Mutagenesi1. 2 MUTAZIONI SPONTANEE La instabilità strutturale del DNA è una possibile fonte di mutazione spontanea Le forze che stabilizzano la doppia.

mutagenesi 1

mutagenesi 2

MUTAZIONI SPONTANEE

La instabilità strutturale del DNA è una possibile fonte di mutazione spontanea

Le forze che stabilizzano la doppia elica (legami idrogeno fra basi complementari delle due emieliche, interazioni idrofobiche tra basi contigue della stessa emielica, interazioni elettrostatiche tra gruppi fosforici e istoni) hanno caratteristiche di elasticità e non di staticità

I legami idrogeno si rompono e si riformano continuamente e le basi affacciate si avvicinano e si allontanano vibrando: le emieliche sono percorse da movimenti laterali alternati, che riguardano 8-10 basi alla volta, centrifughi e centripeti rispetto all’asse centrale

Le interazioni idrofobiche fra le basi sovrapposte avvicinano gli anelli fino a portarli alla distanza minima compatibile con i raggi di Van der Waals, compattandoli, per poi allontanarli bruscamente

Altre possibili cause di mutazioni spontanee sono:

- la rottura del legame fosfodiestere su uno o entrambi i filamenti durante i cicli di condensazione-decondensazione della cromatina- tautomeria cheto-enolica della guanina e della timina e tautomeria amino-imminica della adenina e della citosina (lo stato raro delle basi consente la formazione di coppie di basi “proibite” A-C e G-T)- errori nell’incorporazione di un nucleotide all’estremità di un filamento nascente durante la duplicazione del DNA

mutagenesi 3

Le mutazioni possono riguardare un singolo nucleotide o un breve tratto della sequenza nucleotidica (mutazioni geniche), oppure possono essere più estese e coinvolgere parzialmente o interamente uno o più cromosomi (aberrazioni cromosomiche)

A T G G C T T C A T A C C G A A G T

Mutazioni per sostituzione (transizione) A T G G T T T C A T A C C A A A G T

(trasversione) A T G G A T T C A T A C C T A A G T

Mutazioni per inserzione (frameshift +) A T G G G C T T C A T A C C C G A A G T

Mutazioni per delezione (frameshift -) A T G C T T C A T A C G A A G T G C

Mutazioni per duplicazione A T G G C G G C T T C A T A C C G C C G A A G T

Mutazioni per inversione A T T T C G G C A T A A A G C C G T

mutagenesi 4

Luogo della mutazione Possibili conseguenze

sequenza TATA (promotore) impediscono o rendono meno efficiente la trascrizione tripletta TAC impediscono la formazione del complesso d’inizio della traduzione

triplette codificanti aminoacidi alterano il messaggio o generano un sinonimo (terza lettera del codone)

giunzione tra esone e introne alterano il segnale di splicing

codoni di terminazione traduzione alterano la cornice di lettura

TATAbox

TAC

ATTATCACT AATAA

esoneintroneesone

UNITA' DI TRADUZIONE

UNITA' DI TRASCRIZIONE

INIZIO

INIZIO

TERMINE TERMINE

mutagenesi 5

MUTAZIONI INDOTTE

Mutageni chimici

-analoghi delle basi azotate-agenti alchilanti-agenti intercalanti

N NH H

O

O

CH3

H

N NH H

O

O

Br

H

TIMINA 5-BROMOURACILE (forma chetonica)

A - T

A - bU

A - T + G - bU

A - T + A - T G - C + A - bU

mutagenesi 6

N

NN

N

NH2

H

H

HN

NN

N

NH2

H

H H

ADENINA 2 - AMINOPURINA

A - T

2aP - T

2aP - C + A - T

2aP - T + C - G A - T + A - T

mutagenesi 7

Etilmetansulfonato (addiziona gruppi alchilici) e nitrosoguanidina (addiziona gruppi metilici)

ALCHILANTI

Alchilazione del O legato al C6 della guanina o al C2 della timina appaiamento errato G – T transizioni: AT – GC e GC – AT

mutagenesi 8

INTERCALANTI

La proflavina e le acridine sono sostanze costituite da tre anelli planari le cui dimensioni sono quasi uguali a quelle di una coppia purina-pirimidina. Si legano al DNA inserendosi tra coppie di basi adiacenti e possono provocare, durante le duplicazione, l’inserzione o la delezione di un nucleotide

mutagenesi 9

RADIAZIONI UV e FOTODIMERIZZAZIONE

Formazione di fotodimeri pirimidinici

DEPURINAZIONE

Aflatossina B1

mutagenesi 10

OSSIDAZIONE PRODOTTA DA SPECIE REATTIVE DELL’OSSIGENO

La 8-oxodG può legare la adenina determinando una trasversione GC TA

DEAMINAZIONE

L’uracile lega l’adenina determinando transizione GC ATLa timina lega l’adenina determinando transizione GC AT

cancerogenesi 11

IL MODELLO A PIU’ STADI DELLA CANCEROGENESI CHIMICA

INIZIAZIONE o TRASFORMAZIONE NEOPLASTICA: porta ad un danneggiamento irreversibile del genoma nelle cellule indotte

