NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BI ÆU HI ÊN GEN MÃ HÏA ENZYME …dhsptn.edu.vn/uploads/news/2017_12/bui-thi-ha_tom-tat-la-tieng-viet.pdf · tổng kết các nội dung có liên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ

HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP

ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN

(Catharanthus roseus (L.) G. Don )

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 9420121

TÓM TẮT LUẬN N TI N S SINH HỌC

TH I NGUYÊN - 2017

Công trình được hoàn thành tại:

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM – ĐẠI HỌC TH I NGUYÊN

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm

2. GS.TS. Chu Hoàng Mậu

Phản biện 1: …………………………………………………….

Phản biện 2: …………………………………………………….

Phản biện 2: …………………………………………………….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường

Họp tại: TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - ĐẠI HỌC TH I NGUYÊN

Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2017

Có thể tìm hiều luận án tại:

1. Thư viện Quốc gia Việt Nam

2. Trung tâm học liệu - Đại học Thái Nguyên

3. Thư viện Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

C C CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN Đ N LUẬN N

Các bài báo

1. Bùi Thị Hà, Hồ Mạnh Tường, Hoàng Phú Hiệp, Lê Văn Sơn, Nguyễn

Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015), “Tách dòng phân tử và thiết kế vector

chuyển gen DAT phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.

Don), TAP CHI SINH HOC 37(2), pp. 236-243.

2. Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015),

“Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồi in vitro ở cây dừa cạn (Catharanthus

roseus (L.).G.Don)”, Tạp chí KHĐHQGHN. Khoa học Tự nhiên và công

nghệ, Tập 31, sô 4S , tr 56-62.

3. Bùi Thị Hà, Đỗ Huy Hoàng, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2016),

“Nghiên cứu quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.)

G. Don)”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Tập 157, số 12/1

4. Bui Thi Ha, Nguyen Thi Ngoc Lan, Nguyen Thi Tam , Le Van Son, Chu

Hoang Mau (2017), “Expression of the gen encoding deacetylvindoline 4-O-

acetyl transferase (CrDAT) from Catharanthus roseus in transgenic tobacco

plants”. (Gửi tại tạp chí Khoa học Quốc tế đang đợi đăng)

Các trình tự gen đã đăng ký trên Ngân hàng Gen quốc tế

[1]. Bui,H.T., Hoang,H.P., Nguyen,T.T. and Chu,M.H (2015),

Catharanthus roseus mRNA for DAT enzyme (DAT gene), isolate TN1

(Pink-purple flower), GenBank: LN809930.1

[2]. Bui,H.T., Hoang,H.P., Nguyen,T.T. and Chu,M.H (2015),

Catharanthus roseus mRNA for DAT enzyme (DAT gene), isolate TN2

(White flower), GenBank: LN809931.1

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Hiện nay, loài người trên thế giới đang phải đối mặt với rất nhiều căn

bệnh nguy hiểm, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe như: Ung thư, AIDS,

tiểu đường, thoái hóa khớp, viêm gan B, C. Ung thư là căn bệnh gây tử vong

hàng đầu trên toàn thế giới. Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tỉ lệ người

mắc ung thư năm 2012 là 14 triệu người. Đến năm 2015 đã có hơn 90 triệu

người mắc ung thư và hàng năm có hơn 8 triệu người chết vì ung thư.

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) là một trong những

loại cây dược liệu quý. Cây dừa cạn có khả năng sản xuất các indol

alkaloid có dược tính quan trọng trong sản xuất các loại thuốc chống ung

thư, đặc biệt là ung thư máu. Ngoài ra, cây dừa cạn còn được chỉ dẫn trong

điều trị bệnh bạch cầu lympho cấp và một số bệnh ung thư khác. Trong dân

gian, dừa cạn được sử dụng trị cao huyết áp, bệnh tiểu đường, điều hòa

kinh nguyệt, chữa tiêu hóa kém và chữa lị, lợi tiểu khá mạnh, chữa bệnh đi

tiểu đỏ và ít, tẩy giun, chữa sốt cao.

Trong cây dừa cạn có chứa 2 loại alkaloid là vinblastine và

vincristine được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh ung thư. Vinblastine

và vincristine là những chất ức chế mạnh sự phân chia tế bào và do vậy

ngăn cản sự tăng số lượng tế bào

Hàm lượng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn hoang dại rất

thấp cho nên định hướng nghiên cứu làm tăng hàm lượng alkaloid ở cây dừa

cạn được quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật hiện đại trong đó, xác định và

tăng cường biểu hiện enzyme chìa khóa là rất quan trọng. Deacetylvindoline-

4-O-acetyltransferase (DAT) là một trong những enzyme chìa khóa trong

chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn. Biểu hiện mạnh enzyme

DAT sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng vinblastine

và vincristine trong dừa cạn sẽ được nâng cao.

2

Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu tăng

cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở

cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định đặc điểm và biểu hiện được gen mã hóa deacetylvindoline-4-

O-acetyltransferase (CrDAT) phân lập từ cây dừa cạn. Tạo được cây dừa

cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng alkaloid được cải thiện.

3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Nghiên cứu thu thập thông tin về gen CrDAT, thiết kế cặp mồi PCR

nhân bản gen CrDAT, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen

CrDAT.

3.2. Thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa gen CrDAT và đánh giá hoạt

động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá.

3.3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh và xây dựng quy trình chuyển gen thông

qua Agrobacterium tumafaciens ở cây dừa cạn.

3.4. Nghiên cứu chuyển gen CrDAT vào dừa cạn, phân tích cây chuyển gen

và đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển CrDAT ở cây

dừa cạn.

4. Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống

từ phân lập, tách dòng phân tử đến thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện

gen CrDAT ở cây thuốc lá và cây dừa cạn, cụ thể là:

1) Đã phân lập được gen CrDAT từ mRNA của cây dừa cạn, gen CrDAT

(cDNA) có kích thước 1320 bp, mã hóa 439 amino acid.

