Nouveaux outils de cytogénétique moléculaire (MLPA et CGH) utilisés en constitutionnel COUTTON Charles EC Génétique Jeudi 12 Janvier 2012
Nouveaux outils de cytog énétique moléculaire (MLPA et CGH) utilis és en constitutionnel
COUTTON Charles
EC GénétiqueJeudi 12 Janvier 2012
Remaniements génomiques
• Regroupent les duplications, les délétions, les insertions, les inversions et les translocations.
• Impliquent des régions d’une centaine de paires de bases jusqu’à plusieurs millions
• A l’origine de: – polymorphismes bénins – maladies génétiques regroupées sous le nom
de maladies ou désordres génomiques
Mécanismes• Trois principaux mécanismes:
– NAHR (Non Allelic Homologous Recombination) ou recombinaison homologue non allélique
– NHEJ (Non Homologous End Joining) ou raccordement d’extrémités non homologues
– FoSTeS (Fork Stalling and Template Switching)
• Surviennent aussi bien dans les cellules germinales (méiose) que dans les cellules somatiques (mitose / mosaïque)
=> maladies génétiques / cancers
NAHR• Dérive d’un mécanisme de réparation d’une CDB de l’ADN• Recherche d’une matrice contenant une séquence homologue =>
erreurs possibles si une mauvaise matrice de réparation est utilisée => NAHR
• Du à des séquences répétées appelées LCR (Low copy repeat) (5 % de notre génome , forte homologie (>90%)
• A proximité de structures génomiques capables de générer des CDB
NAHR
Pathogène ou bénin ?Bénin +++
Risque pour la descendance
NHEJ• Mécanisme biochimique
de réparation de l’ADN
• Perte d'information : les extrémités de la cassure double brin sont souvent digérées avant d'être recollées
• Impliqués dans les • recombinaisons
«physiologiques» V(D)J•• En pathologie: cancers
+++, DMD…
FoSTeS• Lié à la réplication (pas
de CDB)
• Entraine la formation de réarrangements non récurrents complexes
• En pathologie: Pelizaeus-Merzbacher, Potocki-Lupski (PTLS)
• Nécessite « que » des micro-homologies de séquences
Copy Number Variation
• Si le réarrangement génomique entraine une variation du nombre de copies (gain / perte) d’un segment d’ADN de 1 kb et plus, on parle de CNV (Copy Number Variation)
• Soit polymorphes, soit pathogènes:⇒ Intérêt médical⇒ Intérêt d’étude et de détection
CNV et polymorphismes
Cohorte d’individus « apparemment » sains
CNVs et polymorphismes
� Répertoriés dans des bases de données (DGV)
� 57 000 CNVs décrits
� Représenterait 13 à 20% du génome
� Situés dans des régions pauvres en gènes ou liés àl’environnement (R olfactifs)
� Si F > 1% : CNP (copy number polymorphism)
CNVs et pathologiesPhénotype anormal: RM + dysmorphie
Répertoriées dans des bases de données(DECIPHER)
Méthodes de detection
1970
1990
2000
.
.
.
Premier caryotype
« banding »
« banding » haute-résolution
FISH
MLPA, QMPSF
CGH-array
.
.
.
.
.
.
1956
CGH
.
.
.
FISH
MLPACaryotype
CGH-array
Approche globale Approche ciblée
Choix des techniques
Choix des techniques
ATGCACTGATGAATGCATGCAATATGCACTGATGAATGCATGCAAT
Gène moyen: 2.104 pb
Sous-bande: 2.105 pb
Bande chromosomique: 3.106 pb
Exon: 50 à 1000 pb
Caryotype
FISH
Séquençage
CGH-array
MLPA
Paire de bases
Réso
luti
on
Caryotype / FISH
Carotype
Résolution entre 3 et 5 Mb
Inconvénients: long ; faible résolution; cout
Avantages: mécanismes remaniements
FISH
Résolution: 150KbInconvénients: petite duplication, cout,culture, banque de clonesAvantages: mécanismes remaniements
FISH
CGH-array
• Technique d’hybridation comparative génomique sur microréseau(puce à ADN).
• Technique de quantification relative: mise en évidence de pertes ou de gains de matériel chromosomique (par rapport àune référence).
