MUTASYONLAR MUTASYON · mutasyonlardır. DNA replikasyonu sırasındaki hatalardan veya DNA molekülü içinde bulunan nükleotitin kendiliğinden değişimi sonucu oluşabilirler.

MUTASYONLAR

• Genlerin nükleotit dizisinde herhangi bir nedenle

meydana gelen ve kalıtsal olan değişime

mutasyon denir. Böyle bir değişikliğin ürünü

mutant olarak adlandırılır.Mutant ebeveyn suştan

genotipik olarak ve aynı zamanda fenotipik olarak

da farklı olabilir.

• Mutasyonlar evrimsel değişimin kaynaklarıdır.

Organizmalarda yeni alleller ortaya çıkar

bunların bazıları spontan bazıları da radyasyon

yada kimyasallar sonucu gerçekleşir.

MUTASYON

molekulce.com/Tuba ERTÜRK_

• Genotip: Bir organizmanın sahip olduğu bütün genetik materyal. Bir hücrenin kromozomlarının ve eğer varsa plazmitlerinin bütün dizileri genotip olarak adlandırılır.

• Fenotip: Bir organizmanın gözlenebilir karakteristikleridir.

• DNA yapısına mutasyonlar çoğunlukla çeşitli ajanlarla sokulur ki bunlara mutajen denir. Mutasyonlar spontane de olabilirler ancak daha az sıklıkta görülür. Ancak evrimsel açıdan bu mutasyonlar çok önemlidir.


Yeni oluşan mutasyonlar iki gruba ayrılır

• Spontan mutasyonlar

• İndüklenen mutasyonlar

– Spontan mutasyonlar kendiliğinden oluşurken

indüklenen mutasyonlar mutajen ya da çevresel

ajanlarla amaçlı olarak mutasyonun teşvik

edilmesidir. Spontan mutasyonlar evrimsel

çeşitlilik sağlarlar.


• Spontan mutasyon frekansı oldukça düşüktür bir hücrede yaklaşık 10-5-10-10 lokus/generasyon dur. Bunun yanında aynı iki gende birden meydana gelecek mutasyon oranı çok daha düşüktür. Dolayısıyla daha fazla mutasyon isteniyorsa mutlaka indüklemek gerekir.

• Spontan mutasyonlar gene göre farklılık göstermektedirler.

• Kendiliğinden mutasyon meydana gelme oranı mikroorganizmaların ürediği şartlara göre de değişiklik gösterir.

• Mutasyon oranı aerobik ortamda daha fazla iken anaerobik ortamda daha azdır.

• Aerobik solunum sonucu peroksidazlar, purin analogları, nitröz asit ve formaldehit gibi toksik ara ürünler oluşur. Bu maddelere endojen mutajen adı verilir ve spontan mutasyonlara sebep olur.


• Spontan mutasyonlar, bilinen bir nedeni olmaksızın

spontan olarak (kendiliğinden) meydana gelen

mutasyonlardır. DNA replikasyonu sırasındaki hatalardan

veya DNA molekülü içinde bulunan nükleotitin

kendiliğinden değişimi sonucu oluşabilirler.

• Oluşumları ile ilgili olarak hiçbir özgün etken yoktur ve

genellikle genlerin nükleotit dizilerinde rastgele olan

değişikler olarak kabul edilirler. Bu mutasyonların çoğu,

genlerin azotlu bazlarının yapısını değiştiren

organizmadaki normal kimyasal süreçlerle ilişkilidir.


Spontan mutasyonlar ne şekilde meydana gelir?

• Replikasyonda meydana gelen hatalar: DNA

replikasyonu sırasında tautomerik değişim ortaya çıkabilir. Sıklığı düşüktür.

• Mikroorganizmaların doğal çevresi

• Kendiliğinden mutasyon yapıcı ara ürünlerin ortamda birikmesi

• Salmonella ve E. coli gibi bazı bakterilerde bazı genlerde meydana gelen mutasyon organizmanın diğer genlerinde kendiliğinden mutasyon meydana gelme olasılığını arttırır.


Taze besiyerine E. coli eklenir.

Her bir petriye 100μlt aktarılıp L bagetle yayılır.

50μgr/ml streptomisin içeren nutrient agar 37 0C’de 24h inkübasyon

Her bir tüpe 0,2ml ilave edilir ve 1-2h inkübasyona bırakılır.

50μgr/ml streptomisin içeren nutrient agarlı 10 petriye her bir tüpten 100μlt aktarılıp L bagetle yayılır.