2) Xây dựng được quy trình tái sinh, quy trình chuyển gen thông qua

A.tumefaciens và tạo được 4 dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT ở thế hệ T1

(T1-1; T1-3; T1-6; T1-7) có hàm lượng alkaloid tổng số tăng từ 3,16 lần

đến 15,57 lần so với đối chứng không chuyển gen.

3

3) Protein tái tổ hợp rCrDAT được biểu hiện trên cây thuốc lá, cây dừa cạn

chuyển gen và kết quả được kiểm chứng bằng Western blot và ELISA.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

Về mặt khoa học

Kết quả nghiên cứu trong luận án góp phần làm sáng tỏ đặc điểm

cấu trúc của gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn màu hoa hồng tím và màu

hoa trắng thu thập tại Thái Nguyên. Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ

thuật tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme chìa khóa trong chuỗi

chuyển hóa tổng hợp alkaloid nhằm nâng cao hàm lượng alkaloid của cây

dừa cạn.

Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học cùng với 2 trình tự

gen công bố trên Ngân hàng gen quốc tế là những tư liệu có giá trị tham

khảo trong nghiên cứu và giảng dạy sinh học và công nghệ sinh học.

Về mặt thực tiễn

Các trình tự gen CrDAT được phân lập, cấu trúc vector chuyển

gen, các dòng cây chuyển gen góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về

việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen để cải thiện hàm lượng alkaloid trong cây

dược liệu nói chung và cây dừa cạn nói riêng. Kết quả nghiên cứu đã mở ra

triển vọng ứng dụng kỹ thuật biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme vào việc

nâng cao hàm lượng dược chất trong cây dược liệu.

6. Cấu trúc luận án: Luận án có 120 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được

chia thành các chương, phần: Mở đầu (03 trang), Chương 1: Tổng quan tài

liệu (21 trang), Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (21 trang);

Chương 3: Kết quả và thảo luận (49 trang); Kết luận và đề nghị (01 trang);

Các công trình công bố liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham

khảo (16 trang). Phụ lục (4 trang). Luận án có 20 bảng, 31 hình và tham

khảo 121 tài liệu.

4

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận án đã tham khảo 22 tài liệu tiếng Việt; 99 tài liệu tiếng Anh để

tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Alkaloid ở cây dừa cạn, (2)

Sinh tổng hợp alkaloid và hoạt động của DAT ở cây dừa cạn, ( 3) Nghiên

cứu cải thiện hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn.

Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có

phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật,

thường có dược tính mạnh. Trong lĩnh vực y học, alkaloid cung cấp nhiều

loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo. Theo Đỗ Tất Lợi (1977),

cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don.) hay hải đằng, dương

giác, bông dừa, trường xuân hoa là một loài thực vật trong chi

Catharanthus thuộc họ La bố ma (Apocynaceae). Dừa cạn là cây bản địa và

đặc hữu của Madagascar. Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, phân bố

khắp nơi trong nước. Dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại

alkaloid terpenoid indole được tách chiết từ ba giống, đó là roseus với hoa

màu hồng tím, albus với hoa màu trắng vàng và ocellatus với hoa màu

trắng đỏ, trong đó hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristine và

vinblastine cao nhất.

Trong cây dừa cạn có khoảng 130 loại alkaloid, trong đó vinblastine

và vincristine là hai hợp chất quan trọng nhất. Alkaloid có nhân indol được

tìm thấy trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất trong lá và rễ.

Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37% - 1,15%, thân

0,40%, rễ chính 0,7% - 2,4%, rễ phụ 0,9% - 3,7%, hoa 0,14% - 0,84%, vỏ

quả 1,14%, hạt 0,18%. Trong khoảng 130 loại alkaloid đã được chiết từ cây

dừa cạn, người ta đặc biệt chú ý 20 nhóm alkaloid dimeric là những nhóm

có hoạt tính chống ung thư bao gồm vincristine và vinblastine.

DAT là enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối cùng trong

chuỗi tổng hợp vindoline từ deacetylvindoline ở cây dừa cạn. Theo St-

5

Pierre và cs (1998) protein DAT có khối lượng phân tử là 51 kDa, gồm 9

chuỗi polypeptid. Gen DAT ở cây dừa cạn mã hóa cho enzyme acetyl CoA:

deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) tham gia vào bước cuối

cùng trong quá trình sinh tổng hợp vindoline. Gen DAT có kích thước

1320bp, gồm 439 amino acid, tham gia xúc tác chuỗi phản ứng cuối cùng

trong quá trình tổng hợp vindoline.

Để cải thiện hàm lượng vinblastine và vincristine, các hướng

nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, kỹ thuật chuyển

gen đã được đề xuất. Nhiều nghiên cứu theo hướng tăng sinh khối như việc

thu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy, nuối cây mô tế bào thực vật, nuôi cấy

tạo dòng rễ tơ để làm tăng hàm lượng alkaloid, đặc biệt là vinblastine và

vincristine. Trong những năm gần đây, ứng dụng kỹ thuật chuyển gen

nhằm tăng hàm lượng alkaloid trong cây dừa cạn được quan tâm nghiên

cứu. Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ chuyển gen ở cây dừa cạn nhờ vi khuẩn

Agrobacterium rhizogens của Mohsen Zargar và cs (2010) cho thấy các

dòng cây dừa cạn chuyển gen có hàm lượng alkaloid tăng đáng kể so với

các cây không chuyển gen. Kỹ thuật biểu hiện mạnh một gen mã hóa

enzyme chìa khóa trong chuỗi phản ứng tổng hợp vinblastine và vincristine

trong cây dừa cạn chuyển gen còn ít được tập trung nghiên cứu .

