NASKAH PUBLIKASI

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK Curcuma longa

TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa),

STUDI IN VITRO

NASKAH PUBLIKASI

Disusun Oleh :

CHANDRA KURNIAWAN

41090024

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS KRISTEN DUTA WACANA

YOGYAKARTA

2013

LEMBAR PENGESAHAN

NASKAH PUBLIKASI

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK Curcuma longa TERHADAP SEL

KANKER SERVIKS (HeLa),

STUDI IN VITRO

Oleh :

CHANDRA KURNIAWAN

41090024

Yogyakarta, 27 Juli 2013

Disetujui oleh :

Pembimbing I, Pembimbing II,

Prof. dr. JW. Siagian, Sp. PA drg. MM. Suryani Hutomo, MDSc

INTISARI

Sampai saat ini, kanker serviks masih merupakan masalah kesehatan yang

serius bagi perempuan di Indonesia. Diperkirakan angka kejadian kanker serviks

mencapai 180.000 kasus baru per tahunnya. Berbagai macam tanaman dilaporkan

memiliki kemampuan sebagai anti kanker. Salah satu tanaman yang sering digunakan

oleh masyarakat di Indonesia adalah kunyit (Curcuma longa). Penelitian ini

dilakukan untuk mengetahui efek sitotoksisitas ekstrak kunyit pada cell line kanker

serviks (HeLa) secara in vitro sitotoksisitas. Aktifitas sitotoksisitas ekstrak kunyit

terhadap sel HeLa diuji dengan metode MTT assay. Konsentrasi ekstak kunyit yang

digunakan adalah 200μg/ml, 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml, dan 12,5 μg/ml. Sebagai

kontrol positif digunakan doxorubicin; dan sebagai kontrol negatif sel HeLa

ditumbuhkan dalam media tanpa diberikan perlakuan. Dilakukan perhitungan nilai

IC50 menggunakan persamaan regresi linier. Hasilnya, ekstrak kunyit memiliki efek

sitotoksisitas terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 = 184,5 μg/ml. Sedangkan efek

sitotoksisitas doxorubicin jauh lebih kuat dengan nilai IC50 = 0,90 μg/ml.

Kata kunci : ekstrak Curcuma longa, sel HeLa, uji sitotoksisitas

Abstract

Cervical cancer is a serious problem in Indonesian woman. The incidence of

cervical cancer is about 180.000 new cases per year. Various kinds of herbals have

been reported potential as anticancer , including Curcuma longa. The purpose of this

research was to evaluate the cytotoxicity of Curcuma longa extract against cervical

cancer (HeLa) cell line in vitro. The cytotoxic activity was performed by using MTT

assay. Doxorubicin was used as a positive control, and as negative control HeLa cell

were grown without any treatment. The yellow tetrazolium MTT (3-[4,5-

dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) is reduced by metabolically

active cells, in part by the action of dehydrogenase enzymes. The resulting

intracellular purple formazan can be solubilized and quantified by

spectrophotometric using ELISA reader. The IC50 (concentration that inhibits cell

growth by 50%) was calculated. Our result showed that Curcuma longa extract

exhibit cytotoxicity against HeLa cell line with IC50 of 184,5 µg/ml. However,

doxorubicin exhibit cytotoxicity against HeLa cell line with IC50 of 0,90 µg/ml. It

means that Curcuma longa extract has lower cytotoxicity potential compared with

doxorubicin.