37 0C’de 24h inkübasyon

UYGULAMA


Luria- delbrück yükseltme azaltma (fluctuation) deneyi (iniş çıkış deneyi)

• 1943te araştırıcılar bu deneyi yaparlarken E.coli hücrelerinin besin ortamındaki agara ekimiyle birlikte T1 fajı da eklenirse bu fajlar bakterileri enfekte ettiği ve öldürdüğü biliniyordu

• Ancak nadir olarak bazı bakteriler faj enfeksiyonuna direnç göstermektedir bu koloniler kararlı ve gerçek mutantlardır.

• Ancak o dönemde bu mutantların spontanmı yoksa rastgele zamanla oluşup oluşmadıkları bilinmiyordu. Ayrıca fajların bu bakterilerden bazılarını resiztan hale getirip getirmedikleri de bilinmiyordu

• Luria’ya göre eğer mutasyon spontansa farklı kültürlerde farklı zamanlarda mutantlar oluşmalıydı ve kültür başına oluşan resistan koloni sayısı yüksek çeşitlilik göstermeliydi (yani inişli çıkışlı bir sayıda olmalıydı)

• Bu araştırıcılar deneyi şöyle kurdular

• 20 tane küçük kültürü herbiri birkaç koloni ile inoküle ettiler ve hücre sayısının 108 hücre/ml oluncaya kadar büyüttüler

• Aynı zamanda daha büyük bir kültürü bakteriyle inoküle edip aynı hücre sayısına ulaşıncaya kadar büyüttüler

• 20 küçük kültür ve büyük kültürden elde edilen 20 örnek faj bulunan ortama ekildi

• 20 küçük kültür önemli sayıda dirençli koloni oluştururken büyük kültürlerden elde edilen örneklerde varyasyon daha az görüldü. 20 küçük kolonili örnekten 11inde dirençli koloni görülmedi kalanlarda, 1, 1, 3,5, 5, 6, 35, 64 ve 107. büyük kültürde ise dirençli koloni sayısı 14-27 arasında değişti

• Eğer faj mutasyonu indüklemiş olsaydı küçük kültürlerde aynı sayıda mutasyon görülürdü.en iyi açıklama rastgele mutasyon oluşmuştu.erken mutasyona uğrayan hücreler daha fazla sayıda mutant koloni verirken geç mutasyona uğrayan hücreler daha az mutant hücre vermiştir.

• Buna göre resistan hücreler çevresel ajanlar tarafından (burada faj) oluşturulmaktan öte onlar tarafından seçilirler


Fluctuation Test




İndüklenmiş Mutasyonlar

• Mutajen adı verilen fiziksel veya kimyasal etkenlerle meydana gelen mutasyonlardır.

• Bu etkenlerin kullanılması sonucu mutasyonların meydana gelme olasılığı artar. (10-2)

• Mutajenler genler üzerinde hiç fark gözetmeksizin etkili olurlar.

• Fiziksel mutajenler: pH değişimi, sıcaklık, manyetik ve elektriksel alan, uv, x ışınları gibi.

• Kimyasal mutajenler: Nitröz asit, hidroksil amin, alkilleyici maddeler gibi.


KİMYASAL MUTAJENLER

• Baz anologları

• Alkilleyici Ajanlar

• DNA bazlarını kimyasal olarak değiştiren

mutajenler

• Aromatik mutajenler


. BAZ ANALOGLARI

• Nükleik asit biyosentezi sırasında, pürin ve pirimidinlerin

yerine geçebilen moleküllere baz analogları denir.

• Baz analogları, pürin ve pirimidin bazlarından hangisine

benziyorsa, replikasyon sırasında benzerinin yerine

geçebilir, ancak normal bazlara kıyasla daha yüksek

oranda hatalı baz çifti yaptıklarından mutasyon hızını

artırırlar

• 5-Bromourasil ve 2-aminopürin baz analogları

örnekleridir.


• Urasilin bir türevi olan 5-bromourasil

bromourasil (5-BU) timin analoğu olarak

davranır. Timin bazının 5. pozisyonundaki -

CH3 yerine 5-bromourasilde bromourasilde

Br bulunur bulunur.


Antibiyotiklere Dirençli Mutant Elde Edilmesi

Direnç: Bir bakterinin antimikrobiyal bir ajanın

öldürücü veya üremeyi durdurucu etkisine karşı

koyabilme yeteneğidir.

Bir bakteri bir antibiyotiğe karşı nasıl direnç geliştiriliyor?

• Antibiyotikler hücre çeperini, protein sentezini, replikasyonunu, DNA polimeraz, RNA polimerazı inhibe eden antibiyotikler mevcuttur.

• ilacın bağlandığı reseptör veya bağlanma bölgesinde değişiklikler oluşur.

• İlaç enzimatik olarak inaktive olur.