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Hạt của giống dừa cạn màu hoa hồng tím và màu hoa trắng thu thập

tại tỉnh Thái Nguyên. Giống thuốc lá Nicotinana tabacum K326 có nguồn

gốc từ Viện Kinh tế kỹ thuật thuốc lá, do Phòng tế bào Thực vật - Viện Công

nghệ Sinh học cung cấp.

Các chủng vi khuẩn E. Coli (DH5α), chủng A. tumefaciens CV58 do

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.

6

2.2. HÓA CHẤT, THI T BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được mua từ những hãng nổi tiếng

trên thế giới như hãng Fermentas, Bio-Neer, Invitrogen, như Trizol

Reagents, kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis, ..

Các thí nghiệm được thực hiện trên các trang thiết bị hiện đại của

Phòng công nghệ gen, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học

Thái Nguyên và Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Phòng Công

nghệ ADN ứng dụng và Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện công

nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Luận án được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại&Giáo dục

sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái

Nguyên.

2.3. PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU

Các phương pháp nghiên cứu chia thành 4 nhóm chính: (1) nhóm

phương pháp sinh học phân tử, (2) nhóm phương pháp thiết kế vector

chuyển gen thực vật, (3) nhóm phương pháp tạo cây chuyển gen, (4) nhóm

phương pháp phân tích cây chuyển gen. Các thí nghiệm được tiến hành

theo sơ đồ tổng quát mô tả ở hình 2.1.

Chuyển cấu trúc mang gen

CrDAT vào cây thuốc lá

Phân tích cây thuốc lá

chuyển gen ở T0 bằng PCR,

Southern blot, Western blot

Chuyển cấu trúc mang gen

CrDAT vào cây dừa cạn

Phân tích cây dừa cạn

chuyển gen CrDAT ở T0, T1

Đánh giá chức năng sinh

học của gen chuyển ở T1

Khảo sát điều kiện tối ưu tái

sinh in vitro cây dừa cạn từ

đoạn thân và nách lá mầm

Xây dựng quy trình chuyển

gen qua nách lá mầm nhờ

A.tumefaciens thông qua

chuyển gen gus

Phân lập, nghiên cứu đặc điểm

gen CrDAT của cây dừa cạn

Thiếtkế vector chuyển gen thực

vật mang gen CrDAT

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

7

2.3.1. Các phƣơng pháp sinh học phân tử

Phân lập gen CrDAT bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đã

thiết kế DAT-NcoI-F/DAT-NotI-R. RNA tổng số được tách chiết bằng

Trizol Reagent Kit. cDNA được tổng hợp theo quy trình của nhà sản xuất.

Tách dòng và giải trình tự gen qua các bước: i) Tinh sạch sản phẩm PCR,

ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT; iii) Biến nạp plasmid tái

tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α; iv) Chọn dòng khuẩn lạc bằng

colony PCR; v) Tách chiết plasmid và cắt kiểm tra bằng BamHI; vi) Xác

định và phân tích trình tự nucleotide. Kết quả nghiên cứu về các trình tự

gen, amino acid được xử lý bằng phần mềm BioEdit,

2.3.2. Phƣơng pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen

CrDAT

Vector chuyển gen mang gen CrDAT được thiết kế theo hai bước cơ

bản (1) Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrDAT; (2) Gắn cấu

trúc chứa gen CrDAT vào vector chuyển gen thực vật pBI121 (Hình 2.2).

pBI121-CrDAT

pBT – CrDAT

CrDAT

Nco I Not I

pR T R A7/3

2SP, antiABA cmyc

Nco I Not I

KDEL polyA35S

pRTRA7/3-CrDAT

CrDAT cmyc KDEL polyA35S

Hind III Hind III

pBI121

nptII MSC GUS LBRB

HindIII

Hind III

CrDAT cmyc KDEL polyA35S LBRB nptII

Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrDAT

8

2.3.3. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào cây thuốc lá: Phương pháp

chuyển cấu trúc chứa gen CrDAT vào cây thuốc lá trong môi trường tái

sinh in vitro được thực hiện theo Topping (1998).

2.3.4. Tái sinh và chuyển gen gus ở cây dừa cạn: Hạt dừa cạn rửa sạch

dưới vòi nước, hạt được đưa vào trong box cấy. Sau khi khử trùng, cấy hạt

lên môi trường MS (Murashige, Skoog 1962).

Sử dụng gen chỉ thị gus để xây dựng quy trình chuyển gen cho cây dừa

cạn. Thông qua chuyển gen gus, mật độ tế bào A. tumefaciens, nồng độ

acetosyringone, thời gian nhiễm khuẩn và nồng độ kanamycin được tối ưu

làm cơ sở cho chuyển gen đích vào cây dừa cạn.

2.3.5. Chuyển gen CrDAT vào cây dừa cạn thông qua A.tumefaciens

Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển CrDAT vào cây thuốc lá N.

tabacum K326 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và tạo cây thuốc lá

chuyển gen qua hệ thống tái sinh phù hợp theo mô tả của Topping - 1998.

Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển CrDAT vào cây dừa cạn hoa

hồng tím nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Quy trình tạo cây dừa cạn chuyển

gen được thực hiện dựa trên kết quả nghiên cứu chuyển gen gus.

2.3.6. Phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen

Xác định sự có mặt và sự hợp nhất gen chuyển CrDAT vào hệ gen tế bào

chủ của cây thuốc lá và cây dừa cạn chuyển gen bằng PCR và Sothern blot.

Các cây chuyển gen dương tính với kết quả lai Southern được sử dụng cho

phân tích sự biểu hiện protein tái tổ hợp CrDAT bằng Western blot. Định

lượng protein tái tổ hợp rCrDAT được tiến hành theo phương pháp của Sun

và cs (2006).

