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Establecimiento de un cultivo de celulas en suspensionde
Eucalyptus cinerea
Establishment of cell suspension culture ofEucalyptus
cinerea
Fernando Orozco Sencnez", Rodrigo Hoyos Sencnez"; Mario Arias
Zabala ***
RESUMENSe desarrolla un protocolo para la obtencion y
establecimiento de suspensiones celulares de E. cinerea. La
con-centra cion de las hormonas 2,4 D Y BAP tienen un efecto
significativo en la forrnacion de callos friables de E.cinerea,
obteniendo una respuesta periodica en la forrnacion de callos
friables con respecto a la concentracion delas hormonas. Puede
obtenerse hasta un 90% de forrnacion de callos friables con varias
cornbinaciones horrno-nales; primero, con concentraciones alrededor
de 3,0 rng/L de 2,4 D Y 1,0 mg/L de BAp, y segundo, alrededor de6,0
mg/L de 2,4 D Y1,0 mgIL de BAP. A partir de los callos anteriores,
se obtienen suspensiones celulares con unactivo crecimiento
celular, con tiempos de duplicacion entre cuatro y siete dias, y
alcanzando densidades celula-res de 15 g celulas secas/L. Las
suspensiones de E. cinerea ofrecen una herramienta importante para
la propaga-cion de esta especie via ernbriogenesis sornatica,
estudio de biorreactores, produccion de metabolitos secunda-rios y
procesos de biotransforrnacion.
Palabras clave: Biorrcactores, terpenoides, biotransforrnacion,
metabolismo secundario.
ABSTRACTA protocol is developed for obtaining and establishment
of E. cinerea cell suspension. The concentration ofhormones 2,4 D
and BAP have a significant effect in the formation of friable
callus of E. cinerea, obtaining aperiodic answer in the formation
of friable callus with regard to hormones concentration. It can be
obtaineduntil 90% of formation of friable callus in several hormone
combinations, first with concentrations around 3,0mg/L of 2,4 D and
1,0 mg/L of BAP; and second, around 6,0 mgIL of 2,4 D and 1,0 mg/L
of BAP. Using the lastcallus, cell suspensions are obtained with an
active cellular growth, with times of duplication between 4 and
7days and obtaining cell densities of 15 g of dry cells/L. The
suspensions of E. cinerea offer an important tool forthe
propagation of this specie by somatic embryogenesis, bioreactors
study, production of secondary metabolitesand biotransformation
processes.
Key words: Bioreactors, terpenoids, biotransformation, secondary
metabolism.
INTRODUCCION
Las celulas de las plantas son importantesbiocatalizadores que
pueden ser usados parala obtenci6n de productos
tarrnaceuticos,bioinsecticidas, saborizantes, fragancias y
colo-rantes para alimentos, como antocianina y aza-fran. Las
celulas de las plantas tarnbien puedenutilizarse para metabolizar
un amplio conjuntode compuestos suministrados ex6genamente
(proceso conocido como biotransformaci6n), atraves de varias
reacciones para obtener com-puestos de mayor valor agregado, con
una ma-yor complejidad estructural y mas tacilmente canrespecto a
la sfntesis qufmica (Lee, 1996;Yokoyama, 1996). La productividad de
los ante-riores compuestos, en base seca de celulas ve-getales, 5e
puede incremental' considerablemen-
* Profesor, Escuela de Quimica. Universidad Nacional de
Colombia, sede Medellin. Autopista Norte x Calle 65.
Medellin,Colombia. E-mail: [email protected]** Profesor,
Departamento de Agronomia. Universidad Nacional de Colombia, sede
Medellfn.*** Profesor, Escuela de Geociencias. Universidad Nacional
de Colombia, sede Medellin.
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REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGIA VOL. IV NO.1
te en los cultivos celulares con respecto a la productivi-dad
con plantas intactas. Sin embargo, la producci6nde los compuestos
anteriores implica manipular unaserie de variables y requiere un
control y conocimientocuidadosos de los medios de cultivo,
biorreactores yde las rutas metab61icas secundarias. EI primer
pro-ceso comercial que utiliz6 celulas vegetales fue laproducci6n
del colorante y compuesto antibacterianoshikonina, utilizando
Lithospermum erythrorhizon, en1983. Otros procesos comerciales a
escala indus-trial inciuyen la producci6n de fosfodiesterasa,
acidorosmarfnico, gingseng y berberina (Kreiss y Reinhard,1989;
Sajc et et., 2000; Z ong et et., 1995).
