METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR B. Stoica (ver. 1.0, necorectat)
Nucleotidele sunt compui care ndeplinesc o multitudine de funcii
celulare. Cea mai important s-ar prea c este funcia de suport
informaional deoarece nucleotidele intr n structura acizlior
nucleici. Se pot aminti i alte funcii cum ar fi: depozite
energetice, transportori pentru unii intermediari activai din
sinteza unor carbohidrai, lipide i proteine, componente eseniale
ale unor coenzime (FAD, NAD+, NADP+ i coenzima A), reglatori pentru
unele ci din metabolismul intermediar, inhibnd sau activnd enzimele
cheie din diferite ci metabolice, etc. Bazele purinice i
pirimidinice din nucleotide pot fi sintetizate de novo sau pot fi
obinute prin ci de salvare care permit reutilizarea bazelor
preformate rezultate din turnoverul celular normal sau din diet.
STRUCTURA NUCLEOTIDELOR Nucleotidele sunt formate dintr-o baz
azotat (purinic sau pirimidinic), o pentoz (riboza sau
2-deoxiriboza) i una sau mai multe molecule de acid fosforic.
Derivaii purinici majori din celul sunt adenina i guanina. Alte
baze ntlnite sunt hipoxantina i xantina, intermediari din
mettabolismul adeninei i guaninei.
Nucleozidele derivate din aceste molecule conin riboz sau
deoxiriboz legat la nucleul purinic printr-o legtur -N-glicozidic
la atomul N-1. Ribonucleozidele conin riboz n timp ce
deoxiribonucleozidele conin deoxiriboz (o molecul de riboz n care
gruparea hidroxil din poziia 2 lipsete, fiind inlocuit cu
hidrogen).
Nucleotidele sunt esteri fosforici ai nucleozidelor.
3-nucleotidele ca de exemplu adenozin-3-monofosfatul (3-AMP) se
gasesc n celul ca rezultat al degradrii acizilor nucleici. n
celulele normale, di i tri fosfat nucleozidele se gsesc n
concentraie mai mare dect monofosfat nucleozidele, nucleozidele sau
bazele libere.
Nucleotidele pirimidinice gsite n concentraie mare n celul sunt
acelea care conin baze azotate cu nucleu pirimidinic (uracil,
citozin i timin).
Citozina i uracilul sunt pirimidinele din nucleotidele care intr
n structura ARN n timp ce timina i citozina se gsesc n compoziia
ADN. Ca i derivaii purinici, nucleozidele sau nucleotidele
pirimidinice conin fie riboz, fie deoxiriboz. Glucidul este legat
la pirimidin printr-o legtur -Nglicozidic la atomul N-1.
Nucleozidele pirimidinice sunt uridina, citidina sau timidina
(respectiv deoxiuridina, deoxicitidina sau deoxitimidina). Esterii
monofosforici ai nucleotidelor pirimidinice sunt UMP, CMP i TMP. n
celul compuii majori
pirimidinici conin 2 sau 3 resturi de fosfat. Grupele fosfat
sunt responsabile de ncrcarea negativ a nucleotidelor i a acizilor
nucleici.
n concluzie se poate vorbi de mai multe structuri care sunt
strns legate unele de altele. Astfel avem 5 baze azotate mai
importante (2 cu heterociclu purinic adenina i guanina i 3 cu
heterociclu pirimidinic uracil, timina i citozina), 5 nucleozide
(care conin pentoze) i 5 nucleotide (care conin 1,2 sau 3 resturi
de acid fosforic). De menionat c numrul acestor structuri este de
fapt dublu dac inem cont c putem avea ca pentoze i riboza i
deoxiriboza. In afara de cele 5 baze azotate numite i majore, se
mai cunosc baze azotate minore. Acestea se gasesc ntr-o cantitate
relativ mic att n structura ADN-ului ct i a ARN-ului,
caracterizndu-se prin mici modificari ale nucleelor purinice sau
pirimidinice (metilri, prezena sulfului, izomeri ai nucleelor,
etc).
PROPRIETILE NUCLEOTIDELOR Componentele celulare coninnd fie baze
purinice, fie pirimidinice pot fi evideniate uor datorit absorbiei
puternice n ultraviolet a acestora. Bazele purinice, nucleozidele i
nucleotidele corespunztoare au absobie mai puternic dect
pirimidinele i derivaii acestora. Lungimea de und la care se afl
maximul de absobie a acestor compui este n funcie de baza
component, dar n cele mai multe cazuri este n jur de 260 nm.
Spectrul de absobie n UV pentru nucleozide sau nucleotide variaz n
funcie de pH. Absorbia n UV i diferenele care apar datorit
structurii specifice a bazelor reprezint o metod de cercetare
pentru acesti compui. Legtura N-glicozidic din nucleozidele
purinice sau pirimidinice este stabil fa de alcalii, n timp ce
stabilitatea acestor legturi la hidroliza acid difer: legtura
Nglicozidic din nucleozidele i nucleotidele purinice este uor
hidrolizat de acizi diluai la temperatur ridicat (60C) cnd se
elibereaz baza purinic i glucidul sau glucid-fosfatul. Legtura
Nglicozidic din nucleozidele i nucleotidele pirimidinice este
foarte stabil la acest tratament. Totui, condiii mai severe ca de
exemplu acid percloric 60% i 100C hidrolizeaz aceste legturi
elibernd pirimidina cu distrugerea complet a pentozei. Datorit
naltei polariti a grupului fosfat, nucleotidele purinice sau
pirimidinice sunt mult mai solubile n soluii apoase dect
nucleozidele i bazele lor
libere. n general nucleozidele sunt mai solubile dect bazele
purinice sau pirimidinice libere. Datorit caracterului aromatic al
purinelor i pirimidinelor, substituenii oxo sau amino particip la
tautomeria: ceto enol i amino imino.
DISTRIBUIA NUCLEOTIDELOR N CELUL Derivaii 5-nucleotidici sunt
formele principale ale compuilor purinici i pirimidinici.
Concentraia intracelular a nucleotidelor variaz mult i depinde de
tipul de celul. ATP ul este nucleotidul cu cea mai mare concentraie
intracelular. De exemplu n globulele roii adenin-nucleotidele se
gsesc n exces fa de alte nucleotide prezente n concentraii extrem
de mici. n ficat i alte esuturi este prezent spectrul complet de
mono, di i trifosfonucleotide ca i UDP-glucoza, acidul
UDP-glicuronic NAD+ i NADP+. Bazele libere, nucleozidele sau 2 i 3
nucleotidele din fracia acid solubil din celul reprezint produi de
degradare ai nucleotidelor endogene i exogene sau acizilor
nucleici. Prezena aa numitor baze minore este datorat degradrii
acizilor nucleici. Concentraia ribonucleotidelor din celul este de
ordin milimolar n timp ce concentraia deoxiribonucleotidelor din
celul este de ordin micromolar. Nivelu de deoxiribonucleotidelor
este subiectul flutuaiilor majore din timpul ciclului celular,
comparativ cu nivelul ribonucleotidelor care rmne relativ constant.
n condiii normale, concentraia total a nucleotideor oscileaz n
limite foarte stricte, ns concentraia componentelor individuale
poate varia. De exemplu concentraia total a adenin-nucleotidelor
(AMP, ADPi ATP) este constant dar variaz raportul ATP/AMP+ADP,
dependent de starea energertic a celulei. Aceste concentraii fixe
se datoreaz faptului c sinteza nucleotidelor este una din cile
metabolice cele mai fin reglate din celul. FUNCIILE METABOLICE ALE
NUCLEOTIDELOR Toate tipurile de celule (mamifere, bacterii i
plante) conin o mare varietatede nucleotide i derivaii lor. Unele
din aceste nucleotide se gdsesc n concentraii relativ mari (de
ordin milimolar) n celule. Numrul mare de nucleotide i derivate ale
acestora din celul este motivat de implicarea acestora ntr-o
multitudine de procese metabolice importante pentru dezvoltarea i
creterea normal a celulelor. Principalele roluri lae nucleotidelor
sunt: - uniti monomerice ale macromoleculelor informaionale, ADN i
ARN. n sinteza acizilor nucleici, nucleozid-5-trifosfaii sunt
substrate i sunt legai n polimer prin legturi 3,5-fosfodiesterice
(cu eliberare de pirofosfat). - mediatori fiziologici: nucleotidele
sau nucleozidele servesc ca mediatori ai proceselor metabolice
cheie. AMPc este unul dintre cei mai cunoscuti mesageri secunzi
(ex:reglarea glicogenolizei mediat de epinefrin i glucagon). - GMPc
activeaz ca mediator i alte evenmente celulare. - ADP este
indispensabil agregrii plachetare normale i deci coagulrii sngelui.