• Digestion de l'ADN génomique par les enzymes AluI et RsaI– Obtention de produits de digestion dont la
taille varie entre 100 et 500 pb• Marquage fluorescent de l'ADN digéré
– Alexa Fluor 5 et Alexa Fluor 3• Purification sur colonne de l'ADN digéré et
marqué• Vérification du marquage au Nanodrop
– Rejet des échantillons si marquage insuffisant
CGH-array
CGH-array
Dans chaque spot:� Fragment spécifique d’ADN simple brin de petite taille (60 pb)� Dépôt multiple du même oligonucléotide
• Hybridation sur lame CGH– 4x180K– Caisson ozone free– Durée 24 h à 65°C
ADN Patient
ADN Témoin
CGH-array
• LavagesCGH-array
• Scan des lames et extraction des données– Mesure des intensités de fluorescence – Logiciels d'extraction des données et
d'analyse
CGH-array
• Interprétation
Quantité d’ADN identique chez le patient et le témoin
- fluorescence jaune
- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0
Patient Témoin Patient TémoinPatient Témoin
=
CGH-array
Log2(R/V)
• Interprétation
Quantité d’ADN identique chez le patient et le témoin
- fluorescence jaune
- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0
Patient Témoin Patient TémoinPatient Témoin
=
Quantité d’ADN moindre chez le patient par rapport au témoin
- délétion
- fluorescence verte
- ratio de fluorescence log2(1/2) = -1
CGH-array
Log2(R/V)
• Interprétation
Quantité d’ADN identique chez le patient et le témoin
- fluorescence jaune
- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0
Patient Témoin Patient TémoinPatient Témoin
=
Quantité d’ADN moindre chez le patient par rapport au témoin
- délétion
- fluorescence verte
- ratio de fluorescence log2(1/2) = -1
Quantité d’ADN supérieure chez le patient par rapport au témoin
- duplication
- fluorescence rouge
- ratio de fluorescence log2(3/2) = 0,58
CGH-array
Log2(R/V)
Expérience en quatuor:
CGH-array
Patient A en Al5 et B en Al3 (témoin)
CGH-array
Délétion ?
Duplication ?
• Patient A en Al5 et B en Al3 (témoin) : courbe rouge
• Courbe rouge : log2(1/2) = -1• 1 copie patient / 2 copies témoins
• Patient A en Al3 et D en Al5 : courbe verte
• Courbe verte : log2(2/1) = 1• 2 copies témoins / 1 copie patient
=> Image en miroir⇒ Délétion chez A confirmée
• Pas de miroir pour la duplication⇒ CNV n'appartiennent pas à A
CGH-array
• Avantages du quatuor et dye swap– Moindre coût : 4 patients par lame– Confirmation de l’anomalie qui apparaît en miroir– Bonne attribution des CNV– Lecture plus facile quand la courbe est bruitée– Attention : ne pas associer patients avec clinique strictement
identique
Expérience en quatuor:
CGH-array
CGH-array
Délétion 4q21.22q22.3 ~ 15.2 Mb
Détection d’anomalies au niveau de régions pauvres en bandes
CGH-array
Délétion
DuplicationInv dupdel (8p)
Détection facilité des anomalies complexes
Détection de petits remaniements
Duplication de 30 Kb
CGH-array
Duplication 1qcenq24.2 de 35 Mb en mosaïque à 23 %
Détection de faibles mosaïques
CGH-array
CGH-array
• Différents type de puces CGH-array (en f° des cibles)
– BAC/PAC: robuste, sensible, contrôle aisé, faible résolution (80-200 Kb), limite de la banque
– Oligonucléotides: résolution: < 30kb moy.• Longs: CNV seulement; excellente spécificité• Courts: détection des CNV + SNPS (LOH)
– cDNA: étude du niveau d’expression
• Puces ciblées– Hyperdense sur un région d’intérêt (< 1 kb)– Limitées à des régions précises (résolution std)
• Choix de la plate-forme dépend aussi du cout et des outils d’analyse bio-informatique.
FISH
MLPACaryotype
CGH-array
Approche globale Approche ciblée
Choix des techniques
DenaturationHybridation
MLPA
Ligation
MLPA
Ligation
MLPA
1
2
3
45
1
2
3
45
Amplification
MLPA
Triple X
Témoin
Patient
Séparation électrophorétique
Une différence relative de la hauteur ou surface d’un pic indique une variation du nombre de copie de la séquence cible.
