 30.5333 10.4576 *
4 - 5 16.6333 10.4576 *
4 - 6 13.8667 10.4576 *
5 - 6 -2.76667 10.4576
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
One-Way Analysis of Variance
--------------------------------------------------------------------------------
Data: THAN.ketqua
Level codes: THAN.nghiemthuc
Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 9890.8050 5 1978.1610 128.438 .0000
Within groups 184.8200 12 15.4017
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 10075.625 17
0 missing value(s) have been excluded.
Page 95
Table of means for THAN.ketqua by THAN.nghiemthuc
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .000000 .0000000 2.2658087 -3.491727 3.491727
2 3 38.900000 2.8000000 2.2658087 35.408273 42.391727
3 3 72.233333 2.7666667 2.2658087 68.741606 75.725060
4 3 55.533333 2.7666667 2.2658087 52.041606 59.025060
5 3 50.000000 .0000000 2.2658087 46.508273 53.491727
6 3 22.233333 2.7666667 2.2658087 18.741606 25.725060
--------------------------------------------------------------------------------
Total 18 39.816667 .9250125 .9250125 38.391175 41.242158
Multiple range analysis for THAN.ketqua by THAN.nghiemthuc
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 .000000 X
6 3 22.233333 X
2 3 38.900000 X
5 3 50.000000 X
4 3 55.533333 X
3 3 72.233333 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference +/- limits
1 - 2 -38.9000 6.98345 *
1 - 3 -72.2333 6.98345 *
1 - 4 -55.5333 6.98345 *
1 - 5 -50.0000 6.98345 *
1 - 6 -22.2333 6.98345 *
2 - 3 -33.3333 6.98345 *
2 - 4 -16.6333 6.98345 *
2 - 5 -11.1000 6.98345 *
2 - 6 16.6667 6.98345 *
3 - 4 16.7000 6.98345 *
3 - 5 22.2333 6.98345 *
3 - 6 50.0000 6.98345 *
4 - 5 5.53333 6.98345
4 - 6 33.3000 6.98345 *
5 - 6 27.7667 6.98345 *
--------------------------------------------------------------------------------
denotes a statistically significant difference.
One-Way Analysis of Variance
--------------------------------------------------------------------------------
Data: LA.ketqua
Level codes: LA.nghiem_thu
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 714.60667 5 142.92133 9.224 .0008
Within groups 185.93333 12 15.49444
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 900.54000 17
Page 96
Table of means for LA.ketqua by LA.nghiem_thu
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 8.300000 .0000000 2.2726229 4.797772 11.802228
2 3 16.700000 .0000000 2.2726229 13.197772 20.202228
3 3 27.766667 2.7666667 2.2726229 24.264438 31.268895
4 3 22.233333 2.7666667 2.2726229 18.731105 25.735562
5 3 13.900000 2.8000000 2.2726229 10.397772 17.402228
6 3 13.900000 2.8000000 2.2726229 10.397772 17.402228
--------------------------------------------------------------------------------
Total 18 17.133333 .9277944 .9277944 15.703555 18.563112
Multiple range analysis for LA.ketqua by LA.nghiem_thu
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 8.300000 X
5 3 13.900000 XX
6 3 13.900000 XX
2 3 16.700000 XX
4 3 22.233333 XX
3 3 27.766667 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference +/- limits
1 - 2 -8.40000 7.00446 *
1 - 3 -19.4667 7.00446 *
1 - 4 -13.9333 7.00446 *
1 - 5 -5.60000 7.00446
1 - 6 -5.60000 7.00446
2 - 3 -11.0667 7.00446 *
2 - 4 -5.53333 7.00446
2 - 5 2.80000 7.00446
2 - 6 2.80000 7.00446
3 - 4 5.53333 7.00446
3 - 5 13.8667 7.00446 *
3 - 6 13.8667 7.00446 *
4 - 5 8.33333 7.00446 *
4 - 6 8.33333 7.00446 *
5 - 6 0.00000 7.00446
--------------------------------------------------------------------------------
Phụ lục 2.4: thí nghiệm 4 One-Way Analysis of Variance
--------------------------------------------------------------------------------
Data: SG4KIEU.ketqua
Level codes: SG4KIEU.nghiemthuc
Labels:
Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD
Analysis of variance
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
Between groups 1.7196917 3 .5732306 42.858 .0000
Within groups .1070000 8 .0133750
--------------------------------------------------------------------------------
Total (corrected) 1.8266917 11
Page 97
Table of means for SG4KIEU.ketqua by SG4KIEU.nghiemthuc
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD
Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean
--------------------------------------------------------------------------------
1 3 2.0100000 .0208167 .0667708 1.9010937 2.1189063
2 3 2.3466667 .0676593 .0667708 2.2377604 2.4555729
3 3 1.9666667 .0726483 .0667708 1.8577604 2.0755729
4 3 2.9133333 .0868588 .0667708 2.8044271 3.0222396
--------------------------------------------------------------------------------
Total 12 2.3091667 .0333854 .0333854 2.2547135 2.3636198
Multiple range analysis for SG4KIEU.ketqua by SG4KIEU.nghiemthuc
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95 Percent LSD
Level Count Average Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
3 3 1.9666667 X
1 3 2.0100000 X
2 3 2.3466667 X
4 3 2.9133333 X
--------------------------------------------------------------------------------
contrast difference +/- limits
1 - 2 -0.33667 0.21781 *
1 - 3 0.04333 0.21781
1 - 4 -0.90333 0.21781 *
2 - 3 0.38000 0.21781 *
2 - 4 -0.56667 0.21781 *
3 - 4 -0.94667 0.21781 *
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.