Keywords : Curcuma longa extract, HeLa cell line, cytotoxicity

PENDAHULUAN

Kanker serviks atau kanker leher rahim merupakan bentuk neoplasma atau

keganasan yang dimulai dari organ serviks, yaitu bagian inferior dari uterus (rahim)

yang terbuka ke bagian proksimal vagina. Sampai saat ini, kanker serviks masih

merupakan masalah kesehatan yang serius bagi perempuan di Asia Tenggara karena

prevalensi dan angka kematiannya yang tinggi, dengan insidensi 188 kasus per

100.000 penduduk, dan angka mortalitas mencapai 102 dari 188 kasus tersebut. Di

seluruh dunia, kanker serviks merupakan kanker ketiga terbanyak yang paling sering

dijumpai pada perempuan dengan perkiraan 530.000 kasus selama tahun 2008. Di

Indonesia diperkirakan sekitar 90-100 kanker baru per 100.000 penduduk per

tahunnya, atau sekitar 180.000 kasus baru pertahun, dengan kanker serviks

menempati urutan pertama di antara kanker pada wanita. Kanker serviks juga

merupakan kanker kelima yang menyebabkan kematian terbanyak pada perempuan

di dunia. Diperkirakan di seluruh dunia, setiap tahunnya terjadi 473.000 kasus kanker

serviks dan 253.000 kematian terjadi akibat kanker ini (Global Cancer WHO, 2008).

Berbagai macam tanaman dilaporkan memiliki kemampuan sebagai anti

kanker. Salah satu tanaman yang sering digunakan oleh masyarakat di Indonesia

adalah kunyit (Curcuma longa). Suatu bahan alam yang berpotensi dikembangkan

menjadi obat antikanker baru memerlukan skrining lebih lanjut mengenai potensi

sitotoksistasnya secara in vitro. Dalam studi in vitro, bahan alam tersebut dipaparkan

terhadap berbagai macam cell line, kemudian dilakukan penghitungan untuk mencari

nilai IC50 (inhibitory concentration), yaitu konsentrasi yang mampu menghambat

pertumbuhan/mematikan sel sebesar 50%. National Cancer Institute menetapkan

suatu kriteria bahwa bahan alam yang dianggap berpotensi memiliki efek antikanker

harus memilki nilai IC50 yang kurang dari 30 µg/ml. Kunyit memiliki kandungan

curcumin yang terbukti secara klinis memiliki efek antioksidant, anti-inflamasi,

antiproliferasi, dan sitotoksik sehingga mampu menginduksi apoptosis. Studi in vitro

oleh Ashok Khar, et al., 2001 menunjukkan sensitivitas setiap sel terhadap curcumin

berbeda-beda. Curcumin menginduksi apoptosis pada sel-sel keganasan leukemia,

payudara, colon, hepatocelular, dan ovarium, tetapi resistensi terjadi pada sel-sel

keganasan paru, ginjal, prostat, serviks, sistem saraf pusat, serta melanoma.

HeLa cell line merupakan sel epitelial kanker leher rahim yang telah dikultur

dan dikembangkan untuk berbagai kepentingan penelitian. Sel HeLa merupakan cell

line pertama yang berhasil dikultur dari manusia. Sel HeLa berproliferasi secara

cepat dengan waktu duplikasi 24 jam (Rahbari et al., 2009). Dalam penelitian ini, sel

HeLa akan dijadikan sebagai model representatif untuk mewakili sel kanker.

METODOLOGI PENELITIAN

Ekstraksi Curcuma longa

Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Metode ini dilakukan dengan

cara serbuk kunyit (simplisia) yang didapatkan dari rimpang kunyit, dimasukkan ke

dalam wadah, setelah itu ditambahkan pelarut etanol (alkohol 96%) dengan

perbandingan 10 : 1. Kemudian direndam selama 24 jam dengan melakukan

pengadukan secara berkala. Setelah itu dilakukan penampungan filtrat. Ampas yang

didapatkan dari penyaringan kemudian direndam kembali dengan menggunakan

etanol 96%. Prosedur ini dilakukan sebanyak 3 kali. Setelah filtrat didapatkan maka

dilakukanlah evaporasi dengan menggunakan evaporator hingga dihasilkan ekstrak

semi padat etanol rimpang kunyit. Kemudian keringkan dalam oven bersuhu 40 ºC

hingga didapatkan ekstrak kental etanol rimpang kunyit.