9

Chƣơng 3. K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN CrDAT PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN

3.1.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen

CrDAT

t qu khu ch ại v t ch d ng cDNA

RNA tổng số được tách chiết từ lá cây dừa cạn TN1, TN2 và cDNA

được tổng hợp từ RNA tổng số bằng phản ứng phiên mã ngược. Phản ứng

PCR khuếch đại cDNA của gen CrDAT với cặp mồi đã thiết kế DAT-NcoI-

F/DAT-NotI-R. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel

agarose 1% cùng với thang DNA 1 kb được thể hiện ở hình 3.1. Kết quả

thu được ở hình 3.1A cho thấy, mẫu dừa cạn TN1 và TN2 cho sản phẩm

PCR với một băng DNA với kích thước ước tính khoảng 1,3 kb. Các băng

đều sáng, r nét và không có sản phẩm phụ. Kích thước này phù hợp theo

tính toán lý thuyết và tương ứng với kích thước của đoạn mã hoá của gen

DAT ở dừa cạn mang mã số AF053307 trên Ngân hàng gen.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

1,3 kb 1,0 kb

1,3 kb

1 2 3 4 M

1,0 kb

A B

Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT. A: Sản

phẩm PCR nhân gen CrDAT (cDNA) từ hai mẫu dừa cạn TN1 và TN2. M:

thang DNA 1 kb; 1,2: gen CrDAT (cDNA) khuếch đại từ mẫu TN1; 3,4: gen

CrDAT (cDNA) khuếch đại từ mẫu TN2). B: Sản phẩm colony-PCR từ 12

dòng khuẩn lạc. 1-6: đoạn gen DAT (cDNA) khuếch đại từ khuẩn lạc của

mẫu TN2; 7-12: đoạn gen DAT (cDNA) khuếch đại từ khuẩn lạc của mẫu

TN1. M: thang DNA 1 kb.

10

X c ịnh trình tự gen CrDAT

Kết quả giải trình tự nucleotide của gen CrDAT (cDNA) phân lập từ hai

mẫu dừa cạn TN1 (hoa hồng tím) và TN2 (hoa trắng) cho thấy gen CrDAT

có kích thước 1320 bp. Gen CrDAT phân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1 và

TN2 có độ tương đồng so với trình tự gen DAT mang mã số AF053307 là

99,5% và 99% là t lệ tương đồng của trình tự gen CrDAT giữa hai mẫu

TN1 và TN2. Như vậy có thể kết luận rằng, gen CrDAT phân lập từ mẫu

dừa cạn TN1 và TN2 đã được tách dòng thành công. Trình tự nucleoitde

của gen CrDAT phân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1, TN2 đã được đăng ký

trên Ngân hàng Gen quốc tế với mã số LN809930 và LN809931.

Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của DAT ở hai mẫu dừa

cạn TN1, TN2 và DAT mang mã số AAC99311 trên Ngân hàng Gen

(protein suy diễn từ gen DAT mang mã số AF053307) cho thấy protein DAT

gồm 439 amino acid và có độ tương đồng cao so với protein mang mã số

AAC99311 trên Ngân hàng gen (99,3% và 99,4%); còn trình tự amino acid

suy diễn của hai mẫu TN1 và TN2 tương đồng là 97,7%.

3.2. THI T K VECTOR CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN

CrDAT TRÊN CÂY THUỐC L

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT

Trình tự nucleotid gen CrDAT màu hoa hồng tím được sử dụng để thiết

kế vector chuyển gen thực vật thông qua A. tumefaciens. Sử dụng enzyme

giới hạn HindIII xử lý vector pRTRA7/3-CrDAT để thu nhận cấu trúc 35S-

CrDAT-cmyc-KDEL-polyA. Gắn cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL-polyA

vào vector chuyển gen pBI121 bằng DNA T4 ligase tạo vector chuyển gen

mang cấu trúc chứa gen chuyển CrDAT (pBI121-CrDAT.

11

Plasmid tái tổ hợp pBI121-35S-DAT-cmyc được tách chiết, kiểm tra

và biến nạp vào A. tumefaciens. Cấu trúc vector chuyển gen pBI121 –

CrDAT bao gồm các thành phần chính được thể hiện ở hình 3.8A. 1 2 3 M 4 5 6 7 8 9 10

1,5 kb

1,0 kb

pBI121-CrDAT

CrDAT cmyc KDEL polyA35S GUS LBRB nptII

A B

Hình 3.8. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT và kết quả

điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR. A: Cấu trúc vector chuyển gen

pBI121-CrDAT. LB: bờ trái của T-DNA; RB: bờ phải của T-DNA; nptII:

gen kháng kanamycin; 35S: promoter CaMV35S. B: Kết quả kiểm tra sản

phẩm colony-PCR các dòng A. tumefaciens chứa vector chuyển gen

pBI121-DAT.

Các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp chứa vector chuyển gen pBI121-

35S-DAT-cmyc được kiểm tra bằng colony-PCR và kết quả phân tích ngẫu

nhiên 10 dòng khuẩn lạc thu được 8 dòng dương tính với colony-PCR

(Hình 3.8B). Các dòng A.tumefaciens tái tổ hợp chứa vector chuyển gen

pBI121-CrDAT được lưu giữ và sử dụng cho các thí nghiệm chuyển gen

tiếp theo.

3.2.2. Phân tích biểu hiện gen CrDAT trên cây thuốc lá chuyển gen

Bi n nạp cấu trúc chứa gen CrDAT v tạo cây thuốc l chuyển gen nhờ

A.tumefacinens

Các mảnh lá cây thuốc lá giống K326 có kích thước khoảng

1cm2 được sử dụng làm vật liệu nhận gen. Thí nghiệm chuyển gen

CrDAT vào thuốc lá được trình bày ở hình 3.9.

12

A B C

D E G

Hình 3.9. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp, chọn lọc và tái sinh tạo cây thuốc

lá chuyển gen. A: Mảnh lá sau khi rửa khuẩn được cấy trên môi trường chọn

lọc; B, C: Tái sinh đa chồi; D: Kéo dài chồi; E: Tạo rễ; G: Ra cây trong bầu

ở điều kiện nhà lưới.