PROMOZIONE: porta all’espansione per clonazione delle cellule iniziate

PROGRESSIONE: porta ad un aumento progressivo ed irreversibile della malignità delle cellule

L’interazione del cancerogeno o di un suo metabolita con il DNA può portare a premutazioni

La premutazione innesca i meccanismi di riparazione del DNA

I danni al DNA che vengono eliminati prima della divisione cellulare non hanno conseguenze

Più è lungo il tempo tra due divisioni cellulari, tanto maggiore è la probabilità che vengano eliminati i danni al DNA

Il danno diventa irreversibile quando viene “fissato” da almeno una divisione cellulare

CELLULA NORMALE CELLULA INIZIATA

formazione di addotti

fissazione del danno

meccanismi di riparazione del DNA

cancerogenesi 12

Grazie ad un aumento della frequenza delle divisioni cellulari e ad una diminuzione dell’apoptosi, dalla cellula iniziata si forma una popolazione cellulare con mutazioni identiche

Nelle cellule figlie si evidenzia il fenotipo mutato

Contrariamente all’iniziazione, la promozione è un processo lungo ma reversibile

I promotori agiscono con meccanismi d’azione differenti:- possono influenzare le vie cellulari di trasduzione del segnale- possono inibire la comunicazione intercellulare- possono influenzare la crescita cellulare e l’apoptosi

CELLULA INIZIATA

promotori

fattori omeostatici cellulari

dieta

fattori omeostatici tissutali

cancerogenesi 13

Induttore : 7,12-DMBA (7,12-dimetilbenzoantracene)

Promotore: TPA (12-O-tetradecanoil-forbolo-13-acetato) 1) + +

2) +

3) no

4) +

5) no 6) no 7) no

8) +

tempo

1) e 2) La applicazione ripetuta di 7,12-DMBA sulla pelle porta, in modo dose-dipendente, alla formazione di tumori3) Una dose subcancerogena di 7,12-DMBA non è in grado di provocare tumori4) Nelle stesse condizioni, il trattamento con TPA porta alla formazione di tumore5) L’inversione dello schema di trattamento non ha effetto6) Il TPA da solo non ha effetto7) Aumentando l’intervallo di tempo tra le applicazioni di TPA scompare l’azione promotrice8) Si formano tumori anche quando aumenta l’intervallo di tempo tra iniziazione e promozione

cancerogenesi 14

Il passaggio da tumore benigno a tumore maligno è indicato come fase di progressione ed è irreversibile

La progressione è caratterizzata dalla comparsa di ulteriori mutazioni nella linea di cellule iniziate che contengono già danni genetici

Nella progressione si manifesta una instabilità del genoma che porta ad anomalie cromosomiche

Il tumore maligno cresce in modo aggressivo e si spinge negli spazi intercellulari del tessuto circostante (crescita infiltrante o invasiva)

Inoltre dal tumore maligno primario si liberano cellule che vengono trasportate dal sangue o dalla linfa ad altri organi (capacità di formare metastasi)

crescita aggressiva

invasività

capacità metastatica

cancerogenesi 15

Mutazioni a carico di geni codificanti proteine che controllano i processi di crescita e proliferazione cellulare possono determinare l’insorgenza di tumori

cancerogenesi 16

Il gene Ras è situato nel braccio corto del cromosoma 11 , locus 11p15.5

Il prodotto dell’espressione del gene Ras è una proteina che, nella cellula normale, si comporta come un “interruttore molecolare”, passando rapidamente da uno stato attivo (on) ad uno inattivo (off). La proteina Ras svolge importanti funzioni nella cellula, in quanto , nello stato “on”, è in grado di attivare numerose vie di trasduzione del segnale che sono implicate nella regolazione dell’espressione genica, nella proliferazione, adesione e motilità cellulare

Mutazioni del gene Ras portano alla espressione di una proteina che non è più in grado di passare allo stato inattivo e pertanto, una volta innescato il segnale intracellulare, non è più in grado di spegnerlo

In circa il 30% dei tumori solidi dell’uomo sono state rinvenute mutazioni a carico del gene Ras

