-
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
Augusta Ževžikovienė
NAUJŲ 4-TIAZOLIDINONŲ, TURINČIŲ
SULFANILAMIDO, ALILAMINO IR
NITROFURANO FARMAKOFORUS,
PRIEŠMIKROBINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAS
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai,
farmacija (08B)
Kaunas, 2012
-
2
Disertacija rengta 2003–2011 metais Lietuvos sveikatos
mokslų
universitete, Medicinos akademijoje (Kauno medicinos
universitete)
Moksliniai vadovai:
prof. habil. dr. Eduardas Tarasevičius (Lietuvos sveikatos
mokslų uni-
versitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija
– 08B)
2008–2011 m.
prof. habil. dr. Paulius Vainauskas (Lietuvos sveikatos mokslų
universi-
tetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija –
08B)
2004–2008 m.
doc. dr. Rimantas Klimas (Lietuvos sveikatos mokslų
universitetas, Medi-
cinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B)
2003–2004 m.
Konsultantai:
prof. habil. dr. Antanas Stankevičius (Kauno medicinos
universitetas,
fiziniai mokslai, chemija – 03P)
prof. dr. (HP) Alvydas Pavilonis (Lietuvos sveikatos mokslų
universite-
tas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina –
06B)
-
3
TURINYS
SANTRUMPOS
.............................................................................................
4
ĮVADAS.........................................................................................................
5
1. LITERATŪROS APŽVALGA
...............................................................
8
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI
................................................. 22
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
................................................... 46
3.1. Naujų susintetintų 4-tiazolidinono darinių apibūdinimas
.............. 46
3.2. Susintetintų junginių, kaip biologiškai aktyvių
medžiagų,
vertės nustatymas in silico
.............................................................
59
3.3. Susintetintų junginių priešmikrobinio aktyvumo tyrimo
rezultatų įvertinimas
......................................................................
63
3.3.1. Priešmikrobinio aktyvumo prognozė in silico
.............................. 63 3.3.2. Priešmikrobinio aktyvumo
įvertinimas in vitro ............................ 67
3.4. Susintetintų junginių struktūros – aktyvumo ryšio
įvertinimas ..... 75
3.5. Darbo rezultatų apibendrinimas
..................................................... 92
IŠVADOS
....................................................................................................
96
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS
...................................................................
97
DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ..... 114
-
4
SANTRUMPOS
1H BMR – protono branduolių magnetinis rezonansas
DMF – dimetilformamidas
DMSO – dimetilsulfoksidas
DMSO-d6 – dimetilsulfoksidas, turintis 6 deuterio atomus
s – singletas
d – dupletas
dd – dupletų dupletas
t – tripletas
m – multipletas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
IR – infraraudonoji spektroskopija
MSK – mažiausia slopinanti koncentracija
Pa – aktyvumo tikimybė
PASS – medžiagų aktyvumo prognozės programa (Prediction
of Activity Spectra for Substances)
ZAT – kodas, žymintis susintetintus junginius su
sulfanilamido ir alilamino farmakoforais
MA – kodas, žymintis susintetintus junginius su
sulfanilamido farmakoforu
LF, LCF – kodai, žymintys susintetintus junginius su
nitrofurano
ir alilamino farmakoforais
LCD – kodas, žymintis susintetintus junginius su benzilamino
farmakoforu
L – kodas, žymintis susintetintus 3-aminorodanino
darinius
S. aureus – Staphylococcus aureus
E. faecalis – Enterococcus faecalis
E. coli – Escherichia coli
P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa
K. pneumoniae – Klebsiella pneumoniae
P. mirabilis – Proteus mirabilis
B. subtilis – Bacillus subtilis
C. albicans – Candida albicans
-
5
ĮVADAS
XIX a. viduryje Louis Pasteur įrodė, kad daugelį ligų sukelia
mikrobai ir
parazitai, todėl medžiagos turi būti tiriamos su šiais
mikroorganizmais, kad
būtų identifikuota molekulė padedanti įveikti ligą [90].
Priešmikrobinių medžiagų vartojimo pradžia klinikinėje
praktikoje suma-
žino mirtingumą (nuo 70–90 proc. iki 10 proc.) nuo sunkių ir
gyvybei pavo-
jingų ligų, kurias sukelia bakterijos [6, 34, 138, 199, 213].
Šiuo metu klini-
kinėje praktikoje infekcinėms ligoms gydyti vartojama daugiau
kaip 200
priešmikrobinių medžiagų, nepaisant to, infekcinės ligos vis dar
yra viena
dažniausių mirties priežasčių [78, 101, 158, 275].
Pastaruoju metu susirūpinimą kelia bakterijų atsparumo didėjimas
[6, 37,
59, 74, 199]. Atsparūs mikroorganizmai plinta ne tik ligoninėse.
Jų sukelia-
mos ligos yra sunkiai gydomos ir pavojingos visai žmonijai. Vis
daugiau
mikroorganizmų tampa atsparūs priešmikrobiniams vaistams. Todėl,
mažėja
vartojamų priešmikrobinių medžiagų efektyvumas ir pasirinkimo
galimybės.
Būtina tęsti naujų veikliųjų medžiagų paiešką, nes atsparių
bakterijų
sukeltos infekcijos ateityje gali tapti pavojingos epidemijos
priežastimi [34,
51, 52, 190, 199, 200, 282].
Heterociklinės struktūros junginiai yra viena svarbiausių
organinių
junginių klasė. Apie 50 proc. visų cheminių junginių,
susintetintų iki antrojo
tūkstantmečio pabaigos, yra heterociklinės struktūros. Didelis
dėmesys
skiriamas sierą ir azotą turintiems heterocikliniams junginiams
dėl
sėkmingo jų pritaikymo įvairiose mokslo srityse [14, 81, 201].
Susidomė-
jimas tiazolo ir tiazolidino junginiais padidėjo, kai ši
struktūra buvo
nustatyta plačiai vartojamuose junginiuose (pvz. tiazolidinas –
peniciline)
[21, 140, 195]. Tiazolo dariniais, kaip potencialiais vaistais,
imta domėtis
XX a. pradžioje.
Anksčiau susintetintų junginių struktūros analizė parodė, kad
4-
tiazolidinono dariniai, turintys sulfanilamido farmakoforą, yra
aktyvesni nei
patys sulfanilamidai prieš bakterijas, be to jie pasižymi ir
priešgrybeliniu
poveikiu [113, 127, 233]. Nitrofurano farmakoforą
(5-nitrofurfurolo ar 5-
nitrofurilakroleino) turintys 4-tiazolidinono dariniai yra vieni
aktyviausių
priešmikrobinių junginių [32, 36, 195, 249]. Alilaminai yra
naujausia
priešgrybelinių vaistų grupė [10, 73], šį farmakoforą įjungus į
molekulę
kartu su jau anksčiau žinomais farmakoforais – sulfanilamidais
ir nitrofu-
ranais, tikėtąsi geresnio naujų junginių priešmikrobinio
aktyvumo.
Remiantis sėkmingais ankstesniais mokslo darbų rezultatais [150,
193,
195, 249], nuspręsta susintetinti priešmikrobiniu aktyvumu
pasižyminčius 4-
tiazolidinono darinius, panaudojant įvairių aminų ir aldehidų
fragmentus.
-
6
Darbo tikslas: Nustatyti keleto farmakoforų poveikį naujų
4-tiazolidino-
no junginių priešmikrobiniam aktyvumui.
Uždaviniai: Susintetinti naujus biologiškai aktyvius
4-tiazolidinono
darinius su sulfanilamido, nitrofurano ir alilamino farmakoforų
struktūri-
niais fragmentais, bei įvertinti šių fragmentų įtaką naujų
junginių prieš-
mikrobiniam aktyvumui:
1. Nustatyti tinkamiausias metodikas kuriant naujus
4-tiazolidinono darinius su pasirinktais farmakoforų struktūriniais
fragmentais.
2. Nustatyti susintetintų junginių fiziko-chemines savybes ir
toksišku-mo riziką in silico.
3. Įvertinti susintetintų junginių priešbakterinį ir
priešgrybelinį akty-vumą in silico ir in vitro.
4. Apibendrinti tyrimų rezultatus ir nustatyti didžiausiu
priešbakteriniu ir priešmikrobiniu aktyvumu pasižyminčius
junginius.
5. Įvertinti farmakoforų įtaką naujų junginių priešmikrobiniam
aktyvu-mui.
Tyrimo hipotezė:
4-tiazolidinono dariniai su sulfanilamido, nitrofurano ir
alilamino farma-
koforais pasižymi priešmikrobinėmis savybėmis prieš skirtingas
bakterijų ir
grybelio kultūras.
Mokslinio darbo naujumas ir praktinė reikšmė: Atlikta kryptinga
4-
tiazolidinono darinių sintezė, susintetinti 37 nauji junginiai,
struktūroje
turintys sulfanilamido, nitrofurano ar alilamino farmakoforus,
įvertintos jų
priešmikrobinės savybės.
Priešmikrobinio aktyvumo (prieš S. aureus, E. faecalis, E. coli,
P. aeru-
ginosa, K. pneumoniae, B. subtilis, P. mirabilis, C. albicans)
tyrimo in vitro
rezultatai palyginti su prognozės rezultatais. Nustatyta, kad
duomenys nesu-
tampa. Pvz., tyrimas in silico parodė, kad 7 junginiai aktyvūs
prieš grybelius
ir bakterijas, 21 junginys neturi priešmikrobinio aktyvumo.
Tyrimas in vitro
parodė, kad tokių junginių atitinkamai buvo 23 ir 14. O tyrimų
in silico ir in
vitro rezultatų palyginimas rodo, kad prognozė gali padėti
planuoti tyrimus,
tačiau duomenys turi būti tikrinami eksperimentiškai.
Priešmikrobinio aktyvumo tyrimo prieš kiekvieną bakteriją
rezultatų
įvertinimas, parodė, kad tokios struktūros junginiai
aktyviausiai slopina
bakterijų: S. aureus, E. faecalis ir E. coli, grybelio C.
albicans augimą,
tačiau visiškai neveikia kapsules sudarančios bakterijos P.
aeruginosa.
Didžiausiu aktyvumu pasižymėjo junginiai struktūroje turintys
nitrofurano
farmakoforą, mažiausiu – sulfanilamido farmakoforą.
Nustatytas priešmikrobinis aktyvumas prieš skirtingo tipo
bakterijas
(gramteigiamą – S. aureus, gramneigiamą – E. colis, kapsules
sudarančią–
K. pneumoniae, sporas sudarančią– B. subtilis, šliaužiančiąją –
P. mirabilis),
-
7
bei farmakoforo įtaka susintetintų junginių aktyvumui. Ateityje
šie duome-
nys papildys struktūros-aktyvumo ryšio dėsningumus bei kryptingą
naujų
priešmikrobinių junginių sintezę.
Darbo rezultatų aprobavimas: Darbo rezultatai pristatyti 4
konferen-
cijose: Tarptautinė farmacijos mokslo ir farmacijos praktikos
konferencija
skirta 225-osioms farmacijos mokslo Lietuvoje metinėms paminėti
(Kaunas,
2010.10.15–16), IV nacionalinė doktorantų mokslinė konferencija
„Mokslas –
sveikatai“ (Kaunas, 2011.04.07), Mokslinė konferencija „Chemija
ir chemi-
nė technologija“ (Kaunas, 2010.04.27), 5-oji tarptautinė
konferencija „THE
VITAL NATURE SIGN“ (Kaunas, 2010.05.19-21).
Išspausdintas 1 mokslinis straipsnis (žurnale „Medicina“).
Vienas moks-
linis straipsnis priimtas spausdinimui užsienio moksliniame
žurnale (Acta
Poloniae Pharmaceutica). Išspausdintos 3 pranešimų tezės.
Darbo apimtis ir struktūra: Disertaciją sudaro: įvadas,
literatūros
apžvalga, tyrimo objektas ir metodai, tyrimų rezultatai ir jų
aptarimas, išva-
dos, bibliografijos sąrašas (287 literatūros šaltiniai),
disertacijos tema pa-
skelbtų darbų sąrašas. Pateikta 21 lentelė ir 62 paveikslai.
Disertacijos
apimtis 114 puslapių.
