8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-dinh-luong-dong-phan-doi-quang-cua-atenolol-bang 1/97 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾTRƯỜ NG ĐẠI HỌC DƯỢ C HÀ NỘI NGÔ MINH THÚY NGHIÊN CỨ U ĐỊNH LƯỢ NG ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢ C HỌC HÀ NỘI 2014 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
97
Embed
Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
1.2.2 Nguyên lý c7a quá trình điện di mao quản ........................................................ 6
1.2.3 Điện di mao quản vùng ..................................................................................... 7
1.3 VÀI NÉT V1 PHÂN TÍCH Đ.NG PHÂN QUANG H8C ..................................... 9
1.3.1 Đ9ng phân quang học ....................................................................................... 9
1.3.2 Phươ ng pháp phân tách đ9ng phân đ"i quang ................................................... 9
1.3.2.1 Phươ ng pháp phân tách đ9ng phân đ"i quang gián tiếp .................................. 9
1.3.2.2 Phươ ng pháp phân tách đ9ng phân đ"i quang trực tiếp .................................. 10
1.3.3 : ng d4ng điện di mao quản (CE) trong phân tích đ9ng phân quang học ........... 12
1.4 TÁCH Đ.NG PHÂN ĐỐI QUANG B;NG CE S< DỤNG CYCLODEXTRINLÀM TÁC NHÂN CH8N L8C ĐỐI QUANG ............................................................. 13
1.4.1 T=ng quan v! cyclodextrin ................................................................................ 13
1.4.2 Tách đ9ng phân đ"i quang b>ng CE sử d4ng cyclodextrin là tác nhân chọn lọcđ"i quang ................................................................................................................... 15
1.5 MỘT SỐ NGHIÊN C: U PHÂN TÍCH Đ.NG PHÂN ĐỐI QUANG C?AATENOLOL .................................................................................................................. 16
1.5.1 Nghiên c'u trong nướ c ..................................................................................... 16
1.5.2 Nghiên c'u trên thế giớ i ................................................................................... 17
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
CH2*NG 2: ĐỐI T2@NG VÀ PH2*NG PHÁP NGHIÊN C: U ............................... 20
2.1 ĐỐI T2@NG NGHIÊN C: U, HÓA CHẤT, TRANG THIẾT B/ ............................ 20
2.1.1 Đ"i tư% ng nghiên c'u ...................................................................................... 20
2.1.2 Hóa ch#t, trang thiết bị ...................................................................................... 20
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN C: U .................................................................................... 21
2.2.1 Hoàn thiện phươ ng pháp định lư% ng đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol b>ngđiện di mao quản ....................................................................................................... 21
2.2.2 ThAm định phươ ng pháp phân tích .................................................................... 21
2.2.3 : ng d4ng .......................................................................................................... 22
2.3 PH2*NG PHÁP NGHIÊN C: U ............................................................................ 22
2.3.1 ChuAn bị các dung dịch chuAn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm việc ........ 22
2.3.2 Khảo sát và lựa chọn đi!u kiện điện di ............................................................ 23
2.3.3 ThAm định phươ ng pháp phân tích .................................................................... 24
2.3.4 : ng d4ng .......................................................................................................... 26
2.3.5 Phươ ng pháp xử lý s" liệu................................................................................. 27
CH2*NG 3: KẾT QU) NGHIÊN C: U....................................................................... 28
3.1 KH)O SÁT VÀ LB A CH8N ĐI1U KIỆN ĐIỆN DI .............................................. 28
3.1.1 Lựa chọn dung dịch điện ly n!n ........................................................................ 28
3.1.2 Lựa chọn bướ c sóng phát hiện .......................................................................... 29
3.1.3 Lựa chọn ct mao quản ..................................................................................... 29
3.1.4 Lựa chọn hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản .............................................. 30
3.1.5 Lựa chọn n9ng đ tác nhân chọn lọc đ"i quang................................................. 33
3.2 THCM Đ/NH PH2*NG PHÁP PHÂN TÍCH ......................................................... 35
3.2.1 Xác định hàm lư% ng đ9ng phân R, S-atenolol trong chuAn atenolol racemic ..... 35
3.2.2 Đ phù h% p hệ th"ng ........................................................................................ 36
3.2.3 Đ đDc hiệu ....................................................................................................... 37
3.2.4 Khoảng n9ng đ tuyến tính ............................................................................... 38
3.2.5 Đ chính xác ..................................................................................................... 41
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
3.3.1 Đ/NH L2@NG CÁC Đ.NG PHÂN ĐỐI QUANG C?A ATENOLOL TRONGMỘT SỐ CHẾ PHCM ................................................................................................... 44
3.3.2 ĐÁNH GIÁ ĐỘ HÒA TAN CÁC Đ.NG PHÂN C?A ATENOLOL TRONGCHẾ PHCM VIÊN NÉN ............................................................................................... 45
Bảng 1.1 Tính ch#t c7a mt s" CD tự nhiên............................................................... 14
Bảng 3.1 Xác định hàm lư% ng các đ9ng phân trong chuAn atenolol racemic .............. 35
Bảng 3.2 Đ phù h% p hệ th"ng .................................................................................. 36
Bảng 3.3 ChuAn bị dãy dung dịch chuAn atenolol racemic ......................................... 39
Bảng 3.4 Quan hệ gi&a n9ng đ và diện tích pic c7a atenolol racemic ....................... 39
Bảng 3.5 Quan hệ gi&a n9ng đ và diện tích pic c7a S-atenolol ................................. 40
Bảng 3.6 Quan hệ gi&a n9ng đ và diện tích pic c7a R-atenolol ................................ 40
Bảng 3.7 Kết quả đánh giá đ lDp lại trên mẫu Atenolol STADA 50 mg ................... 41
Bảng 3.8 Kết quả đánh giá đ chính xác trung gian trên mẫu Atenolol STADA
50mg ........................................................................................................................ 42Bảng 3.9 Kết quả đánh giá khả năng tìm lại vớ i S-atenolol ........................................ 43
Bảng 3.10 Kết quả đánh giá khả năng tìm lại vớ i R-atenolol ..................................... 43
Bảng 3.11 Kết quả định lư% ng mẫu chế phAm viên nén ch'a atenolol ....................... 44
Bảng 3.12 Kết quả định lư% ng các đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol trong mẫu thử hòa tan ....................................................................................................................... 46
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
Hình 1.1 Công th'c c#u tạo c7a Atenolol .................................................................. 3
Hình 1.2 Sơ đ9 hệ th"ng điện di mao quản ................................................................ 6
Hình 1.3 Sự hình thành dòng EOF ............................................................................. 7
Hình 3.1 Điện di đ9 khi sử d4ng các dung dịch điện ly n!n khác nhau ....................... 28
Hình 3.2 Điện di đ9 c7a dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi sử d4ng vớ i cácmao quản khác nhau .................................................................................................. 30
Hình 3.3 Điện di đ9 c7a dung dịch chuAn atenolol racemic $ 3 điện thế sử d4ng ...... 32
Hình 3.4 Đ9 thị biểu diHn sự ph4 thuc c7a thờ i gian di chuyển các đ9ng phânquang học c7a atenolol vào giá trị điện thế sử d4ng ................................................... 32
Hình 3.5 Điện di đ9 dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi thay đ=i n9ng đ tác
nhân chọn lọc đ"i quang ............................................................................................ 34Hình 3.6 Điện di đ9 mẫu placebo .............................................................................. 37
Hình 3.7 Điện di đ9 mẫu atenolol racemic chuAn ....................................................... 37
Hình 3.8 Điện di đ9 mẫu atenolol STADA ................................................................ 37
Hình 3.9 Điện di đ9 mẫu S-atenolol ........................................................................... 38
Hình 4.1 Vị trí tươ ng tác liên kết hydro ..................................................................... 49
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
Hiện nay, trong đi!u trị trên lâm sàng đã sử d4ng ngày càng nhi!u các thu"c
có ch'a hoạt ch#t là các dạng đ9ng phân quang học tinh khiết, giúp nâng cao hiệu
quả đi!u trị, giảm li!u dùng và hạn chế đư% c nhi!u tác d4ng không mong mu"n so
vớ i khi dùng thu"c có ch'a hoạt ch#t $ dạng hIn h% p racemic. Ví d4: levofloxacin
(đ9ng phân tả tuy!n c7a ofloxacin) có tác d4ng kháng khuAn mạnh g#p hàng ch4c
đến hàng trăm lần dextrofloxacin (đ9ng phân h&u tuy!n c7a ofloxacin) [4], hoDc
dexchlorpheniramin maleat (đ9ng phân h&u tuy!n c7a chlorpheniramin maleat) là
mt thu"c kháng Histamin H1 dùng đi!u trị dị 'ng có tác d4ng mạnh g#p hai lần
chlorpheniramin maleat (dạng racemic) vớ i cùng li!u lư% ng do dạng đ9ng phân tả
tuy!n không có tác d4ng, cho phép li!u dùng chJ còn mt nửa [3], lamivudin có haiđ9ng phân đ"i quang có tác d4ng trên HIV tươ ng đươ ng nhau, nhưng đ9ng phân (-)
lamivudin có đc tính trên tế bào th#p hơ n so vớ i đ9ng phân (+) lamivudin [18].