Penumbuhan Sel HeLa

Sel HeLa ditumbuhkan menggunakan RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St Louis,

MO, USA) yang disuplementasi dengan 10% FBS, 100 IU/ml penisilin, 10μg/ml

streptomisin dalam suhu 37ºC dengan kadar CO2 5%. Flask yang berisi sel

diinkubasi semalam untuk mendapatkan sejumlah sel yang dibutuhkan (konfluen).

Sel HeLa dipanen dengan cara menambahkan 1-2 ml trypsin 0,25% ke dalam flask

dan ditunggu beberapa saat. Sel HeLa kemudian dipindahkan ke conical tube dan

ditambahkan medium RPMI hingga volume 10 ml kemudian disentrifuge selama 5

menit dengan kecepatan 2000rpm. Supernatan dibuang, kemudian pelet diresuspensi

dalam 1 ml medium, dan dihitung jumlahnya menggunakan bilik hitung. Suspensi sel

ditambahkan sejumlah medium hingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2 x 104

sel/100µl dan siap digunakan untuk penelitian.

MTT assay

Suspensi sel kanker serviks (HeLa) sebanyak 100 μL dengan kepadatan 2 x

104 sel/100 μL media didistribusikan ke dalam sumuran- sumuran pada 96-well plate

dan diinkubasi 3 jam. Kemudian ke dalam sumuran dimasukkan 100 μL larutan

ekstrak kunyit dengan seri konsentrasi sebagai berikut : 12,5 µg/ml, 25 µg/ml, 50

µg/ml, 100 µg/ml, dan 200 µg/ml. Sebagai kontrol positif ditambahkan 100 μL

doxorubicin ke dalam sumuran yang telah berisi 100 μL suspensi sel dengan seri

konsentrasi sebagai berikut : 2 µg/ml; 1 µg/ml; 0,5 µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,125 µg/ml.

Sebagai kontrol sel ditambahkan 100 μL medium kultur ke dalam sumuran yang

berisi 100 μL suspensi sel. Kemudian sel diinkubasi overnight (14 -24 jam) dalam

inkubator dengan aliran 5% CO2. Pada akhir inkubasi, media kultur dibuang lalu

ditambahkan 10 μL larutan MTT (5 mg/mL PBS), dan medium diganti dengan 190

μL medium RPMI 1640 komplit. Kemudian sel diinkubasi selama 3-4 jam. Reaksi

MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper SDS (100 μL). Microplate

kemudian dibungkus dengan tissue dan diinkubasi selama 1 malam pada suhu kamar

dan ruangan gelap. Sel yang hidup bereaksi dengan MTT membentuk kristal

formazan yang berwarna ungu. Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada

panjang gelombang 595 nm.

HASIL dan PEMBAHASAN

Dalam penelitian ini digunakan metode MTT assay. Dasar dari metode ini

adalah reduksi garam tetrazolium MTT [3-(4,5-dimethylthiazopl-2-yl)-2,5-diphenyl

tetrazolium bromid]) oleh enzim dehidrogenase mitokondria dari sel yang hidup

membentuk kristal formazan yang berwarna ungu. Kristal formazan ini akan

terakumulasi di dalam sel yang hidup, dimana jumlah formazan yang terbentuk

proporsional dengan jumlah sel yang hidup dalam kultur. Formazan yang terbentuk

kemudian dilarutkan dengan penambahan reagen stopper, dan dibaca secara

spektrofotometri menggunakan ELISA reader (Itharat, 2007).

Sel HeLa yang hidup akan bereaksi terhadap larutan MTT (yang berwarna

kuning) membentuk kristal formazan yang berwana ungu. Terlihat dari gambaran

sumuran 96 pada gambar A bahwa sumuran yang berwana ungu menandakan lebih

banyak sel yang hidup dari pada yang mati, sedangkan sumuran yang berwarna

kuning menandakan banyak sel yang mengalami kematian.