-
8
1. LITERATŪROS APŽVALGA
Priešmikrobinių medžiagų vartojimo klinikinėje praktikoje
pradžia yra
vienas svarbiausių modernios medicinos žingsnių. Pirmųjų
priešmikrobinių
medžiagų vartojimas sumažino mirtingumą (nuo 70–90 proc. iki 10
proc.)
nuo sunkių ir gyvybei pavojingų ligų, kurias sukelia bakterijos
[6, 34, 138,
199, 213]. Per 30 metų nuo sulfanilamidų ir penicilino vartojimo
pradžios
klinikinėje praktikoje, buvo sukurta daugybė priešmikrobinių
vaistų, kurie
sėkmingai vartojami įvairių infekcinių ligų gydymui. Naujų
medžiagų
kūrimui naudoti Vokietijos ir Šveicarijos mokslininkų metodai,
pasiūlyti
XIX a. tyrinėjant natūralias medžiagas. Dauguma šių dienų
priešbakterinių
junginių grupių sukurtos 1935–1962 m.: sulfanilamidai,
β-laktamai, amino-
glikozidai, chloramfenikolis, tetraciklinai, makrolidai,
glikopeptidai, chino-
lonai [45, 72, 134, 156, 199, 271]. Daugelis naujų medžiagų
sukurtos modi-
fikuojant jau žinomus priešmikrobinius junginius [34, 199]. Šiuo
metu
klinikinėje praktikoje infekcinėms ligoms gydyti vartojama
daugiau kaip
200 priešmikrobinių medžiagų. Nepaisant to, infekcinės ligos vis
dar yra
viena dažniausių mirties priežasčių [78, 101, 158, 275] ir naujų
priešmikro-
binių vaistų poreikis nemažėja. Tai lemia pastaruoju metu vis
didėjantis
pacientų skaičius, kurių susilpnėjęs imunitetas. Tokie pacientai
dažniau
serga įvairiomis infekcinėmis ligomis. Nauji priešmikrobiniai
preparatai
sumažina klinikinio gydymo trukmę ir/ar dozavimą, yra mažiau
toksiški,
juos vartojant pasireiškia mažiau šalutinių poveikių (rečiau
sukelia vėmimą,
viduriavimą, alergines reakcijas) [52]. Viena iš priežasčių,
skatinanti kurti
naujas medžiagas, pasižyminčias priešmikrobinėmis savybėmis –
atsparumo
antibiotikams problema [6, 20, 22, 34, 50, 52, 100, 102, 143,
180, 200, 224,
278]. Atsparūs mikroorganizmai plinta ne tik ligoninėse. Jų
sukeliamos
ligos yra sunkiai gydomos ir pavojingos visai žmonijai [72, 180,
253]. Kai
kurie mokslininkai mano, kad atsparių mikroorganizmų sukeltas
infekcijas
galima gydyti derinant keletą priešmikrobinių vaistų ir naujų
kurti nereikia
[34, 52, 153, 199, 200]. Manoma, kad dėl tokio požiūrio yra
sumažėjęs
verslo interesas. Dauguma didžiųjų farmacijos kompanijų
nusprendė, kad
vaistai lėtinių ligų gydymui yra pelningesni nei priešbakterinės
medžiagos,
todėl labai sumažino arba visiškai atsisakė vaistų nuo infekcijų
kūrimo ir
tyrimų. Viena iš galimų tokio sprendimo priežasčių – mažas
tinkamais
vaistais negydomų infekcinių ligų skaičius ir plati jomis
sergančiųjų
geografija. Tai apsunkina klinikinių tyrimų administravimą ir
kompanijoms
tampa nepatrauklu kurti naujus vaistus nuo infekcijų [20, 34,
52, 57, 77,
143, 157, 161, 199, 200, 203, 242].
-
9
Antibiotikams atsparių bakterijų skaičius vis auga, o naujo,
saugaus ir
efektyvaus vaisto kūrimas užtrunka daugiau nei 10 metų. Dėl
minėtų
priežasčių būtina tęsti naujų veikliųjų medžiagų paiešką, nes
atsparių bak-
terijų sukeltos infekcijos ateityje gali tapti pavojingos
epidemijos prie-
žastimi [34, 52, 58, 74, 99, 190, 199, 200, 282].
Dėl šių priežasčių, tampa akivaizdu, kad dabartinė
priešmikrobinių vaistų
paieška yra nepakankama ir neatitinka visuomenės poreikių.
Heterociklinės struktūros junginiai yra viena svarbiausių
organinių
junginių klasė, naudojama įvairiose mokslo srityse [14, 201].
Šių junginių
stuktūra nustatyta ir biologiškai aktyvių medžiagų struktūroje.
Šių junginių
tarpe didelę reikšmę turi tiazolo dariniai, kuriais, kaip
potencialiais vaistais,
imta domėtis XX a. pradžioje, tiazolo ir tiazolidino dariniais
susidomėjimas
padidėjo, kai ši struktūra buvo nustatyta plačiai vartojamuose
junginiuose
(pvz. tiazolidinas – peniciline) [21, 195, 255].
Tiazolidinono dariniai taikomi medicinos praktikoje, kaip:
onkologiniai
[2, 21, 43, 89, 103, 188, 207, 251], prieuždegiminiai [2, 83,
132, 189, 234,
244, 248], priešgrybeliniai [39, 240], malšinantys skausmą [21,
248],
mažinantys karščiavimą [21], priešmikrobiniai [2, 7, 21, 26, 53,
61, 94, 108,
125, 130, 160, 192, 232, 251, 261, 264, 266], prieštraukuliniai
[2, 149, 260],
antihistamininiai [21, 58], antivirusiniai [2, 15, 17, 18, 19,
21, 124, 210,
211, 212, 214, 215, 216, 251], prieštuberkulioziniai vaistai
[117, 251],
folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) receptorių agonistai [2,
276].
Neseniai buvo nustatytas 4-tiazolidinonų aktyvumas prieš
bakterijų fermen-
tą Mur B, kuris yra peptidoglikano biosintezės pirmtakas
[9].
4-tiazolidinonai – tai yra tiazolidino dariniai, ketvirtoje
žiedo padėtyje
turintys karbonilo grupę [2, 140, 235, 236] (1.1 pav.).
S
NH
O
X1 2
34
5
1.1 pav. Bendra 4-tiazolidinonų formulė
Pastaruoju metu susidomėjimą kelia ir kiti panašios struktūros
junginiai:
2,4-tiazolidindionas (X = O) ir 2-tiokso-4-tiazolidinonas
(rodaninas, X = S).
Šių struktūrų pagrindu kuriami antidiabetiniai vaistai [140]. 4
padėtyje
esanti karbonilo grupė yra neaktyvi, nors literatūroje yra
aprašyta atitinkamų
tiodarinių, kurie gaunami reakcijoje su Lawesson reagentu
(2,4-bis(4-
metoksifenil)-1,3,2,4-ditiodifosfoetan-2,4-disulfidu) [2,
114].
-
10
4-tiazolidinono žiedas sintetinamas keliomis sintezės kryptimis:
ciklokon-
densacija, sintezė iš panašių heterociklinių junginių,
heterociklinių junginių
transformacija. Vienas dažniausiai naudojamų metodų yra
ciklokondensacija.
Šiuo metodu dažniausiai sintetinami 2,4-tiazolidindionas ir
2-tiokso-4-
tiazolidinonas. α-halogenkarboksirūgštys naudojamos kaip
dielektrofiliniai
reagentai [C2]2+
reakcijose su N,S-nukleofilais (1.2 pav.) [2, 116, 124, 140,
165, 235, 236, 264].
S
N
O
X
R
R NH2
CXSRNHCXS X = O,S
Cl
OHO
1.2 pav. Klasikinis 4-tiazolidinono ciklo sintezės metodas
Vienas iš dažniausiai naudojamų metodų 2-imino-4-tiazolidinono
gavi-
mui yra įvairių tiokarbamidų ir tiosemikarbazidų reakcijos su
α-halogen-
karboksirūgštimis (1.3 pav.) [60, 83, 91, 92, 130, 140, 236,
252, 284].
RNH NH
2
S
N
S
RO
NH
N
SNHR
O
ClCH2
O
OH
1.3 pav. 2-imino-4-tiazolidinono gavimo iš įvairių tiokarbamidų
reakcija
Taip pat galimi būdai: tiokarbamidą veikiant monochloracto
rūgšties
natrio druska [2, 165], tiocianatą arba alkilizotiocianatą
veikiant hidrazidu
(acetamidu), esant etilbromacetatui ir natrio acetatui [2, 41,
129].
Sintetinant 4-tiazolidinono darinius, pakaitai dažniausiai
įvedami į 2, 3
arba 5 padėtį [2, 140, 235, 236]. 5-je padėtyje esanti metileno
grupė yra
ypač aktyvi, todėl dažniausiai 4-tiazolidinono dariniai gaunami
modifikuo-
jant šią padėtį [64, 65, 121, 140]. Biologiškai aktyvūs
junginiai gaunami į
5-tą padėtį įvedant karbonilinių junginių fragmentus aldolinės
kondensacijos
metu (1.4 pav.) [129, 130, 195, 267].
-
11
N
S
RO
XO
R
R
X = O, S, NH, NR
X
N
S
RO
R
R
1.4. pav. Karbonilinių junginių fragmentų įjungimas į
4-tiazolidinono žiedą
Verta paminėti, kad 5-toje 4-tiazolidinono ciklo padėtyje
esančios meti-
leno (-CH2-) grupės reakcijos su oksojunginiais yra
efektyviausias būdas
sintetinti biologiškai aktyvius 5-ariliden-4-tiazolidinono
darinius. Šie jungi-
niai yra tiriami kaip potencialūs priešmikrobiniai,
priešvirusiniai, priešvėži-
niai vaistai [140, 195]. Reakcija gali būti katalizuojama natrio
šarmu, natrio
acetato ir acto rūgšties ar jos anhidrido mišiniu, amonio
hidroksidu, amonio
hidroksido ir amonio chlorido mišiniu, metilamino ir acto
rūgšties mišiniu ir
kt. katalizatoriais [76, 140, 144, 145, 148, 178, 217, 259].
Atlikus reakcijas
su įvairiais aromatiniais aldehidais pagal Knoevenagel‘io
metodiką,
nustatyta ir BMR spektrine analize patvirtinta, kad
nepriklausomai nuo
naudojamo aldehido visada gaunamas trans-izomeras [23, 174,
202].
Literatūroje yra aprašyta ir tiesioginių, vieno etapo,
5-pakeistų 4-tiazoli-
dinonų sintezės metodų, naudojant 3 komponentus. Pvz., aldehidą,
tiokarba-
midą ir chloroformą [2, 16, 24, 76, 97, 118, 165] (1.5
pav.).
CHO
NH2
NH2
S
CHCl3
NH
NH
S
O
1.5 pav. 5-pakeistų 4-tiazolidinonų sintezė
2-tiokso-4-tiazolidinono dariniams būdinga tautomerija [66,
180].
Judriam vandenilio atomui esant prie tioksogrupės, susidaro
merkapto
grupė, kurią alkilinant galima gauti
2-alkiltio-4-tiazolidinonus. 2-alkiltio-4-
tiazolidinonams reaguojant su aminais, reakcijos vyksta lengviau
nei su
rodaninu, gaunamos didesnės išeigos bei grynesni reakcijos
produktai. 2-
alkilrodaninai gaunami veikiant rodanino darinius
alkilhalogenais esant
bazėms (NaOH, KOH, NaH, EtN3) [140]. 2-alkiltio-4-oksotiazolinai
reaguo-
-
12
ja su aromatiniais aminais, susidarant 2-imino-4-oksotiazolidino
dariniams
(1.6 pav.) [184, 195, 246].
NH
SS
O
RHal
N
SSHal
O
NH2
- HSRN
SNH
O
1.6 pav. 4-tiazolidinonų darinių sintezė iš
2-tiokso-4-tiazolidinono
Šiuo metu 4-tiazolidinono struktūra yra daugelio medžiagų,
pasižyminčių
skirtingomis farmakologinėmis savybėmis pagrindas. Dažniausiai
jie
naudojami kaip antidiabetiniai vaistai. Pirmasis vaistinis
preparatas, kurio
pagrindas 4-tiazolidinono struktūra buvo rosiglitazonas (1.7
pav.).
N NH
S O
OON
1.7. pav. Rosiglitazonas
4-tiazolidinonų veikimo mechanizmo nustatymas, išskyrė juos į
atskirą
antidiabetinių vaistų klasę. Vėlesni tyrimai atskleidė, kad
4-tiazolidinonų
dariniai gali būti naudojami įvairiose medicinos srityse
(onkologijoje,
infektologijoje ir kt.) kaip potencialūs vaistai. Įvairios
4-tiazolidinono žiedo
modifikacijos, siekiant susintetinti biologiškai aktyvius
junginius yra svar-
biausia priežastis, dėl kurios ši heterociklinių junginių klasė
yra įdomi įvai-
rių sričių tyrėjams [120, 140, 263].