Trong cuc s"ng hiện đại ngày nay, xu hướ ng các bệnh tiểu đườ ng, r"i loạn
lipid máu, các bệnh tim mạch ngày càng tăng nhanh. ĐDc biệt, vớ i nhóm thu"c tim
mạch thờ i gian đi!u trị thườ ng kéo dài, do đó việc sử d4ng thu"c $ dạng đ9ng phân
quang học tinh khiết lại càng có ý ngh K a quan trọng. Atenolol là dẫn ch#t c7a
aryloxypropanolamin, có tác d4ng chLn chọn lọc trên th4 thể F1- adrenergic dùng
đi!u trị tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính =n định, nh9i máu cơ tim sớ m (trong
vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nh9i máu cơ tim, loạn nhịp nhanh trên th#t [2].
Vớ i mt carbon b#t đ"i trong phân tử, atenolol là hIn h% p racemic c7a hai đ9ng
phân đ"i quang: S-atenolol và R-atenolol. Mt s" nghiên c'u đã ch'ng minh và chJ
ra r>ng S-atenolol có vai trò chính chLn beta giao cảm khi dùng atenolol dạng hIn
h% p racemic, đ9ng thờ i đc tính cũng th#p hơ n so vớ i dạng R-atenolol [20], [25],
[26]. Do đó việc sản xu#t và sử d4ng đ9ng phân S-atenolol ngày càng đư% c quantâm nhi!u hơ n. Đi!u này đòi hGi phải xây dựng phươ ng pháp phân tách và định
lư% ng đư% c tMng dạng đơ n đ9ng phân trong hIn h% p racemic c7a atenolol.
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
Trong nh&ng năm gần đây, kỹ thuật điện di mao quản (Capillary
Electrophoresis - CE) là phươ ng pháp hóa lý đư% c các nhà phân tích lựa chọn trong
l K nh vực tách các đ9ng phân quang học vớ i nhi!u lý do: hiệu lực tách cao, lư% ng
mẫu sử d4ng ít, dung môi sử d4ng trong quá trình phân tích chJ là dung dịch đệm dođó không ảnh hư$ ng đến môi trườ ng, việc tách các đ9ng phân quang học có thể đạt
đư% c khi chJ cần thêm mt lư% ng nhG tác nhân chọn lọc đ"i quang (chiral selector)
vào dung dịch điện ly n!n [8].
Tại Việt Nam, việc áp d4ng kỹ thuật điện di mao quản trong phân tích kiểm
nghiệm vẫn còn hạn chế. Để nâng cao năng lực kiểm tra ch#t lư% ng thu"c c7a hệ
th"ng kiểm nghiệm cũng như hi nhập vớ i xu hướ ng phát triển c7a ngành Dư% c trên
thế giớ i, chúng tôi thực hiện đ! tài: “Nghiên cứ u đị nh l ượ ng đồ ng phân đố i quang
củ a Atenolol bằ ng đ iệ n di mao quả n”. Vớ i hai m4c tiêu:
1. Hoàn thiện và thAm định phươ ng pháp định lư% ng đ9ng phân đ"i quang c7a
atenolol b>ng điện di mao quản.
2. : ng d4ng phươ ng pháp này định lư% ng và đánh giá đ hòa tan các đ9ng
phân đ"i quang c7a atenolol trong mt s" chế phAm có ch'a atenolol trên thị
trườ ng ph4c v4 công tác kiểm nghiệm.
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
Ði!u trị atenolol sN 'c chế tác d4ng c7a catecholamin khi gắng s'c và căng
thOng tâm lý, dẫn đến làm giảm tần s" tim, giảm cung lư% ng tim và giảm huyết
áp.
Ði!u trị atenolol không làm tăng hoDc làm tăng r#t ít s'c cản c7a mạchngoại biên. P li!u đi!u trị, tác d4ng co cơ trơ n phế quản c7a atenolol kém hơ n so
vớ i nh&ng thu"c chLn th4 thể beta không chọn lọc. Tính ch#t này cho phép đi!u
trị cả nh&ng ngườ i có bệnh hen phế quản nhL hoDc bệnh ph=i tắc nghNn khác.
Atenolol ít ảnh hư$ ng đến giải phóng insulin và chuyển hóa carbohydrat.
B$ i vậy, atenolol có thể dùng đư% c cho ngườ i đái tháo đườ ng. P ngườ i tăng
huyết áp, atenolol làm giảm mt cách có ý ngh K a huyết áp cả $ tư thế đ'ng lẫn tư
thế n>m.
Ðể đi!u trị tăng huyết áp, nếu cần, có thể kết h% p atenolol vớ i thu"c ch"ng
tăng huyết áp khác, ch7 yếu là thu"c l% i niệu và/hoDc thu"c giãn mạch ngoại
biên [2].
Mt s" nghiên c'u so sánh tác d4ng gi&a các đ9ng phân quang học c7a
atenolol:
* Nghiên c'u so sánh tác d4ng giảm nhịp tim c7a atenolol racemic và R-
atenolol, S-atenolol so vớ i giả dư% c trên ngườ i tình nguyện sau khi tập thể d4c
do Stoschitzky K. và cng sự thực hiện cho th#y tác d4ng giảm nhịp tim sau khi
u"ng 100 mg atenolol racemic tươ ng đươ ng vớ i u"ng 50 mg S- atenolol, trong
khi không th#y tác d4ng giảm nhịp tim sau khi u"ng 50 mg R- atenolol [25],
[26].