- adenozina produce dilataia vaselor coronare i prin urmare este
important pentru reglarea circulaiei coranariene. - GTP este
necesar pentru funcii ca: transducerea semnalului de ctre
proteinele G care leag GTP n scopul activrii acestora.
-
-
-
componente ale coenzimelor: NAD+, NADP+, FAD, FMN,
adenozilcobalamina, S-adenozil-metionina i CoA sunt constitueni
celulari implicai direct n multe mecanisme enzimatice. rol n
metabolismul energetic: ATP este principala form de stocare a
energiei chimice n celulele vii. Sinteza ATP se poate face cu
ajutorul reaciilor de fosforilare oxidativ cuplate cu lanul
respirator mitocondrial i cu ajutorul reaciilor de fosforilare la
nivelul substratului. ATP este utilizat pentru a dirija reaciile
metabolice i este implicat n diverse procese consumatoare de
energie: contracia muscular, transportul activ prin membrane,
generarea potenialelor de aciune n celule specializate, etc. Ca
agent de fosforilare ATP servete ca donor de fosfat pentru
generarea altor nucleozid-trifosfai (GTP, UTP, CTP i TTP).
intermediari activai: nucleotidele servesc ca transportori de
intermediari activai necesari pentru o varietate de reacii. Ca
exemple se pot da: UDPglucoza este intermediar cheie n sinteza de
glicogen, glicoproteine i acid glucuronic; GDP-manoza, GDP-fucoza,
UDP-galactoza, acidul CMP-sialic sunt intermediari cheie n reaciile
n care restul de zahr este transferat pentru sinteza de
glicoproteine; CDP-colina, CDP-etanolamina sau CDPdiacilglicerolul
cu rol n metabolismul fosfolipidelor; S-adenozil metionina (SAM) i
3-fosfoadenozin-5-fosfosulfatul (PAPS) sunt compui donori de metil
respectiv sulfat n diverse ci metabolice. efectori alosterici:
multe trepte reglate din cile metabolice sunt controlate de
concentraia intracelular a nucleotidelor.
BIOSINTEZA NUCLEOTIDELOR Nucleotidele sunt sintetizate prin 2
tipuri de reacie: de novo, adic din molecule mici precursoare i de
salvare din purinele i pirimidinele care pot fi reutilizate dup
catabolismul acizilor nucleici. BIOSINTEZA NUCLEOTIDELOR PURINICE
A. Sinteza de novo a nucleului purinic n celulele mamiferelor
utilizeaz aminoacizi ca donori de C i N iar CO2 i formiatul ca
donor de C. n figura .... sunt indicate sursele de C i N din bazele
azotate purinice. S-a demonstrat c nivelul glutaminei i
aspartatului influeneaz rata sintezei acestor nucleotide n celulele
tumorale. Multe din reaciile acestei ci necesit ATP.
Toate enzimele implicate n sinteza purin-nucleotidelor se gsesc
n citoplasma celular dar nu toate celulele sintetizeaz nucleotide.
O serie de 10 reacii conduc la sinteza de novo a
inozin-monofosfatului (IMP) care servete ca precursor pentru
adenozin-5-monofosfat (AMP) i guanozin-5monofosfat (GMP).
CONVERSIA IMP LA AMP I GMP Conversia IMP la GMP necesit ATP ca
surs de energie n timp ce conversia spre AMP necesit GTP. Prin
urmare, dac n celul exist suficient ATP, IMP va fi convertit la GMP
i invers, cnd este suficient GTP n celul IMP este convertit la
AMP.
Rata sintezei depinde de disponibilitatea R-5-P i de activitatea
PRPP-sintetazei, o enzim sensibil la concentraia de fosfat i la
purin-ucleotidele care acioneaz ca reglatori alosterici. Reacia 2
de formare a 5-fosforibozil aminei este trepta de control n cadrul
sintezei i este puternic reglat de nucleotidele IMP, GMP i AMP. La
punctul de ramificare al cii, cele 2 enzime IMP dehidrogenaza i
adenilosuccinat sintetaza au valori ale KM similare pentru IMP, AMP
este un inhibitor competitiv al adenilosuccinat sintetazei n timp
ce GMP este inhibitor competitiv pentru IMP-dehidrogenaza.
Printr-un mecanism de feed-back AMP i GMP inhib
PRPPamidotransferaza. Produii finali ai biosintezei de novo
acioneaz ca efectuori negativi asupra enzimei care catalizeaz
reacia 2. Concentraia PRPP n celul este un determinant major n
sinteza nucleotidelor purinice i reflect rata sintezei, utilizarea
i degradarea lor. CALEA DE SALVARE Eficiena metabolismului celular
n condiii normale se datoreaz aa numitei ci de salvare n care
bazele preformate (din surse exogene sau din turn-over-ul acizilor
nucleici) pot fi reutilizate, cu economisirea unor mari cantiti de
energie pentru celul.
Enzima care catalizeaz ambele reacii este
hipoxantin-guanin-fosforiboziltransferaza (HGPRT) i necesit ioni de
magneziu. Este reglat de prezena IMP sau GMP care acioneaz ca
inhibitori competitivi.
Nucleozid difosfaii sunt sintetizai din NMP corespunztor i ATP
care se gsete n concentraie mai mare n celul. Enzimele implicate
sunt adenilat chinaza sau guanilat chinaza.
Adenilat chinaza este acctiv n ficat i muchi unde concentraia
ATP este mare. NDP i NTP sub aciunea nucleozid difosfat chinazei
sunt interconvertibili.
Enzima care catalizeaz aceast reacie este adenin fosforibozil
transferaza (APRTaza) i necesit ioni de Mg. Produsul reaciei este
AMP care funcioneaz i ca inhibitor al enzimei. Aceste reacii sunt
importante nu numai pentru faptul c se conserv energia, dar permit
unor celule (ex.: eritrocitul) s formeze nucleotide din baze
azotate simple. Aceste celule nu sintetizeaz 5-P-ribozilamin din
PRPP din cauza lipsei enzimei PRPP-amidotransferazei, motiv pentru
care depind de fosforiboziltransferaze pentru a sintetiza
nucleotide. DEGRADAREA PURINELOR Nucleotidele, nucleozidele i
bazele purinice parcurg o cale comun de degradare. Produsul final
al acestei degradri la om este acidul uric. Enzimele implicate n
degradarea acestori compui variaz ca specificitate.
Xantin oxidaza (XO) este o enzim care conine FAD, Fe (III) i Mo
(VI) n reaciile catalizate oxigenul este substrat genernduse ap
oxigenat ca produs de reacie.
Exist afeciuni clinice n care nivelul seric al acidului uric
este crescut. Guta primar este un deficit metabolic de reglare al
catabolismului purinelor i se caracterizeaz prin hiperuricemie.
Clinic guta se manifest prin crize de artrit acut (atac de gut)
legat de inflamaia produs prin depozitarea cristalelor de urat de
sodiu greu solubil la nivelul articulaiilor. Prin acelai fenomen
precipitarea uratului de sodiu la nivel renal poate produce litiaz
renal. Exist i hiperuricemie secundar datorat unei superproducii de
acid uric n cadrul unor afeciuni n care catabolismul purinelor este
accelerat: cancer, iradiere, boli endocrine, etc. Tratamentul
clasic cu alopurinol inhib competitiv xantin oxidaza scznd n acest
fel produsul final de catabolism care este greu solubil. Deficiena
de adenozin dezaminaz (ADA) cauzeaz imunodeficien, implicnd
disfuncia celulelor T i B. Deficiena de purin nucleozid fosforilaza
duce la creterea nivelului de purin nucleozide i nucleotide.
METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR PIRIMIDINICE A. SINTEZA Pirimidinele
sunt sintetizate de novo n celulele mamiferelor din aminoacizi. Se
folosesc glutamina i aspartatul ca donor de azot i carbon, iar CO2
ca donor de carbon.
Secvena de reacii care duce la sinteza nucleotidelor este: 1.
formarea carbamil fosfatului (C-2 i N-3 din nucleu de pirimidin).
2. adiia aspartatului (N-1, C-4, C-5 i C-6). Reacia este considerat
treapta de reglare n sinteza de pirimidine. 3. nchiderea nucleului
cu formarea acidului dihidroorotic. 4. oxidarea la acid orotic. 5.
adiia ribozo-5-fosfatului sub aciunea orotat fosforibozil
transferaza. PRPP este donor de ribozo-5-P. 6. decarboxilarea
orotidin-monofosfatului. Enzima implicat se numete OMPdecarboxilaza
i lipsa acesteia duce la aciduria orotic. 7. sinteza de UTP, CTP
sau TTP.