Hasil Uji Sitotoksisitas Ekstrak kunyit (Curcuma longa) terhadap Sel Kanker Serviks

(HeLa) dengan metode MTT assay

Hasil pengukuran menggunakan Enzime-linked Immunosorbent Assay (ELISA

reader) menunjukkan bahwa persentase kematian sel HeLa terus meningkat

sebanding dengan kenaikan konsentrasi ekstrak kunyit yang diberikan. Kematian sel

terbesar terdapat pada pemberian konsentrasi ekstrak kunyit 200 µg/ml yaitu sebesar

51,873 % (Tabel 1).

Berdasarkan hasil di atas, dibuat grafik menggunakan regresi linear, dan

didapatkan persamaan y = 0,0012x + 0,2912; dimana y merupakan persentase

kematian sel HeLa, dan x merupakan konsentrasi ekstrak kunyit. Dari persamaan

tersebut dilakukan perhitungan untuk mengetahui nilai IC50 ekstrak kunyit.

Dilakukan perhitungan nilai IC50, maka harga y diganti menjadi 0,5 ; sehingga :

( )

= 184,5 µg/ml

Konsentrasi ekstrak (µg/ml) Persentase kematian sel HeLa

200 51,873%

100 42,233%

50 34,940%

25 32,093%

12,5 31,194%

A B

Gambar 1. Sumuran 96 setelah diberikan larutan MTT, digunakan bersamaan untuk

menumbuhkan sel HeLa dan T47D (A). Terbentuknya kristal formazan pada sel yang

hidup (B).

Tabel 1. Persentase kematian sel HeLa dengan pemberian ekstrak kunyit

Didapatkan nilai sebesar 184,5 µg/ml. Dengan kata lain, pertumbuhan sel HeLa akan

dihambat sebanyak 50% pada konsentrasi ekstrak kunyit sebesar 184,5 µg/ml.

Hasil Uji Sitotoksisitas doxorubicin terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) dengan

metode MTT assay

Hasil pengukuran menggunakan Enzime-linked Immunosorbent Assay ELISA

reader menunjukkan bahwa persentase kematian sel HeLa terus meningkat sebanding

dengan kenaikan konsentrasi doxorubicin yang diberikan. Kematian sel terbesar

terdapat pada pemberian konsentrasi ekstrak 2 µg/ml yaitu sebesar 73% (Tabel 2).

Berdasarkan hasil di atas, dibuat grafik menggunakan regresi linear, dan

didapatkan persamaan y = 0,2292x + 0,2935; dimana y merupakan persentase

kematian sel HeLa, dan x merupakan konsentrasi doxorubicin. Dari persamaan

tersebut dilakukan perhitungan untuk mengetahui nilai IC50 doxorubicin.

Untuk perhitungan nilai IC50, maka harga y diganti menjadi 0,5 ; sehingga :

y = 0,0011x + 0,297

R² = 0,9931

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

0 50 100 150 200 250

Per

sen

tase

Kem

ati

an

Konsentrasi Ekstrak Kunyit (µg/ml)

Grafik Persentase kematian sel HeLa yang

diinduksi ekstrak kunyit

Series1

Linear(Series1)

Konsentrasi doxorubicin (µg/ml) Persentase kematian sel HeLa

2 73%

1 54%

0,5 48%

0,25 34%

0,125 27%

Tabel 2. Persentase kematian sel HeLa dengan pemberian Doxorubicin

( )

Didapatkan nilai sebesar 0,90 µg/ml. Dengan kata lain, pertumbuhan sel

HeLa akan dihambat sebanyak 50% pada konsentrasi doxorubicin sebesar 0,90

µg/ml.