* Theo nghiên c'u c7a McCoy R. và cng sự khi tiến hành thử nghiệm trên
ngườ i, S-atenolol có tác d4ng 'c chế chọn lọc F1-adrenergic hơ n khoảng 40 lần
và có ít tác d4ng ph4 như loạn nhịp, đánh tr"ng ngực so vớ i R- atenolol [20].
b) D%& c *+ng h,c Sau khi u"ng thu"c đạt n9ng đ t"i đa trong huyết tươ ng trong vòng tM 2 -
4 giờ . Sinh khả d4ng x#p xJ 45%, nhưng có sự khác nhau tớ i 3 - 4 lần gi&a các
ngườ i bệnh. Thể tích phân b" là 0,7 lít/kg. Atenolol chJ đư% c chuyển hóa mt
lư% ng nhG. Phần lớ n li!u thu"c dùng đư% c bài tiết qua thận dướ i dạng không
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
Linh đ là hàm s" c7a điện tích ch#t phân tích và kích thướ c trong đi!u kiện nh#t
định c7a phươ ng pháp. Chúng đư% c t"i ưu hóa b>ng cách kiểm soát các thành phần
c7a đệm, pH và lực ion.
Điện di mao quản vùng sử d4ng nguyên lý c7a điện di và điện thAm để táchcác tiểu phân tích điện. Linh đ điện di c7a ion (µep), đư% c biHu diHn b>ng phươ ng
trình:
µ ep= q/(6 πηr)
Trong đó: q là điện tích c7a ion, η là đ nhớ t dung dịch và r là bán kính c7a
ion hydrat hóa. TM m"i liên hệ này suy ra, ch#t phân tích kích thướ c nhG, điện tích
lớ n có linh đ lớ n. Ch#t phân tích kích thướ c lớ n, điện tích nhG có linh đ th#p.
T"c đ di chuyển c7a mt ion ( νi), tính b>ng cm/s, đư% c biểu thị b>ngphươ ng trình: ν i = µep (V/L)
Trong đó: µep là linh đ điện di, V là điện thế đDt và L là chi!u dài (cm) t=ng
cng c7a mao quản.
T"c đ c7a EOF ( νeo), tính b>ng cm/s, đư% c biHu diHn b>ng phươ ng trình:
ν eo = µeo (V/L)
Trong đó: µeo là linh đ dòng EOF (cm2 /V.s).
Thờ i gian di chuyển (tm), tính b>ng giây, cần thiết cho ch#t tan di chuyển trêntoàn b chi!u dài hiệu d4ng (l) c7a mao quản (tM đầu vào đến detector), tm đư% c
biểu thị b>ng hệ th'c sau:
t m= l/E.( µep+ µeo)= lL/V.( µep+ µeo)
Trong đó: E là cườ ng đ điện trườ ng (E = V/L)
Hiệu lực c7a hệ th"ng điện di đư% c biểu thị b>ng s" đK a lý thuyết (N), đư% c
tính b>ng phươ ng trình:
N = ( µep+ µeo)El/2D
Trong đó: D là hệ s" khuếch tán c7a ch#t hòa tan (cm2 /s) và các ký hiệu
khác đư% c định ngh K a như trên.
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
R-, S- tươ ng 'ng là đ9ng phân quay phải và đ9ng phân quay trái.
HIn h% p thu đư% c có thể đư% c tách b>ng GC và HPLC. V! nguyên tắc, cóthể dùng CE để phân tích hIn h% p trên, sử d4ng dung dịch điện ly n!n không chọn
lọc đ"i quang, b$ i các thành phần trong hIn h% p có tính ch#t lý hóa khác nhau.Tuy
nhiên phươ ng pháp này r#t khó áp d4ng trong CE. So vớ i phươ ng pháp phân tách
trực tiếp thì phươ ng pháp gián tiếp này có mt s" như% c điểm sau đây:
• T"n thờ i gian xử lý mẫu.
• Cần có các nhóm hoạt đng hóa học trong c#u trúc như nitơ , hydroxyl,
carboxylic.• Phải sử d4ng thu"c thử b#t đ"i r#t tinh khiết vì sự có thêm mt ch#t đ"i
quang sN tạo ra thêm hai đ9ng phân lập thể không đ"i quang n&a và gây
khó khăn cho quá trình phân tích.
• Hai đ9ng phân trong hIn h% p racemic cần phân tích phải phản 'ng vớ i
cùng m'c đ và t"c đ.
• Đáp 'ng c7a detector vớ i hai dẫn xu#t tạo thành phải tươ ng đươ ng nhau.
• Đi!u kiện phản 'ng phải thích h% p để tránh sự chuyển dạng lập thể c7a
thu"c thử b#t đ"i, đ9ng phân quang học c7a ch#t phân tích và dẫn xu#t
đ9ng phân lập thể không đ"i quang.
Thông thườ ng, không phải dH dàng để giải quyết t#t cả các v#n đ! trong quá
trình thực nghiệm như mô tả $ trên. Tuy nhiên, phươ ng pháp gián tiếp có thể đư% c
áp d4ng trong nh&ng trườ ng h% p mà phươ ng pháp trực tiếp không thể áp d4ng đư% c
hoDc khi cần tăng đ nhạy. Phươ ng pháp gián tiếp trong CE ch7 yếu đư% c áp d4ng
cho phân tách đ9ng phân quang học c7a acid amin [15].
1.3.2.2 Ph%' ng pháp phân tách *1ng phân *.i quang tr3 c ti(p
Phươ ng pháp phân tách trực tiếp đư% c áp d4ng thành công trong CE cho việc
tách đ9ng phân đ"i quang c7a mt s" nhóm h% p ch#t, ch7 yếu là dư% c ch#t.
Các đ9ng phân quang học r#t gi"ng nhau v! tính ch#t lý hóa nên áp d4ng các
phươ ng pháp thông thườ ng không đem lại kết quả. Tuy nhiên, các đ9ng phân này có
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
khả năng tươ ng tác khác nhau vớ i mt s" ch#t đDc biệt, gọi là tác nhân chọn lọc đ"i
quang. Khi có mDt trong hệ th"ng phân tích, chúng sN tươ ng tác vớ i hIn h% p đ9ng
phân quang học. Quá trình tách đ9ng phân này đạt đư% c do sự khác nhau v! năng
lư% ng tươ ng tác c7a tác nhân chọn lọc đ"i quang vớ i mIi đ9ng phân.
Tác nhân chọn lọc đ"i quang hoDc có thể đư% c thêm vào dung dịch điện ly
n!n hoDc đư% c gắn lên thành mao quản, hoDc đư% c c" định hay gắn lên các hệ gel
để tạo mt môi trườ ng chọn lọc đ"i quang mà tươ ng tác vớ i hai đ9ng phân đ"i
quang trong su"t quá trình điện di dựa trên sự hình thành ph'c đ9ng phân lập thể
không đ"i quang tạm thờ i. Các ph'c tạm thờ i di chuyển v! phía detector vớ i vận t"c
khác nhau chJ khi chúng có h>ng s" b!n khác nhau. Các tươ ng tác tươ ng đ"i yếu
tham gia vào quá trình hình thành đ9ng phân lập thể không đ"i quang g9m liên kếthydro, tươ ng tác kS nướ c, liên kết T-T, lưỡ ng cực - lưỡ ng cực. Đ tinh khiết quang
học c7a tác nhân chọn lọc đ"i quang trong phươ ng pháp tách trực tiếp không phải là
mt yếu t" quan trọng như trong phươ ng pháp tách gián tiếp; trên thực tế, các tạp
ch#t chJ ảnh hư$ ng đến đ phân giải và đã đư% c chJ ra r>ng kết quả tươ ng đ"i t"t có
thể thu đư% c b>ng cách sử d4ng tác nhân chọn lọc đ"i quang có ch'a tớ i 10% đ9ng
phân đ"i quang còn lại [15], [16], [22].