Bảng 3.3 cho thấy, sau 3 lần biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào

các mảnh thuốc lá, kết quả có 235/ 249 mảnh lá sống sót sau 4 tuần,

phát sinh 205 chồi và thu được 186 cây con in vitro sống sót trên môi

trường MS có bổ sung kháng sinh. Số cây ra bầu đất là 113 cây và có 65

cây trồng tại nhà lưới có biểu hiện xanh tốt, mập mạp.

Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào mảnh lá thuốc lá

Đối chứng và

thí nghiệm

Tổng

số

mảnh

lá

Số

mảnh

lá sống

sót sau

4 tuần

Số mảnh

lá cảm

ứng tạo

chồi

Số cây

ra rễ

trên môi

trƣờng

chọn lọc

Số

cây

ra

bầu

Số cây

trồng

trong

nhà

lƣới

ĐC0*

30 0 0 0 0 0

ĐC1*

30 30 40 25 15 15

Thí

nghiệm

Lần 1 82 79 68 55 34 22

Lần 2 90 86 74 61 44 25

Lần 3 77 70 63 52 35 18

Tổng 249 235 205 186 113 65

13

Phân tích sự có mặt v sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong hệ gen

cây thuốc l chuyển gen

Các dòng cây thuốc lá chuyển gen T0 sau khi trồng trong nhà lưới

được 4 tuần thì tiến hành thu lá để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi

CrDATF -Xba/CrDATR-Sac để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển CrDAT

(Hình 3.10).

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen DAT

trong các cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng. Từ làn 1 đến làn 19: các

dòng cây thuốc lá chuyển gen; M: thang DNA 1 kb; wt: cây thuốc lá không

chuyển gen.

Hình 3.10 cho thấy, trong 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen thì có 12

dòng cây thuốc lá chuyển gen dương tính với phản ứng PCR là các dòng

T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15, T0-16, T0-17,

T0-19 (các dòng ở làn điện di số 1, 2, 4, 5, 6, 8, 12, 13, 15, 16, 17, 19). Để

khẳng định gen chuyển CrDAT đã được hợp nhất vào hệ gen cây thuốc lá,

DNA của 9 cây thuốc lá chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8,

T0-12, T0-13, T0-15) cho kết quả PCR dương tính được lựa chọn ngẫu

nhiên để sử dụng phân tích bằng Southern blot. Hình 3.11 cho thấy tất cả 9

dòng thuốc lá chuyển gen cho kết quả lai Southern (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5,

T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15), trong đó hai dòng T0-5 và T0-15 cho 2

băng DNA (2 bản copy), bảy dòng còn lại đều có một băng DNA ở các

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M wt

1,5 kb

1,0 kb

14

kích thước khác nhau. Bảy dòng thuốc lá chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4,

T0-6, T0-8, T0-12, T0-13) cho kết quả lai Southern có một bản copy được

sử dụng phân tích Western blot.

1 2 4 5 6 8 12 13 15 (+) M WT

20

10

7,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,5

Hình 3.11. Kết quả phân tích Southern blot các mẫu thuốc lá chuyển gen

CrDAT. M: Marker 1kbplus, (+) Plasmid pBI121- CrDAT cắt bởi SacI, 1-15: các

cây chuyển gen T0 (1: T0-1 ; 2 : T0-2 ; 4 : T0-4 ; 5 : T0-5 ; 6 : T0-6 ; 8 : T0-8 ;

12 : T0-12 ; 13 : T0-13; 15 : T0-15), wt: cây đối chứng không chuyển gen.

Phân tích sự biểu hiện protein t i tổ hợp CrDAT trên cây thuốc l chuyển

gen

Protein tổng số của 7 dòng thuốc lá chuyển gen T0-1, T0-2, T0-4, T0-

6, T0-8, T0-12, T0-13 xuất hiện 1 băng DNA từ kết quả lai Southern được

phân tích điện di SDS-PAGE và chuyển các phân đoạn protein lên màng

nitrocellulose và thực hiện phản ứng lai Western.

Kết quả phân tích PCR, Southern blot và Western blot các dòng cây thuốc lá

chuyển gen CrDAT ở thế hệ T0 đã chứng minh gen chuyển CrDAT đã hợp nhất

vào hệ gen của cây thuốc lá và gen chuyển CrDAT đã hoạt động phiên mã và

dịch mã cho kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp CrDAT.

130

100

70

55

40

35

kDa M (+) 1 2 4 5 6 8 12 wt

51,5 kDa

KDa M (+) T0-1 T0-2 T0-4 T0-6 T0-8 T0-12 T0-13 WT

15

Hình 3.12. Kết quả phân tích western blot các dòng cây thuốc lá chuyển

gen CrDAT. M: thang protein chuẩn ; (+) đối chứng dương ; T0-1, T0-2,

T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13: các cây chuyển gen; WT: cây đối chứng

không chuyển gen.

3.3. NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG T I SINH VÀ XÂY DỰNG QUY

TRÌNH CHUYỂN GEN Ở CÂY DỪA CẠN

3.3.1. Nuôi cấy in vitro cây dừa cạn

Kết quả nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây dừa cạn cho nhận xét là khử

trùng hạt dừa cạn bằng cồn 70% trong 1 phút và dung dịch javen 60% trong

15 phút cho hiệu quả cao nhất. Môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l; agar

8,5g/l; BAP 1,0mg/l và IBA 0,6mg/l; nước dừa 100ml/l; pH 5,8 thích hợp

cho sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi

bên. Môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; BAP 0,5mg/l và

IBA 0,4mg/l; nước dừa 100ml/l; pH 5,8, thích hợp cho sự phát sinh

chồi và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm. Gây tổn thương bằng cách ch

dọc hoặc dùng m i dao châm vào đoạn thân mang mắt chồi bên đều cho

hiệu quả đa chồi cao. Môi trường tối ưu tạo đa chồi là cơ sở cho những thí

nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn.