Las especies del qenero Eucalyptus producenalgunos metabolitos
secundarios de interes comercial,como los aceites esenciales, con
aplicaciones indus-triales, medicinales, farmacol6gicas y en
control biol6-gico de plagas. Este genero se constituye en un
buencandidato para un proceso productivo no tradicional,pero es
precise desarrollar inicialmente la tecnica decalloqenesis y
suspensi6n de celulas para estudiar laproducci6n de estos
compuestos. Entre sus metabolitosde interes se encuentran
terpineno, cimeno, pineno,timol, carvacrol, cineol, eudesmol,
macrocarpales,sideroxilonales, entre otros. (Menut et al., 1995;
Murataet al., 1992; Singh et al., 1995; Singh et al., 1996).
EI1,8-cineol es el principal componente del aceite esen-cial del
eucalipto. EI eucalipto ha side utilizado tarnbienpara la
biotransformaci6n de acido tr6pico, precursorde los alcaloides
tropanicos (Ushiyama y Furuya, 1989);acido 1,8-I3-glicirretfnico
(Orihara y Furuya, 1990); oxi-do de cariofileno (Orihara et al.,
1994), 1,8-Cineol(Orihara y Furuya 1994), 13-Thujaplicina, con
actividadantitunqica y antibacteriana (Furuya et al. 1997); men-tol
y esteviol, para la obtenci6n de gentiobi6sidos;mentano glic6sidos,
trigluc6sidos y estevi6sidos(Yokohama, 1996) y acido k6jico para la
producci6n defitoestr6genos (Nakajima et al., 2001).
EI rendimiento de los aceites esenciales en lashojas de
eucalipto puede alcanzar 3,5% en base seca,como en E. cinerea. Este
rendimiento es superior alde E. globulus, E. citriodora y E.
grandis, con valoresde 2,5, 2,0 Y 0,25%, respectivamente (Mora et
al.,2002). En un estudio comparativo entre las cuatroespecies
anteriores, E. cinerea result6 ser la mejorfuente de 1,8-cineol,
tanto por su rendimiento comopor la concentraci6n de este
monoterpeno, el cual es72,42% en los respectivos aceites esenciales
(Moraet et., 2002). Con la presente investigaci6n se defi-
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nen los procedimientos para establecer las suspen-siones
celulares de E. cinerea, que puedan ser utili-zadas en la
producci6n de metabolitos secundariosy procesos de
biotransformaci6n.
METODOLOGIA
Para establecer el cultivo in vitro de E. cinerea se pro-cedi6 a
la germinaci6n de semillas in vitro. Luego, es-tas plantulas fueron
micropropagadas utilizando unmedio de cultivo desarrollado por los
investigadores(articulo en proceso de publicaci6n). La
micropro-pagaci6n se realiz6 utilizando microesquejes en me-dios
dosificados con 1,1 giL de sales de Murashige ySkoog (1962), acido
indol butfrico (ISA: 0,1 mg/L), sa-carosa (20 giL),
polivinilpirrolidona (PVP: 1,0 giL), aci-do nicotfnico (0,5 mg/L),
piridoxina (0,5 mg/L), glicina(2,0 mg/L) y agar (9,0 giL). EI pH se
ajust6 entre 5,6 y5,8. Las hojas juveniles fueron utilizadas
comoexplantes para la formaci6n de callos. Los medios decultivo
utilizados en esta etapa correspondieron a unacombinaci6n de auxina
(2-4 diclorotenoxiacetico: 2-4D entre 0,0 y 7,5 mg/L) y citoquinina
(benzilami-nopurina: SAP entre 0,0 y 1,5 mg/L), pH (5,6 - 5,8),agar
(9 giL), sacarosa (30 giL), sales inorqanicas (Me-dio de Murashige
y Skoog, 4,4 giL), glicina (2,0 mg/L),acido nicotfnico (5,0 mg/L),
tiamina (0,5 mg/L),piridoxina (0,5 mg/L) y PVP (1,0 giL). Los
callos obte-nidos fueron establecidos en medios hquidos con
unacomposici6n similar al medio de inducci6n de callos,libre de
citoquinina. Las suspensiones celulares seiniciaron mediante la
incubaci6n de trozos de callosfriables en el medio llquido
continuamente agitado, deacuerdo con la metodologia general de
Szabados etal. (1991), 110 r.p.m., subcultivos peri6dicos (cada
15dlas), en erlenmeyers de 100 ml y 250 ml, y ocupandos610el 20 %
de este volumen con medio de cultivo. Seconservaron en la oscuridad
y una temperatura de24QC. Inicialmente, las suspensiones celulares
sonheteroqeneas, observando grandes agregados, celu-las libres,
alargadas, de gran tamafio y celulas peque-rias isodiametricas.