Tiokarbamido dariniai. Tiokarbamidai yra organinių junginių
klasė.
Dažniausiai jie naudojami, kaip reagentai organinėje sintezėje
[44, 128, 230,
281]. Tiokarbamidai gali egzistuoti dviejuose tautomerinėse
formose (1.8 pav.).
NH2
S
NH2
NH2
SH
NH
1.8 pav. Tiokarbamidų tautomerija
Tiokarbamidų ir tiosemikarbazidų reakcijos su
α-halogenkarboksirūgš-
timis yra vienas iš dažniausiai naudojamų metodų
2-imino-4-tiazolidinono
gavimui [67, 69, 83, 91, 92, 116, 130, 140, 252, 284].
Tiosemikarbazidų
-
13
dariniai pasižymi skirtingu biologiniu aktyvumu, pvz.,
priešmikrobinių
junginių struktūroje yra 1,2,4-triazolo fragmentas [110, 119,
122, 185, 208,
225], prieštraukulinių - 1,3,4-tiadiazol-2-amidino fragmentas
[71, 86, 122].
Paprasčiausias tiokarbamido darinių gavimo metodas yra
izotiocianatų
reakcija su aminais, vykstanti pagal nukleofilinio prijungimo
mechanizmą.
(1.9 pav.) [230].
+ NH2RR
N S R N NH2
S
R
-
+ RN NH
SH
R
RNH NH
S
R
1.9 pav. Tiokarbamido darinių gavimo iš izotiocianatų
reakcija
Vienas iš dažniausiai naudojamų metodų, tiosemikarbazidų
sintezei yra
izotiocianatų ir hidrazinų sąveika (1.10 pav.) [122].
+ NH2NH2R N SR
NH NH
S
NH2
1.10 pav. Tiosemikarbazidų gavimo reakcija
Reakcijos su aminais dažniausiai vykdomos etanolyje, tačiau
galima jas
atlikti ir kituose tirpikliuose, pvz.: metanolyje, acetone,
toluene, chlorofor-
me, piridine, dimetilformamide, benzene. Reakcija vykdoma imant
ekviva-
lenčius reaguojančių medžiagų kiekius. Literatūroje yra aprašyta
atvejų, kai
buvo imamas izotiocianato perteklius [284].
Nesimetrinių tiokarbamido darinių kondensacijos su
monochloracto
rūgštimi metu, į antrą padėtį įjungiami elektrofiliniai
pakaitai. Pagal 2-je
padėtyje pakeisto 4-tiazolidinono susidarymo galimybę, pakaitai
išdėstomi
elektrofiliškumo didėjimo tvarka: vandenilis – alkilas – arilas
– piridilas
[284]. Kondensuojant aliltiokarbamidus, alilo radikalas elgiasi
kaip alkilas.
Simetrinių tiokarbamido darinių sintezėje naudojamas anglies
disulfidas
[147]. Šiuo metodu sintezė vykdoma ne tiesiogiai (kaip sintezėje
su izotio-
cianatu), bet sudarant tarpinį junginį. Metodo privalumas –
gaunami simetri-
niai ir nesimetriniai (1.11 pav.).
-
14
NH
R
R+CS2+ NaOH
R'-NH2
NR
R
NH
R'S
1.11 pav. Simetrinių tiokarbamidų gavimo reakcija
Sulfanilamidotiokarbamido dariniai. Dėl panašaus farmakologinio
po-
veikio (p-aminobenzoinės rūgšties inaktyvavimo), karbamidas ir
sulfani-
lamidai XX a. pradžioje kartu vartoti klinikinėje praktikoje.
Ankstesniuose
mokslo darbuose (1940–1950 m.) kelti uždaviniai sujungti šias
dvi medžia-
gas į vieną molekulę ir ištirti jų priešbakterinį aktyvumą. 1940
m. Northey
aprašė dešimt sulfanilamidokarbamido ir
sulfanilamidotiokarbamido dari-
nių. Junginiai gauti modifikuojant tik aromatinę amino grupę (N4
pakeisti
sulfanilamidai). Mokslininkai Roth ir Degering sintetino
sulfanilamido-
karbamido ir sulfanilamidotiokarbamido darinius, modifikuodami
aromatinę
amino grupę (N4 pakeisti sulfanilamidai) bei sulfogrupės
amidogrupę (N
1
pakeisti sulfanilamidai), taip pat lygino šių junginių
priešbakterinį aktyvumą.
N4 pakeisti sulfanilamidai susintetinti sujungiant sulfanilamidą
su atitin-
kamu izocianatu (sulfanilamidokarbamido dariniams) arba
izotiocianatu
(sulfanilamidotiokarbamido dariniams) (1.12 pav.) [228,
229].
NH2SNH2
O
ORN S NH
SNH2
O
O
S
NHR
1.12 pav. Bendra sulfaniltiokarbamidų gavimo reakcija
N1 pakeisti sulfanilamidai susintetinti sujungiant
p-acetilaminobenzen-
sulfonilchloridą su semikarbazidu / tiosemikarbazidu arba
acetilsufanilhidra-
ziną su izocianatu / izotiocianatu. Semikarbazidas ir
izocianatas naudoti,
siekiant gauti sulfanilamidokarbamido darinius, o
tiosemikarbazidas ir
izotiocianatas – sulfanilamidotiokarbamido darinius (1.13–1.14
pav.) [228,
229].
S
O
O
NH
CH3
O
Cl
NH2
NH NH2
S
NH
CH3
O
SNH
O
O
NH
S
NH2
1.13 pav. Sulfaniltiokarbamidų gavimo iš tiosemikarbazido
reakcija
-
15
RN S
NH
CH3
OS
NHO
O
NH
S
NHRS NH
O
O
NH2
NH
CH3
O
1.14. pav. Sulfaniltiokarbamidų gavimo iš izotiocianato
reakcija
Panašius junginius sintetino ir Niemiec (1944–1950 m.).
Skirtingai nuo
Roth ir Degering ji papildomai atliko savo susintetintų junginių
deaceti-
linimą, naudojant rūgštinę hidrolizę, aprašė šių junginių
priešmikrobines
savybes. Ji įrodė, kad sulfanilamidotiokarbamido dariniai
pasižymi 1–10
kartų didesniu aktyvumu prieš Streptococcus viridans nei
sulfatiazolas.
Sulfanilamidai – sintetinės priešmikrobinės medžiagos, kurių
struktūros
pagrindą sudaro sulfanilamido (-NH-C6H4-SO2-NH-) grupė [4, 13,
79].
Sulfanilamidai – pirmieji priešmikrobiniai vaistai, davę pradžią
antibiotikų
revoliucijai medicinoje [38, 93, 123, 137, 270]. Cheminiu
požiūriu sulfanil-
amidai yra sulfanilo rūgšties amido (streptocido), kuris gali
būti vertinamas
kaip priešbakterinio veikimo farmakoforas, dariniai (1.15
pav.).
NH S
O
O
NH XX
1.15 pav. Bendra sulfanilamidų formulė
Tai bekvapės, baltos spalvos medžiagos, mažai tirpios vandenyje
(0,1–5
g/l) ir organiniuose tirpikliuose [107].
Nauji sulfanilamidų dariniai kuriami pakeičiant X įvairių
junginių
fragmentais (streptocidas X=H). 4 padėtyje esanti amino grupė
yra
atsakinga už priešmikrobinį veikimą, todėl jos vandeniliai nėra
keičiami,
išskyrus atvejus, kai organizme radikalas atskyla ir amino
grupė
išlaisvinama (pvz. ftalazolis). Papildomų radikalų įvedimas į
benzeno žiedą
– sumažina sulfanilamidų aktyvumą [38, 75, 107, 209, 265, 268,
269, 286].
Sulfanilamidų veikimo veikimo spektras labai platus (veikia
daugelį
mikroorganizmų, silpniau chlamidijas, grybelius ir pirmuonis),
tačiau per
daugelį metų atsirado nemažai jiems atsparių mikrobų padermių
[4, 8, 25,
28, 30, 38, 75, 95, 107, 111, 152, 155, 179, 227, 237, 247, 250,
277, 286].
Taip pat sulfanilamidų vartojimas maždaug 3 proc. bendros
populiacijos ir
60 proc. pacientų su žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV), gydomų
sulfani-
lamidais, sukelia gana daug pašalinių reiškinių. Dažniausiai
pasireiškia
padidėjusio jautrumo (alerginės) reakcijos, virškinimo
sutrikimai, galvos
-
16
skausmas [31, 40, 48, 238, 254]. Literatūroje aprašomi tyrimai,
kad ilgalai-
kis sulfanilamidų (ypač sulfamerazino ar sulfadimetoksino)
vartojimas gali
sukelti onkologinius susirgimus (epitelinio audinio piktybinius
navikus)
[105, 135, 163].
Dėl išvardintų priežasčių ir sukurtų aktyvesnių priešmikrobinių
vaistų
sulfanilamidų vartojimas mažėja [5, 56, 133, 286]. Tačiau, jie
vis dar aktua-
lūs žemės ūkyje ir veterinarijoje – bakterijų sukeltų ligų
gydymui, augimo
skatinimui, pašarų kokybės gerinimui ir kt. [27, 46, 47, 79,
141, 151, 231,
243, 256, 283].
Progresuojant priešbakterinių vaistų tyrimams, sukuriama vis
daugiau ir
skirtingos cheminės struktūros junginių. Tačiau, peržiūrėjus
priešbakterinių
vaistų vartojimo istoriją, negalima nepastebėti, kad
sulfanilamidai užėmė
gana svarbią vietą infekcijų gydyme gana ilgą laiką. Tobulėjant
biotechno-
logijoms nustatyta, kad sulfanilamidų toksiškumas ir
selektyvumas labai
priklauso nuo galimybės konkuruoti su folio rūgštimi [173].
Taigi, viena iš
sulfanilamidų grįžimo į klinikinę praktiką galimybių –
toksiškumo mažini-
mas. Naujausiuose moksliniuose darbuose [142, 168, 218, 245],
aprašomos
įvairios sintezės reakcijos panaudojant sulfanilamidų
fragmentus. Žinant,
kad dėl panašumo į 4-aminobenzoinę rūgštį sulfanilamidai
organizme rea-
guoja su folio rūgštimi sudarydami neveiklius junginius, buvo
iškelta hipo-
tezė, kad sulfanilamidus sujungus su organizme lengvai
metabolizuojamais
junginiais, pvz. aminorūgštimis ar jų acilintais dariniais bus
sumažintas jų
toksiškumas ir tuo pačiu, jie išliks svarbiais folio rūgšties
antagonistais
(1.16 pav.) [131, 196, 245].
NH2
S
O
O
NH R +N
OR'
NO2
NH
S
O
O
NH R
OR'
NH
O
NO2
1.16 pav. Mažiau toksiškų sulfanilamidų sintezės metodas
Įvertinus šiuo būdu susintetintų junginių toksiškumą, nustatyta,
kad
hipotezė, jog sulfanilamidus sujungus su organizme lengvai
metabolizuo-
jamais junginiais, sumažės jų toksiškumas, bet išliks
priešmikrobinės
savybės pasitvirtino. Gauti junginiai mažai toksiški LD50 =
5,8–6,8 g/kg
kūno svorio. Taip pat ištyrus jų priešmikrobinį aktyvumą,
nustatyta, kad
-
17
susintetinti junginiai yra aktyvūs mažesnėmis nei 5 mg
koncentracijomis,
kai tuo tarpu patys sulfanilamidai buvo neaktyvūs.
Dar viena galimybė sulfanilamidams yra jų fragmentų įjungimas į
naujų
potencialių priešmikrobinių vaistų struktūrą. Vieni iš tokių yra
azoto
heteroatomą turintys heterociklai – pirimidino ir pirazolo
dariniai.
Nustačius, kad pirolo, pirazolo ir pirimidino dariniai pasižymi
naudingomis
biologinėmis savybėmis [3, 11, 54, 62, 63, 98, 171, 175, 176,
223],
nuspręsta jų fragmentus sujungti su sulfanilamidais, tokiu būdu
tikintis
didesnio naujų junginių aktyvumo [82]. Sulfanilamido molekulės
amido
grupė sujungiama su tiazolo, chinoksalino ir pirimidino
pakaitais, o
aromatinė amino grupė transformuojama į įvairius azoto
heteroatomą
turinčius heterociklus (1.17 pav.).