3.3.2. Xây dựng quy trình chuyển gen thông qua gen chuyển gus

Tiến hành biến nạp gen gus vào dừa cạn thông qua A.tumefaciens.

Các mẫu biến nạp sau khi nhiễm khuẩn được nuôi trong tối 3 ngày và

nhuộm X-gluc để xác định hiệu suất chuyển gen gus (Hình 3.16). Kết quả

chọn lọc sau 2 tuần thu được 84 mẫu tạo chồi (đạt 23,3 %), sau 4 tuần số

chồi sống sót là 34 mẫu (đạt 9,45%), trong đó có 21 chồi ra rễ. Khi đưa cây

ra môi trường thu được 15 cây sống sót. Lấy ngẫu nhiên lá và rễ của 15 cây

đem nhuộm X-gluc để kiểm tra biểu hiện của gen gus. Tất cả 15 cây này

đều cho kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh chàm đặc trưng

16

Hình 3.16. Kết quả biểu hiện tạm

thời gen gus. A: Lá mầm chuyển

gen; B: Đoạn thân chuyển gen; C:

Lá mầm không chuyển gen; D:

Đoạn thân không chuyển gen

Hình 3.17. Kết quả biểu hiện gen

gus ở cây dừa cạn chuyển gen. A:

Lá cây chuyển gen gus; B: Rễ cây

chuyển gen gus; C: Lá cây không

chuyển gen; D: Rễ cây không

chuyển gen.

Như vậy thông qua chuyển gen gus, quá trình chuyển gen vào

cây dừa cạn được tối ưu là (i) Vật liệu chuyển gen là lá mầm; (ii)

Nồng độ vi khuẩn OD600nm 0,8; (iii) Nồng độ acetosyringone là

100µM; (iv) Thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút; (v) Nồng độ

kanamycin để chọn lọc chồi chuyển gen là 50 mg/l. Quy trình chuyển

gen gus vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được tóm

tắt ở hình 3.18.

Chọn lọc chồi chuyển gen

Chọn lọc chồi trên môi trường: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l +

MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l +

kanamycin 50 mg/l

Tái sinh chồi chuyển gen

Chồi sống sót được tái sinh trên môi trường: MS + sucrose 30g/l +

agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim

500 mg/l + kanamycin 50 mg/l

Tạo cây hoàn chỉnh và ra cây

- Chồi tái sinh được chuyển sang môi trường ra rễ: MS + sucrose

30g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + kanamycin 50 mg/l.

- Đưa cây ra môi trường

Chuẩn bị vật liệu chuyển gen

- Gieo hạt tạo cây con in vitro

- Thu lá mầm 10 ngày tuổi

Chuẩn bị vi khuẩn

A.tumefaciens

mật độ OD600nm = 0,8

Chuyển gen

- Lá mầm được nhiễm khuẩn trong thời gian 30 phút + AS 100 µM

- Đồng nuôi cấy 3 ngày trên môi trường: MS + sucrose 30g/l + agar

8g/l + MES 3,9g/l + muối B5 0,3g/l + AS 100µM

A C

B D

A C

B D

17

Hình 3.18. Sơ đồ quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi

khuẩn A. tumefaciens.

3. 4. K T QUẢ CHUYỂN GEN CrDAT VÀ TẠO CÂY DỪA CẠN CHUYỂN

GEN

3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT và tái sinh cây dừa cạn chuyển

gen

Lá mầm thu từ hạt dừa cạn nảy mầm được sử dụng làm mẫu biến nạp.

Cấu trúc mang gen CrDAT được chuyển vào cây dừa cạn thông qua

A.tumefaciens bằng lây nhiễm qua nách lá mầm (Hình 3.19). Kết quả biến

nạp 390 mẫu, qua các giai đoạn tái sinh và sinh trưởng chồi, chọn lọc bằng

kháng sinh tạo được 19 cây được chuyển gen CrDAT trong điều kiện nhà

lưới, chiếm 4,87% (Bảng 3.13).

Hình 3.19. Hình ảnh biến nạp và tái sinh cây dừa cạn chuyển gen. A: Hạt dừa

cạn; B: Hạt nảy mầm trên môi trường MS; C: Lá mầm dừa cạn; D: Nhiễm

khuẩn trong 30 phút; E. Đồng nuôi cấy trong tối; F: Cảm ứng tạo đa chồi; G:

A B C D

E F G H

I K L M

18

Tái sinh đa chồi sau 2 tuần ; H: Tái sinh đa chồi sau 4 tuần; I: Chọn lọc và kéo

dài chồi; K, L: Ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh; M: Cây trồng trên giá thể.

Các cây dừa cạn chuyển gen ra bầu có lá xanh tốt được đưa trồng ở

vườn thực nghiệm, kết quả trong 19 cây chuyển gen T0 đem trồng trong

môi trường tự nhiên chỉ có 7 cây sinh trưởng, phát triển bình thường

(36,84%).

Bảng 3.13. Kết quả biến nạp cấu trúc CrDAT vào cây dừa cạn hoa hồng

tím

Đối chứng và

thí nghiệm

Tổng

số

mẫu

Số mẫu

tạo

chồi

Số

chồi

kéo

dài

Số

chồi

ra rễ

Số cây

ra

bầu

Số cây sống

và trồng tại

vƣờn thực

nghiệm

ĐC0*

30 0 0 0 0 0

ĐC1*

30 25 20 13 12 9

Thí

nghiệ

m

Lần 1 80 55 36 28 15 5

Lần 2 120 86 65 45 20 6

Lần 3 180 92 63 47 35 8

Tổng 390 233 164 120 70 19

3.4.2. Xác định sự có mặt và hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong hệ

gen của các cây dừa cạn đƣợc chuyển gen ở thế hệ T0

K t q i m tra các c y dừa cạn c ch y n gen ng C

Cây dừa cạn chuyển gen được trồng tại vườn thực nghiệm, chọn 7 cây

sinh trưởng, phát triển tốt để xác định sự có mặt của gen chuyển CrDAT

bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu XbaI-DAT-F/cmyc-KDEL-SacI-

R (Hình 3.20). Kết quả cho thấy cả 7 dòng cây dừa cạn kiểm tra đều có

băng DNA có kích thước ứng với kích thước của gen chuyển CrDAT là

1383 bp. Gen CrDAT nội tại của cây dừa cạn có kích thước 1320 bp, không

có đuôi cmyc và KDEL; gen chuyển CrDAT chứa điểm cắt của enzyme

giới hạn XbaI và SacI, đuôi cmyc và KDEL có kích thước là 1383 bp.