Dei calea de sintez de novo necesit prezena a 6 activiti
enzimatice care catalizeaz 6 trepte, acestea sunt produse numai de
3 gene: - Carbamil fosfat-sintetaza, aspartat carbamil-transferaza
i dihidro-orotaza, (abreviate PYR 1-3 sau CAD) se gsesc pe acelai
lan polipeptidic ( 200000 Da). - Dihidro-orotat-DH este o protein
separat. - Orotat-fosforibozil transferaza i OMP-decarboxilaza (PYR
5-6) sunt pe acelai lan polipeptidic (51000 Da). Enzimele
multifuncionale PYR 1-3 i PYR 5-6 se gsesc n citozol, n timp ce
dihidroorotat-DH este o enzima mitocondriala. Deci produsul final
al acestor reacii este UMP. Formarea citidin nucleotidelor are loc
din uridin nucleotide, cu precdere din derivaii trifosforici mai
curnd dect monofosforici.
Concentraii mai mici de 0,2 mM GTP stimuleaz activitatea CTP
sintetazei de 5-10 ori. Dei carbamilfosfat sintetaza I mitocondrial
este diferit de cea citoplasmatic II, n condiii de stres
fiziologic, cnd n ficat este un exces de amoniac, enzima I
sintetizeaz carbamilfosfat care trece din mitocondrii n citoplasm i
devine substrat pentru aspartat carbamil transferaz. Cnd
concentraia de amoniac este mare (toxic) sa observat o eliminare
mai mare de acid orotic. Calea de sintez a pirimidinelor difer de
cea a purinelor: - n sinteza purin nucleotidelor legtura
N-glicozidic se formeaz n prima treapt care este i treapta de
reglare n timp ce n sinteza pirimidin nucleotidelor mai nti se
formeaz nucleul de pirimidin i apoiu legtura Nglicozidic. - toate
enzimele implicate n sinteza de nucleotide purinice sunt n
citoplasm n timp ce n sinteza pirimidin nucleotidelor una se gsete
n mitocondrii (orotatDH) i celelalte cinci fiind prezente n dou
proteine din citosol. REGLAREA SINTEZEI Are loc la nivelul a dou
enzime: - carbamil fosfat sintetaza care este inhibat de UTP. -
OMP-decarboxilaza (inhibitorii enzimei sunt UMP i ntr-o msur mai
mic CMP). Deoarece OMP-decarboxilaza i orotat fosforibozil
transferaza sunt pe acelai lan polipeptidic, funcionarea lor este
simultan. B. CALEA DE SALVARE Pirimidinele provenite numai din
acizii nucleici celulari (nu i cele din aportul exogen) pot fi
salvate cu ajutorul unei reacii de fosforilare a nucleozidelor
corespunztoare:
Exist 2 tipuri de kinaze: o enzim accept ca substrat uridina i
citidina i alta timidina. S-ar prea ca acest tip de reutilizare e
mai important dect in cazul purinelor. FORMAREA
DEOXIRIBONUCLEOTIDELOR Concentraia deoxiribonucleotidelor este
extrem de redus pentru celulele n repaus. Numai n timpul replicrii
n ADN (faza S) fondul de nucleotide crete pentru a susine aceast
sintez. Deoxiribonucleotidele se formeaz prin reducerea direct n
poziia 2 a ribonucleotidelor corespunztoare.
Reacia este reglat nu numai de efectori alosterici dar i de
modificri ale concentraiilor enzimelor implicate. Enzima care
catalizeaz transformarea este nucleozid difosfat reductaza
(ribonucleotid reductaza). Aceast reducere a NDP necesit un
nucleozid trifosfat specific (NTP) ca efector alosteric pozitiv sau
negativ al enzimei. Ribonucleotid reductaza este format din 2
subuniti identice care separat nu a activitate enzimatic. Una din
subunti conine centrii de legare a efectorului n timp ce a 2-a
subunitate conine fier neheminic i un radical liber tirozil
(probabil care face parte din centrul aactiv al enzimei). Cele 2
subuniti care formeaz enzima activ sunt codificate de gene separate
care sunt exprimate difereniat n timpul ciclului celular. La
mamifere nu este clar dac exist o singur enzim pentru toate
substratele (CDP, UDP, ADP, GDP) sau dac sunt enzime i centri de
legare separai. Deoxi-ATP este un puternic inhibitor al reductazei
celor 4 substrate. Acest fapt furnizeaz bazele biochimice pentru
toxicitatea deoxiadenozinei pentru multe celule mamifere.
Tioredoxina este o protein cu mas molecular mic (12000) care este
oxidat n timpul reducerii grupului 2-OH din restul de riboze.
Pentru a completa ciclul catalitic tioredoxina redus este regenerat
de ctre tioredoxin-reductaz (o flavoprotein) i ENADPH.
Ribonucleotid reductaza este singura enzim responsabil de cataliza
reaciei de formare a deoxinucleozid trifosfailor necesari pentru
replicarea ADN. n controlul nivelului deoxiribonucleotidelor din
celul sunt utilizate cel puin 2 ci: - concentraia celular a
reductazei. - reglarea strict alosteric a activitii enzimei de ctre
NTP. SINTEZA DEOXITIMIDILATULUI Deoxitimidilatul se formeaz prin
transferul concomitent cu reducerea unei uniti cu un singur atom de
carbon (metil) pe deoxiuridin monofosfat (dUMP). Reacia este
catalizat de timidilat sintaza i necesit N5N10-metilen-FH4 ca
transportor de fragmente cu un carbon.
dUMP pentru aceast reacie provine din 2 ci diferite: dezaminarea
dCMP sub acinea enzimei dCMP-dezaminaza i reducerea UDP la dUDP
care este convertit apoi la dUMP. CATABOLISMUL PIRIMIDIN
NUCLEOTIDELOR
Din turnover-ul acizilor nucleici se formeaz pirimidin
nucleotide care se afl ntr-o continu dinamic, fiind consttant
sintetizate i degradate.
Prin catabolism nucleotidele sunt degradate la nucleozide i apoi
la baze libere (uracil i timin). Conversia la nucleozide este
catalizat de fosfataze nespecifice. Deoxicitidilat dezaminaza are
preferin pentru dCMP dar poate utiliza i CMP ca substrat. Citidina
i deoxicitidina sunt dezaminate la uridin i respectiv deoxiuridin
de ctre nucleozid dezaminaza. Uridin fosforilaza catalizeaz
fosforoliza nu numai a uridinei dar i a deoxiuridinei i
deoxitimidinei. Trebuie subliniat c celulele mamiferelor conin o
deoxi-UTP fosforilaz specific n concentraie mare care catalizeaz
reacia: dUTP dUMP + pirofosfat Uracilul i timina sunt degradate mai
departe la -alanin i -amino izobutirat. Enzimele implicate n aceast
etap de degradare sunt: - dihidropirimidin-dehidrogenaza -
dihidropirimidinaza - ureidopropionaza
Acidul -amino izobutiric este excretat prin urin i nivelul lui
crete la pacieni cu cancer supui chimioterapiei sau radioterapiei
(la acetia un nr. Foarte mare de celule sunt omorte i ADN-ul
degradat). NUCLEOZID I NUCLEOTID KINAZELE Purin i pirimidin
nucleotidele sunt sintetizate de novo ca monofosfat. Totui cele mai
multe reacii dac nu toate necesit nucleotide ca difosfai sau
trifosfai. n acest sens exist kinaze specifice care salveaz
nucleozidele ca nucleotide i care convertesc nucleozid monofosfaii
la di i trifosfai. De exemplu:
Alte kinaze care catalizeaz astfel de reacii sunt: - pirimidin
nucleozid monofosfat kinaze a cror substrate sunt CMP, UMP i dCMP.
- timidin kinaza - timidilat kinaza - adenozin kinaza - nucleozid
difosfokinaza - AMP kinaza - GMP kinaza COMPUI CARE INTERFER CU
METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR PURINICE I PIRIMIDINICE AGENI
CHEMOTERAPEUTICI Sinteza de nucleotide purinice i pirimidinice este
necesar pentru replicarea, meninerea i funcionarea normal a
celulelor. Reglarea acestei sinteze are o deosebit importan
deoarece defecte ale unor etape din aceste ci sunt la originea
difweritelor afeciuni. Muli compui care au fost sintetizai sau
izolai ca produi naturali din
plante, bacterii sau fungi sunt inhibitori relativ specifici ai
enzimelor implicate n producerea sau interconversia nucleotidelor.
Aceti compui utilizai n terapia multor afeciuni au fost clasificai
ca: antimetabolii, antifolai, antagoniti ai glutaminei i ali
compui. ANTIMETABOLIII sunt analogi structurali ai bazelor azootate
purinice sau pirimidinice sau ai nucleozidelor i interfer cu
enzimele din cile specifice acestora. Dintre acetia amintim: 1.