Các tác nhân chọn lọc đ"i quang có bản ch#t hóa học khá đa dạng và đư% cchia thành các nhóm chính sau [11]:
− Nhóm 1: có bản ch#t protein (albumin huyết thanh (HSA, BSA), E1- acid
glycoprotein – AGP, ovalbumin trong tr'ng gà…), cyclopeptid, mt s"
kháng sinh macrocyclic glycopeptid (vancomycin, teicoplanin, avoparcin,
tubocuracin…) đã đư% c dùng để tách nhi!u đ9ng phân đ"i quang.
− Nhóm 2: Các oligosaccharid không vòng và dẫn ch#t polysaccharid. Mt s"
phân tử hay dùng như dẫn ch#t maltose, lactose, sucrose, amylose, cellulose.− Nhóm 3: Ch#t chọn lọc đ"i quang dựa trên c#u trúc tạo thành mt “h"c”
chọn lọc đ"i quang (chiral cavity). G9m các cyclodextrin (CD) và dẫn ch#t
(F – CD, dẫn ch#t sulfat hóa, alkylhydroxy hóa c7a F - CD), ether vòng,
polymer.
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
− Nhóm 4: ch#t chọn lọc đ"i quang dựa trên tươ ng tác gi&a nhóm cho điện tử T
và nhóm nhận điện tử T (ch#t chọn lọc kiểu Pirkle).
− Nhóm 5: Trao đ=i ligand (ion đ9ng tạo ph'c vớ i nhóm hoạt quang).
Trong các nhóm ch#t chọn lọc đ"i quang $ trên, nhóm cyclodextrin đDc biệt
là F-cyclodextrin và dẫn xu#t c7a chúng đư% c sử d4ng rng rãi nh#t, có khả năng
tách đ9ng phân quang học r#t mạnh, cho kết quả t"t trên hầu hết các nhóm dư% c
ch#t hoạt quang ph= biến [12].
Sử d4ng các tác nhân chọn lọc đ"i quang kể trên, nhi!u phươ ng pháp tách đã
đư% c sử d4ng để phân tích các đ9ng phân đ"i quang, ch7 yếu dựa trên các quá trình
sắc ký (như sắc ký lGng, sắc ký khí, sắc ký lGng siêu tớ i hạn) và điện di. Trong đó,
hai kỹ thuật ph= biến nh#t hiện nay đư% c áp d4ng để phân tích các đ9ng phân đ"iquang là sắc ký lGng hiệu năng cao và điện di mao quản [19]. Phươ ng pháp HPLC
có ba kỹ thuật để tách các đ9ng phân quang học trong hIn h% p racemic:
Sử d4ng ch#t tạo dẫn xu#t hoạt quang.
Sử d4ng pha đng ch'a tác nhân chọn lọc hoạt quang và pha t K nh không hoạt
quang thông thườ ng.
Sử d4ng ct tách chọn lọc (chiral stationary phases): Tác nhân chọn lọc hoạt
quang đư% c h#p ph4 hoDc liên kết vớ i pha t K nh.Trong đó kỹ thuật sử d4ng ct pha t K nh hoạt quang là phươ ng pháp đư% c sử
d4ng ph= biến nh#t do tính tiện l% i, nhanh chóng và chính xác, nhi!u ct đư% c
thươ ng mại hóa nhưng chi phí r#t đắt. Phươ ng pháp CE cũng đư% c sử d4ng khá ph=
biến trong phân tách đ9ng phân quang học vớ i nhi!u ưu điểm và chi phí kinh tế
hơ n.
1.3.3 Ứ ng d)ng CE trong phân tích *1ng phân quang h,c.
Điện di mao quản là kỹ thuật ngày càng đư% c áp d4ng rng rãi hơ n trong
phân tích đ9ng phân đ"i quang. CE là mt kỹ thuật b= sung cho HPLC, đDc biệt đ"i
vớ i việc phân tích h% p ch#t phân cực và tích điện. Các ch#t chọn lọc hoạt quang sử
d4ng trong điện di mao quản chính là các ch#t chọn lọc đ"i quang đư% c sử d4ng các
pha t K nh c7a HPLC. Tuy nhiên trong phươ ng pháp điện di mao quản, các ch#t chọn
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
lên đến 12 đơ n vị D-(+)-glucose đã đư% c phân lập, tuy nhiên chJ CD có 6,7,8 đơ n vị
D-(+)-glucose (tươ ng 'ng vớ i E, F, V-CD) là đư% c sử d4ng ph= biến.
Hình dạng c7a CD đư% c mô phGng như mt hình nón c4t rIng vớ i mt
khoang tươ ng đ"i kS nướ c, có thể lưu gi& ch#t phân tích và mDt ngoài thân nướ c dosự có mDt c7a các nhóm hydroxyl (vị trí 2, 3 và 6 c7a glucopyranose). Vành rng
hơ n có ch'a các nhóm hydroxyl th' c#p đ"i quang, trong khi vành hLp hơ n ch'a
nhóm hydroxyl sơ c#p không đ"i quang. Tính ch#t hóa lý c7a CD đư% c trình bày
trong bảng 1.1.
B2ng 1.1 Tính ch#t c$a m+t s. CD t3 nhiên
Tính ch#t
Loại CD
6 7 8
S. *' n vị glucose 6 7 8
S. nhóm hydroxyl 18 21 24
Tr,ng l%& ng phân t9 972 1135 1297
Đ%: ng kính trong c$a khoang (nm) 0,47-0,52 0,60-0,64 0,75-0,83
phản 'ng, loại và tW lệ thu"c thử…Mt s" lư% ng lớ n các dẫn xu#t c7a CD hiện đang
đư% c sử d4ng trong CE để phân tích đ9ng phân đ"i quang như dẫn xu#t methyl,
hydroxyethyl, hydroxypropyl, acetyl hóa không tích điện và các dẫn xu#t
methylamino, sulphobutylether, carboxymethyl, sulfat, photphat hóa tích điện. Cácdẫn xu#t c7a CD có thể biểu hiện tính ch#t r#t khác so vớ i nh&ng CD tự nhiên, có
thể đư% c sử d4ng dH dàng để cải thiện đ chọn lọc trong tách đ9ng phân đ"i quang,
ví d4 như tăng đ tan, tăng khả năng tạo ra các liên kết th' c#p khác nhau, ti!m
năng trong phân tích nh&ng h% p ch#t không tích điện, m'c đ kị nướ c khác nhau
c7a h"c kị nướ c. Ví d4, so sánh F - CD và DM - F- CD, có thể th#y r>ng sự có mDt
c7a các nhóm methoxy làm tăng hoDc đ sâu hoDc đ tan c7a tác nhân chọn lọc đ"i
quang. Nhóm thế tích điện hoDc không tích điện thay thế cho nhóm hydroxyl trên
c#u trúc CD có thể r#t có ích cho t"i ưu phươ ng pháp CE. Trong thực tế, đ9ng phân
không tích điện có thể đư% c chuyển đến detector như ch#t phân tích tích điện do sự
hình thành ph'c l9ng vớ i dẫn xu#t c7a CD có nhóm thế tích điện. Hơ n n&a sự
chuyển đng c7a tác nhân chọn lọc đ"i quang theo hướ ng ngư% c lại vớ i ch#t phân
tích là đi!u kiện lý tư$ ng để đạt đư% c đ phân giải t"t vì làm tăng sự khác biệt v!
linh đ gi&a ch#t phân tích tự do và ch#t phân tích trong ph'c l9ng [14], [19].