Điểm phân biệt giữa gen nội tại CrDAT và gen chuyển CrDAT ở kết quả

19

PCR nhân bản đoạn gen DAT với cặp mồi XbaI-DAT-F/cmyc-KDEL-SacI-

R và PCR chỉ nhân bản được cấu trúc CrDAT-cmyc-KDEL.

1 2 3 4 5 6 7 M (+) ( -)

1383 bp CrDAT cmyc KDEL NOS35S

cmyc-KDEL-SacI-R

1320+18+ 33+12= 1383 bp

XbaI-DAT-F

Xba I Sac I

Hình 3.20. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT từ các

cây dừa cạn chuyển gen. M: thang DNA chuẩn 1 kb; (+) đối chứng dương

(+) là plasmid pBT-CrDAT; (-) Đối chứng âm (-) kết quả PCR nhân gen

CrDAT từ cây dừa cạn không chuyển gen; 1-7 các dòng cây dừa cạn

chuyển gen CrDAT.

Bảy cây dừa cạn chuyển gen dương tính với PCR và cây đối chứng

không chuyển gen đã được sử dụng để phân tích Southern blot. DNA tổng số

của các cây dừa cạn chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen, được

xử lý bằng enzyme giới hạn SacI. Kết quả ở hình 3.21 cho thấy băng DNA

xuất hiện ở các dòng chuyển gen T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-6 và T0-7; dòng

dừa cạn chuyển gen T0-5 và cây đối chứng không chuyển gen không xuất

hiện băng DNA. Dòng T0-2 và T0-4 xuất hiện 2 băng DNA (2 bản copy),

các dòng còn lại T0-1, T0-3, T0-6, T0-7 có một bản copy. Hiệu suất chuyển

gen tính đến thời điểm phân tích lai Southern là 1,54% (6/390). Các dòng

chuyển gen cho kết quả lai Southern tiếp tục được đánh giá sự sinh trưởng và

phát triển thu hạt phục vụ các thí nghiệm phân tích cây chuyển gen ở thế hệ

gen T1.

3.4.3. Phân tích biểu hiện protein DAT tái tổ hợp ở thế hệ T1

Theo d i sự sinh trưởng và phát triển của 6 cây dừa cạn ở thế hệ T0

(T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-6, T0-7) cho thấy có 4 cây ra hoa và kết quả

20

(T0-1, T0-3, T0-6, T0-7) được thế hệ T1, còn 2 cây ra hoa nhưng không

cho quả (T0-2, T0-4). Thu quả và hạt của 4 dòng dừa cạn chuyển gen ở thế

hệ T1 (T1-1, T1-3, T1-6, T1-7) đem gieo trồng, thu lá sử dụng cho phân

tích biểu hiện và đánh giá hoạt động của protein tái tổ hợp CrDAT của các

dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1.

20 kb

10 kb

7 kb

5 kb

4 kb

3 kb

2 kb

1,5 kb

M (+) 1 2 3 4 5 6 7 (-)

Hình 3.21. Kết quả phân tích Southern blot DNA tổng số các cây dừa cạn

chuyển gen CrDAT với đoạn dò nptII được đánh dấu bằng biotin. M: thang

DNA chuẩn 1 kb, (+): vector pBI121-CrDAT; 1-7: các dòng dừa cạn

chuyển gen dương tính với PCR (T0-1; T0-2; T0-3; T0-4; T0-5; T0-6; T0-

7); (-): cây dừa cạn không chuyển gen,

Hình 3.22. Kết quả phân tích Western blot từ 4 dòng dừa cạn chuyển gen

và cây đối chứng không chuyển gen. (+): protein đối chứng dương; M:

thang protein chuẩn; T1-1, T1-3, T1-6, T1-7: protein của bốn cây dừa cạn

chuyển gen dương tính với southern blot; (-) protein cây dừa cạn đối chứng

không chuyển gen.

55 kDa

40 kDa

( +) M T1-1 T1-3 T1-6 T1-7 (- )

21

Kết quả phân tích Western blot ở hình 3.22 cho thấy, trên màng lai

nitrocellulose xuất hiện một băng màu ở vị trí kích thước khoảng 51 kDa ở

cả 4 dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1, tương ứng với kích thước phân

tử của protein CrDAT tái tổ hợp và đã cho kết quả biểu hiện ở cây thuốc lá

chuyển gen. Điều đó chứng tỏ rằng gen chuyển CrDAT ở bốn dòng dừa cạn

chuyển gen T1 đã biểu hiện dịch mã cho protein CrDAT tái tổ hợp. Hiệu

suất chuyển gen đến giai đoạn dịch mã là 1,02% (4/390).

Hình 3.23 biểu thị kết quả phân tích hàm lượng protein tái tổ hợp

CrDAT từ 4 dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật

ELISA cho thấy 4 dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng protein

tái tổ hợp dao động từ 2,86 µg/mg đến 5,12 µg/mg, dòng dừa cạn chuyển

gen T1-1 có hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT cao nhất (5,12 µg/mg) và

dòng T1-3 có hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT thấp nhất (2,86 µg/mg)

(Hình 3.24).