6-mercaptopurina i 6-tioguanina sunt utilizate n tratamentul
leucemiei cronice. Activitatea citostatic este legat de formarea
6-mercaptopurin ribonucleotidelor de ctre celulele tumorale.
Utiliznd PRPP i HGPRT-aza, 6-mercaptopurin ribonucleozid
5-monofosfatul se acumuleaz n celul i servete ca efector negativ al
PRPP amidotransferazei, blocnd etapa de reglare n sinteza de novo.
Acest nucleotid acioneaz i ca inhibitor al conversiei IMP la GMP n
calea IMP dehidrogenazei i a IMP la AMP n calea adenilosuccinat
sintetazei. Deoarece GMP este substrat pentru xantinoxidaza se
formeaz prin oxidare acid tiouric i alopurinolul poate fi
admnistrat pentru a inhiba aceast degradare i a potena activitatea
antitumoral. 2. 5-fluorouracilul (F-ura) este un analog pirimidinic
care nu are aciune citotoxic
Metabolitul activ al F-ura este fluorodeoxiuridilatul (F-dUMP) i
FUTP. F-dUMP este inhibitor al timidin sintetazei iar FUTP mpiedic
transformarea pre ARN-mesager la ARNm funcional (deci maturarea
ARNm). 3. Citozin-arabinozidul (Ara-C) este utilizat n tratamentul
mai multor forme de cancer. Pentru a-i exercita efectele citotoxice
trrebuie s fie transformat n citozin-arabinozid-5-trifosfat. Acest
compus intr n competiie cu dCTP n reacia ADN polimerazei.
Clinic, eficacitatea ara-C ca medicament antileucemic se
coreleaz cu concentraia ara-CTP n celulele tmorale care determin
nivelul de ara-CMP incorporat n ADN. Formarea ara-CMP via
deoxicitidin kinaza este etapa limitant n activarea araCTP. 4.
Azatioprina este folosit pentru imunosupresie la pacienii cu
transplant de organe. 5. Alopurinolul este folosit pentru
tratamentul gutei i hiperuricemiei. 6. Aciclovirul este util n
tratamentul infeciei cu virusul herpetic i tratamentul zonei
Zoster. ANTIFOLAII sunt compui care interfer cu formarea FH4 din
FH2 sau din acid folic prin inhibiia folat reductazei. Metotrexatul
estre un exemplu de antifolat utilizat ca agent antitumoral i
acioneaz prin inhibiia competitiv a folat reductazei.
ANTAGONITII GLUTAMINEI inhib utilizarea acesteia ca donor de
azot. Glutamina are rol de a asigura atomii de azot din poziia 3 i
9 n sinteza de novo a purinelor dar i n conversia IMP la GMP, UTP
la CTP i a nicotinat adenin dinucleotidului la NAD. Compuii care
inhib aceste reacii sunt antagoniti ai glutaminei: 1. azaserina
(O-diazoacetil-L-serina) izolat din culturi de Streptomices este un
inhibitor al utilizarii glutaminei.
Un dezavantaj al acestui tip de compui este toxicitatea. ALI
AGENI CARE INHIB CRETEREA CELULAR 1. Hidroxiureea inhib specific
sinteza de ADN i n mai mic msur sinteza de ARN i de proteine.
Mecanismul implic inhibiia ribonucleotid reductazei, deci blocarea
reducerii celor 4 nucleozid-difosfai la derivai 2deoxi.
Toxicitateaei rezult din depleia 2deoxi NTP necesari pentru
replicarea ADN. Utilizarea ei n clinic este limitat de clearence-ul
prea rapid i necesitatea unor concentraii mari terapeutice. 2.
Tiazofurin este convertit la tiazofurin adenin dinucleotid (TAD)
care inhib IMP-dehidrogenaza cu diminuarea concentraiei
intracelulare de GMP.
ANALOGI PURINICI I PIRIMIDINICI CA AGENI ANTIVIRALI Mai cunoscui
sunt compuii care acioneaz mpotriva infeciei cu HIV i cu virus
herpes simplex. 1. Aciclovirul (acicloguanozina) 2. AZT
(3-azido-2-deoxiimidina)
Aciclovirul este activat la monofosfat de ctre o kinaz specific
doar virusului herpes i oprit de ctre enzimele celulare la forma di
i trifosfat. Rezult un fals substrat pentru ADN-polimeraza fiind
incorporat n ADN viral. AZT este fosforilat la AZT trifosfat de
ctre o kinaz celular. Este inhibat astfel HIV-ADN polimeraza pentru
care s-ar prea c exist o mai mare specificitate.
ACIZI NUCLEICI STRUCTURA SI FUNCTII Acizii nucleici reprezinta
moleculele care pastreaza, transporta si manipuleaza informatia in
orice celula vie. Codul de scriere a acestei informatii este
universal valabil iar mecanismele biochimice implicate sunt pe de o
parte complexe si pe de alta parte foarte precise.
Unitatile de baza din compozitia acizilor nucleici sunt
reprezentate de nucleotide - structuri care contin pentoze ( riboza
sau deoxiriboza ), acid fosforic si baze azotate cu nucleu purinic
sau pirimidinic:
Acizii nucleici pot fi impartiti in 2 mari clase, intre care
exista diferente structurale si functionale: acizii ribonucleici
(ARN sau RNA) si acidul dezoxiribonucleic (ADN sau DNA). Ambele
macromolecule prezinta din punct de vedere chimic o structura
polinucleotidica, construita cu ajutorul legaturilor
fosfodiesterice si avand in componenta pentoze facand din ADN si
ARN molecule inrudite. Exista insa diferente nete la nivelul
structurii: - pentoza din ARN este reprezentata de riboza iar in
ADN de deoxiriboza, o riboza in care gruparea hidroxil de la
carbonul 2 lipseste fiind, inlocuita cu hidrogen. - ARN are o
structura predominant monocatenara iar ADN are o structura
bicatenara. - Timina din ADN este inlocuita cu uracilul in molecula
de ARN.
ADN-ul, structura polinucleotidica dublu catenara, formeaza
genomul unui organism, cu alte cuvinte, totalitatea genelor care
poarta informatia acelui sistem biologic. ADN-ul este prezent in
nucleul celulelor (si in mitocondrii) sub forma de cromatina sau
cromozomi pentru animalele eucariote.Pentru procariote exista un
cromozom circular in citoplasma, compactat -prin formarea unor
superhelixuri cu ajutorul unei enzime numita ADN giraza. Plasmidele
sunt unitati mici de ADN specifice bacteriilor (exemplu: plasmidele
care codifica rezistenta la antibiotice). La eucariote cromatina
apare in nucleul celulelor in perioadele de repaus. In momentul
inceperii mitozei cromatina se organizeaza in cromozomi, complexe
ADNproteine cu numar diferit de la specie la specie (la om 44xy sau
44xx). Lungimea de aproximativ 2m a ADN-ului eucariotelor face
necesara o supercompactare a acestei molecule care trebuie sa
incapa intr-un nucleu cu dimensiuni de ordinul micronilor. Aceasta
superhelicare se realizeaza cu ajutorul unor proteine speciale
numite histone. Histonele contin cantitati mari de lisina si
arginina, aminoacizi bazici care sunt incarcati pozitiv la pH
fiziologic. Din acest motiv aceste protine pot sa adere usor la
structura ADN care contine grupari fosfat cu sarcini negative.
Exista 5 clase de histone (H1, H2a, H2b, H3, H4) care realizeaza un
miez proteic pe care ADNul se infasoara de aproximativ doua ori.
Histona H1 nu intra in structura miezului dar are un rol in
stabilizarea structurii. Celelalte histone formeaza un
octamer(2H2a-2H2b2H3-2H4) care impreuna cu 2 spire de ADN formeaza
un nucleozom. Deci cu ajutorul histonelor ADN-ul eucariot este
impachetat de mai multe ori formandu-se o structura super
spiralata.