1.4.2 Tách *1ng phân *.i quang b>ng CE s9 d)ng Cyclodextrin là tác nhân
ch,n l,c *.i quang
Nhi!u dẫn xu#t CD đã đư% c phát triển để tăng khả năng hòa tan trong nướ c
và để thay đ=i hình dạng khoang. Tách đ9ng phân đ"i quang b>ng CZE vớ i CD là
tác nhân chọn lọc đ"i quang lần đầu tiên đư% c giớ i thiệu b$ i Fanali và là kỹ thuật
thành công nh#t trong s" các kỹ thuật để tách đ9ng phân đ"i quang c7a CE; s"
lư% ng các bài báo mô tả kỹ thuật này gia tăng đáng kể [24].
Trong cơ chế tạo ph'c l9ng, h% p ch#t l9ng khít vào khoang CD vớ i toàn b
phân tử hoDc vớ i phần kS nướ c c7a phân tử; do đó, loại CD có vai trò r#t quan trọngtrong quá trình tách. Tươ ng tác kS nướ c vớ i mình khoang kS nướ c không đ7 để cho
phép tách các đ9ng phân đ"i quang, liên kết yếu gi&a các nhóm nhóm thế vớ i trung
tâm b#t đ"i c7a ch#t phân tích và các nhóm hydroxyl th' c#p và / hoDc sơ c#p c7a
CD đóng vai trò trong nhận dạng đ"i quang [14], [15], [24].
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
CD là mt h% p ch#t trung hòa v! điện và do đó chúng di chuyển vớ i t"c đ
c7a dòng EOF trong CZE. Khi mt ch#t tan tích điện đư% c l9ng vào khoang c7a
CD, ph'c l9ng tạo thành có điện tích gi"ng vớ i ch#t tan tự do nhưng kh"i lư% ng
phân tử tăng lên, và do đó linh đ điện di th#p hơ n so vớ i ch#t tan tự do. Trong táchđ9ng phân đ"i quang, các đ9ng phân có linh đ điện di đ9ng nh#t và các đ9ng phân
trong ph'c l9ng có thể có linh đ tươ ng tự nhau. Vì vậy, nguyên tắc c7a CZE sử
d4ng CD là tác nhân chọn lọc đ"i quang (CD - CZE) để tách đ9ng phân đ"i quang
là sự khác biệt gi&a các h>ng s" b!n c7a ph'c l9ng tạo ra gi&a các đ9ng phân đ"i
quang vớ i CD. Đ9ng phân tạo ph'c l9ng b!n hơ n thì có linh đ hiệu d4ng th#p hơ n.
Linh đ hiệu d4ng là linh đ trung bình hoDc biểu kiến c7a ch#t tan trong đi!u kiện
thử nghiệm, nhưng trong hầu hết các trườ ng h% p, chúng ta sử d4ng đơ n giản là linh
đ [24].
Phân tách đ9ng phân đ"i quang có thể bị ảnh hư$ ng b$ i các yếu t" như: loại
và n9ng đ CD, pH, thành phần c7a BGE, nhiệt đ mao quản, hiệu điện thế…[14]
1.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨ U PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA
ATENOLOL.
1.5.1. Nghiên c" u trong n%< c.
Nhóm tác giả Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn LAu, NguyHn Thị Thu Hi!n, NguyHnThị Ki!u Anh [9], đã tách và định lư% ng đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol b>ng
phươ ng pháp sắc ký lGng hiệu năng cao sử d4ng:
• Ct Chirex 3022 ((S)-indoline-2-carboxylic acid và (R)-1-(E-
naphtyl)ethylamine) kích thướ c 4,0 x 250 mm; 5 Qm.
• Thờ i điểm cu"i ngày, mao quản đư% c rửa vớ i dung dịch NaOH 0,1 M trong
20 phút, nướ c 20 phút, sau đó th=i khí 3 phút.
a) L3 a ch,n dung dịch *i0n ly nền
Tiến hành điện di dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) sử d4ngdung dịch điện ly n!n lần lư% t là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0, ch'a
CM-F-CD 8 mM và dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0, ch'a CM-F-CD 8 mM.
Dựa vào tín hiệu trên điện di đ9 thu đư% c, lựa chọn dung dịch điện ly n!n
thích h% p.
b) L3 a ch,n b%< c sóng phát hi0n
Tiến hành quét ph= dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) trong
Tris 50 mM vớ i bướ c sóng tM 190 đến 225 nm. Dựa vào ph= h#p th4 tìm bướ c sóng
tại đó đ h#p th4 c7a atenolol là cực đại.
c) L3 a ch,n c+t mao qu2n
Chúng tôi tiến hành điện di dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt)
vớ i đi!u kiện điện di trên, sử d4ng các ct mao quản khác nhau.
d) L3 a ch,n hi0u *i0n th( áp vào hai *Au mao qu2n
Sau khi lựa chọn đư% c ct mao quản chúng tôi tiến hành khảo sát lại hiệu
điện thế áp vào hai đầu mao quản. Thay đ=i hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản
tM 15 đến 30 kV (XE= 5 kV) và tiến hành phân tích mẫu, lựa chọn hiệu điện thế phù
h% p.
e) L3 a ch,n n1ng *+ tác nhân ch,n l,c *.i quang
Tiến hành điện di dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm vớ i đi!u kiện
điện di đã lựa chọn $ trên và thay đ=i n9ng đ tác nhân chọn lọc đ"i quang CM-F-
CD tM 6 mM đến 10 mM. Dựa vào tín hiệu trên điện di đ9 thu đư% c, lựa chọn n9ng
đ CM-F-CD thích h% p.
2.3.3 Th?m *ịnh ph%' ng pháp phân tích
Sau khi khảo sát, lựa chọn đư% c đi!u kiện điện di tiến hành thAm định để
đảm bảo phươ ng pháp xây dựng đư% c là phù h% p. Các tiêu chí cần thAm định bao
g9m: đ phù h% p c7a hệ th"ng, đ đDc hiệu, khoảng n9ng đ tuyến tính, đ lDp lại
và đ đúng c7a phươ ng pháp.
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
TM kết quả $ hình 3.1, nhận th#y khi dùng dung dịch đệm phosphat 50 mM
thì đườ ng n!n nhiHu, pic bị ch[ ngọn. Trong khi sử d4ng dung dịch đệm Tris thì
đườ ng n!n =n định và các pic gọn, tách nhau hoàn toàn. Do đó chúng tôi lựa chọndung dịch đệm Tris 50 mM là dung dịch điện ly n!n cho nghiên c'u tiếp theo.
3.1.2 L3 a ch,n b%< c sóng phát hi0n
Tiến hành quét ph= dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) trong
Tris 50 mM vớ i bướ c sóng tM 190 đến 225 nm. Dựa vào ph= h#p th4 tìm bướ c sóng
tại đó đ h#p th4 c7a atenolol là cực đại.