Despues de repetir los subcultivos(seis meses), se obtuvo una
suspensi6n celular fina ydispersa con alta velocidad de
crecimiento. Para cons-truir las curvas de crecimiento fueron
utilizadas comoin6culo suspensiones tamizadas con una malla deacero
inoxidable No. 40 (tarnario de abertura 0,42 mm).Se evalu6 el
crecimiento mediante la determinaci6ndel peso seco de la biomasa
contenida en 10 ml demedio (24 horas a 70QC) sequn el procedimiento
deTorres (1989).
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ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO DE cELULAS EN SUSPENSION DE
Eucalyptus cinerea
Resultados y Discusi6n
La fotograffa 1 presenta plantulas micropropagadasde E. cinerea.
Las fotograffas 2 y 3 muestran callosobtenidos a partir de hojas
juveniles.
Fotograffa 1. Plantulas de E. cinerea utilizadas para el
experimentode formaci6n de callos.
Fotografla 2. Callo friable de E. cinerea obtenido
mediantecombinaciones de 2,4 0 Y BAP.
Fotograffa 3. Diferentes callos de E. cinerea obtenidos
mediantec9mbinaciones de auxin a y citoquinina.
Mediante experimentos factoriales se deter-rnino el efecto que
tiene la concentracion de 2,4 DY BAP sabre diferentes variables
respuesta (for-
macron de callos, callos friables, callos can raicesy brotes
multiples). En el presente trabajo s610 sepresenta el porcentaje de
torrnacion de callosfriables, ya que este material es el utilizado
parael establecimiento de las suspensiones. La tabla1 presenta el
anal isis de varianza de este experi-menta y las figuras 1 y 2, el
porcentaje de forma-ci6n de callos friables a diferentes
concentracio-nes de 2,4 D Y BAP.
Tabla 1. Analisis de varianza para el porcentaje deformaci6n de
callos friables de E. cinerea
Factor GI' Suma Media Hazon NS'cuadrados cuadrados F'
2-40 4 36806 9202 10,5822 1,3E-06
BAP 3 21858 7286 8,3791 9,1E-05
2-40:BAP 12 11418 951 1,0943 0,3806
Residuales 63 54780 870
1 GI. Grados de Iibertadz Hazen F. Relaci6n entre las
variaciones debidas a los cam-bios de cad a variable y las
variaciones no controladas 0 errorexperimental.3 NS. Nivel de
significancia. Mayor que 0,05: el efecto de lavariable es no
significativo. Menor que 0,05: el efecto de lavariable sf es
significativo.4 Residuales. Variacion deb ida al error
experimental.
Del nivel de significancia se deduce que tantolas
concentraciones de 2,4 D como el BAP tienen unefecto significativo
sabre el porcentaje de tormacionde callos friables (nivel de
significancia < 0,001) Yestadfsticamente no hay evidencia de que
exista unainteraccion entre los contenidos de las hormonas (2-4 D:
BAP), es decir, la interaccion no tiene un efectosignificativo
sabre la variable respuesta.