Sel HeLa dengan pemberian ekstrak kunyit pada konsentrasi IC50 setelah

diwarnai menggunakan double staining acridine orange – ethidium bromide dan

difoto menggunakan mikroskop fluoresens dengan perbesaran 100x menampakkan

sebagian besar sel HeLa mengalami apoptosis (berwana oranye) seperti pada gambar

3B. Sedangkan kontrol sel (gambar 3A) yang tidak diberikan perlakuan

menampakkan gambaran sel HeLa yang hidup (berwarna hijau).

y = 0,2292x + 0,2935 R² = 0,9358

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Per

sen

ase

kem

ati

an

Konsentrasi doxorubicin µg/ml

Grafik Persentase Kematian Sel HeLa yang

diinduksi doxorubicin

Series1

Linear (Series1)

A B C

Gambar 2. Merupakan hasil foto pengamatan menggunakan mikroskop inverted. Kontrol

sel tanpa diberi ekstrak kunyit (A). Sel HeLa dipapar dengan ekstrak kunyit dengan

konsentrasi 200 µg/ml (B), Sel yang diberikan 2 µg/ml doxorubicin (C). Gambar B dan C

menunjukkan penurunan jumlah sel yang signifikan.

PEMBAHASAN

Ekstrak kunyit (Curcuma longa) dengan konsentrasi 184,5 µg/ml mampu

mematikan 50% sel HeLa yang ditumbuhkan dalam medium (IC50), sedangkan

doxorubicin dengan konsentrasi 0,90 µg/ml mampu mematikan 50% sel HeLa yang

ditumbuhkan dalam medium (IC50). Sehingga jelas terlihat bahwa efek sitotoksisitas

doxorubicin jauh lebih potensial dibandingkan dengan ekstrak Curcuma longa.

Perbedaan respons/sensitifitas dari beberapa sel kanker terhadap paparan

ekstrak seringkali dijumpai dalam penelitian. Hasil penelitian yang dilakukan oleh

Anggraini tahun 2007 yang menguji ekstrak rimpang Curcuma longa terhadap sel

kanker payudara T47D, dimana didapatkan harga IC50 = 100 µg/ml. Penelitian lain

yang dilakukan oleh Mohammad et al., tahun 2010, menggunakan ekstrak yang sama

terhadap pada cell line kanker paru A549, mendapatkan nilai IC50 = 0,23 µg/ml.

Perbedaan nilai IC50 dari beberapa penelitian bisa terjadi karena beberapa faktor,

seperti kadar kurkumin yang terkandung di dalam ekstrak, jenis ekstrak, dan

perbedaan cell line yang dipakai, sehingga setiap sel bisa memberikan respons yang

berbeda-beda terhadap paparan ekstrak (Prayong, 2008). Dari beberapa hasil

penelitian diatas, bisa terlihat bahwa nilai IC50 ekstrak Curcuma longa yang

dipaparkan terhadap sel HeLa memerlukan konsentrasi yang jauh lebih tinggi bila

dibandingkan dengan cell line yang lain.

National Cancer Institute (NCI) menetapkan kriteria bagi ekstrak bahan alam

yang akan dikembangkan sebagai obat antikanker. Ekstrak bahan alam dengan nilai

IC50 < 30 µg/ml dianggap mempunyai efek sitotoksisitas yang potensial, dan

dilanjutkan untuk diuji lebih lanjut dengan cell line yang lain secara in vitro (Itharat,

Gambar 3. Kontrol sel hidup (A), dan sel HeLa yang mengalami apoptosis (panah hitam),

sel HeLa yang hidup (panah putih), serta sel HeLa yang nekrosis (panah biru) (B)

2007). Berdasarkan kriteria tersebut, efek sitotoksisitas ekstrak kunyit (Curcuma

longa) tidak cukup potensial jika dipaparkan terhadap sel HeLa. Walaupun

demmikian, efek sitotoksisitas ekstrak kunyit (Curcuma longa) terhadap cell line

yang lain masih perlu diteliti lebih lanjut.