Carcinoma della vescica: sostituzione gly12valCarcinosarcoma mammario: sostituzione gly12aspCarcinoma polmonare: sostituzione gln61leuCarcinoma renale: sostituzione gln61arg

Mutazioni a carico delle triplette che codificano per gli aminoacidi in posizione 12 e 61 sembrano perciò portare con elevata probabilità a trasformazione neoplastica delle cellule interessate

cancerogenesi 17

11p15.5

cancerogenesi 18

Mentre il gene Ras è un oncogene, cioè un gene che, qualora subisca una mutazione, può portare a crescita e proliferazione incontrollata della cellula, i geni Rb e p53 vengono definiti oncosoppressori, in quanto, nella cellula normale, sono in grado di impedire la trasformazione neoplasticaIl gene Rb è localizzato nel cromosoma 13, loci 13q14.1 e 13q14.2Il prodotto dell’espressione del gene Rb è una proteina (p105, proteina del retinoblastoma) che svolge un ruolo chiave nella transizione G1 / S del ciclo cellulareLa p105, nello stato defosforilato, sequestra in una tasca della molecola il fattore di trascrizione E2F, indispensabile per la trascrizione di geni che entrano in gioco durante la duplicazione del DNALa fosforilazione di p105 è sotto il controllo dei complessi ciclina /Cdk e, quando la proteina è fosforilata, libera il fattore E2F che può perciò svolgere la sua funzione

G0 G1 S G2 M

ciclina D ciclina E ciclina A ciclina B

Cdk4-Cdk6 Cdk2 Cdk1

fosforilazione p105

cancerogenesi 19

13q14.1 - 13q14.2

cancerogenesi 20

Il gene Rb ha una funzione di regolazione negativa della proliferazione cellulare, in quanto inibisce la progressione dalla fase G1 alla fase S

Mutazioni a carico del gene Rb che impediscono la sintesi o portano alla sintesi di proteina p105 inattiva determinano una crescita cellulare incontrollata

Il retinoblastoma è un tumore infantile della retina determinato dalla mutazione di Rb. Nella forma ereditaria, si sviluppano tumori multipli in entrambi gli occhi, mentre nella forma non ereditaria generalmente è colpito un solo occhio

In realtà mutazioni del gene Rb possono essere responsabili di numerosi altri tumori, quali alcuni carcinomi della prostata, carcinomi della vescica, della mammella e del polmone, nonché di osteosarcomi e leucemie

Mutazione attivazione di oncogeni induzione del tumore Mutazione inibizione di geni oncosoppressori induzione del tumore

Molti tumori causati dalla soppressione della funzione di Rb presentano anche danni a carico del gene p53

Il gene p53 è situato nel cromosoma 17, locus 17p13.1

La proteina p53, espressa da questo gene oncosoppressore, è un fattore di trascrizione che funge da “sensore” della normale progressione del ciclo cellulare e anche da induttore dell’apoptosi

In caso di malfunzionamento del ciclo, p53 può indurre il blocco del processo replicativo per consentire il ripristino della normalità. Qualora ciò non avvenga, p53 può indurre l’attività di geni che avviano il processo di morte cellulare

p53 è il gene che più frequentemente si trova alterato o non espresso nei tumori umani. Nelle cellule trasformate che esprimono la forma mutata, questa è generalmente non funzionale

cancerogenesi 21

17p13.1

cancerogenesi 22

Danneggiamento del DNA

Condizioni sub-ottimali per la crescita cellulare(ipossia, deplezione delle riserve di ribonucleotidi)

Malfunzionamento dell'apparato mitotico

attivazione del fattore di trascrizione p53

induzione p21

-

ciclina E - Cdk2

p105 defosforilata p105 fosforilata

rilascio fattore di trascrizione E2F

Transattivazione geni per la duplicazione del DNA(diidrofolato reduttasi, timidina chinasi, DNA polimerasi)

l'arresto dell'attività fosforilantedel complesso ciclina E-Cdk2blocca la transizione G1 / S

cancerogenesi 23

L'apoptosi è spesso associata con la deregolazione dell'espressione e/odell'attività di proteine implicate nel controllo della progressione del ciclo cellulare

La proteina p53 può innescare attivamente il programma di morte cellularequando sia venuta meno la sua funzione di blocco del ciclo.