NH2
S OO
NH
R
CH
2
O
Br
NH
S OO
NH
R
O
NN
EtOH NaOEt
N
S OO
NH
R
NH2
CN
N
NH
N
S OO
NH
R
O
HCOOH
1.17 pav. Sulfanilamidų aromatinės amino grupėtokie junginiai
pasižymi
geresnėmis priešmikrobinėmis savybėmis nei pradiniai
sulfanilamidai.
Taip pat naujausiose publikacijose nagrinėjama galimybė –
sulfanilamidų
fragmentų naudojimas, siekiant priešgrybelinio aktyvumo [113,
127, 233].
Tuo tikslu sulfanilamido fragmentas jungiamas su chitozanu [280]
- nusta-
tyta, kad priešgrybelinis aktyvumas didėja, didėjant junginio
molekulinei
masei; 1,2,3-triazolu [272] – nustatyta, kad gauti junginiai
pasižymėjo
priešmikrobinėmis ir priešgrybelinėmis savybėmis, tačiau
visiškai neveikė
C. albicans.
Nitrofuranai – sintetinės chemoterapinės medžiagos, kurių
struktūros
pagrindą sudaro furano žiedas (1.18 pav.).
ONO
2X
1.18 pav. Bendra nitrofuranų formulė
-
18
Nitro grupė yra penktoje furano žiedo padėtyje, o antroje
padėtyje
prisijungiami įvairūs radikalai. Tai gali būti vinilideno grupė
(furaginas),
azometino grupė (nitrofurantoinas, furazolidonas, nitrofuralis)
[32, 258].
Nitrofurano dariniai pasižymi priešmikrobiniu aktyvumu,
vartojami bakte-
rijų, grybelių ir pirmuonių sukeltoms ligoms gydyti, taip pat
kaip antiseptinė
priemonė. Tai plataus spektro preparatai, aktyviai veikiantys
prieš gamtei-
giamas ir gramneigiamas bakterijas Escherichia coli, Klebsiella
pneumo-
niae, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigela,
Campylobacter, Heli-
cobacter, kai kurias Proteus padermes, Enterococcus faecalis,
Staphyloco-
ccus aureus, Staphylococcus epidermidis ir k., įskaitant ir
salmoneles,
dažnai yra aktyvūs prieš sulfanilamidams ir kitiems
antibiotikams atsparias
bakterijų formas [32, 104, 197, 257].
Farmakologinis nitrofuranų aktyvumas priklauso ir nuo jų
cheminės
struktūros. Vieni jų daugiau pasižymi kaip priešgrybeliniai,
kiti – kaip anti-
protozojiniai, treti – kaip priešbakteriniai preparatai. Pvz.,
furazolidonas
(šoninėje grandinėje turi oksazolidono fragmentą) veikia
gramneigiamus
mikroorganizmus, o nitrofurantoinas (šoninėje grandinėje turi
aminohidan-
tiono fragmentą) – šlapimtakių infekcijas (1.19 pav.) [12, 32,
42 68, 84, 87,
88, 136, 159, 239, 262, 279].
O
N
OO
2N N
O
NHN
OO
2N N
O
O
nitrofurantoinasfurazolidonas
1.19 pav. Nitrofuranų atstovai
Žinoma, kad dauguma medicinoje ir veterinarijoje vartojamų
nitrofuranų
turi nitrofurilideno fragmentą. Norint gauti biologiškai aktyvų
nitrofurano
darinį, nitrofurano žiedas turi būti sujungtas su mažo bazingumo
azoto
atomu per etileno grupę [32]. 1944 m. Dodd ir Stillman in vitro
tirdami
furanų aktyvumą nustatė, kad priešmikrobiniam veikimui yra
būtina nitro
grupė. Redukavus arba pašalinus nitro grupę priešmikrobinis
aktyvumas
prarandamas [206]. Lyginant 5-nitrofurano darinių priešbakterinį
aktyvumą,
nustatyta, kad junginių turinčių dvigubą jungtį anglis-anglis
šoninėje furano
žiedo grandinėje, priešmikrobinis aktyvumas yra didesnis [42,
162, 164,
194]. Taip pat buvo pastebėta, kad į junginių,
nepasižyminčių
priešbakterinėmis savybėmis, struktūrą įjungus 5-nitro-2-furil-
fragmentą,
-
19
buvo gaunamas naujas junginys pasižymintis priešmikrobiniu
aktyvumu
[32, 42].
Svarbu paminėti, kad rezistentiškumas nitrofuranams vystosi
lėtai [32,
262], tačiau literatūroje yra duomenų, kad kai kurios
gramneigiamos bak-
terijos, kaip Pseudomonas, Serratia, Enterobacter ir Proteus,
taip pat ir
mieliniai grybeliai yra atsparūs nitrofurano dariniams [112]. Iš
kitų prieš-
bakterinių preparatų išsiskiria tuo, kad neslopina imuniteto, o
jį sustiprina,
didindami fagocitozę ir komplemento titrą [32, 219, 226, 257,
262].
Priežastis dėl kurios daugelis nitrofuranų darinių prarado savo
populia-
rumą ir šiandien nebevartojami, yra jų mutageniškumas ir
karcinogenišku-
mas [204, 205].
Nepaisant to, pastaruoju metu išaugo susidomėjimas šiais
nitrohetero-
cikliniais junginiais, tiriami nauji jų dariniai [33, 49, 80,
274].
Alilaminai ir benzilaminai – naujausios sintetinių
priešgrybelinių vaistų
grupės. Šios grupės junginiai yra skiriami vietinėms grybelių,
ypač derma-
tofitų, sukeltoms infekcijoms gydyti [10, 50, 73, 274].
Alilaminų ir benzila-
minų grupės vaistai veikia selektyviai slopindami ergosterolio
sintezėje
dalyvaujantį fermentą – skvaleno epoksidazę [1, 220, 221, 222].
Skirtingai
nuo azolų, jie neveikia citochromo P450 [10, 73, 85, 100].
Alilaminų, kaip
biologiškai aktyvių junginių, paieška prasidėjo nuo struktūros
aktyvumo
ryšio analizės. Modifikuojant pirmojo alillamino – naftifino
molekulę (daž-
niausiai keičiant šoninę grandinę), buvo sukurtas antrasis šiuo
metu naudo-
jamas alilaminų grupės atstovas – terbinafinas (1.20 pav.)
[181].
N
N
Terbinafinas Naftifinas
1.20 pav. Alilaminų atstovai
Tiriant šių junginių aktyvumą prieš mieles, nustatyta, kad
aktyvumas
padidinamas į naftaleno žiedą įjungiant halogeno pakaitus
(5-chlor, 5-fluor,
5,7,-difluor) arba vietoje naftaleno žiedo įjungiant
3-halogen-7-benzo[b]tio-
-
20
feną [182]. Intensyviai keičiant šoninę grandinę buvo sukurtos
dvi naujos
vaistų grupės: benzilaminai ir homopropargilaminai. Analizuojant
strutūros
aktyvumo ryšio tyrimų rezultatus, sukurtas bendras
farmakoforinis modelis
visoms paminėtoms junginių grupėms, apibrėžiamas erdve tarp
dviejų
lipofilinių fragmentų (L1 ir L2) tam tikru atstumu nutolusių nuo
polinio
centro (X) (1.21 pav.) [181].
X
L1 L2
N
1.21 pav. Farmakoforinis alilaminų modelis
Pirminiai struktūros aktyvumo ryšio tyrimai parodė, kad
alilamino gru-
pėje esantis azoto atomas nėra būtinas fermento – skvaleno
epoksidazės,
inaktyvavimui, tačiau padeda junginiui patekti į grybelio
ląstelę. Tuo tikslu
alilamino grupėje esantis azoto atomas buvo pakeistas deguonies,
anglies
atomu arba vietoje tretinio amino panaudotas antrinis aminas.
Tyrimo rezul-
tatai parodė, kad šie junginiai buvo aktyvesni nei terbinafinas
ir naftifinas
[70, 183]. Šiuo metu siekiama nustatyti, ar polinis centras
privalo būti tarp
dviejų lipofilinių fragmentų, ar gali būti viename iš jų.
Analizuojant įvairių
polinių grupių įtaką, nustatyta, kad norint išlaikyti
priešgrybelinį aktyvumą,
nesumažinant patekimo į ląstelę galimybės, pakaitai (išskyrus
fluorą) gali
būti įvesti tik į 5-ą naftaleno ciklo padėtį. [181]
Apžvelgus literatūros šaltinius, nusprendėme sintezuoti
4-tiazolidinono
darinius, jų struktūrą papildant šiuo metu naudojamų
priešmikrobinių
medžiagų fragmentais:
sulfanilamidai – šie junginiai vis mažiau vartojami dėl jų
toksiškumo ir išsivysčiusių atsparių bakterijų padermių bei
pašalinių reakcijų [8].
Tačiau įjungus sulfanilamidų fragmentus į naujų potencialių
prieš-
-
21
mikrobinių vaistų struktūrą, pastebimas didesnis jų
priemikrobnis
aktyvumas lyginant su pradiniais sulfanilamidais, taip pat
išryškėja
priešgrybelinis poveikis [113, 127, 233];
nitrofuranai – šių fragmentų įjungimo į 5-tiazolidinono ciklo
padėtį racionalumas įrodytas ankstesniuose moksliniuose darbuose.
Taip
pat yra žinoma, kad 7 proc. priešgrybelinėmis savybėmis
pasižyminčių junginių struktūroje turi furano ar nitrofurano
ciklą
[32, 126, 195, 242];
alilaminai ir benzilaminai – naujausios priešgrybelinių vaistų
grupės, todėl buvo įdomu, šiuo farmakoforus įjungti į molekulę,
kartu su jau
anksčiau naudojamų, priešmikrobinėmis savybėmis
pasižyminčių,
junginių fragmentais [10, 50, 73, 195].
-
22
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI
Tyrimų objektas – susintetinti nauji 4-tiazolidinono dariniai,
turintys
sulfanilamido, alilamino ar nitrofurano farmakoforus.
Tyrimo metodika
Naudotos medžiagos ir tirpikliai
2,6-dichlorbenzaldehidas (99 proc.), 2-fluorbenzaldehidas (97
proc.), 2-
hidroksi-5-nitrobenzaldehidas (98 proc.),
2-hidroksibenzaldehidas (≥98 proc.),
4-(dimetilamino)benzaldehidas (99 proc.), 4-brombenzaldehidas
(99 proc.),
4-chlorbenzaldehidas (97 proc.), 4-fluorbenzaldehidas (98
proc.), 4-hidrok-
sibenzaldehidas (98 proc.), 4-nitrobenzaldehidas (98 proc.),
5-nitrofurfuro-
las (99 proc.), furfurolas (99 proc.), 5-nitrofurilakrpleinas
(99 proc.), 3-
aminorodaninas (99 proc.), benzilaminas (99 proc.), aktyvuota
anglis, kalio
acetatas (≥99 proc.), bromacto rūgšties metilo esteris (97
proc.),
alilizotiocianatas (95 proc.), amonio acetatas (≥98 proc.),
hidrazino hidratas
(78–82 proc.), jodmetanas (≥99 proc.), monochloracto rūgštis
(≥99 proc.),
rodaninas (97 proc.), sulfametizolis (≥99 proc.), sulfanilamidas
(≥99 proc.),
sulfisomidinas (≥99 proc.), 2-propanolis (99,5 proc.),
acetonitrilas
(≥99,9 proc.), acetonas (≥99,8 proc.), benzenas, butanolis (99,8
proc.),
dioksanas (99,8 proc.), DMF, dimetilsulfoksidas (≥99,5
proc.),
dimetilsulfoksidas-d6, anglies tetrachloridas ( ≥99,5 proc.),
dietilo eteris
(≥99 proc.), heksanas (95 proc.), ledinė acto rūgštis (≥99,7
proc.), metanolis
(≥99.9 proc.), n-butanolis (≥99,9 proc.), n-propanolis (99,7
proc.) įsigyti iš
„Sigma-Aldrich GmbH“ (Buchs, Šveicarija), sulfadimidinas,
sulfafurazolas,
sulfametoksipiridazinas, sulfamoksolis, sulfapiridinas (≥99
proc.),
sulfatiazolas (≥98 proc.) iš „Fluka Chemie“ (Buchs, Šveicarija),
etanolis
(96,3 proc.) iš „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva). Visi naudoti
tirpikliai yra
ESC analitinio švarumo. Ultragrynas vanduo ruošiamas „Millipore“
(JAV)
vandens valymo sistema.
Naujų junginių sintezės metodika. Junginiai susintetinti
Lietuvos
sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Vaistų
chemijos kated-
roje.