MLPA
Normalisation
• Permets une quantification relative des signaux de chaque sonde:
• par rapport aux sondes contrôles (c)
• par rapport à un témoin négatif (sain)
⇒ obtenir un ratio
⇒ apprécier le nombre de copie de la région cible
Témoin
Exemple
0.5
1.5
0
1 11
c c
MLPA
MLPA et 22q11
Témoin
Patient
ComparaisonDélétion
22q11
Région
22q11
MLPA / CGH-array
Analyse des
signaux
Quantification
MLPA CGH-array
Hybridation
sondes / cibles
• Avantages
• Pas de culture (ADN)• Analyse pangénomique• Haute résolution• Haut débit• Automatisable• Tous types de tissus
• Pas de culture (ADN)• Multiplexage• Spécificité 100%• Sensibilité 100%• Coût• Rapide (48h)• Tous types de tissus
CGH-arrayMLPA
MLPA / CGH-array
CGH-array et RM
• Patients avec RM + dysmorphie:
– Le caryotype seul: 3 à 5% de diagnostic– Caryotype + FISH: 8 à 10% de diagnostic– CGH-array: 9 à 13% d’anomalies supplémentaires
par rapport au caryotype => 12 à 18% de diagnostic
CGH-array en première intention en post-natal ?
MLPA et 22q11
La MLPA détecte 100% des anomalies impliquées
LA FISH ne détecte « que » 95% des anomalies
Stachon et al. 2007. AJMG
• Limites
• Ne détecte pas lesremaniements équilibrés• Anomalie de la ploïdie• Prix• Mécanisme de l’anomalie• Éthique• Interprétation complexe
• Ne détecte pas lesremaniements équilibrés• Anomalie de la ploïdie• Analyse ciblée• Mécanisme de l’anomalie• Faux positifs• Pas automatisable
CGH-arrayMLPA
MLPA / CGH-array
Perte d’un gène suppresseur de tumeur (TP53)Impliqué dans le syndrome de Li-Fraumeni => attitude ?
Ethique
Interprétation
• Que faire quand on trouve des délétions ou des duplications ?
– Est-ce un CNV (Copy Number Variation) bénin ?
– Est-ce un CNV responsable de la maladie ?
– Bases de données
– Vérification de la variation chez le cas index
– Analyse des parents
Interprétation
• Anomalies héritées = polymorphismes ??
- L’expressivité variable : une même maladie s’exprime de manière différente chez plusieurs personnes porteuses de la même anomalie génomique.
- La pénétrance incomplète : elle consiste en l’absence d’expression de la maladie chez une personne porteuse d’une même anomalie génétique.
- La récessivité ou hétérozygote composite : un gène inclus dans la région délétée peut avoir son deuxième allèle porteur d’une mutation révélant ainsi une maladie récessive autosomique.
- L’empreinte parentale : elle consiste en l’expression différentielle de régions génomiques selon qu’elles sont héritées du père ou de la mère du patient.
- La régulation épigénétique : la méthylation ou l’acétylation différentielles de certaines régions génomiques entraînent une modification du niveau d’expression des gènes.
Interprétation
Van Ommen GJ
Nat Genet 37:333-4, 2005
Array CGH
NormalCNV
Polymorphisme(CNP)
ConnuInconnu
Héritéde novo
Anomalie causale
Analyser les parents
Anomaliecausale
Critères de Lee
Guidelines :Vermeesch et al, Shaffer et al
Interprétation
Interprétation
Anomalie de novo dans une région dépourvue de gènes et non répertoriée dans les bases de données
=> interprétation ?
Interprétation
Interprétation
Interprétation
• L’association de plusieurs CNVs apparemment bénins et/ou l’association avec d’autres facteurs comme des facteurs environnementaux peut favoriser l’apparition d’une maladie.
• Depuis quelques années, certains CNVs ont été clairement identifiés comme facteurs de prédisposition ou de susceptibilité à des maladies complexes multifactorielles (cancers, neuro-dégénératives etc…).
Signes d'appel écho ne justifiant pas à eux seuls l'IMG
CNV inconnus
Hérités ?CNV dans les gènes de
prédisposition aux cancers
Technique longue et coûteuse
Interprétation
• CNVs et prénatal
Séquençage haut-débit
• Séquenceurs nouvelles génération
– Séquençage d’un grand nombre de fragments d’ADN au hasard (« shotgun »)
– Séquences générées alignées sur séquence de référence
– Application en cancéro / constitutionnel• Efficacité validée mais recherche fondamentale• Niveau de résolution meilleure que puces