K(t qu2:
Tại bướ c sóng 194 nm, đ h#p th4 c7a atenolol trong dung dịch Tris 50 mMlà cực đại. Do đó, lựa chọn bướ c sóng phát hiện cho nghiên c'u định lư% ng atenolol
tiếp theo là 194 nm.
3.1.3 L3 a ch,n c+t mao qu2n
Theo tác giả Đinh Thị Thanh và cng sự [10], khi sử d4ng ct mao quản có
chi!u dài t=ng cng 60,0 cm, chi!u dài hiệu d4ng 50,0 cm, đườ ng kính trong 75 Qm
thì thờ i gian phân tích mẫu khá dài (thờ i gian luyện ct- rửa ct gi&a 2 lần phân tích
liên tiếp là 16 phút, thờ i gian phân tích mẫu khoảng 30 phút). Do đó, chúng tôi khảo
sát lựa chọn mt s" ct mao quản khác nh>m giảm thờ i gian phân tích mẫu và nhiHu
đườ ng n!n so vớ i nghiên c'u trướ c.
Tiến hành điện di dung dịch atenolol racemic chuAn 100 ppm (kl/tt) vớ i đi!u
kiện điện di: nhiệt đ mao quản 200 C, tiêm mẫu 50 mbar x3s, điện thế 25 kV, dung
dịch điện di Tris 50 mM, pH 4,0, ch'a CM-F-CD 8 mM, sử d4ng các ct mao quản
silica nung chảy, có vG bao polyimid vớ i các thông s" ct như sau:
Mao
qu2n
Chiều dài t5ng c+ng
(cm)
Chiều dài hi0u d)ng
(cm)
Đ%: ng kính trong
(Em)1 64,5 56,0 50
2 48,5 40,0 50So sánh tín hiệu thu đư% c để lựa chọn ct phù h% p cho nghiên c'u tiếp theo.
D& liệu điện di đ9 thu đư% c như sau.
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
Hình 3.3 Đi0n di *1 c$a dung dịch chu?n atenolol racemic = 3 *i0n th( s9 d)ng
a) 15 kV; b) 20 kV; c) 25 kV; d) 30 kV
Hình 3.4 Đ1 thị bi;u diễn s3 ph) thu+c c$a th: i gian di chuy;n các *1ng phân
quang h,c c$a atenolol vào giá trị *i0n th( s9 d)ng
NhDn xét:
TM kết quả trên hình 3.4, nhận th#y vớ i giá trị hiệu điện thế tM 15-25 kV thì
các đ9ng phân đ!u đư% c tách ra t"t. P điện thế 15kV, thờ i gian di chuyển c7a các
đ9ng phân kéo dài khoảng 26,5 và 28,0 phút, đườ ng n!n nhiHu. P điện thế 20kV,thờ i gian di chuyển c7a các đ9ng phân rút ngắn xu"ng còn 12,3 và 13,2 phút, đườ ng
n!n còn bị nhiHu ít. Trong khi đó $ điện thế 25 kV, thờ i gian di chuyển c7a các
đ9ng phân rút ngắn xu"ng còn hơ n 9 phút và đườ ng n!n =n định. Khi điện thế sử
d4ng tăng lên 30 kV (giá trị tớ i hạn c7a thiết bị) thì các đ9ng phân di chuyển ra sớ m
hơ n khoảng 8 phút, nhưng các pic bị xen ph7 và chân pic doãng rng. Do đó chúng
tôi lựa chọn điện thế 25 kV để thực hiện cho các nghiên c'u tiếp theo.
3.1.5 L3 a ch,n n1ng *+ tác nhân ch,n l,c *.i quang
Tiến hành điện di dung dịch chuAn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) vớ i đi!ukiện điện di: ct mao quản chi!u dài t=ng cng 48,5 cm, chi!u dài hiệu d4ng 40,0
cm, đườ ng kính trong 50 Qm; nhiệt đ mao quản 200 C, tiêm mẫu 50 mbar x3s, điện
thế 25 kV, dung dịch điện di Tris 50 mM, pH 4,0, ch'a CM-F-CD có n9ng đ tM 6
mM đến 10 mM. D& liệu điện di đ9 thu đư% c như sau.
3.2.1. Xác *ịnh hàm l%& ng *1ng phân R, S-atenolol trong chu?n atenololracemicChuAn bị mẫu:
- Dung dịch chuAn S-atenolol (chuAn S-atenolol hàm lư% ng 99%).
Kh"i lư% ng cân(mg)
T=ng thể tích pha loãng(ml)
N9ng đ dung dịch chuAnS-atenolol (ppm)
4,86 100 48,11
- Dung dịch chuAn atenolol racemic.
Tiến hành điện di các mẫu theo đi!u kiện đã lựa chọn. Kết quả xác định hàmlư% ng các đ9ng phân trong chuAn atenolol racemic đư% c trình bày trong bảng 3.1.
Như vậy, chuAn atenolol racemic c7a Viện Kiểm nghiệm thu"c Trung ươ ng
có thành phần g9m 48,72% S-atenolol và 51,28% R-atenolol.B2ng 3.1 Xác *ịnh hàm l%& ng các *1ng phân trong chu?n atenolol racemic
Dung dịchChuAn
S-atenolol
ChuAnracemic
1
ChuAnracemic
2
ChuAnracemic
3
Diện tích pic S-atenolol (mAU.s) 262,3 267,0 266,6 265,8
T=ng n9ng đ atenolol racemic(ppm)
100,86 100,46 99,66
N9ng đ S-atenolol (ppm) 48,11 48,97 48,90 48,75
N9ng đ R-atenolol (ppm) 51,89 51,56 50,91TW lệ (%) S-atenolol trong chuAn racemic 48,55 48,67 48,92
TW lệ (%) S-atenolol trung bình 48,72
TW lệ (%) R-atenolol trong chuAn racemic 51,45 51,33 51,08
TW lệ (%) R-atenolol trung bình 51,28
Kh"i lư% ng cân(mg)
T=ng thể tích pha loãng(ml)
N9ng đ dung dịch chuAnatenolol racemic (ppm)
25,20 250 100,86
25,10 250 100,46
24,90 250 99,66
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
Tiến hành tiêm lDp lại 6 lần cùng mt dung dịch chuAn atenolol racemic 100
ppm trong cùng đi!u kiện điện di.
Kết quả đ phù h% p hệ th"ng đư% c thể hiện trong bảng 3.2.B2ng 3.2 Đ+ phù h& p h0 th.ng
STT
S-atenolol R-atenolol Đ+ phân
gi2i
(Rs)tm
(phút)
Di0n tích pic
(mAU.s)
tm
(phút)
Di0n tích pic
(mAU.s)
1 9,39 272,1 9,92 276,1 2,66
2 9,37 264,1 10,04 274,3 2,66
3 9,26 262,8 9,91 265,2 3,21
4 9,41 263,7 10,08 268,3 3,00
5 9,28 267,3 9,85 270,3 2,46
6 9,22 266,2 9,76 269,5 2,42
Trung
bình 9,32 266,03 9,92 270,62 2,74
RSD
(%)0,85 1,28 1,20 1,47
NhDn xét:
Kết quả trong bảng 3.2 cho th#y, RSD (%) đ"i vớ i thờ i gian di chuyển và
diện tích pic c7a hai đ9ng phân S-atenolol và R-atenolol đ!u n>m trong khoảng cho
phép, nhG hơ n 2%. Đ9ng thờ i đ phân giải gi&a hai đ9ng phân đ!u lớ n hơ n 2. Đi!unày ch'ng tG hệ th"ng điện di phù h% p cho việc định lư% ng các đ9ng phân đ"i
quang c7a atenolol.