1) Nauji 4-tiazolidinono dariniai su sulfanilamido ir alilamino
far-
makoforais susintetinti ciklokondensacijos metodu, paremtu
α-halo-
genkarboksirūgščių sąveika su N,S-nukleofilais [2, 29, 55, 139,
140,
169, 172, 228, 229].
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=281549|SIAL&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC
-
23
1-{4-[(4,6-dimetilpirimidin-2-il)sulfamoil]fenil}-3-(2-propen-1-il)tiokar-
bamidas (ZAT-1-1),
3-(2-propen-1-il)-1-{4-[(1,3-tiazol-2-il)sulfamoil]fe-
nil}tiokarbamidas (ZAT-1-2),
3-(2-propen-1-il)-1-(4-sulfamoilfenil)tiokar-
bamidas (ZAT-1-3),
1-{4-[(5-metil-1,3,4-tiadiazol-2-il)sulfamoil]fenil}-3-
(2-propen-1-il)tiokarbamidas (ZAT-1-4) (2.1 pav.).
0,01 mol atitinkamo sulfanilamido (sulfadimidino, sulfatiazolo,
sulfanila-
mido, sulfametizolio) sumaišomas su 0,02 mol alilizotiocianato
ir 10 ml
(ZAT-1-1, ZAT-1-2) arba 20 ml etanolio (ZAT-1-3, ZAT-1-4).
Mišinys
kaitinamas glicerolio vonioje su grįžtamu šaldytuvu, 80 °C
temperatūroje,
3–5 val. Reakcijos mišinys vėsinamas iki kambario temperatūros,
susidarę
balti kristalai brandinami 15–20 min kambario temperatūroje,
filtruojami,
plaunami etanoliu, eteriu ir džiovinami kambario temperatūroje.
Gautas
produktas perkristalinamas: ZAT-1-1 iš 2-propanolio, ZAT-1-2 -
iš etanolio
ir DMF mišinio (1:1), ZAT-1-3 – etanolio, ZAT-1-4 - ledinės acto
rūgšties.
ZAT-1-1 R=
S
N
N N
S
ZAT-1-2 R=
ZAT-1-3 R= -H
ZAT-1-4 R=
NC
S
R S
O
O
NH NH2
NH S
O
O
NH RNH
S
N
N
2.1 pav. Tarpinių (1-alil-3-sulfanilamidotiokarbamido
darinių)
junginių sintezė
N-(4,6-dimetilpirimidin-2-il)-4-{[4-okso-3-(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-
2-iliden]amino}benzen-1-sulfonamidas (ZAT-2-1),
4-{[4-okso-3-(2-propen-
1-il)-1,3-tiazolidin-2-iliden]amino}-N-(1,3-tiazol-2-il)benzen-1-
sulfonamidas (ZAT-2-2),
4-{[4-okso-3-(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-2-iliden]-
amino}benzen-1-sulfonamidas (ZAT-2-3),
N-(5-metil-1,3,4-tiadiazol-2-il)-
4-{[4-okso-3-(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-2-iliden]amino}benzen-1-sulfona-
midas (ZAT-2-4) (2.2 pav.).
-
24
2,5 ml ledinės acto rūgšties ištirpinamas 0,01 mol atitinkamo
1-alil-3-
sulfanilamidotiokarbamido darinio, maišant pridedamas 0,01 mol
mono-
chloracto rūgšties ir 0,01 mol amonio acetato. Mišinys
kaitinamas glicerolio
vonioje su grįžtamu šaldytuvu, 78–80 °C temperatūroje, 2,5–3
val. Karštas
tirpalas filtruojamas ir filtratas vėsinamas iki kambario
temperatūros. Susi-
darę kristalai filtruojami, plaunami vandeniu, etanoliu, eteriu
ir džiovinami
kambario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš
ledinės acto
rūgšties.
Cl
O
OH
ZAT-2-1 R=
N
N
S
N
N N
S
CH3COONH4 ZAT-2-2 R=
ZAT-2-3 R= -H
ZAT-2-4 R=
N
S
O
N S
O
O
NH R
NH S
O
O
NH RNH
S
2.2 pav. Naujų 4-tiazolidinono darinių su sulfanilamido
ir alilamino farmakoforais sintezė
2) Nauji 5-pakeisti 4-tiazolidinono dariniai su sulfanilamido
farma-
koforu sintetinti Knoevenagel‘io metodu, paremtu
oksojunginių
sąveika su 5-je 4-tiazolidinono ciklo padėtyje esančia
metileno
grupe, katalizuojant natrio acetatui, esant acto rūgščiai [76,
140, 148,
259]. Pradiniu junginiu reakcijoje naudotas –
2-metilrodaninas
susintetintas pagal Tarasevičiaus metodiką [249].
Sulfanilamido
fragmentas įjungtas amininimo reakcijos metu [195, 241,
249].
2-metilrodanino sintezė. 1 mol kalio susmulkinamas ir mažais
kiekiais
dedamas į maišomą ir šaldomą metanolį, gaunant kalio metilatą. 1
mol
rodanino sumaišomas su 2 litrais eterio ir maišant į jį
lašinamas kalio
metilatas. Sulašinus, mišinys dar maišomas apie 30 min., kol
pastebimas
spalvos pasikeitimas iš geltonos į rusvai gelsvą. Nuosėdos
filtruojamos,
plaunamos vandeniu ir metanoliu. Acetono ir trichlormetano
mišinyje (1:1)
-
25
šildant ištirpinami 0,25 mol rodanino kalio druskos. Mišinys
atvėsinamas iki
3 °C vonelėje su ledu ir lėtai sulašinami 0,35 mol jodmetano.
Mišinio
temperatūra pakyla iki 7 °C, maišoma dar apie 50–60 min, po to
įberiama 20
g aktyvuotos anglies miltelių (reakcijos skilimo produktų
absorbcijai),
100 ml chloroformo ir intensyviai maišoma 5 min. Nufiltruojama
naudojant
vakuuminį filtrą. Gautas filtratas yra raudonai rusvos spalvos.
Naudojant
vakuuminio distiliavimo aparatūrą, nudistiliuojamas acetonas,
chloroformas
ir jodmetano perteklius. Distiliacija atliekama 60 °C
temperatūroje. Po
distiliavimo gaunamas aliejaus konsistencijos tamsiai raudonos
spalvos
tirpalas, kuris vėliau išsikristalina. Ant kristalų užpilama 50
ml atšaldyto
etanolio ir gauta suspensija filtruojama per stiklinį filtrą,
praplaunama 30 ml
etanolio, 50 ml anglies tetrachlorido. Gauti kristalai
perkeliami į Petri
lėkštelę ir džiovinami kambario temperatūroje. Gautas
2-metilrodaninas
perkristalinamas iš anglies tetrachlorido santykiu 1:10 (2.3
pav.).
+ CH3I+ KI
rodanino kalio druska 2-metilrodaninas
N
SSK
ON
SS
O
2.3 pav. 2-metilrodanino sintezė
5-pakeisti-2-metilrodanino dariniai. 0,04 mol 2-metilrodanino,
0,05 mol
atitinkamo aldehido (4-fluorbenzaldehido, 2-fluorbenzaldehido,
4-hidroksi-
benzaldehido, 4-chlorbenzaldehido, 4-brombenzaldehido,
4-nitrobenzalde-
hido, 2,6-dichlorbenzaldehido, 5-nitrofurfurolo), 0,005 mol
amonio acetato
ištirpinami 30 ml ledinės acto rūgšties. Mišinys šildomas
glicerolio vonioje
5-20 min, susidariusios nuosėdos filtruojamos, plaunamos
vandeniu,
etanoliu, eteriu ir džiovinamos kambario temperatūroje. Gauti
produktai
perkristalinami iš acetono (2.4 pav.).
-
26
MZ-18TIP-201
MZ-28MZ-20
MZ-21
MZ-27
MZ-24MZ-25
F
N
S
O
S
OH
N
S
O
S
Cl
N
S
O
S
2-metilrodaninas
O
NO2
OH
O2N
O
H
O
H
Cl
Cl
Br
O
H
Cl
O
H
O
H
OH
F
O
H
O
H
F
N
SS
O
Br
N
S
O
S
ClCl
N
S
O
S
F
N
SS
O
O
N
S
O
O2N
S
NO2
N
S
O
S
2.4 pav. 5-pakeistų-2-metilrodaninų sintezė
N-(dimetil-1,3-oksazol-2-il)-4-{[5-[(2-fluorfenil)metiliden]-4-okso-4,5-di-
hidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas (MA-2),
4-{[5-[(2-fluor-
fenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}-N-(piridin-2-
il)benzen-1-sulfonamidas (MA-4),
4-{[5-[(2-fluorfenil)metiliden]-4-okso-4,5-
dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}-N-(6-metoksipiridazin-3-il)benzen-1-sulfona-
midas (MA-7),
N-(2,6-dimetilpirimidin-4-il)-4-{[5-[(2-fluorofenil)metiliden]-
4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas
(MA-8) (2.5
pav.).
0,003 mol MZ-28, 0,004–0,005 mol atitinkamo sulfanilamido
(sulfamok-
solio, sulfapiridino, sulfametoksipiridazino, sulfisomidino),
ištirpinami 10–
40 ml ledinės acto rūgšties. Mišinys šildomas glicerolio vonioje
3 val (MA-
8) arba 6 val (MA-2, MA-4) arba 24 val (MA-7), susidariusios
nuosėdos
filtruojamos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir
džiovinamos kambario
temperatūroje. Gauti produktai perkristalinami iš ledinės acto
rūgšties.
-
27
MZ-28
MA-2
MA-4
MA-7
MA-8
N
O
N
S
O
NH
SNH
O
O
F
NN
S
O
NH
SNH
O
O
F
N
N
N
S
O
NH
SNH
O
O
F
NN
N
S
O
NH
SNH
O
O
F
O
S
N
S
O
F
N
O
NH2
S
O
O
NH
N
NH2
S
O
O
NH
N N O
NH2
S
O
O
NH
N
N
NH2
S
O
NH
2.5 pav. Junginių MA-2, MA-4, MA-7, MA-8 sintezė
4-{[5-[(2,6-dichlorfenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]ami-
no}-N-(piridin-2-il)benzen-1-sulfonamidas (2.6 pav.).
0,003 mol MZ-20, 0,005 mol sulfapiridino, ištirpinami 10 ml
ledinės
acto rūgšties. Mišinys šildomas glicerolio vonioje 4 val,
susidariusios nuo-
sėdos filtruojamos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir
džiovinamos
kambario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš
ledinės acto
rūgšties.
MZ-20
N
NH2
S
O
ONH
MA-17
NN
S
O
NH
SNH
O
O
Cl
Cl
S
N
S
O
Cl
Cl
2.6 pav. Junginio MA-17 sintezė
N-(dimeti-1,2-oksazol-5-il)-4-{[5-[(4-hidroxifenil)metiliden]-4-okso-4,5-
dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas (2.7
pav.).
0,003 mol MZ-25, 0,004 mol sulfafurazolo, ištirpinami 30 ml
ledinės
acto rūgšties. Mišinys šildomas glicerolio vonioje 3 val,
susidariusios nuosė-
dos filtruojamos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir
džiovinamos
-
28
kambario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš
ledinės acto
rūgšties.
MZ-25
NO
NH2
S
O
ONH
MA-30
OH
NO
N
S
O
NH
SNH
O
O
OH
S
N
S
O
2.7 pav. Junginio MA-30 sintezė
4-({5-[(4-chlorfenil)metil]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il}amino)-N-
(dimetil-1,3-oksazol-2-il)benzen-1-sulfonamidas (MA-32),
4-{[5-[(4-chlor-
fenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}-N-(dimetil-1,3-
oksazol-2-il)benzen-1-sulfonamidas (MA-37) (2.8 pav.)
0,003 mol MZ-24, 0,004 mol sulfamoksolio (MA-32) arba
sulfame-
toksipiridazino (MA-37), ištirpinami 10 ml ledinės acto
rūgšties. Mišinys
šildomas glicerolio vonioje 3 val, susidariusios nuosėdos
filtruojamos, plau-
namos vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinamos kambario
temperatūroje.
Gautas produktas perkristalinamas iš ledinės acto rūgšties.
MZ-24
MA-32MA-37
N N
NH2 S
O
ONH
O
N
O
NH2
S
O
ONH
N
S
O
SCl
Cl
N N
O
N
S
O
NH
SNH
O
O
Cl
N
O
N
S
O
NH
SNH
O
O
2.8 pav. Junginių MA-32 ir MA-37 sintezė
N-(6-metoksipiridazin-3-il)-4-{[5-[(4-nitrofenil)metiliden]-4-okso-4,5-
dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas (2.9
pav.)