Pada pengecatan dengan menggunakan Acridine Orange dan Ethidium

Bromide didapatkan bahwa sebagian besar sel mengalami apoptosis. Hal ini

ditunjukan dengan warna orange pada sebagian besar sel. Sebagian kecil sel

mengalami nekrosis dengan warna merah, sedangkan sebagian sel lagi hidup

berwarna hijau. Tetapi hal ini masih memerlukan penelitian lebih lanjut untuk

memastikan berapa banyak sel yang mengalami apoptosis.

KESIMPULAN

Ekstrak kunyit memerlukan konsentrasi yang cukup tinggi untuk

menghambat pertumbuhan sel HeLa sebesar 50% yaitu pada konsentrasi 184,5

µg/ml.

SARAN

1. Diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai tingkat apoptosis yang diinduksi

oleh ekstrak kunyit terhadap sel HeLa

2. Diperlukan penelitian lebih lanjut menggunakan cell line yang lain untuk

menentukan efek terbaik (IC50 terendah, mendekati IC50 doxorubycin = 0,90

µg/ml)

3. Studi ditingkatkan menjadi studi in vivo

DAFTAR PUSTAKA

Akram, M, et al. (2010) Curcuma longa and curcumin. Journal Biol. – Plant

Biol., volume 55, page 65-70. Bucharest.

Anggraini, Polis Novita. (2007) Aktivitas Campuran Ekstrak Etanol Herba

Sambiloto dan Rimpang Kunyit terhadap Sel Kanker Payudara Manusia T47D in

vitro dengan Metode MTT. Skripsi, Universitas Airlangga, Surabaya.

Hutomo, Suryani. (2012) Cellular and Molecular Study of Apoptosis Induced by

Streptoccocus sanguinis on HeLa Cell, in Vitro Study. Thesis, Master Program of

Dental Science, Universitas Gadjah Mada.

Itharat A., B. Ooraikul. (2007) Research on Thai medicinal plants for cancer

treatment. Advances in Medicinal Plant Research.

Jurenka J S. (2009) Anti-inflammatory properties of curcumin, a major

constituent of Curcuma longa: a review of preclinical and clinical research.

Alternative Medicine Review: A Journal of Clinical Therapeutic 14: 141-153

Lu HF, et al. (2009) Curcumin induces apoptosis through FAS and FADD, in

caspase-3-dependent and -independent pathways in the N18 mouse-rat hybrid retina

ganglion cells. Oncol Rep, 22:97-104.

Mohandas KM, Desai DC. (1999) Epidemiology of digestive tract cancers in

India : Large and small bowel. Indian J Gastroenterol, 18:118-121.

Moos PJ, Edes K, Mullally JE, Fitzpatrick FA. (2004) Curcumin impairs tumor

suppressor p53 function in colon cancer cells. Carcinogenesis., 25(9), 1611-1617.

Mukhopadhyay A, Banerjee S, Stafford LJ, Xia C, Liu M, Aggarwal BB. (2007)

Curcumin-induced suppression of cell proliferation correlates with down-regulation

of cyclin D1 expression and CDK4-mediated retinoblastoma protein

phosphorylation. Cell Cycle, 6:2953-2961.

Nayak, P.L. 2012. Curcumin : a wonder anticancer drug. International Journal

Phram Biomed page 60-69.

Prayong P, Barusrux S, Weerapreeyakul N. (2008) Cytotoxic activity screening

of some indigenous Thai plants. Fitoterapia, 79:598-601

Wang Y, Okan I, Szekely L, Klein G, Wiman KG. (1995) Bcl-2 inhibits wild-

type p53- triggered apoptosis but not G1 cell cycle arrest and transactivation of

WAF1 and Bax. Cell Growth Differ, 6:1071-1075.

Wilken Reason, et al. (2011) Curcumin: A review of anti-cancer properties and

therapeutic activity in head and neck squamous cell carcinoma. Molecular cancer.

(diakses dari : http://www.molecular-cancer.com/content/10/1/12)

Sa G, Das T. (2008) Anti cancer effects of curcumin: cycle of life and death. Cell

Div, 3:14.