En las figuras 1 y 2 se aprecia el efecto quetienen el 2,4 D Y
el BAP sabre el porcentaje de for-macron de callos friables. Se
observa un efecto pe-ri6dico tanto de la auxina como de la
citoquinina sa-bre el porcentaje de torrnacion de callos friables,
estoes, se encuentran rnaximos y mfnimos en la forma-cion de callos
friables a medida que aumenta la con-centracion de las harmon as,
siendo mas claro estecomportamiento peri6dico para la auxina. En
las dosfiguras se aprecia que los mayo res valores de la va-riable
respuesta se encuentran en dos zonas: prime-ro, alrededor de 3,0
mg/L de 2,4 D Y 1,0 mg/L deBAP; y segundo, alrededor de 6,0 mg/L
2,4 D y 1,0mg/L de BAP.
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REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGIA VOL. IV No.1
~ 100III" 90i 80:.E 70] 60iO 50~ 40:S 30 • ,~ 20. 'e 10.1,'oLl.
0 -
00 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 ao
:
,- -+- - 0,0 mg/Li BAPi 0.5 mg/L
BAPi·, '.', '1,Omg1L
.~ I BAP', i~l,5mglL" BAP,,,,
Auxin. 2,4 0 (mglq
Figura 1. Porcentaje de tormacion de callos friables de E.
cinereacontra diferentes concentraciones de 2,4 D Y BAP.
100
X 90
~ BO:c 70~ 60-1
~ 50 ~iO 40-'"I:'0
I '~o
ILl. 2.0
Figura 2. Porcentaje de torrnacion de callos friables de E.
cinereacontra diferentes concentraciones de BAP y 2,4 D.
Aunque los callos presentaron cierto grado defenolizaci6n
(conservando el material en la oscuridad),su textura permite
usarlos para el establecimiento delas suspensiones. Se requiere
realizar subcultivos cadaquince dias durante seis meses para
adaptar las celu-las al cultivo en suspensi6n y tener un material
con uncrecimiento activo. Este tiempo se considera normal yesta
acorde con el trabajo requerido 'para establecersuspensiones de
otras especies vegetales, asf porejemplo, el banana puede necesitar
entre 6 y 15 me-ses, desde la transferencia de callos a un medio
liqui-do hasta tener un material en cantidad adecuada paracualquier
aplicaci6n (Schoofs et al. 1999). EI estable-cimiento de las
suspensiones de E. cinerea se logr6usando un medio de cultivo que
contiene la mismacomposici6n que el medio s61ido en ausencia de
SAP.La figura 3 presenta la curva de crecimiento para
lassuspensiones de E. cinerea, en la cual se evatua elcrecimiento
celular durante seis semanas.
46
16 , - ;........ ._ )
oJ 14-~ 12sIII 10
:e 8ClcO 6IIIE 4oiii 2
o t=:=~==~~·_---_·_·_--~--_·_--~-_..Jo 10 20 30
Tiempo, dias40
Figura 3. Curva de crecimiento de suspensiones celulares de
E.cinerea. Las barras indican la desviacion estandar,
En esta curva se observa una fase lag 0 de adap-taci6n de las
celulas de nueve dias, una fase de cre-cimiento exponencial entre
los dfas 9 y 30, Y las fa-ses estacionaria y de muerte celular,
entre los dlas30 y 44 aproximadamente, las cuales no se
diferen-cian c1aramente una de otra. La forma de la curvacoincide
con las curvas tfpicas para este tipo de cul-tivos (Szabados,
1991). La densidad celular alcan-zada (15 9 celulas secas/L) es
adecuada para mu-chas aplicaciones, y corresponde a un cultivo
condensidad celular moderada de 15 a 20 9 cel/L (Hu yZhong, 2001).
La fase exponencial puede modelarsemediante la siguiente
ecuaci6n:
X = Xoe/ltX = biomasa (g celulas secas/L)X = biomasa en el
tiempo cero (g celulas secas / L)ofl = velocidad especffica de
crecimiento (dla')t = tiempo (dfa).
La ecuaci6n obtenida para el cultivo es la siguiente:
X = 0 0793eo,1667t R2 = 0,9203,La velocidad especffica de
crecimiento para un
cultivo de celulas en suspensi6n es de 0,2 dia'. EI tiem-po de
duplicaci6n (tei) se obtiene de la relaci6n td= In2/fl = 4,2 dfas.