Exista si proteine nehistonice in nucleu, mai mult de 1000 de
tipuri, cu functii diverse: diferiti factori de transcriptie,
polimeraze, receptori hormonali, etc. Hertonele, de exemplu, au rol
in modificarea structurii hipercompactate a ADN-ului in vederea
citirii genelor existente la acest nivel. Nu toate nucleotidele din
lantul ADN (numarul lor total fiind de aproximativ 3,5 miliarde de
perechi) codifica informatia necesara sintezei de proteine. Exista
3 tipuri de portiuni in aceasta molecula: - Zone inalt repetitive
construite din 6-10 perechi de baze ce se repeta de sute de mii de
ori. - Zone moderat repetitive - Zone non-repetitive, portiuni
corespunzatoare genelor, detinatoare de informatii ce sunt stocate
prin insiruirea intr-o anumita ordine a celor 4 litere ale
alfabetului genetic: A, T, C, G. La eucariote, o gena apare doar o
singura data in tot genomul, exceptie facand doar cateva gene care
se pot repeta, de exemplu genele care codifica histonele sau ARN-ul
ribozomal. Tot in cazul eucariotelor, s-a observat in ADN prezenta
unor portiuni nepurtatoare de informatie chiar in interiorul
genelor. Acestea poarta numele de introni si, in procesul de
biosinteza proteica vor fi copiate pe ARN mesager dar vor fi apoi
excizate. Doar genele pentru histone si genele procariotelor nu
prezinta introni. Lantul unei catene de ADN este format prin
insiruirea celor 4 tipuri de nucleotide care se unesc intre ele cu
ajutorul acidului fosforic. Astfel, se formeaza legaturi
fosfodiesterice intre deoxiriboza unui nucleotid si o deoxiriboza a
urmatorului, in pozitiile 5 si 3. Scheletul va fi deci construit
dintr-o succesiune deoxiriboza-acid fosforic, de fiecare pentoza
fiind legata cate o baza azotata. Legaturile 5-3 vor conferi un
sens pentru fiecare dintre cele 2 catene care se infasoara una in
jurul celeilalte deci se poate vorbi de o catena cu sens 5-3 si de
o catena cu sens invers, 3-5 numita si catena antisens (catene
antiparalele). S-a demonstrat ca ADN-ul adopta aceasta conformatie
dublu helicoidala din ratiuni de stabilitate energetica. Structura
este stabilizata astfel prin interactiunea dintre bazele azotate
care se plaseaza in interiorul dublului helix. Aici apar legaturi
de hidrogen intre bazele de pe o catena si bazele de pe cealalta
catena conform unui principiu al complementaritatii. Acest
principiu postuleaza ca intotdauna adenina se leaga de timina prin
2 legaturi de hidrogen si guanina se leaga de citozina prin 3
legaturi de hidrogen.
Cele 2 catene pot fi despartite in anumite conditii (de exemplu
temperatura si pH) prin desfacerea legaturilor de hidrogen. Acest
fenomen se numeste denaturare si este reversibil, prin revenirea la
conditiile initiale, procesul numindu-se renaturare. S-a observat
ca zonele cu o cantitate mai mare de guanina si citozina sunt mai
greu de denaturat din cauza legaturii de hidrogen in plus dintre
acestea. Hibridizarea reprezinta procesul de renaturare a doua
catene provenind de la 2 acizi nucleici diferiti, tehnica prin care
se poate aprecia de exemplu, gradul de potrivire a acizilor
nucleici provenind de la specii diferite. Exista mai multe
posibilitati de structurare a dublului helix (A,B,Z), cea mai
raspandita fiind forma B. Aceasta forma se prezinta ca o elice
formata din doua lanturi antiparalele, stabilizata prin legaturile
de hidrogen din interior. Diametrul este de 20 A, pasul elicei
(distanta pentru o rotatie completa de 360) este de 34 A si
cuprinde o spira cu 10 perechi de nucleotide. Deci distanta dintre
2 nucleotide de pe acelasi lant este de 3,4 A. Exista doua zone
numite jgeaburi (unul mare si unul mic), importante penru ca aici
se poat face un contact mai intim intre diferite substante
(medicamente, proteine) si molecula de ADN. Se poate vorbi deci de
mai multe posibilitati de abordare structurala a ADNului: -
Structura primara, care ne arata insiruirea bazelor azotate pe
scheletul format din pentoze unite prin punti fosfodiesterice.
(vezi figura 2) - Structura secundara, care ne arata forma de dubla
elice stabilizata de puntile de hidrogen dintre bazele azotate
complementare.
-
Structura tertiara, ce explica superhelicarea si compactarea
moleculei cu ajutorul proteinelor, fenomen necesar potrivirii cu
dimensiunile reduse ale nucleului.
ACIZI NUCLEICI PROCESE BIOCHIMICE GENETICE Dogma centrala a
geneticii postuleaza urmatoarea transformare: ADN ARN proteine sau
O GENA UN ARN MESAGER O PROTEINA. Descoperirile din ultimii ani nu
au contrazis transformarile clasice care sunt fundamentul acestei
stiinte ci au completat in mod fericit dogma centrala, facand-o mai
complexa si mai apropiata de adevar.
Exista 3 procese esentiale in manipularea informatiei genetice
pentru orice celula vie: 1. Replicarea ADN - reprezinta procesul
prin care cantitatea de ADN dintr-o celula se dubleaza si se
regaseste practic neschimbata in fiecare dintre celulele fiice. 2.
Transcriptia - reprezinta procesul prin care o parte din informatia
de pe ADN este copiata pe ARN (o genaun ARN mesger). 3. Translatia
reprezinta procesul prin care informatia din ARN este folosita la
sinteza unei proteine in ribozomi.
REPLICAREA ADN Toate celulele se divid in timpul vietii, unele
dintre ele sufera mai multe diviziuni si altele se divid de un
numar limitat de ori. In timpul diviziunii celulare informatia
prezenta la nivelul ADN-ului se conserva de la o generatie la alta
din punct de vedere cantitativ si calitativ. Acest proces care se
numeste replicare este semiconservativ deoarece in celulele noi
constituite se regaseste o structura a ADN-ului construita dintr-o
catena mama si o catena noua, complementara. Replicarea
semiconservativa a fost demonstrata clar la bacterii:
administranduse ca unica sursa de azot, clorura de amoniu marcata
cu azot radioactiv sa observat ca dupa prima diviziune bacteriana
azotul radioactiv s-a regasit doar in procent de 50%. La urmatoarea
diviziune acest procent scade inca odata la jumatate, s.a.m.d..
Replicarea ADN necesita un sistem biochimic si enzimatic complex
format din: - ADN matrita (ADN-ul mama) - Deoxinucleotidele
necesare sintezei (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) - Ribonucleotidele
necesare sintezei unui ARN care va folosi ca punct de plecare
pentru sinteza ADN (ATP, GTP, CTP, UTP) - Ioni de magneziu - Un
sistem multi enzimatic compus din: a. topoizomeraze enzime care
detensioneaza elicea ADN-ului in timpul replicarii. b. ADN primaza
enzima care produce mici fragmente de ARN, necesare inceperii
procesului de replicare.
c. ADN polimeraza ADN dependenta si care are o serie de
caracteristici: sintetizeaza ADN in directia 5`-3`, are si
activitate exonucleazica pentru ca elimina unele nucleotide in
timpul replicarii, are o inalta fidelitate pentru ca exercita un
control strict al replicarii. La procariote existe 3 ADN
polimeraze. d. ADN ligaza enzima care reuneste fragmentele de ADN
rezultate in timpul replicarii. Intregul complex de factori care
participa la acest proces se mai numeste replizom. Exista diferente
in replicarea la procariote si eucariote. Replicarea la procariote
ADN-ul procariotelor este compus dintr-un singur cromozom circular.
Replicarea incepe in puncte bine determinate numite regiuni de
origine (ori). La unele bacterii exista o singura regiune de
origine (punct de plecare). De aici procesul se desfasoara pa
ambele catene ale ADN-ului circular astfel incat la un moment dat
un ADN bacterian poate lua forma literei grecesti theta. Initierea
replicarii incepe prin desfacerea legaturilor de hidrogen dintre
nucleotidele de pe cele doua catene ale ADN-ului mama, in punctul
de origine (reamintim ca adenina se leaga de timina prin 2 legaturi
de hidrogen si guanina de citozina prin 3 legaturi de hidrogen,
conform principiului complementaritatii;A=T, G=C). Enzimele
implicate in acest proces se numesc helicaze. Astfel pe catenele
eliberate se poate construi o noua catena de ADN. Deci in fata
enzimelor care realizeza replicarea se afla aceste helicaze care
separa cele 2 catene. Prin separarea celor 2 catene dubla elice a
ADN-ului devine din ce in ce mai tensionata. Aceasta situatie ar
putea duce la oprirea replicarii daca nu ar exista topoizomerazele
care detensioneaza ADN-ul. Topoizomeraza 2 numita si ADN giraza
poate induce tensionari negative, inverse tensionarilor produse de
helicaza permitand continuarea procesului. Astfel se poate explica
actiune antimicrobiana a acidului nalidixic (negram) care inhiba
ADN giraza si blocheaza deci diviziunea bacteriana. Topoizomeraza 1
detensioneaza ADN-ul suprahelicat pentru ca poate sa desfaca o
legatura fosfodiesterica de pe o catena a ADN-ului permitand
relaxarea elicei (catena rupta se roteste in jurul celelalte
catene). Dupa detensionare catena desfacuta se poate reface
deoarece fenomenul este reversibil, mai mult decat atat neavand
nevoie de energie pentru ca aceasta energie este conservata cu
ajutorul unui rest de tirozina din enzima. Odata desfacut si
detensionat, pe ADN-ul mama se poate incepe construirea celor 2
catene a noului ADN. Pentru aceasta este nevoie de mici molecule de
ARN numite primeri sau initiatori (au 5-10 nucleotide). Acestea
sunt realizate cu ajutorul ADN primazei. De la capatul 3` al
ARN-ului initiator pleaca sinteza ADN-ului propriu zis prin
adaugarea succesiva a deoxinucleotidelor care se unesc prin
legaturi fosfodiesterice. Molecula fiica nou constituita respecta
cu strictete ADN-ul matrita astfel incat daca pe ADN-ul mama exista
timina acolo va veni adenina, pentru citozina va veni guanina,
s.a.m.d. , conform principiului complementaritatii. Enzima necesara
este ADN polimeraza III.
