NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI · 2014. 1. 8. · reaktif içine konulmalı (1 mg doku başına yaklaşık 10 μl reaktif) 150 mg’ a kadar ağırlıktaki dokularda RNA

NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI

Dr. Zafer KÜÇÜKODACIGATA HEH Patoloji Servisi

22. ULUSAL PATOLOJİ KONGRESİ7 Kasım 2012

Manavgat

Spektrofotometrik ölçüm Floresans teknik

DNA ve RNA’NIN KANTİTASYONU

Spektrofotometre

Spektrofotometre bir solüsyon tarafından absorbe edilen ışığın miktarını ölçen cihazdır.

Spektrofotometre• Hazırlanan çözeltiden belirli spektrumlarda ışık

geçirilmesi ve bu ışının ne kadarının çözelti tarafından absorblandığının bulunması esasına dayanır.

• Çözeltinin içerdiği madde miktarı ne kadar fazla ise daha fazla ışın, çözelti tarafından soğurulur.

• Spektrofotometre, çözeltinin içinden geçebilen -çözelti tarafından absorblanmayan- ışığın yoğunluğu tespit ederek çözelti içeriğindeki aranan maddenin miktarı hakkında kantitatif bilgi verir.

• Ulraviyole bölgede en çok kullanılan lambalar, hidrojen ve döteryum elektriksel boşalım lambalarıdır. Bu lambalar 180-380 nm arasında ışık yayar.

• Dalga boyu seçicileri (monokromatörler), ışık kaynağından gelen polikromatik ışıktan tek bir dalga boyunda monokromatik ışık elde edilmesini gerçekleştiren düzeneklerdir.

• Spektrofotometrelerde dedektör, maddenin ışığı absorplayıp absorplamadığını anlamak için ışık kaynağından gelen ışığın şiddetinin ölçülmesi amacıyla kullanılan düzenektir.

• Spektrofotometrelerde örneğin konulduğu örnek kapları(küvet),yuvarlak bir tüp veya dört köşe olabilir. Küvetler, soft veya borosilikat camdan, kuartz veya plastikten yapılır.

IŞIK KAYNAĞI

DALGABOYUSEÇİCİ

ÖRNEK KABI DEDEKTÖR

KAYDEDİCİ

Spektrofotometre

• UV spektrofotometre

Elektromanyetik ışınlar dalga boylarına göre adlandırılır.

Dalga boylarına göre;

200-340 nm : Ultraviyole

340-800 nm : Görünür

800-2000 nm: İnfrared

OD 260OD 280

• Dalga boyu uzunluk birimleri cinsinden ifade edilir. Angstrom Spektrofotometrik ölçümlerde nanometre, mikrometre, veya milimikron

10AO = 1nm = 1milimikron

• Absorbansın birimi yoktur. Spektrofotometreden okunan bir sayıdır. Okunan dalgaboyu absorbans ile birlikte

A260 = 0.34

DNA konsantrasyonu (g/mL) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/mL

Deoksiribonükleotid

Ribonükleotid

Nükleotid içerisindeki bazlar 260 nm’de maksimum absorbansı sağlar

DNA konsantrasyonu (g/mL) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/mL

1 A260nm ünite dsDNA

=

50 g/mL

DNA konsantrasyonu (g/mL) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/mL

Nükleik asit maksimum absorbansı 260 nm dalga boyu

Oran 1.8 - 2.0 DNA saf Oran 1.8 den düşük ise protein varlığı ve/veya diğer UV absorbers Oran 2.0 den büyük ise örnek kloroform veya fenol ile kontamine

OD260/OD280 oranı ?

DNA konsantrasyonu (g/mL) = OD260 x 100 (dilüsyon faktörü) x 50 g/mL

Örneğimiz saf mı?

[dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL)[ssDNA] ≈ A260 x (33 µg/mL)[ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL)

DF=1001:99 (Örnek:dsu)

OD260 =0,065OD280 =0,040

• DNA miktarı = 0,065x 100x 50= 325 g/mL= 325 ng/L

• DNA’nın saflığı ?

OD260/280 = 0,065/ 0,040 = 1,625

?

DF=1001:99 (Örnek:dsu)

• NUMUNE

• KÖR

• STANDART

Nano Drop

NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI

• DNA

• RNA

Azotlu heterosiklik bir baz, beş karbonlu bir seker ve bir fosfat grubundan meydana gelir

OH

OCH2

Sugar

H

HH

NH2

N

N N

N

BaseP

O

OH

HO OPhosphate

DNA• KARARLI

– Çift sarmal yapıda– Şeker fosfat omurga– Hidrojen bağlarıyla birbirine bağlanan

baz yapıları– Kümeleşme etkisi (hidrofobik)

• FOSİL ÇALIŞMALARI

DNA

• DNA kararlılığını etkileyen başlıca faktörler – DNA’nın baz içeriği– Tek iplikli DNA oranı– Ortamın ısısı – Ortamın pH değeri – Ortamın tuz içeriği– Fenol-kloroform

DNA

BAZ İÇERİĞİ•A = T zengin DNA moleküllerine göre, G ≡ C’den zengin DNA molekülleri daha kararlıdır.