En otras curvas de crecimiento, se obtu-vieron tiempos de
duplicaci6n entre cuatro y siete dias,sugiriendo esto que
posiblemente se han formado di-ferentes Ifneas celulares, debido
probablemente a unamejor adaptaci6n fisiol6gica de las celulas 0
algunavariaci6n somaclonal. Las suspensiones se han con-servado con
un crecimiento activo durante mas de docemeses, manteniendo las
condiciones de cultivo esta-bles y la densidad celular baja (menor
que 12 9 de
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ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO DE cELULAS EN SUSPENSION DE
Eucalyptus cinerea
Fotograffa 4. Celulas individuales de un cullivo de celulas
ensuspension de E. cinerea. Tincion con Azul de Evans.
Fotograffa 5. Aglomerados de pocas celulas en un cullivo
decelulas en suspension de E. cinerea. Tincion con Azul de
Evans.
Fotograffa 6. Microcallos en un cullivo de ceiulas en
suspensionde E. cinerea. Sin tincion,
Fotograffa 7. Microcallos en un cultivo de celulas en
suspensionde E. cinerea. Tincion con Azul de Evans.
celutas secas por litro). Las fotograffas 4 a 7
presentandiferentes aspectos de las suspensiones celulares.
La tinci6n con Azul de Evans permite apreciarlas celulas muertas
con un color oscuro y las celulasviables con un color blanco. Con
este rnetodo se de-termin6 una viabilidad de las celulas en
suspensi6nentre 30 y 70%. A pesar de encontrarse un cultivo enel
valor de viabilidad de 30%, se pudieron establecersuspensiones con
un activo crecimiento celular.
CONCLUSIONES
La concentraci6n de las hormonas 2,4 D Y SAP tieneun efecto
significativo en la formaci6n de callos friablesde E. cinerea. Sin
embargo, estadfsticamente no hayevidencia de que exista una
interacci6n entre estasdos hormonas. Utilizando hojas juveniles
comoexplantes, se obtuvo un comportamiento peri6dico enla formaci6n
de callos friables con respecto a la con-centraci6n de las
hormonas, es decir, el comportamien-to de la variable respuesta
vari6 de forma ondulatoriacon la concentraci6n de las hormonas.
Puedeobtenerse hasta un 90% de formaci6n de callos friablesen
varias zonas, primero con concentraciones alrede-dor de 3,0 mg/L de
2,4 D Y 1,0 mg/L de SAP; y segun-do, alrededor de 6,0 mg/L de 2,4 D
y 1,0 mg/L de SAP.A partir de los callos anteriores, se obtuvieron
suspen-siones celulares con un activo crecimiento, con tiem-pos de
duplicaci6n entre cuatro y siete dias, alcanzan-do densidades
celulares de 15 9 celulas secas/L. Losdiferentes tiempos de
duplicaci6n sugieren que posi-blemente se han formado diferentes
Ifneas celulares,debido probablemente a una mejor adaptaci6n
fisiol6-gica de las celulas 0 alguna variaci6n somaclonal.
Lassuspensiones de E. cinerea ofrecen una herramientaimportante
para la propagaci6n de esta especie viaernbrioqenesis sornatica, y
un punta de partida para elestudio de biorreactores y la producci6n
de importan-tes metabolitos secundarios (1,8-cineol,
timol,carvacrol, macrocarpales, sideroxilonales, etc.) que
sonutilizados en perlumerfa, medicina, control biol6gicode algunas
plagas (hongos e insectos), y como mate-rias primas en procesos
qufmicos. Adernas, estas sus-pensiones ofrecen la posibilidad de
biotransformar cier-tas sustancias qulrnicas para la obtenci6n de
productosde mayor valor agregado (acido tr6pico, acido 1,8
~-glicirretfnico, ~-Thujaplicina, estevi6sidos, mentol, etc.).De
acuerdo con el conocimiento de los autores, estees el primer
reporte para la obtenci6n y mantenimien-to de suspensiones
celulares de E. cinerea.
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REVISTACOLOMBIANA DE BIOTECNOLOGiA VOL. IV No.1
AGRADECIMIENTOS
La presente investigaci6n fue financiada por la Di-recci6n de
Investigaciones (DIMED) y el Laboratoriode Crecimiento y Desarrollo
de las Plantas de la Uni-versidad Nacional de Colombia, sede
Medellfn y laEmpresa Phyton Ltda.
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