Energia necesara procesului provine din legaturile fosfat
tmacroergice ale nucleotidelor folosite. Pirofosfatul rezultat este
desfacut in 2 molecule de fosfat impingind reactia ireversibil spre
dreapta. Replicarea continua astfel pana la intalnirea unei noi
unitati de origine. Finalul replicarii necesita eliminarea ARN-ului
initiator si asigurarea continuitatii catenei nou formate. Enzima
necesara este ADN polimeraza 1 care este deci si polimeraza si
exonucleaza. Asta inseamna ca ribonucleotidele din ARN-ul initiator
sunt inlocuite pe rand cu deoxinucleotidele necesare noului ADN.
Exista proteine specifice legate pe catena ADN, cu rol in reglarea
si optimizarea interactiunii dintre catena si enzime. Acest
mecanism explica foarte bine sinteza lantului polinucleotidic cu
directia 5`-3`. Insa este demonstrat ca ADN polimeraza nu poate
functiona decat in aceasta directie, deci la prima vedere s-ar
putea crede ca cealalta catena a ADN-ului mama care are directie
inversa nu poate fi folosita in acelasi fel. S-a demonstrat ca si
cealalta catena poate fi copiata cu ajutorul aceleiasi ADN
polimeraze printr-un mecanism asemanator dar care pleaca in sens
invers. Deci de data asta punctul de plecare a polimerazei este
bifurcatia de replicare construindu-se astfel catena in directia
5`-3`. Procesul este discontinuu, pentru ca dupa ce punctul de
bifurcatie avanseaza suficient de mult o noua sinteza pleaca din
dreptul noului punct de bifurcatie. Astfel se vor forma mai multe
fragmente mici de ADN numite fragmente Okazaki.Fragmentele Okazaki
au o lungime de cateva sute de nucleotide la eucariote si cateva
mii la procariote. Fragmentele vor fi reunite dupa excizia fiecarui
fragment de ARN initiator care insoteste lanturile Okazaki. Cu
excizia ARN-ului se ocupa tot ADN polimeraza 1 iar cu unirea
lanturilor de ADN ramase se ocupa ADN ligaza (necesita cosum de
ATP).
In final de pe fiecare catena a ADN-ului mama se construieste
cate o catena noua rezultand 2 molecule polideoxinucleotidice
bicatenare cu un lant vechi (matrita sau mama) si un lant nou
sintetizat de complexul enzimatic numit replicare. Intregul
mecanism este extrem de fidel astfel incat erori nu apar decat cu o
frecventa de una la un milion zece miloane de nucleotide. ADN
polimeraza are o extraordinara capacitate de autocontrol astfel
incat daca o nucleotida nu este pusa conform principiului
complementaritatii aceasta este imiediat eliminata si inlocuita cu
nucleotidul corespunzator. Viteza replicarii este de sute de
nucleotide pe secunda si se face aproape perfect.
Replicarea la eucariote Se face asemanator cu cea de la
procariote. Exista totusi o serie de particularitati: - ADN
polimerazele: aici sunt in numar de trei , si . polimeraza este
implicata in replicarea ADN-ului nuclear, polimeraza este implicata
in replicarea ADN-ului mitocondrial. Pe de alta parte nici una din
enzime nu are activitate exonucleazica. - originea replicarii: la
eucariote viteza este mai mica si s-ar parea ca nu exista
explicatie cum aprope 2 metri de ADN care contine in jur de 3
miliarde jumatate de baze nucleotidice pot fi copiate doar in
aproximativ 8 ore. Dar explicatia este foarte simpla pentru ca
exista mai multe origini de replicare, aproximativ una la cateva
zeci de mii de baze care functioneaza in acelasi timp. Aici, in
momentul inceperii copierii fiecare origine are cate un replizom
care se ocupa de ambele catene ale ADN-ului. Fidelitatea este si
mai mare, riscul erorii fiind de una la cateva miliarde. - exista
un mecanism propus pentru catena 5`-3` a ADN-ului mama in momentul
copierii. Se pare ca la nivelul replizomului aceasta catena poate
face o bucla care permite folosirea complexului de sinteza in
acelasi sens ca in cazul catenei 3`-5`. - biosinteza ADN apare in
faza S a diviziunii celulare, intreaga cantitate de ADN si histone
(necesare impachetarii) fiind dublata complet. ADN ligazele si
fragmentele Okazaki se regasesc si la mamifere deci si aici
procesul este discontinuu. Diferite situatii (radiatii puternice,
toxice, etc.) pot provoca mutatii in timpul replicarii. De exemplu,
radiatiile ultraviolete pot genera formarea dimerilor intre 2
nucleotide pirimidinice (exemplu timina-timina). Acest defect poate
fi inlaturat prin
actiunea unor enzime specializate care excizeaza si repara
bazele anormale. Cel mai puternic generator de mutaii ramane
stressul oxidativ (de diverse cauze) care poate sa produca diverse
oxidari (de exemplu transformarea guaninei in oxiguanina),
intreruperi ale catenei acizilor nucleici, modificari ale
pentozelor, etc. Consecinta poate fi (in cazul in care repararea
este depasita) oprirea ciclului celular la nivelul punctelor de
control (checkpoint) si chiar moartea celulara programata
(apoptoza). Molecula de ADN poate fi sintetizata folosindu-se ca
matrita o molecula de ARN. Este o situatie mai rar intalnita, de
exemplu in cazul anumitor virusuri ARN. Acestia prezinta o enzima
speciala numita revers transcriptaza care este o ADN polimeraza ARN
dependenta si are capacitatea de a copia informatia de pe ARN-ul
virusului care a patruns in celula pe o molecula de ADN care dupa
ce devine dublu catenar se insera in genomul gazdei. Celula astfel
parazitata va fabrica inconstient proteine si ARN, acesta fiind
modul de inmultire a unui virus. Cel mai bun exemplu este virusul
HIV care infecteaza in special limfocitele T helper si care poate
fi partial inhibat cu medicamente care blocheaza revers
transcriptaza. Revers transcriptaza modifica intr-o mica masura
teoria clasica mendeliana a geticii care postuleaza procesul ADNARN
proteine. Intre ADN si ARN informatia poate fi copiata in ambele
sensuri. Pe de alta parte revers transcriptaza este utila obtinerii
genelor sintetice plecandu-se de la diferiti ARN mesageri, usor de
izolat. Exista o multitudine de baze azotate modificate artificial
care pot sa inhibe replicarea normala a AND-ului. Unele dintre
acestea pot fi folosite ca medicamente antivirale sau citostatice
(ex. : 5-fluorouracil, 5-bromouracil etc.) TRANSCRIPTIA ARN
Reprezinta un proces absolut necesar de transfer a informatiei
genetice de pe ADN (o portiune a ADN-ului numita gena) pe ARN-ul
mesager. Acesta este modalitatea de transport a informatiei care se
gaseste in nucleu la ribozomii din citoplasma in vederea sintezei
proteinelor. Exista 3 tipuri importante de ARN: 1. ARN mesager
(ARNm). 2. ARN de transfer (ARNt). 3. ARN ribozomal (ARNr). Deci
transcriptia reprezinta sinteza ARN-ului mesager. Structura
acestuia este dictata de matrita ADN-ului copiat (gena). Aceasta
matrita sau portiune de ADN numita gena se poate afla pe oricare
dintre cele 2 catene ale ADN-ului si este transcrisa in functie de
necesitatile proteice ale fiecarei proteine. La procariote exista o
singura ARN-polimeraza care catalizeaza formarea tuturor tipurilor
de ARN (ribozomal de transfer si mesager). La eucariote procesul
este mai specializat in sensul ca exista 3 tipuri de ARNpolimeraza:
- ARN-polimeraza I pentru sinteza ARN ribozomal - ARN-polimeraza II
pentru sinteza ARN mesager - ARN-polimeraza III pentru sinteza ARN
de transfer a. Transcrierea informatiei pe ARN necesita la inceput
un semnal de initiere. Deci ARN-polimeraza se fixeaza pe o portiune
a ADN-ului numita promotor. Acest locus promotor este constituit
din aproximativ 40 de perchi de nucleotide specifice inceputului
fiecarei gene. Mai exista o secventa de 6 nucleotide situata
inaintea celei
dintai care mareste exactitatea initierii transcrierii, si un
factor sigma care creste afinitatea enzimei pentru promotor.
b. Odata fixata, ARN-polimeraza va incepe elongarea moleculei de
ARN folosind ribonucleotide care se ordoneaza conform matritei
ADN-ului ce se copie. Deci gena impune cu ajutorul enzimei
aranjarea nucleotidelor intr-o ordine stricta care respecta
principiul complementaritatii (A=U, C=G). Acum factorul sigma se
disociaza de ADN permitand ARN-polimerazaei sa gliseze dea lungul
moleculei si sa adauge rand pe rand ribonucleotidele necesare
elongarii moleculei de ARN. Prin atacuri nucleofile
ribonucleotidele se leaga una de alta fiecare la capatul 3`-OH a
celei din urma.
c. Terminarea transcrierii se face cand ARN-polimeraza ajunge la
capatul genei unde intalneste un numar mare de nucleotide C si G.