-
29
0,003 mol MZ-18, 0,005 mol sulfametoksipiridazino, ištirpinami
30 ml
dioksano. Mišinys šildomas glicerolio vonioje 3 val,
susidariusios nuosėdos
filtruojamos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir
džiovinamos kambario
temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš
dioksano.
N N
NH2
S
O
ONH
O
MA-45
NO2
N
SS
O N N
ONH
SNH
O
O
NO2
N
S
O
MZ-18
2.9 pav. Junginio MA-45 sintezė
4-{[5-[(4-bromfenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}
-
N-(dimetil-1,3-oksazol-2-il)benzen-1-sulfonamidas (MA-50),
4-{[5-[(4-brom-
fenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-thiazol-2-il]amino}-N-(2,6-dimetil-
pirimidin-4-il)benzen-1-sulfonamidas (MA-52),
4-{[5-[(4-bromofenil)me-
tiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}-N-(pyridin-2-il)benzen-1-
sulfonamidas (MA-56) (2.10 pav.).
0,003 mol MZ-21, 0,0045 mol atitinkamo sulfanilamido
(sulfamoksolio,
sulfisomidino, sulfapiridino), ištirpinami 10–15 ml ledinės acto
rūgšties.
Mišinys šildomas glicerolio vonioje 4 val, susidariusios
nuosėdos filtruoja-
mos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinamos
kambario tempe-
ratūroje. Gauti produktai perkristalinami iš ledinės acto
rūgšties.
-
30
MZ-21
MA-50
MA-52
MA-56
BrS
N
S
O
Br
N
N
NH
SNH
O
ON
S
O
N
O
NH2
S
O
O
NH
N
NH2
S
O
O NH
N
N
NH2
SO O
NH
Br
N
NH
SNH
O
ON
S
O
Br
N
ONH
S
NHO
ON
S
O
2.10 pav. Junginių MA-50, MA-52, MA-56 sintezė
N-(dimetil-1,3-oksazol-2-il)-4-{[5-[(4-fluorfenil)metiliden]-4-okso-4,5-
dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas (MA-58),
N-(2,6-dimetil-
pirimidin-4-il)-4-{[5-[(4-fluorofenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-
il]amino}benzen-1-sulfonamidas (MA-60), 4-{[5-[(4-fluorfenil)
metiliden]-4-
okso-4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}-N-(6-metoksipridazin-3-il)benzen-1-
sulfonamidas (MA-63),
4-{[5-[(4-fluorfenil)metiliden]-4-okso-4,5-dihidro-1,3-
tiazol-2-il]amino}-N-(pyridin-2-il)benzen-1-sulfonamidas (MA-64)
(2.11 pav.).
0,003 mol MZ-27, 0,003–0,0045 mol atitinkamo sulfanilamido
(sulfa-
moksolio, sulfisomidino, sulfametoksipiridazino, sulfapiridino),
ištirpinami
10–40 ml ledinės acto rūgšties. Mišinys šildomas glicerolio
vonioje 4 val,
susidariusios nuosėdos filtruojamos, plaunamos vandeniu,
etanoliu, eteriu ir
džiovinamos kambario temperatūroje. Gauti produktai
perkristalinami iš
ledinės acto rūgšties.
-
31
MZ-27
MA-58
MA-60
MA-63
MA-64
N
NH2
S
O
ONH
N N
NH2
S
O
O
NHO
N
N
NH2
S
O
O
NH
O
N
NH2
S
O
O
NH
F
N
N
NH
SNH
O
ON
S
O
F
N
NH
SNH
O
ON
S
O
F
N N
NH
SNH
O
ON
S
O
O
F
N
ONH
SNH
O
ON
S
O
F
N
S
O
S
2.11 pav. Junginių MA-58, MA-60, MA-63, MA-64 sintezė
N-(dimetil-1,3-oksazol-2-il)-4-{[5-[(5-Nitro-2-furil)metiliden]-4-okso-
4,5-dihidro-1,3-tiazol-2-il]amino}benzen-1-sulfonamidas (2.12
pav.)
0,003 mol TIP-201, 0,004 mol sulfamoksolio, ištirpinami 25 ml
ledinės
acto rūgšties. Mišinys šildomas glicerolio vonioje 4 val,
susidariusios nuo-
sėdos filtruojamos, plaunamos vandeniu, etanoliu, eteriu ir
džiovinamos
kambario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš
ledinės acto
rūgšties.
TIP-201
N
ONH
2S
O
ONH
MA-66
S
N
S
O
O
NO2
O
NO2
O
N
NH
SNH
O
ON
S
O
2.12 pav. Junginio MA-66 sintezė
-
32
3) Nauji 5-pakeisti 4-tiazolidinono dariniai su benzilamino
farmakoforu susintetinti vieno etapo metodu, paremtu
aldehido,
tiokarbamido ir α-halogenkarboksirūgšties druskos sąveika [2,
16,
24, 139, 165, 169, 172]
2-(benzilimino)-5-{[4-(dimetilamino)fenil]metiliden}-3-(2-propen-1-il)-1,3-
tiazolidin-4-onas (LCD-1-4),
2-(benzilimino)-5-[(2-hidroksifenil) metiliden]-3-
(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas (LCD-1-6),
2-(benzilimino)-5-[(2-hidrok-
si-5-nitrofenil)metiliden]-3-(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas
(LCD-1-13)
(2.13 pav.).
5 ml ledinės acto rūgšties ištirpinamas 0,01 mol
1-alil-3-benziltiokar-
bamido, 0,02 mol monochloracto rūgšties, 0,03 mol bevandenio
kalio
acetato ir 0,01 mol 4-(dimetilamino)benzaldehido (LCD-1-4) arba
0,01 mol
2-hidroksibenzaldehido (LCD-1-6) arba 0,01 mol
2-hidroksi-5-nitrobenzal-
dehido (LCD-1-13). Mišinys kaitinamas glicerolio vonioje su
grįžtamuoju
šaldytuvu, 78–80 °C temperatūroje, 1,5–2 val. Karštas tirpalas
filtruojamas
ir filtratas vėsinamas iki kambario temperatūros, susidarę
geltoni kristalai
filtruojami, plaunami vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinami
kambario
temperatūroje. Gauti produktai perkristalinami iš ledinės acto
rūgšties.
Cl
O
OH
LCD-1-4 R=
CH3COOK LCD-1-6 R=
LCD-1-13 R=
NH
S
NH
R-CO
H
N
OH
OH
NO2
RN
N
S
O
2.13 pav. 5-pakeistų 4-tiazolidinono darinių, turinčių
farmakoforu sintezė
-
33
4) Nauji 4-tiazolidinono dariniai su nitrofurano ir alilamino
far-
makoforais sintetinti ciklokondensacijos metodu, paremtu
α-halo-
genkarboksirūgščių sąveika su tiosemikarbazidais [2, 140,
165].
4-aliltiosemikarbazido sintezė. Į 2 mol hidrazino hidrato
tirpalo 200 ml
etanolio, kuris šaldomas ir maišomas su mechanine maišykle iš
lėto
sulašinami 2 mol alilizotiocianato sumaišyto su 100 ml etanolio.
Reakcijos
temperatūra 0–5 °C. Po kurio laiko susidaro baltos spalvos
suspensija ir
pradeda kristi gausios baltos spalvos nuosėdos, kurios
filtruojamos,
plaunamos etanoliu, eteriu ir džiovinamos kambario
temperatūroje. Gautas
produktas perkristalinamas iš etanolio (2.14 pav.).
NS + NH2 NH2 NH NH
NH2
S
2.14 pav. 4-aliltiosemikarbazido sintezė
1-[(2-furilmetiliden)amino]-3-(2-propen-1-il)tiokarbamidas
(LF-1), 1-[[(5-
nitro-2-furil)metiliden]amino]-3-(2-propen-1-il)tiokarbamidas
(LF-2), 1-[[3-
(5-nitro-2-furil)-2-propen-1-iliden]amino]-3-(2-propen-1-il)tiokarbamidas
(LF-3) (2.15 pav.).
0,01 mol 4-aliltiosemikarbazido šildant ir maišant su magnetine
maišykle
ištirpinamas 50 ml etanolio. Į šį tirpalą lėtai sulašinama 0,11
mol šviežiai
distiliuoto furfurolo (LF-1) arba 0,125 mol 5-nitro-furfurolo,
ištirpinto 100 ml
verdančio etanolio (LF-2) arba 0,125 mol 5-nitrofurilakroleino
(LF-3). Spalva
palaipsnui pereina į rausvą, o vėliau į raudoną. Virinama apie
30 min. ir
paliekama ataušti. Vėstant išsikristalina geltonos (LF-1 ir
LF-2) arba tamsiai
raudonos (LF-3) spalvos kristalai. Filtruojama, plaunama eteriu
ir džiovinama.
NH NH
NH2
S
LF-1
LF-2
LF-3
O O
H
O O
H
O2N
OO
2N O
ON
NH NH
S
O2N
ON
NH NH
S
NNH NH
OO
2N
2.15 pav. Semikarbazonų sintezė
-
34
2-[2-(2-furilmetyliden)hidrazin-1-iliden]-3-(2-propen-1-il)-1,3-tiazolidin-
4-nas (2.16 pav.).
0,01 mol LF-1, 0,02 mol bromacto rūgšties metilo esterio ir 0,03
mol
bevandenio kalio acetato ištirpinti 5 ml metanolio. Mišinys
virinamas su
grįžtamuoju šaldytuvu glicerolio vonioje 1,5–2 val. Karštas
tirpalas filt-
ruojamas ir filtratas vėsinamas iki kambario temperatūros,
susidarę geltoni
kristalai filtruojami, plaunami vandeniu, etanoliu, eteriu ir
džiovinami kam-
bario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš
heksano, gaunant
gelsvus kristalus.
5-(2-furilmetiliden)-2-[2-(2-furilmetiliden)hidrazin-1-iliden]-3-(2-propen-
1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas (2.16 pav.)
0,01 mol LF-1, 0,02 mol monochloracto rūgšties, 0,03 mol
bevandenio
kalio acetato ištirpinami 10 ml metanolio. Mišinys virinamas su
grįžtamuoju
šaldytuvu glicerolio vonioje 1,5-2 val, kol tirpalo spalva tampa
rausva.
Tuomet įpilama 0,01 mol šviežiai distiliuoto furfurolo ir
virinama dar 1-1,5
val., kol tirpalo spalva pakinta į geltoną, o vėliau į rausvą.
Karštas tirpalas
filtruojamas ir filtratas vėsinamas iki kambario temperatūros,
susidarę
geltoni kristalai filtruojami, plaunami vandeniu, etanoliu,
eteriu ir džiovi-
nami kambario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas
iš heksa-
no, gaunant geltonus kristalus.
2-[2(2-furilmetiliden)hidrazin-1-iliden]-5-[(5-nitro-2-furil)metiliden]-3-(2-
propen-1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas (LCF-1-3),
2-[2-(2-furilmetiliden)hidra-
zin-1-iliden]-5-[3-(5-nitro2-furil)-2-propen-1-iliden]-3-(2-propen-1-il)-1,3-
tiazolidin-4-onas (LCF-1-4) (Pav.2.16)
0,01 mol LF-1, 0,02 mol bromacto rūgšties metilo esterio, 0,03
mol
bevandenio kalio acetato ištirpinami 5 ml metanolio. Mišinys
virinamas su
grįžtamuoju šaldytuvu glicerolio vonioje 1,5–2 val, kol tirpalo
spalva tampa
rausva. Tuomet įpilama 0,02 mol 5-nitrofurfurolo (LCF-1-3) arba
5-
nitrofurilakroleino (LCF-1-4). Tirpalas akimirksniu pradeda
ruduoti ir
tampa juodos spalvos. Mišinys dar kaitinamas 15 min 55–65 °C
tempe-
ratūroje. Karštas tirpalas filtruojamas ir filtratas vėsinamas
iki kambario
temperatūros, susidarę rudi kristalai filtruojami, plaunami
vandeniu,
etanoliu, eteriu ir džiovinami kambario temperatūroje. Gautas
produktas
perkristalinamas iš 2-propanolio, gaunant rudus kristalus.
-
35
LF-1
O O
H
O2N
OO
2N O
BrCH2COOCH3CH3COOK
CH3OH
ClCH2COOH
CH3COOK
CH3OH
LCF-1-1
O O
H
LCF-1-3 LCF-1-4
ON
NH NH
S
O
N
S
O
NN
O
N
S
O
NN
LCF-1-1
O O
N
S
O
NN
LCF-1-2
O O
N
S
O
NN
O2N OO
2N
O
N
S
O
NN
2.16 pav. Junginių LCF-1-1 – LCF-1-4 sintezė
2-[2-[(5-nitro-2-furil)metiliden]hidrazin-1-iliden]-3-(2-propen-1-il)-1,3-
tiazolidin-4-onas (2.17 pav.).