• bakteriyal membran değişikliği


• Uygulama:

• Bakterileri mutajen ile birlikte inkübe ederek mutant elde etmeye çalışacağız.

• 50ml’lik 2 nutrient brotha organizma ekilir.

• 37 0C’de 24h ink. bırakılır.

• 100μgr/ml streptomisin ve 50μgr/ml nalidiksik asit içeren 50ml’lik nutrient brothlara kültürün tümü eklenir. 37 0C’de 24h ink. bırakılır.

• Antibiyotiksiz ilk kültürden ve antibiyotik ilave edilen erlenlerden de antibiyotik içeren petrilere ekim yapılır.

• 24h’lik inkübasyondan sonra üreme olup olmadığına bakılır.

•


Nutrient Agar dökülür

Nutrient Agar

100μlt S. aureus L-baget ile yayılır.

50μgr/ml Streptomisin içeren Nutrient agar

Böylece antibiyotik gradienti elde edilir.

Burada çoğalan koloninin ne kadar dirençli olduğu da MIC (minimal inhibitör konsantrasyon) ve MBC (minimal bacterisidal konsantrasyon) ile saptanır.

Gradient Plate Yöntemi:

Antibiyotik kon. en fazla




.... ...

.

.

MBC=4μg/ml


Fenotipik Modifikasyonlar

• Adaptasyon: Genlerde herhangi bir

değişiklik olmaksızın değişen çevre

koşullarına gösterilen fenotipik bir

uyumdur. Kalıtımla ilişkili olmaksızın

fizyolojik değişikliğe uğrayarak gösterilen

adaptasyondur.

• Adaptasyonun en önemli özelliği geriye

dönüşümlü olmasıdır.


• Deneme 1:

• Kırmızı pigmenet üreten Serratia marcescens ATCC 39006

Pridigiosin adı verilen pigment üretir.

• 24 saatlik kültür 2 farklı Nutrient Agar petrisine ekim

yapılır.

• Petrilerden biri 27 0C diğeri 37 0C’ye kaldırılır. 24h

inkübasyona kaldırılır.

• Süre sonunda bu petrilerden tekrar NA’ya ekim yapılır ve

ters sıcaklıklarda ink. bırakılır.

• Kırmızı beyaza, beyaz kırmızıya dönerse bu koloni

değişiminin sıcaklığa bağlı olduğu anlaşılır.


• Deneme 2:

• Kırmızı pigmentli suştan 2 NA’lı petriye ekim yapılır.

• Petrilerden biri uv’ye maruz bırakılır.

• Her iki petride 27 0C ‘ye kaldırılır.

• Uv’ye bırakılan petride beyaz koloni görülerse bunun mutasyom olup olmadığını anlamak için tek saf beyaz koloniden ekim yapılır.

• 27 0C ‘de ink. kaldırılır.

• İnkübasyondan sonra üreyen koloninin rengi beyaz ise mutasyon olduğu anlaşılır.


• DNA yapısındaki her bir baz tautomer denen birkaç

formda bulunur

• Tautomerler izomerlerdir atomlarının pozisyonları

ve atomları arasındaki bağları farklıdır

• Her form denge halindedir

• Keto form normal olarak DNA yapısında bulunan

formdur

• İmino ve enol formları ise daha az rastlanan

formlardır

• İmino yada enol tautomerler yanlış bazla eşleşirler

ve mispair oluştururlar.


Bazların normal keto formlarının eşleşmesi


5-Bromo urasil • Bazların yanlış eşleşmesi spontan yada bazlar iyonize

olduklarında görülür

• 5-bromourasil (5-BU) timin analogudur ve timinde bulunan CH3 gurubu yerine karbon 5. pozisyonda bromin bulunur.

• 5-BU’nun mutajenik eylemi enolizasyon ve iyonizasyondan kaynaklanır. 5-BU’de bromin atomu baz eşleşmesi sırasında H bağı oluşturacak pozisyonda bulunmaz dolayısıyla 5BU timin bazı gibi adenin ile eşleşir ancak bromin atomu baz halkasında bulunan elektronların dağılımını önemli ölçüde değiştirir.çünkü 5BU ya enol yada iyonize forma dönüşür: enol ve iyonize form ise guanin ile eşleşir

• 5BU replikasyon sırasında enolizasyon yada iyonizasyonuna bağlı olarak G.C-A.T yada A.T-G.C transisyonuna neden olur.


MUTASYONLAR MUTASYON · mutasyonlardır. DNA replikasyonu sırasındaki hatalardan veya DNA molekülü içinde bulunan nükleotitin kendiliğinden değişimi sonucu oluşabilirler.

Documents