Aici, cu ajutorul factorului aceste semnale sunt recunoscute,
enzima paraseste gena matrita si poate sa isi reia functionarea in
alta parte prin reasocierea cu factorul sigma.
Exista situsuri reglatoare ale transcriptiei situate in fata
situsurilor promotoare care supravegheaza frecventa transcrierii.
Pe de alta parte promotorii pot imprima viteze diferite procesului
ceea ce face ca anumite gene sa fie mai active decat altele.
Exista diferite substante care pot bloca transcrierea. Exemple:
actinomicina modifica structura ADN-ului matrita si acesta nu mai
poate fi copiat; rifampicina, chimioterapic folosit in tratarea
TBC-ului si activ pe un spectru larg microbian inhiba
ARN-polimeraza bacteriana. ARN-ul mesager astfel obtinut difera la
procariote fata de eucariote. Astfel in ARN-ul procariot molecula
este continua deci intreaga informatie de aici poate fi folosita
pentru sinteza proteinelor. In ARN-ul eucariot s-a observat
prezenta unor
portiuni repetitive de nucleotide numite introni care nu detin
nici o informatie pentru sinteza proteica. Acesta este motivul
pentru care ARN-ul mesager primar este mult mai lung decat ARN-ul
mesager folosit de ribozom. Deci intronii trebuie excizati si
pastrate doar portiunile cu informatie utila numite exoni.
Excizarea intronilor se poate face in 2 feluri: - Cu ajutorul
unor enzime speciale care recunosc capetele fiecarui intron
(exemplu: ARN U1) acestia sunt eliminati si capetele libere ale
exonilor sunt sudate. - Prin autocataliza, fenomen remarcabil care
pune pentru prima data in discutie posibilitatea catalitica a unui
compus neproteic. Deci chiar ARN-ul ribozomal isi autoelimina
intronii printr-un proces care genereaza o bucla (reprezentata de
intron), eliminarea acestei bucle cu ajutorul guanozinei si
coaserea exonilor. O astfel de posibilitate surprinzatoare a facut
ca primul ARN mesager descoperit cu aceasta insusire sa fie denumit
ribozim. S-a reconsiderat viziunea asupra acizilor nucleici care
erau vazuti doar ca molecule informationale si care acum sunt
priviti si ca enzime. Rolul intronilor, departe de a fi pe dea
intregul cunoscut, se conturreaza in directia reglarii procesului
de diferentiere celulara. Mai mult chiar, s-ar parea ca detin
controlul transportului ARN-ului mesager din nucleu in citoplasma.
Este posibila biosinteza ARN pe matrita de ARN, de exemplu in cazul
unor virusuri. Acestea isi injecteaza materialul genetic in celula
gazda si cu ajutorul unei ARN-polimeraze ARN dependenta numita si
replicaza reuseste sa isi multiplice molecula informatinala.
Procesul este analog unei replicari obisnuite.
Un exemplu clasic de inhibitie a transcriptiei este mecanismul
de blocare a ARN polimerazei II de catre amanitina. Aceasta
molecula toxica este un octapeptid ciclic produs de Amanita
phalloides (buretele viperei) cea mai toxica ciuperca din aceasta
zona geografica. Astfel, o singura ciuperca matura poate sa omoare
doi oameni. TRNSLATIA(BIOSINTEZA PROTEINELOR) Este un fenomen
foarte complex care necsita conlucrarea a peste 300 de enzime si
diverse tipuri de acizi ribonucleici. Informatia necesara ordonarii
aminoacizilor in proteine (deci constituirea structurii primare)
este transportata de pe gena de la nivelul ADN-ului nuclear in
citoplasma cu ajutorul ARN-ului mesager. Deci fiecare acid
ribonucleic are fuctii specifice: a. ARN-ul ribozomal intra in
structura ribozomului care reprezinta fabrica de proteine. b.
ARN-ul de transfer este molecula care transporta fiecare din cei 20
de aminoacizi la locul de sinteza. c. ARN-ul mesager detine
informatia constructiei corecte a proteinei. a. ARN-ul ribozomal
prin asociere cu proteine si lipide constituie ribozomul sau
corpusculul lui Palade. Ribozomul este construit din 2 subunitati,
una mica (30S la procariote si 40S la eucariote) si una mare (50S
la procariote si 60S la eucariote). Astfel ribozomul va avea
constanta de sedimentare 70S la bacterii si 80S la organismele
superioare. Precum am vazut, ribozomul prezinta 2 situsuri
speciale: situsul A care este sediul ARN-ului de transfer ce vine
cu aminoacizii necesari sintezei proteice si situsul P ce
gazduieste ARN-ul de transfer legat de un lant polipeptidic deja
sintetizat. Procesul de sinteza proteica poate fi schitat sumar
prin interactiunea celor 3 tipuri de ARN. Cu alte cuvinte
informatia din ARN-ul mesager este citita in ribozom si transpusa
in proteine, aminoacizii necesari fiind adusi de ARN-ul de
transfer. Mai multi ribozomi pot citi simultan acelasi ARN mesager
pe care il parcurg in acelasi sens. Se constituie astfel un
poliribozom, structura ce permite accelerarea sintezei
proteice.
b. ARN-urile de transfer sunt molecule mici cu o forma care
poate fi asemanata cu un trifoi cu patru foi sau cu o cruce. La un
capat al unuia din brate (capatul 3`
terminal) toti ARNt au secventa CCA. Aici se fixeaza unul din
cei 20 de aminoacizi. Deci exista cel putin 20 de tipuri de ARNt.
In realitate exista mai multe tipuri pentru ca un aminoacid poate
fi transportat de diferiti ARNt. O regula este insa sigura: fiecare
ARNt ce transporta un aminoacid are la bratul diametral opus o
secventa de 3 nucleotide numita anticodon care este strict
specifica aminoacidului transportat. Anticodonul trebuie sa se
potriveasca perfect prin complementaritate cu codonul corespunzator
de pe ARN-ul mesager. S-a demonstrat ca informatia genetica este
foarte bine organizata. Astfel la nivelul ADN-ului, exceptand
portiunile care nu codifica nici o informatie si sunt doar zone
polinucleotidice repetitive sau moderat repetitive, informatia
pentru fiecare proteina este organizata in gene. O gena reprezinta
deci un grup mai mare sau mai mic de nucleotide purtatoare de
informatie. Un codon reprezinta 3 nucleotide. Fiecare codon
codifica un aminoacid. Fiecare gena codifica o proteina. Deci
ARN-ul mesager copie toti codonii unei gene transportand in acest
fel informatia pentru fiecare aminoacid. La nivelul ribozomului
fiecare codon se potriveste cu anticodonul complementar de pe ARNt
si aceasta este modalitatea prin care aminoaciziii sunt adusi in
ordine, uniti prin legaturi peptidice si transformati in proteine.
Se poate face o comparatie intre modul de stocare a informatiei in
meomoria calculatoarelor si acizii nucleici. Pentru calculatoare
limbajul primar este in baza 2 (binar), pentru acizii nucleici
limbajul este in baza 4 (patru nucleotide) si este transferat
proteinelor ca limbaj in baza 20 (20 de aminoacizi). Codul genetic
reprezinta alfabetul necesar sintezei de proteine si ne arata care
codoni (3 nucleotide) corespund fiecaruia dintre cei 20 de
aminoacizi. Biosinteza proteinelor (translatia) se realizeaza in 5
etape: 1. Activarea aminoacizilor. 2. Initierea lantului
polipeptidic. 3. Elongarea lantului polipeptidic. 4. Terminarea
lantului polipeptidic si eliberarea acestuia. 5. Prelucrari post
traducere ale proteinei sintetizate. 1. Activarea aminoacizilor
este necesara inceperii biosintezei si poate fi explicata in 2
etape: - In prima etapa aminoacidul reactioneaza cu ATP rezultand
un complex aminoacilAMP. Pirofosfatul eliberat este hidrolizat si
in acest fel reactia este impinsa spre dreapta, fiind ireversibila.