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
TM đ9 thị cho th#y có m"i quan hệ tuyến tính chDt chN gi&a n9ng đ atenolol
racemic và S-atenolol vớ i diện tích pic tươ ng 'ng c7a chúng trong khoảng n9ng đ
tM 20 ppm đến 70 ppm. Đườ ng h9i quy có dạng đườ ng thOng vớ i hệ s" tươ ng quan rđ!u lớ n hơ n 0,997 (hay R2 \ 0,995). Chúng tôi lựa chọn n9ng đ mIi đ9ng phân đ"i
quang atenolol là 50 ppm làm n9ng đ định lư% ng.
3.2.5 Đ+ chính xác
a. Đ+ lBp lại
Đ lDp lại c7a phươ ng pháp đư% c xác định trên 6 phép thử song song trên
cùng mt mẫu vớ i cùng mt đi!u kiện điện di, trong cùng mt ngày.
ChuAn bị dung dịch mẫu thử và mẫu chuAn như chJ dẫn $ m4c 2.3.1.
Kết quả khảo sát đ lDp lại trên mẫu thử đư% c trình bày trong bảng 3.6.
NhDn xét:
Vớ i đi!u kiện điện di đã lựa chọn, kết quả định lư% ng các đ9ng phân c7a
Atenolol đ!u có RSD < 2% . Như vậy, phươ ng pháp định lư% ng đ9ng phân Atenolol
trong chế phAm có đ lDp lại đáp 'ng quy định.
B2ng 3.7 K(t qu2 *ánh giá *+ lBp lại trên m@u Atenolol STADA 50 mg
Tiến hành phân tích xác định hàm lư% ng các đ9ng phân c7a atenolol trong
mẫu thử Atenolol STADA 50 mg trong nh&ng ngày tiếp theo. So sánh kết quả 6 lần
phân tích đánh giá đ lDp lại vớ i 3 lần phân tích đc lập đư% c thực hiện khác ngàytrên cùng mẫu chế phAm. Kết quả xác định hàm lư% ng các đ9ng phân quang học c7a
atenolol trong mẫu thử đư% c trình bày $ bảng 3.7.
NhDn xét:
Qua 9 lần phân tích thực nghiệm, kết quả định lư% ng các đ9ng phân c7a
atenolol đ!u có RSD < 2% . Như vậy, phươ ng pháp định lư% ng các đ9ng phân c7a
atenolol trong chế phAm thể hiện đ chính xác trung gian t"t.
B2ng 3.8
K(t qu2 *ánh giá *+ chính xác trung gian trên m@u Atenolol STADA 50 mg
Hiện nay, s" lư% ng hoạt ch#t có tính ch#t hoạt quang đang lưu hành trên thị
trườ ng dư% c phAm thế giớ i chiếm mt tW lệ r#t lớ n và đang không ngMng tăng lên.
Việc sử d4ng dạng đ9ng phân quang học tinh khiết thay cho hIn h% p racemic manglại nhi!u l% i ích đã đư% c khoa học ch'ng minh. Bên cạnh việc đưa vào sản xu#t và
sử d4ng các dạng đ9ng phân tinh khiết, đ9ng thờ i cũng đDt ra yêu cầu phải có
phươ ng pháp phân tích xác định đư% c thành phần, hàm lư% ng c7a các đ9ng phân
hoạt quang này.
Phươ ng pháp phân tách các đ9ng phân quang học đư% c sử d4ng nhi!u nh#t
hiện nay là phươ ng pháp sắc ký lGng hiệu năng cao HPLC và phươ ng pháp điện di
mao quản CE sử d4ng tác nhân chọn lọc đ"i quang (chiral selector). Phươ ng pháp
điện di mao quản (CE) đã và đang đư% c nghiên c'u, 'ng d4ng trong phân tích các
đ9ng phân quang học ngày càng nhi!u vớ i mt s" ưu điểm vư% t tri hơ n so vớ i
HPLC đó là: vận hành thiết bị đơ n giản, thờ i gian phân tích nhanh nhưng vẫn đạt đ
phân giải cao, t"n r#t ít hóa ch#t, thu"c thử cho xử lý mẫu và chạy máy. ĐDc biệt,
CE không cần phải sử d4ng ct sắc ký chọn lọc đ"i quang đắt ti!n như HPLC do chJ
cần cho thêm tác nhân chọn lọc đ"i quang vào dung dịch điện di. MDt khác, CE cho
phép thay đ=i linh hoạt loại và n9ng đ tác nhân chọn lọc đ"i quang, thể tích mẫu
nhG cho phép sử d4ng các thu"c thử đắt ti!n do đó r#t thuận l% i trong quá trình sàng
lọc tác nhân chọn lọc đ"i quang, đi!u kiện điện di và t"i ưu hóa phươ ng pháp
[14],[15].
Trên thế giớ i, nghiên c'u v! phân tích các đ9ng phân quang học b>ng CE
đư% c nhi!u nhà khoa học quan tâm. Vớ i r#t nhi!u tác nhân chọn lọc đ"i quang khác
nhau tạo ra nhi!u cơ chế phân tách như cyclodextrin, protein, polysaccharid, kháng
sinh glycopeptid…Tại Việt Nam, các công trình nghiên c'u v! phân tách các đ9ng
phân quang học chưa nhi!u, s" lư% ng hoạt ch#t đư% c nghiên c'u chiếm tW lệ nhG.Mt s" nghiên c'u như phân tích đ9ng phân đ"i quang c7a chlorpheniramin maleat,
amlodipin, lamivudin, propranolol, ofloxacin. ĐDc biệt s" lư% ng các công trình
nghiên c'u sử d4ng phươ ng pháp CE r#t ít, do thực tế thiết bị điện di mao quản
chưa đư% c trang bị nhi!u và s" lư% ng thu"c $ dạng đ9ng phân tinh khiết đư% c sử
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
d4ng chưa nhi!u, tập trung ch7 yếu $ các dư% c ch#t đi!u trị bệnh tim mạch
(propranolol, amlodipin), ch"ng virus (lamivudin), kháng sinh (ofloxacin).
Atenolol thuc nhóm thu"c đi!u trị bệnh tim mạch, công th'c c#u tạo c7a
atenolol có mt carbon b#t đ"i trong phân tử do đó t9n tại dướ i hai dạng đ9ng phânquang học (R,S). Nhi!u nghiên c'u đã ch'ng minh r>ng trong hai đ9ng phân quang
học này, đ9ng phân S-atenolol đóng vai trò ch7 yếu trong tác d4ng dư% c lý và có
đc tính th#p hơ n so vớ i đ9ng phân R-atenolol. Do đó trong thực tế đòi hGi phải sản
xu#t và đưa vào sử d4ng dạng đơ n đ9ng phân S-atenolol để nâng cao hiệu quả đi!u
trị bệnh trên lâm sàng. Đ9ng thờ i cũng yêu cầu phải xây dựng đư% c phươ ng pháp
phân tách và định lư% ng đư% c tMng dạng đơ n đ9ng phân trong hIn h% p racemic c7a
atenolol.