DNA

TEK İPLİKLİ DNA ORANI•Hücrede tek iplik DNA – yıkıma açık

• ssDNA bağlayan proteinler•Kümeleşme etkisi daha az

DNApH•Asit ve alkaliye genelde dirençli

– güçlü alkaliye dayanıklı – asidik pH’ya hassas

•Kuvvetli asitlerde ve yüksek ısıda nükleik asitler kendilerini oluşturan baz, şeker ve fosfat gruplarına hidrolize olur•Seyreltik asitlerde (pH 3-4) beta-glikozid pürin bağlarında hidroliz

– apürinik DNA hidroksil iyonlarıyla yıkım•Alkali ortam bazların tautomerik durumunu değiştirir

DNA

ISI•sıcaklık artışı ile denaturasyon•ssDNA-dsDNA absorbans

HELIX-COIL TRANSITION

DNA

FENOL-KLOROFORM•Fenol ve kloroform organik solventler•Her ikisi de güçlü denaturasyon ajanları

– proteinleri denatüre ederler•Fenolden etkilenmez

– Kontaminasyon•Kloroform genellikle suya karışmaz

DNA

• ribonükleazlar• deoksiribonükleazlar

– ekzonükleazlar (5' -> 3‘: Ekzonükleaz VII, Bal31 nükleaz 3' -> 5‘: DNA polymerase I, Ekzonükleaz I, Ekzonükleaz VII, Bal31 nükleaz)

– endonükleazlar (Non-spesifik: DNaz I, Mikrokokkal nükleaz, Mung bean nükleaz; spesifik: restriksiyon endonükleazlar)

Fenol-kloroform-izoamilalkol

DNA

• Ultraviyole gibi iyonizan radyasyon• Serbest radikaller• Uygunsuz tüpler

– Polypropylene plastik: 5ng/mm2

• Uygunsuz solüsyonlar• Agresif pipetleme ve vorteksleme

RNA

RNA

RNA

RNaz

RNA

RNaz•Taze doku-dondurulmuş doku

•Neredeyse tüm hücreler ve salgılarda. Neden?

•Laboratuvarda bulaş çok olası. Nereden?

RNARNaz•Saç, tüy, tükrük ve ter gibi vücut salgılarında•Bakteri ve küf mantarı içeren toz partiküllerinde•Pipet uçlarında, laboratuvar tüplerinde, cam veya plastik laboratuvar malzemelerinde•Suda, çözeltiler ve solüsyonlarda •Laboratuvar yüzeylerinde•Dokunun kendisinde

RNazRNaz İÇERMEYEN

ORTAM

YALNIZCA RNA İÇİN KULLANILAN

MALZEME

RNaz•Kabin•Eldiven, eldiven, eldiven..•Pipet seti•Rnaz’sız pipet uçları, vs.•Steril, RNaz içermeyen polipropilenli tüpler

RNaz• Hazır kimyasallar

• RNaz içermeyen su

• NaOH-EDTA

• Çamaşır suyu

• DEPC• Otoklav

RNA

Çalışma öncesi ve sonrası temizlik

•Tezgahlar, cihazlar vb.– hazır kimyasallar

– NaOH

– çamaşır suyu– deterjan güzelce yayar!

RNA

• Otoklav yeterli değil• Cam malzemeler 230oC 2-4 saat• Plastik laboratuvar ürünleri önce 0.1 M

NaOH, sonra 1 mM EDTA ve RNaziçermeyen su ile durulanmalıdır

• Plastik malzemeler DEPC• RNA izolasyonundaki kimyasallar - DEPC

RNA• DEPC (dietilpropilkarbonat)

– Buffer ve cam malzemelerdeki RNazın inaktivasyonu için kullanılan alkilleyici bir ajandır

– %0.05-%0.1– Karsinojen– Tris, HEPES için uygun değil– Otoklavlanamayacak çözeltiler

• Diğer hazır kimyasallar

RNA

• Pürifiye edilmis RNA, -20°C veya -80°C’de

• Solüsyonlar– (1) 1 mM sodyum sitrat, pH: 6.4 – (2) 0.1 mM EDTA (DEPC ile muamele

edilmiş)– (3) 10 mM Tris-HCL, 1mM EDTA, pH: 7.0

• Uzun dönem saklama etanolde -20°C’de ve tercihen etanol ve sodyum asetat ile çöktürme işlemi sonrasında -80°C’de

Eksizyonu takiben doku hızla en az 10 kat hacminde reaktif içine konulmalı (1 mg doku başına yaklaşık 10 μl reaktif)

150 mg’ a kadar ağırlıktaki dokularda RNA 1.5ml’lik (RNAlater TissueProtect) tüplerde

150-500 mg arası doku parçaları, 5 ml’lik (RNAlater TissueProtect) tüplerde stabilize edilir.

RNazsız ortamda, düşük pH, düşük sıcaklık ve yoğun alkol içinde RNA’nın saklanması önerilir

RNaz