0,01 mol LF-2 sumaišoma su 0,03 mol bevandenio kalio acetato
ir
šildant ištirpinama 30 ml n-propanolio, vėliau sulašinama 0,02
mol bro-
macto rūgšties metilo esterio ir mišinys virinamas su
grįžtamuoju šaldytuvu
glicerolio vonioje 1,5–2 val Karštas tirpalas filtruojamas ir
filtratas vėsina-
mas iki kambario temperatūros, susidarę rudi kristalai
filtruojami, plaunami
vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinami kambario temperatūroje.
Gautas
produktas perkristalinamas iš n-propanolio arba ledinės acto
rūgšties,
gaunant tamsiai raudonus kristalus.
5-(2-furilmetiliden)-2-[2-[(5-nitro-2-furil)metiliden]
hidrazin-1-iliden]-3-(2-
propen-1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas (2.17 pav.)
0,01 mol LF-2, 0,02 mol bromacto rūgšties metilo esterio, 0,03
mol
bevandenio kalio acetato ištirpinami 30 ml ledinės acto
rūgšties. Mišinys
virinamas su grįžtamuoju šaldytuvu glicerolio vonioje 1,5-2 val,
kol tirpalo
spalva tampa rausva. Tuomet įpilama 0,02 mol furfurolo ir
virinama dar 1-
1,5 val, kol tirpalo spalva pakinta į tamsiai rudą. Karštas
tirpalas filtruo-
-
36
jamas ir filtratas vėsinamas iki kambario temperatūros, susidarę
geltoni
kristalai filtruojami, plaunami vandeniu, etanoliu, eteriu ir
džiovinami kam-
bario temperatūroje. Gautas produktas perkristalinamas iš
n-propanolio,
gaunant geltonus kristalus.
LF-2BrCH2COOCH3CH3COOK
C3H7OH
LCF-2-1
O O
H
LCF-2-2
LCF-2-1
BrCH2COOCH3CH3COOK
CH3COOH
ON
NH NH
S
O2N
O
N
S
O
NN
NO2
O
N
S
O
NN
NO2
OO
N
S
O
NN
NO2
2.17 pav. Junginių LCF-2-1 – LCF-2-2 sintezė
2-[2-[3-(5-nitro-2-furil)-2-propen-1-iliden]hidrazin-1-iliden]-3-(2-propen-
1-il)-1,3-tiazolidin-4-onas (2.18 pav.).
0,01 mol LF-3, 0,02 mol monochloracto rūgšties ir 0,03 mol
bevandenio
kalio acetato ištirpinti 30 ml n-butanolio. Mišinys virinamas su
grįžtamuoju
šaldytuvu glicerolio vonioje 1,5–2 val Karštas tirpalas
filtruojamas ir filtra-
tas vėsinamas iki kambario temperatūros, susidarę rudi kristalai
filtruojami,
plaunami vandeniu, etanoliu, eteriu ir džiovinami kambario
temperatūroje.
Gautas produktas perkristalinamas iš n-propanolio, gaunant rudai
rausvus
kristalus.
-
37
ClCH2COOH
CH3COOK
C4H9OH
LCF-3-1LF-3
NNH NH
SOO
2N
ONO
2
N
S
O
NN
2.18 pav. Junginio LCF-3-1 sintezė
5) Nauji 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono (3-aminorodanino)
dariniai sintetinti aldolinės kondensacijos metodu, paremtu
oksojunginių sąveika su pirmine amino grupe [61, 76, 140,
148,
259].
3-[[(4-fluorfenil)metiliden]amino]-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas
(L-1),
3-[[(2-fluorfenil)metiliden]amino]-2-sulfaniliden-1,3-tiazolidin-4-onas
(L-2) (2.19 pav.).
0,01 mol 3-aminorodanino ištirpinamas 75 ml metanolio. Į tirpalą
šildant
glicerolio vonioje su grįžtamuoju šaldytuvu, 78–80 °C
temperatūroje pa-
laipsniui sulašinama 0,011 mol 4-fluorbenzaldehido (L-1) arba
2-fluorben-
zaldehido (L-2). Tirpalo spalvai patamsėjus, mišinys šildomas
dar keletą
minučių ir paliekamas atvėsti iki kambario temperatūros.
Susidarę geltoni
kristalai filtruojami, plaunami etanoliu, eteriu ir džiovinami
kambario
temperatūroje. Gauti produktai perkristalinami iš etanolio.
S
N
S
O NH2
F
O
H
O
H
F
S
N
S
O N F
S
N
S
O N
F
3-aminorodaninas
L-1
L-2
2.19 pav. 3-aminorodanino darinių, turinčių fluorbenzeno
fragmentą sintezė
-
38
Susintetintų junginių elementinės sudėties ir lydymosi
temperatūros
nustatymas.
1) Elementinės sudėties nustatymas. Įvertinant junginių
elementinę sudėtį, nustatytas azoto ir sieros kiekis junginyje
procentais. Šis kiekis
palygintas su teoriškai apskaičiuotu kiekiu. Dėl rezultatų
patikimumo
bandymai kartoti 3 kartus ir išvestas aritmetinis vidurkis.
Elementinė azoto analizė atlikta Kjeldalio metodu
panaudojant
analizatorių Gerhardt Vapodest 20 (Gerhardt Fabrik und Lager
chemischer
Apparate GmbH & Co. KG, Vokietija).
Grūstuvėje sutrinta 1 katalitinė tabletė (5,3 g), sumaišyta su
100 mg
tiksliai pasvertos analizuojamos medžiagos ir mineralizacijos
kolboje su-
maišyta su 7 ml koncentruotos sieros rūgšties. Pradžioje
atliekamas 15 mi-
nučių džiovinimas 250 °C temperatūroje, vėliau 1 val trukmės
minera-
lizacija 410 °C temperatūroje. Mineralizatą atšaldžius iki
kambario tempe-
ratūros, įpilama 70 ml 40 proc. natrio šarmo tirpalo ir
distiliuojama vandens
garais. Distiliatas surenkamas į atskirą indą su 50 ml 3 proc.
boro rūgšties
tirpalu, įlašinami 3 lašai indikatoriaus Kongo rauda ir
titruojama 0,1 N
sieros rūgštimi, kol tirpalo spalva pakinta į violetinę.
Apskaičiuojamas
procentinis azoto kiekis:
Elementinė sieros analizė atlikta Šionigerio metodu.
Pirmiausia pagaminamas bario chlorato tirpalas. Analitinėmis
svarstyk-
lėmis atsveriama 0,9868 g bario karbonato, išdžiovinto 105 °C ir
supilama į
1l matavimo kolbą. Į kolbą įlašinami 1,3 ml 57 proc. perchlorato
rūgšties
(ρ = 1,500 g/ml) ir įpilama 20 ml distiliuoto vandens. Kolbos
turinys maišo-
mas, kol ištirpsta bario karbonatas. Įlašinami dar 5 lašai
perchlorato rūgšties,
įpilama 80 ml distiliuoto vandens, ir tirpalas praskiedžiamas
etanoliu iki 1 l
žymės. Tirpalo pH~ 3.
Toliau atliekamas sieros kiekio nustatymas. Ant specialios
formos
bepelenio filtro analitinėmis svarstyklėmis pasveriamas tikslus
kiekis
analizuojamos medžiagos (apie 0,003–0,005 g). Filtras su tiriama
medžiaga
sulankstomas ir sudeginamas ant platininės vielos deguonies
pripildytoje
kolboje. Kolbos turinys (4 ml distiliuoto vandens ir 4 lašai
perhidrolio)
plakamas apie 20–30 min, kol išsisklaido kolboje susidaręs
rūkas. Kolbos
sienelės ir platinos vielos tinklelis praplaunami 16 ml acetono.
Tirpalas
titruojamas 0,005 M bario chlorato tirpalu, įlašinus 3 lašus 0,2
proc. vande-
ninio torino tirpalo ir 2 lašus 0,0125 proc. vandeninio metileno
mėlio tirpa-
-
39
lo. Titruojama, kol tirpalo spalva iš žalios pasikeičia į
rožinę. Apskaičiuo-
jamas procentinis sieros kiekis:
Kur n – sieros atomų skaičius junginio molekulėje, M – bario
chlorato
molinė koncentracija, V – titravimui sunaudotas bario chlorato
tirpalo kiekis
(ml), F – faktorius (nustatomas bario chloratu titruojant 1 ml
0,02 N sieros
rūgšties sumaišytą su 1 ml vandens ir 8 ml acetono, pridėjus 3
lašus 0,2
proc. vandeninio torino tirpalo ir 2 lašus 0,0125 proc.
vandeninio metileno
mėlio tirpalo), a – atsvertas tiriamojo junginio kiekis
(mg).
2) Lydymosi temperatūros nustatymas atliktas Koflerio lydymosi
tem-peratūros nustatymo aparatu su mikroskopu (Reichert-Jung
Optische
Werke Ag, Austrija) ir yra nekoreguotos. Nedidelis kiekis
medžiagos
uždedamas ant objektyvinio stiklelio, kuris prieš tai nuvalomas
ace-
tonu ir išdžiovinamas. Ant jo dedamas kitas nuvalytas ir
išdžiovintas
stiklelis. Stikleliai suspaudžiami ir medžiaga sutrinama, kad
neliktų
stambių kristalų. Mėginys patalpinamas ant objektyvinio
stalelio,
kuris yra šildomas kaitinimo elementu. Į objektyvinį stalelį
įstatomas
termometras, kuriuo fiksuojama temperatūra. Medžiagos
pokyčiai
stebimi pro okuliarą. Lydymosi pradžia fiksuojama tuomet, kai
pasi-
rodo pirmasis apskritas lašas, o pabaiga – kai išsilydo visi
kristaliu-
kai. Dėl rezultatų patikimumo bandymas kartojamas 3 kartus ir
išve-
damas aritmetinis vidurkis. Bandymo paklaida negali viršyti ±
0,5 °C.
Susintetintų junginių struktūros įrodymas spektriniais
analizės
metodais.
1HBMR spektrai užrašyti Vilniaus universiteto Organinės
chemijos
katedroje, 300 MHz dažnio spektrometru Varian Unity Inova
(Agilent
technologies, JAV). Pavyzdžiai ruošiami, tirpinant analizuojamą
medžiagą
(0,01–0,02 g) DMSO-d6. Tirpalas įpilamas į ploną (5×150 mm)
cilindro
formos ampulę, kuri dedama į stiprų magnetinį lauką. Spektras
registruo-
jamas apie 1 min. Nustatytos cheminių poslinkių reikšmės
pateikiamos
skalėje [167].
IR spektrai užrašyti UAB „Aconitum“, spektrometru Spektrum 100
FT-
IR („PerkinElmer“, JAV). Bandomoji medžiaga preso pagalba
suspau-
džiama ir užrašomas spektras. Nustatomi absorbcijos juostų
bangos skaičiai
būdingi tam tikroms atomų grupėms [167].
-
40
Susintetintų junginių grynumo įvertinimas. Junginių grynumas
įver-
tintas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos
akademijos
Analizinės ir toksikologinės chemijos ir Vaistų chemijos
katedrose.
Plonasluoksnės chromatografijos metodu [166, 287].
Chromatografija
atlikta kylančiuoju metodu, stiklinėje kameroje, kurios matmenys
10×20×20
cm, panaudojant silikageliu dengtas chromatografines plokšteles
„Merck-
254“ (Merck, JAV), kurių matmenys 20×20 cm2. Naudotos tirpiklių
sistemos:
A. chloroformas : ledinė acto rūgštis = 19 : 1
B. chloroformas : ledinė acto rūgštis = 9 : 1
C. butanolis : etanolis : vanduo : amoniakas = 20 : 10 : 10 :
3
D. benzenas : ledinė acto rūgštis = 15 : 1
E. benzenas : etanolis = 15 : 1
F. acetonas : dioksanas = 6 : 2
G. acetonas : dioksanas : benzenas = 20 : 10 : 20
Tirpiklių sistemos parinktos remiantis literatūros šaltiniais
[170, 285].
Ryškinimui naudota metalinio jodo garais prisotinta kamera, 5
proc. vario
sulfato vandeninis tirpalas, UV spindulių lempa. Tiriamoji
medžiaga tirpinta
acetone, etanolyje arba etanolio ir acetono mišinyje.