- In a doua etapa complexul cedeaza aminoacidul unei molecule de
ARNt, specifica acelui aminoacid (deoarece anticodonul ARN-ului
corespunde codonului de pe ARN-ul mesager care codifica aminoacidul
respectiv). Precum se observa, activarea se face cu consum de
energie, enzimele implicate sunt ligazele (aminoacil-ARNt
sintetaze) care au o specificitate absoluta. Aminoacidul este legat
deci de carausul sau specific la capatul CCA al acestuia, la
gruparea OH din pozitia 2 sau 3 de pe riboza restului adenilic.
Enzima poate recunoaste daca un aminoacid gresit s-a fixat pe ARNt,
situatie in care il elimina si il inlocuieste cu aminoacidul
corespunzator deoarece prezinta si un locus hidrolitic. 2.
Initierea lantului polipeptidic incepe prin legarea ARN-ului
mesager de subunitatea mica a ribozomului. Reasocierea prematura a
celor 2 subunitati ribozomale este prevenita de factorul de
initiere 3 (IF3). Legarea se face la codonul aminoacidului
amino-terminal, aminoacid de initiere care este formil-metionina
sau metionina, deci codonul AUG sau GUG este codonul de initiere.
Se consuma energie generata de GTP.
Unele molecule de ARN mesager pot codifica mai multe proteine pe
acelasi lant, deci asta inseamna ca vor fi prezenti mai multi
codoni de initiere pe lantul acestui tip de ARN. Exista o secventa
polinucleotidica bogata in purine situata in fata codonului de
initiere care mareste afinitatea subunitatii mici ribozomale pentru
acesta. Urmeaza legarea primului aminoacid care reste bineinteles
formil-metionina. Acesta este adus de ARN-ul de transfer specific
si pozitionat in situsul p ribozomal in dreptul codonului
corespunzator prin potrivirea codon-anticodon(deci anticodonul
ARN-ului de transfer se potriveste numai cu codonul initiator al
ARN-ului mesager). Etapa necesita factorii de initiere 1 si 2(IF1,
IF2). Ultima etapa a procesului de initiere implica legarea
subunitatii ribozomale mari care reintregeste ribozomul. S-a format
acum un complex intre ribozom, ARN mesager si primul ARN de
transfer. Constructia proteinei va necesita mai departe miscarea
lantului ARNm in ribozom care este citit, si informatia va servi
sintezei proteinei. 3. Elongarea lantului polipeptidic se face prin
adaugarea succesiva a aminoacizilor necesari sintezei. Fiecare
dintre acestia este adus de ARN-ul sau de transfer specific si
pozitionat corect prin potrivirea codon-anticodon intre ARN-ul
mesager si ARNul de transfer. Este nevoie de factorul de elongare
si energie sub forma de GTP. Intregul mecanism consta de fapt in
miscarea ARN-ului mesager in ribozom care isi expune codonii rand
pe rand pentru a fi cititi. Citirea reprezinta contactul intre
acesti codoni si anticodonii ARN-urilor de transfer, care vin rand
pe rand cu aminoacizii ce vor constitui proteina. Intregul proces
se desfasoara deci in ribozom, la nivelul situsurilor p si a. ARNt
vine cu aminoacidul 2 in situsul a, aminoacidul initiator se leaga
de al doilea formandu-se un dipeptid pozitionat deci in situsul a,
ARNt ramas liber pleaca din situsul p si ARNt-dipeptidul se muta in
situsul p prin miscarea ARN-ului mesager in ribozom. Procesul
continua in aceeasi maniera pana la elongarea completa a proteinei.
Deci, spre exemplu, aminoacidul 3 vine in situsul a, se formeaza
legatura peptidica intre aminoacizii 2 si 3, ARN-ul mesager se muta
in ribozom astfel incat complexul ARNttripeptid se va muta la
randul lui din situsul a in situsul p, s.a.m.d. Miscarea ARN-ului
mesager in ribozom consuma GTP si este posibila datorita unei
translocaze. Aminoacidul initiator (formil-metionina) va fi
inlaturat din lantul polipeptidic deorece nu are decat un rol de
start al sintezei proteice. Pentru realizarea legaturii peptidice
intre aminoacizi este nevoie de o enzima numita
peptidiltransferaza, un factor de elongare G si consum de energie.
Toxina difterica, molecula foarte toxica fabricate de
Corynebacterium diphtheriae microorganismul care provoaca difteria
blocheaza sinteza proteica prin inhibarea unui singur factor de
elongare. Astfel, o singura molecula poate distruge o celula. 4.
Terminarea sintezei se face cand pe ARN-ul mesager ce trece prin
ribozom apare un codon care nu codifica nici un aminoacid. Acesta
se mai numeste codon stop sau nonsens si nu exista un ARN de
transfer cu anticodonul corespunzator. In acest moment polipeptidul
sintetizat se desface de ARNt, acest ultim ARNt este eliberat din
ribozom si ribozomul se desface din nou in cele doua subunitati
fiind pregatit pentru o noua sinteza. ARNm dupa copiere este
eliminat prin hidroliza. Sinteza de proteine necesita deci un
complex de factori, o mare cantitate de energie si se desfasoara
foarte rapid (100 de aminoacizi pot fi legati in 5 secunde). La
eucariote aminoacidul initiator este metionina, si viteza de
sinteza este mult mai mare decat la procariote.
4. Prelucrarile postraducere ale proteinelor sunt necesare
definitivarii sintezei si transformarii acestor molecule in compusi
functionali. In aceasta ultima etapa se va elimina formil-metionina
initiatoare, se hidroxileaza unii aminoacizi (prolina, lizina),
unlele proteine se pot iodura (tireoglobulina), altele se pot
combina cu molecule neproteice (fosfoproteine, glicoproteine),
altele se pot desface in fragmente mai mici (preproinsulina).
Biosinteza proteinelor dispune de mecanisme exacte de reglare.
Cel mai acceptat este cel descris de Jacob si Monod care au
dezvoltat teoria operonului. S-ar parea ca exista inductori si
represori ai biosintezei care mentin o balanta a procesului.
Inhibitori ai sintezei proteice Sunt in general antibiotice,
compusi care pot astfel sa blocheze activitatea celulara la
procariote. Inhibitorul Mitomicina Acid nalidixic Rifampicina
Actinomicina Streptomicina Cloramfenicol Tetraciclina
Eritromicina,Azitromicina Puromicina Kanamicina Procesul inhibat
Replicare Replicare Transcriere Transcriere Translatie Translatie
Translatie Translatie Translatie Translatie Mecanismul de actiune
Impiedica separarea catenelor de ADN Inhiba ADN giraza Inhiba ARN
polimeraza Se fixeaza pe ADN Inhiba legarea ARNt initiator la
subunitatea 30S Inhiba peptidil transferaza Inhiba legarea ARNt la
ribozomi Blocheaza subunitatea 50S Blocheaza elongarea inhiband
competitiv ARNt Inhiba citirea codului genetic
Sinteza proteica vedere de ansamblu: (dupa Grays anatomy)
Exist numeroi compui de origine bacterian care interfera sinteza
proteica in celulele eucariote. Acestea sunt toxinele proteice
produse de bacterii (exotoxine termolabile), heteropolimeri compusi
in general din 2 fragmente: un fragment A cu rol
determinant in actiunea toxica a toxinelor si fragmente B cu rol
de liganzi la diferite tipuri de receptori specifici ai celulelor
eucariote. Fragmentul A poate sa catalizeze transferul ADP-ribozei
din molecula de NAD pe diverse molecule tinta implicate in sinteza
proteica. Astfel functia acestora va fi modificata si apare efectul
toxic ca in urmatoarele exemple: Toxina (bacteria) Difterica (C.
Diphtheriae) Toxina A (Bacilul pioceanic) Toxina Shiga (S.
dysenteriae) Mecanisme de actiune (acceptori de ADP-riboza)
Factorul de elongare 2 (EF2) EF-2 Fractiunea ribozomala 60S si
factorul EF-1 Efecte biologice sau clinice Stopeaza sinteza
proteica: efecte necrotice, miocardosi neurotoxice Stopeaza sinteza
proteica: efecte necrotice Stopeaza sinteza proteica: efecte
enteroneurotoxice