In effetti, in molti sistemi che mancano di p53 funzionale, la deregolazione delciclo non causa apoptosi ma trasformazione neoplastica

Molti tumori causati dalla soppressione del gene Rb presentanocontemporaneamente l'assenza della funzione del gene p53

ASSENZA DI Rb FUNZIONALE

DEREGOLAZIONE DELLA TRANSIZIONE G1 / S

APOPTOSI

TRASFORMAZIONE

p53

p53 assente

cancerogenesi 24

CANCEROGENI CHIMICI

COMPOSTI DNA-REATTIVI EPIGENETICI

Attivazione Attivazione 1) non interagiscono conindipendenti dipendenti il DNA

1) sono composti elettrofili 2) sono PROMOTORI2) i cancerogeni attivazioneindipendenti sono instabili e difficilmente si accumulanonell’ambiente3) i cancerogeni attivazione dipendenti sono più stabili,si possono accumularenell’ambiente e necessitanodi attivazione metabolicaper dare origine al compostocancerogeno finale4) i cancerogeni DNA-reattivinon hanno una dose soglia perl’azione genotossica5) possono interagire in modo additivo o sinergico6) sono INDUTTORI

teratogenesi 25

TERATOGENESI

Periodo EMBRIONALE (dal concepimento alla 8° settimana)

Periodo FETALE (dalla 8° settimana al termine della gestazione)

teratogenesi 26

Teratogenesi sperimentale

SPECIE ANIMALERatto, coniglio, topo

DOSAGGIOI° LIVELLO: dose che non produce alterazioni osservabili dello stato di salute nella madreII° LIVELLO: uno o più dosaggi intermediIII° LIVELLO: dose che produce lievi ma chiari effetti tossici nella madreGRUPPI DI CONTROLLO1° GRUPPO (Controllo negativo): trattamento con veicolo o soluzione fisiologica2° GRUPPO (Controllo positivo): trattamento con una sostanza sicuramente teratogenaVIA DI SOMMINISTRAZIONELa stessa prevista per l’esposizione nell’uomoPERIODO DI SOMMINISTRAZIONEDurante l’intero periodo di organogenesi

GIORNO 0 6 15 20

TRATTAMENTO

(RATTO)

teratogenesi 27

RILIEVI ED ESAMI

• Ogni femmina gravida che presenti minaccia di aborto o di parto prematuro deve essere sacrificata ed esaminata• Il sacrificio 1 giorno prima della data prevista per il parto consente di evitare fenomeni di cannibalismo e permette il conteggio dei siti di riassorbimento e dei feti morti• E’ necessario rilevare:- numero di corpi lutei- numero di impianti- numero di riassorbimenti- numero di feti morti- numero di feti vivi- peso e lunghezza (cranio-sacrale) dei feti vivi- anomalie morfologiche dei feti vivi

Dopo aver esaminato le eventuali anomalie morfologiche, 2/3 dei feti, scelti in modo casuale, devono essere esaminati per evidenziare la possibile presenza di anomalie scheletriche (colorazione con rosso di alizarina)La restante frazione (1/3) viene sezionata ed esaminata per evidenziare la possibile presenza di anomalie agli organi interni

ANALISI DEGLI EFFETTI RITARDATI

Per effettuare questo tipo di analisi bisogna consentire alle femmine gravide di partorire e di allevare i piccoliDopo il periodo di allattamento, i piccoli vengono sottoposti a test di tipo neuromotorio e comportamentale per accertare eventuali anomalie

100

50

DOSESOGLIA

DL 100EMBRIOFETALE

n° impianti - n° feti vivi PERDITA POST-IMPIANTO (%) = X 100 n° impianti

Perdita post-impianto (%)

dose (mg/kg/die)

SPECIE ISOTRETINOINA PERIODO MALFORMAZIONI DOSE SOGLIA TRATTAMENTO (mg/kg/die) (giorni)

Topo 100 6-15 craniofacciali Ratto 75 8-10 craniofacciali Coniglio 10 7-18 scheletriche viscerali, SNC Scimmia 5 70-84 palatoschisi Uomo 0,4 variabile craniofacciali cardiovascolari SNC

teratogenesi 29

TERATOLOGIA COMPORTAMENTALE

SVILUPPO DEI RIFLESSI

- raddrizzamento (1,8 giorni)

- geotassi negativa (4,8 giorni)

- evitamento del dirupo (4,8 giorni)

- presa palmare (6,3 giorni)

- allarme fonico (11,4 giorni)

- stimolazione delle vibrisse (12,5 giorni)

- raddrizzamento in caduta libera (17,5 giorni)

- stimolazione visiva (17,6 giorni)

MOVIMENTI SPONTANEI

- pivoting (tecnica di deambulazione in cui le zampe anteriori e posteriori si muovono in modo non coordinato) (comparsa 7 giorni)

- crawling (movimento di propulsione da parte delle zampe anteriori che fungono da remi) (comparsa 8 giorni)

- walking (movimento tipico dell’animale quadrupede) (comparsa 12 giorni)

- rearing (sollevamento sulle zampe posteriori)

- climbing (arrampicamento)

- fuga dalla gabbia