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [166, 170, 273].
Analizei
atlikti naudotas chromatografas Waters 2695 (Waters, JAV) su
fotodiodų
detektorium Waters 996 PDA. Analitės skirstomos C18 Hypersil
(„Thermo
Scientific“, JAV) analitine kolonėle (5 μm, 250×4,6 mm) su
prieškolonėle.
Injekuota 10 μl tiriamosios medžiagos tirpalo acetonitrile.
Detekcija atlikta
prie 200–400 nm bangos ilgio. Tėkmės greitis – 1 ml/min.
Eliuavimas –
izokratinis. Eliuentas: 55 dalys metanolio ir 45 dalys
išgryninto vandens.
Kolonėlė laikyta kambario temperatūroje. Junginių grynumas
įvertintas
apskaičiuojant procentinį tiriamosios medžiagos kiekį pagal
smailių plotą.
Susintetintų junginių, kaip biologiškai aktyvių medžiagų,
vertės nustatymas in silico.
Susintetintų junginių, kaip biologiškai aktyvių medžiagų, vertė
nustatyta,
panaudojant „OSIRIS Property Explorer“ programą [186].
Analizuojant
cheminę struktūrą, įvertinamos šios fiziko-cheminės savybės:
Hidrofiliškumas (cLogP). Dydis cLogP yra junginio neutralios
formos
pasiskirstymo koeficiento oktanolis/vanduo logaritmas. Šis dydis
naudojamas
junginio hidrofiliškumui įvertinti. Junginiai, kurių cLogP
reikšmė yra didelė
(cLogP > 5,0), pasižymi nedidele absorbcija ar praeinamumu.
Įrodyta, kad
lengvai besiabsorbuojančių junginių cLogP reikšmė yra ne didesnė
nei 5,0
[186].
-
41
Tirpumas (logS). Junginio tirpumas vandenyje svarbi absorbcijos
ir pasi-
skirstymo charakteristika. Paprastai mažas tirpumas pasireiškia
bloga absorb-
cija. Dydis LogS yra tirpalo koncentracijos, išreikštos mol/l
dešimtainis
logaritmas. Daugiau kaip 80 proc. šiuo metu naudojamų veikliųjų
medžiagų
logS > –4 [186].
Molekulinė masė. Pastebėta, kad junginių biologinis aktyvumas
didėja,
didėjant jų molekulinei masei, tačiau žinoma, kad didesnės
molekulinės
masės junginiai sunkiai absorbuojami organizme. Todėl, kiekvieno
moksli-
ninko, kuriančio veikliąsias medžiagas, tikslas – sintetinti kuo
mažesnės
molekulinės masės junginius. Daugiau kaip 80 proc. šiuo metu
naudojamų
veikliųjų medžiagų molekulinė masė yra tarp 200 ir 450
[186].
Molekulės fragmentų įvertinimas, atsižvelgiant į įvairias šiuo
metu
naudojamų veikliųjų medžiagų struktūras apskaičiuojamas
lygtimi:
n
vd
i
kur vi – fragmentų, kurie yra tiriamojoje struktūroje, verčių
suma, n – frag-
mentų, kurie yra tiriamojoje struktūroje, skaičius [186].
Fragmentų sąrašas sukurtas išanalizavus 3300 šiuo metu
naudojamų
veikliųjų medžiagų bei 15000 cheminių reagentų struktūros
fragmentus
[186]. Nustatyta, kad veikliųjų medžiagų molekulių fragmentų
vertė yra
teigiamas skaičius (d > 0).
Junginio, kaip biologiškai aktyvios medžiagos, vertė
apskaičiuojama lyg-
timi, kuri sujungia fiziko-cheminių savybių įverčius (cLogP,
logS, molekulinę
masę, molekulių fragmentų įvertinimą) ir toksiškumo rizikos
įvertinimą:
ii tsds2
1
2
1,
kur ds – junginio, kaip biologiškai aktyvios medžiagos, vertė,
si – reikšmė,
apskaičiuojama iš cLogP, logS, molekulinės masės, molekulių
fragmentų
įvertinimo, ti – 4 rizikos tipų reikšmė: 1,0 (maža rizika), 0,8
(vidutinė
rizika), 0,6 (didelė rizika) [186].
bapes
1
1,
a ir b – LogP (1, –5), logS (1, 5), molekulinės masės (0,012,
–6) ir
molekulių fragmentų įvertinimąo (1, 0) intervalai.
Apskaičiuotas dydis ds yra tiriamo junginio, kaip biologiškai
aktyvios
medžiagos, vertė.
-
42
Susintetintų junginių priešmikrobinio aktyvumo įvertinimas.
Priešmikrobinio aktyvumo prognozė in silico. Biologinio junginių
akty-
vumo prognozė atlikta, panaudojant PASS (Prediction of Activity
for
Substances) programą [191, 198]. Ši programa pagrįsta jau
žinomos biolo-
giškai aktyvios medžiagos struktūros ir naujo junginio
struktūros palygi-
nimu, tikintis, kad panašios struktūros junginiai pasižymi
panašiu aktyvumu.
Kompiuterinė struktūros ir aktyvumo ryšio analizė ir molekulių
modelia-
vimas plačiai taikomi ieškant naujų vaistų. PASS programa vienu
metu
nuspėja keleto šimtų tipų biologinį aktyvumą iš skirtingų
cheminių klasių.
PASS programa buvo naudojama nuspėti priešgrybelinį ir
priešbakterinį
junginių aktyvumą, kuris programoje nuspėjamas su atitinkamai 9
proc. ir 7
proc. paklaida. Bendras dabartinės versijos PASS aktyvumo rūšių
sąrašas
yra pateiktas internetiniame tinklalapyje [191].
PASS programa pateikia aktyvumų pavadinimų sąrašą ir
kiekvieno
aktyvumo tikimybės (Pa) reikšmę. Pa reikšmės gali būti
interpretuojamos
taip:
1. Pa > 0,7. Junginio aktyvumą patvirtinti eksperimentiškai
yra didelė
tikimybė, tačiau daugeliu atvejų junginio struktūra yra labai
panaši į
žinomų farmacinių preparatų struktūrą.
2. 0,5 < Pa < 0,7. Tikimybė, kad junginys pasižymi
sistemos nurodytu
biologiniu aktyvumu, yra mažesnė, tačiau tiriamo junginio
struktūra
nėra labai panaši į žinomų farmacinių preparatų struktūrą.
3. Pa < 0,5. Šiuo atveju tikimybė eksperimentiškai nustatyti
programos
spėjamą junginio farmakologinį aktyvumą yra dar mažesnė,
junginys
tik nežymiai panašus į junginius iš sistemoje sukauptos
duomenų
bazės.
Priešmikrobinio aktyvumo prognozė in vitro. Junginių
priešmikrobinis
aktyvumas įvertintas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto
Medicinos
akademijos Mikrobiologijos katedroje.
Junginių priešmikrobinio aktyvumo įvertinimui naudotos 7
skirtingos
bakterijų ir 1 grybelių kultūra:
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Escherichia coli ATCC 25922
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Bacillus subtilis ATCC 6633
Proteus mirabilis ATCC 12453
Candida albicans ATCC 60193
-
43
Bakterijų pasirinkimą lėmė jų struktūriniai ir funkciniai
ypatumai,
siekiant ištirti, kaip susintetinti junginiai veikia šiuos
mikrobus: S. aureus
(gramteigiama), E. coli (gramneigiama), B. subtilis (sudaranti
sporas),
K. pneumoniae (sudaranti kapsulę), P. mirabilis (šliaužianti),
P. aeruginosa
(atspari daugeliui priešmikrobinių vaistų), E. faecalis (vienas
dažniausių
hospitalinių infekcijų sukėlėjų), C. albicans – vienas
dažniausių grybelinių
infekcijų sukėlėjų. Minėtos bakterijų ir grybelio kultūros
dažnai naudojamos
kaip standartiniai mikrobai, tiriant junginių priešmikrobinį
aktyvumą.
Bakterijų ir grybelių kultūros auginamos ant nuožulnaus
triptozės sojos
agaro 5 ml talpos mėgintuvėliuose ir laikomos šaldytuve, 2–8°
temperatū-
roje. Kas savaitę kultūros persėjamos į šviežią triptozės sojos
agarą.
Tiriant priešmikrobinį aktyvumą serijinio skiedimo būdu
standžioje ter-
pėje (Mueller-Hinton II Agar, JAV) nustatytos minimalios
slopinančios jun-
ginių koncentracijos (MSK).
Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas.
Nesporinės bakterijos: kultūros auginamos 20–24 val. 37 °C
tempera-
tūroje ant Miulerio-Hintono agaro.
Sporinės bakterijos: kultūros auginamos 1 savaitę 37 °C
temperatūroje
ant Miulerio-Hintono agaro. Užaugusios bakterijų kultūros
nuplaunamos
nuo agaro steriliu fiziologiniu tirpalu ir gauta suspensija
kaitinama 70 °C
temperatūroje 0,5 val. Suspensiją praskiedus (sporų
koncentracija (107–10
8
ląstelių/ml) fiziologiniu tirpalu, ji gali būti laikoma
žemesnėje nei 4 °C tem-
peratūroje.
Grybelis: kultūros auginamos 20–24 val. 25 °C temperatūroje ant
Miule-
rio-Hintono agaro.
Bakterijų ir grybelio suspensijos gaminamos iš išaugintų mikrobų
kultūrų
fiziologiniame natrio chlorido tirpale, standartizuojama
McFarland standar-
tiniu indikatoriumi, kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios
suspensijos
drumstumą. Mikrobų suspensija laikoma standartizuota, kai
indikatoriaus
reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml mikrobų suspensijos yra
1,5×108
mikrobų ląstelių).
Tiriamųjų junginių paruošimas mikrobiologiniam tyrimui.
Pagrindiniai
susintetintų junginių tirpalai (20000 μg/ml) paruošti junginius
tirpinant
dimetilsulfokside, kadangi dauguma naujų junginių yra blogai
tirpūs kituose
tirpikliuose. DMSO ir pats turi priešmikrobinį veikimą, todėl
lygiagrečiai
buvo atliekamas kontrolinis bandymas ir nustatyta koncentracija,
kurioje jau
nepasireiškia jo priešmikrobinis veikimas. Skiedžiant pagrindinį
tiriamojo
junginio tirpalą, buvo pagaminti mažesnių koncentracijų tirpalai
(10000;
1000; 100; 10 µg/ml) (2.20 pav.).
-
44
M0 = 20 mg/ml
1000µg/ml
900µg/ml
700µg/ml
600µg/ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
800µg/ml
10 ml
200µg/ml
250µg/ml
400µg/ml
500µg/ml
10 ml
10 ml
10 ml
10 ml
300µg/ml
10 ml
M1 = 10 mg/ml
0,45 ml
0,4 ml
0,5 ml
0,35 ml
0,3 ml 0,25 ml
0,2 ml
0,15 ml
0,125 ml
0,1 ml
150µg/ml
10 ml
1 ml M0 + 1 ml DMSO
M2 = 1 mg/ml
0,2 ml M1 + 1,8 ml DMSO
0,1 ml0,15 ml
100µg/ml
10 ml
I
M3 = 0,1 mg/ml
0,2 ml M2 + 1,8 ml DMSO
10 ml
2,5µg/ml
0,25 ml
M4 = 0,01 mg/ml
0,2 ml M3 + 1,8 ml DMSO
50µg/ml
10 ml 0,5 ml 0,25 ml
25µg/ml
10 ml
5µg/ml
10 ml 0,5 ml 0,1 ml
1µg/ml
10 ml
0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
0,5µg/ml
10 ml
0,25µg/ml
10 ml
0,1µg/ml
10 ml
2.20 pav. Tiriamųjų junginių tirpalų paruošimas
Pastaba: M0 - pagrindinis susintetinto junginio tirpalas
(20mg/ml), M1-M4 – darbiniai
tirpalai, gaunami skiedžiant pagrindinį tirpalą (M0)
-
45
Mažiausios slopinančios koncentracijos nustatymas. Atitinkamas
kiekis
praskiesto pagrindinio tiriamojo junginio tirpalo aseptinėmis
sąlygomis
sterilia pipete perkeliamas į sterilų matavimo cilindrą, jame
sumaišomas su
išlydyta standžia Miulerio–Hintono terpe ir perkeliamas į Petri
lėkštelę.
Standartizuotos mikrobų kultūrų suspensijos atskiruose
sunumeruotose
segmentuose kilpele po 0,1 ml sėjamos ant sustingusios standžios
terpės su