0,00

5,12

2,87

4,96

3,78

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

WT T1-1 T1-3 T1-6 T1-7

Hàm

lư

ợn

g p

rote

in C

rDA

T t

ái

tổ

hợ

p (

µg

/mg

)

Cây không chuyển gen (WT) và 4 dòng dừa cạn chuyển gen T1

Hình 3.23. Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp

CrDAT của 4 dòng dừa cạn chuyển gen T1 (T1-1, T1-3, T1-6, T1-7 ) và

cây đối chứng không chuyển gen (WT).

Tuy nhiên, bốn dòng cây dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 có sự sinh

trưởng, phát triển bình thường, không có sự khác biệt về hình thái giữa cây

chuyển gen và cây không chuyển gen (Hình 3.24).

22

Hình 3.24. Các dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 và cây đối chứng

không chuyển gen. WT: cây dừa cạn đối chứng không chuyển gen; T1-1;

T1-3; T1-6; T1-7: các dòng dừa cạn chuyển gen T1.

Tiến hành phân tích hàm lượng alkaloid tổng số của 4 dòng cây dừa

cạn chuyển gen T1-1; T1-3; T1-6; T1-7 và cây đối chứng không chuyển

gen (WT) kết quả thu được được thể hiện ở hình 3.25.

Hình 3.25. Hàm lượng alkaloid tổng số (g/100g khối lượng khô) của 4

dòng dừa cạn chuyển gen ở thế hệ T1 và cây đối chứng không chuyển gen.

WT: dừa cạn không chuyển gen; T1-1; T1-3; T1-6; T1-7: các dòng dừa cạn

chuyển gen CrDAT ở thế hệ T1.

3.4.4. Thảo luận về kết quả sự tăng cƣờng biểu hiện gen CrDAT ở cây

dừa cạn chuyển gen

Dừa cạn (Catharanthus roseus) cây thuốc có giá trị dược học, sản

sinh ra nhiều TIA như vindoline, ajamlicine, serpentine, catharanthine,

WT T1-3 T1-6 T1-7T1-1

0,12

1,82

0,38

1,52

0,64

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

WT T1-1 T1-3 T1-6 T1-7

Hà

m lư

ợn

g a

lka

loid

tổ

ng

số

(g

/10

0g

)

Cây đối chứng không chuyển gen và các dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT

23

vinblastine và vincristine và nhiều hợp chất thứ cấp khác. Vinblastine và

vincristine là những chất chuyển hóa thứ cấp từ cây dừa cạn, có giá trị dược

học rất cao được sử dụng trong điều trị ung thư, tuy nhiên các hợp chất này

được tổng hợp trong cây dừa cạn rất ít. Để nâng cao hiệu suất tổng hợp các

alkaloids trong cây dừa cạn, nhiều nghiên cứu tiếp cận theo hướng tăng

sinh khối bằng nuôi cấy mô, tế bào hoặc nuối cấy rễ tơ. Ở cây dừa cạn,

nghiên cứu sử dụng kỹ thuật gen nhằm tăng hàm lượng alakloid được quan

tâm bởi DAT tham gia ở khâu cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp

vindoline. DAT là enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối cùng trong

quá trình sinh tổng hợp vindoline ở cây dừa cạn và bằng sự biểu hiện mạnh

gen CrDAT làm tăng hàm lượng protein DAT và dẫn đến hiệu quả hoạt

động của enzyme DAT được tăng cường. Nghiên cứu của chúng tôi chuyển

gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn hoa hồng tím vào chính cây dừa cạn

qua nách lá mầm nhờ A.tumefaciens nhằm chứng minh sự tăng cường biểu

hiện gen mã hóa enzyme chìa khóa DAT sẽ cải thiện được hàm lượng

alakaloid ở cây dừa cạn.

24

K T LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1.1. Gen CrDAT phân lập từ cây dừa cạn đã được tách dòng phân tử và xác

định trình tự nucleotide. Gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320 bp, mã

hóa cho 439 amino acid.

1.2. Vector chuyển gen thực vật pBI121-CrDAT đã thiết kế được chuyển

vào hệ gen của cây thuốc lá và cây dừa cạn chuyển gen đã biểu hiện được

protein tái tổ hợp CrDAT có kích thước khoảng 51 kDa.

1.3. Môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 10 g/l; BAP 1,0 mg/l và

IBA 0,6 mg/l; nước dừa 100 ml/l; pH 5,8 thích hợp cho sự phát sinh chồi

và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên. Môi trường MS

bổ sung sucrose 30 g/l; agar 10 g/l; BAP 0,5 mg/l và IBA 0,4 mg/l;

nước dừa 100 ml/l; pH 5,8, thích hợp cho sự phát sinh chồi và sinh

trưởng chồi từ nách lá mầm.

1.4. Hiệu quả chuyển gen CrDAT vào cây dừa cạn qua nách lá mầm được

tối ưu ở mật độ A.tumefaciens là OD600nm 0,8; AS 100 µM và thời gian

nhiễm khuẩn 30 phút; chọn lọc bằng kháng sinh Km thích hợp ở nồng độ

50 mg/l.

1.5. Chuyển thành công cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc vào các dòng cây dừa

cạn với hiệu suất chuyển gen là 1,02%. Protein tái tổ hợp CrDAT được

biểu hiện ở 4 dòng dừa cạn T1 chuyển gen có khối lượng phân tử khoảng

51 kDa, hàm lượng dao động từ 2,86 µg/mg đến 5,12 µg/mg. Các dòng dừa

cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng alkaloid tổng số tăng so với dừa cạn

đối chứng không chuyển gen từ 3,16 - 15,57 (lần)

2. Đề nghị

Tiếp tục phân tích và đánh giá bốn dòng dừa cạn chuyển gen (T1-1,

T1-3, T1-6, T1-7) ở các thế hệ T2, T3,... nhằm chọn được dòng dừa cạn

chuyển gen có hàm lượng alkaloid cao và ổn định.