Tác giả Đinh Thị Thanh và cng sự [10] đã nghiên c'u khảo sát các yếu t"
ảnh hư$ ng đến quá trình điện di và đưa ra đi!u kiện điện di như sau:
• Ct mao quản silica nung chảy: chi!u dài t=ng cng 58,5 cm, chi!u dài
hiệu d4ng 50 cm, đườ ng kính trong 75 Qm.
• Dung dịch điện di: Tris 50 mM, CM-F-CD 8 mM, pH 4,0.
đườ ng kính trong 50 Qm, và sử d4ng điện thế áp vào hai đầu mao quản là 25 kV,
thờ i gian phân tích mẫu đư% c rút ngắn hơ n r#t nhi!u (thờ i gian luyện ct là 7 phút,
thờ i gian phân tích mẫu khoảng 10 phút) đ9ng thờ i đườ ng n!n mẫu =n định t"t.
So vớ i phươ ng pháp HPLC c7a tác giả NguyHn Thị Thu Hi!n và cng sự [9],phươ ng pháp CE chúng tôi xây dựng đư% c có mt s" ưu điểm hơ n như: vận hành
thiết bị CE đơ n giản, thờ i gian phân tích nhanh (thờ i gian chạy mẫu b>ng CE
khoảng 10 phút so vớ i 17 phút b>ng phươ ng pháp HPLC) nhưng vẫn đạt đ phân
giải cao, t"n r#t ít hóa ch#t, thu"c thử cho xử lý mẫu và chạy máy. Dung dịch cho
chạy máy chJ là dung dịch đệm nên an toàn cho ngườ i vận hành máy và môi trườ ng.
Trong khi HPLC sử d4ng mt lư% ng dung môi, hóa ch#t lớ n chạy máy, đDc biệt là
sự có mDt c7a dung môi h&u cơ (n-hexan; 1,2 dicloromethan; methanol; acid
trifluoroacetic) vMa đắt ti!n và cũng r#t đc hại, gây ô nhiHm môi trườ ng ảnh hư$ ng
trực tiếp tớ i s'c khGe ngườ i làm phân tích. ĐDc biệt, phươ ng pháp CE không cần
phải sử d4ng ct sắc ký hoạt quang đắt ti!n như phươ ng pháp HPLC (sử d4ng ct
Chirex 3022 (S)-indoline-2-carboxylic acid và (R)-1-(E-naphtyl)ethylamin) do chJ
cần cho thêm tác nhân chọn lọc đ"i quang vào dung dịch điện di n!n (BGE). MDt
khác, CE cho phép thay đ=i linh hoạt loại và n9ng đ tác nhân chọn lọc đ"i quang
khi khảo sát chọn đi!u kiện điện di so vớ i phải sử d4ng nhi!u ct sắc ký hoạt quang
thươ ng mại hóa, do mIi loại ct đư% c gắn mt loại pha t K nh hoạt quang chJ thích
h% p cho phân tách mt s" đ9ng phân quang học nh#t định.
MDt khác, phươ ng pháp HPLC khó áp d4ng trong việc định lư% ng các đ9ng
phân quang học c7a atenolol trong phép thử đ hòa tan. Do trong phép thử hòa tan
sử d4ng môi trườ ng hòa tan có dung môi nướ c là dung dịch HCl 0,1 N, trong khi
phươ ng pháp định lư% ng b>ng HPLC mẫu ch'a atenolol phải hòa tan trong dung
môi methanol và pha loãng b>ng pha đng (có ch'a dung môi h&u cơ n-hexan, 1,2
dicloromethan, methanol và acid trifluoroacetic). Như vậy, theo phươ ng phápHPLC để định lư% ng đư% c các đ9ng phân c7a atenolol sau thử hòa tan cần bướ c
chiết chuyển các đ9ng phân này tM pha dung dịch nướ c (dung dịch acid HCl 0,1 N)
sang pha dung môi h&u cơ (pha đng) r9i mớ i tiêm vào hệ th"ng sắc kí. Quá trình
này khá ph'c tạp và có thể có nh&ng sai s" trong quá trình xử lý mẫu. Phươ ng pháp
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản
CE có thể sử d4ng ngay sau khi thử hòa tan mẫu mà không qua quá trình xử lý,
chiết mẫu này. Do đó có thể tiết kiệm đư% c thờ i gian và chi phí cho quá trình phân
tích mẫu.
Kết quả nghiên c'u c7a chúng tôi có thờ i gian di chuyển các đ9ng phân c7aatenolol tươ ng đươ ng vớ i nghiên c'u sử d4ng ct pha t K nh hoạt quang Chiracel OD
c7a Santoro M.I [23] khoảng 10 phút, các pic tách nhau hoàn toàn. So sánh vớ i các
nghiên c'u dùng phươ ng pháp CE c7a Wei Wang [28] và Wuhong Li [29], kết quả
thờ i gian di chuyển các đ9ng phân c7a atenolol đư% c rút ngắn hơ n khá nhi!u, song
đ phân giải vẫn đạt yêu cầu cho phép thử định lư% ng. Đi!u này r#t thuận l% i cho
công tác kiểm soát trong quá trình sản xu#t cũng như kiểm tra ch#t lư% ng dư% c
phAm trên thực tế.
Chúng tôi đã tiến hành thAm định phươ ng pháp phân tích vớ i các tiêu chí: đ
phù h% p hệ th"ng, đ đDc hiệu-chọn lọc, khoảng n9ng đ tuyến tính, đ chính xác
g9m đ lDp lại và đ chính xác trung gian, đ đúng. Kết quả các tiêu chí cần thAm
định đ!u đạt yêu cầu v! thAm định phươ ng pháp phân tích.
• Đ phù h% p hệ th"ng.
Giá trị đ lệch chuAn tươ ng đ"i RSD (%) đ"i vớ i thờ i gian di chuyển và diện
tích pic c7a hai đ9ng phân S-atenolol và R-atenolol đ!u n>m trong khoảng cho
phép, nhG hơ n 2%. Đ9ng thờ i đ phân giải gi&a hai đ9ng phân đ!u lớ n hơ n 2
(min= 2,42; max=3,21). Do đó, hệ th"ng điện di phù h% p cho việc định lư% ng
các đ9ng phân đ"i quang c7a atenolol.
• Đ đDc hiệu-chọn lọc.
Trên điện di đ9 c7a mẫu placebo không xu#t hiện pic $ thờ i điểm xu#t hiện
pic cả $ mẫu chuAn và mẫu thử. Thờ i gian di chuyển c7a pic trên điện di đ9 c7a
mẫu thử tươ ng 'ng vớ i thờ i gian di chuyển c7a pic trên điện di đ9 mẫu chuAn.
Thờ i gian di chuyển c7a đ9ng phân S- atenolol tươ ng 'ng vớ i đ9ng phân di
chuyển ra trướ c trên điện di đ9 mẫu atenolol racemic chuAn và atenolol thử.
• Khoảng n9ng đ tuyến tính.
Có m"i quan hệ tuyến tính chDt chN gi&a n9ng đ atenolol racemic và S-
atenolol vớ i diện tích pic tươ ng 'ng c7a chúng trong khoảng n9ng đ tM 20 đến
WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM
WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON
8/20/2019 Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản