IDENTIFIKASI ESTERIFIKASI RETINOL OLEH M~CROSOM DARI MUKOSA USUS HALUS AYAM DENGAN MENGGUNAKAN [ H] RETINOL Retno Murwani* ABSTRAK IDENTlrlKASI DAN KARAXTERISASI ESTERlrlKASI RETINOL OLKH MICROSOKK DARI MUCOSA 3 USUS BALUS AYAM BERRASIL DILAKUKAN DENGAN MKNGGUNAKAN [ H] RETIONAL. Inkubasi micro- some dengan [3H] retinol dan palmitoyl CoA memberikan radioaktif [3H] 'retinyl pal.i- tat yang dapat dideteksi pada kromatografi cairan tekanan tinggi (HPLC). Esterifika- si meningkat selama 15 menit dan pada temperatur antara 370C - 450C. Pembentukan 3 . [ H] retinyl palmitat meningkat dengan konsentrasi protein microsome sampai 240 us dan konsentrasi palmitoyl-CoA sampai 30 uM.pH optimal esterifikasi yaitu 6,6. 3 Konsentrasi serum albumin (DSA) sedikit mempensaruhi pembentukan [H] retinyl palmitat. ABSTRACT IDENTIrICATION AND CHARACTERS OF RETINOL ESTERIFICATION BY MICROSOHE OF CHICK INTESTINAL MUCOSA WAS DEMONSTRATED IN THIS EXPERIMENT. Incubation of microsome with [3H] retinol and palmitoyl CoA as substrate produced [3H] retinyl palmitat corres- ponding to that of authentic retinyl palmitate indentified on (HPLC). No esterifica- tion occured without palmitoyl CoA and microsome, and heat-inactivated microsome. Esterification increased for 15 minutes at temperatur 370C - 450C. [3H] retinyl palmitate formation was enhanced with microsomal protein concentration up to 240 us 3 and palmotoyl CoA concentration up to 30 uM. Optimal pH was reached at 6.6. [ H] retinyl palmitate formation was slightly dependent on bovine serum albumin (DSA). PENDAHULUAN Beta-carotene telah lama dikenal sebagai sumber vitamin A alami yang paling potensil di antara carotenoid (1). Beta-carotene ini diubah menjadi vitamin A terutama di dalam mukosa usus halus. * Fakultas peternakan, Universitas Diponosoro 797
11
Embed
MUKOSA USUS HALUS AYAM DENGAN MENGGUNAKAN [ H] …digilib.batan.go.id/e-prosiding/File Prosiding/Pertanian_Peternakan... · reaksi terutama dengan asam palmi tat (7). Dalam penelitiannya
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
IDENTIFIKASI ESTERIFIKASI RETINOL OLEH M~CROSOM DARIMUKOSA USUS HALUS AYAM DENGAN MENGGUNAKAN [ H] RETINOL
Retno Murwani*
ABSTRAK
IDENTlrlKASI DAN KARAXTERISASI ESTERlrlKASI RETINOL OLKH MICROSOKK DARI MUCOSA3
USUS BALUS AYAM BERRASIL DILAKUKAN DENGAN MKNGGUNAKAN [ H] RETIONAL. Inkubasi micro-
some dengan [3H] retinol dan palmitoyl CoA memberikan radioaktif [3H] 'retinyl pal.i
tat yang dapat dideteksi pada kromatografi cairan tekanan tinggi (HPLC). Esterifika
si meningkat selama 15 menit dan pada temperatur antara 370C - 450C. Pembentukan3 .[ H] retinyl palmitat meningkat dengan konsentrasi protein microsome sampai 240 us
dan konsentrasi palmitoyl-CoA sampai 30 uM.pH optimal esterifikasi yaitu 6,6.3
Konsentrasi serum albumin (DSA) sedikit mempensaruhi pembentukan [H] retinyl
palmitat.
ABSTRACT
IDENTIrICATION AND CHARACTERS OF RETINOL ESTERIFICATION BY MICROSOHE OF CHICK
INTESTINAL MUCOSA WAS DEMONSTRATED IN THIS EXPERIMENT. Incubation of microsome with
[3H] retinol and palmitoyl CoA as substrate produced [3H] retinyl palmitat corres
ponding to that of authentic retinyl palmitate indentified on (HPLC). No esterifica
tion occured without palmitoyl CoA and microsome, and heat-inactivated microsome.
Esterification increased for 15 minutes at temperatur 370C - 450C. [3H] retinyl
palmitate formation was enhanced with microsomal protein concentration up to 240 us3
and palmotoyl CoA concentration up to 30 uM. Optimal pH was reached at 6.6. [ H]
retinyl palmitate formation was slightly dependent on bovine serum albumin (DSA).
PENDAHULUAN
Beta-carotene telah lama dikenal sebagai sumber vitamin A alami
yang paling potensil di antara carotenoid (1). Beta-carotene ini
diubah menjadi vitamin A terutama di dalam mukosa usus halus.
* Fakultas peternakan, Universitas Diponosoro
797
Retinal hasil pemecahan beta-carotene direduksi lebih lanjut menJadi
re~inol \2}. Retinol kemudian diesterifikasi kembali dalam sel
mukosa dengan asam lemak terutama asam lemak jenuh berantai panjang
sebelum diserap ke dalam tubuh dalam bentuk chylomicron (3). Esteri
fikasi retinol ini telah diteliti dan dikarakterisir pada beberapa
jenis mamalia (4, 5, 6), ditemukan dalam fraksi microsome dan be
reaksi terutama dengan asam palmi tat (7). Dalam penelitiannya SKLAN
(8) berhasi I menunjukkan adanya akti vitas pemecahan beta-carotene
dalam mukosa ayam. Demikian pula telah diteliti bahwa peningkatan
pemberian vitamin A dalam ransum hewan percobaan dapat meningkatkan
kandungan retinol hati. Selain itu peningkatan konsumsi beta-caro
tenepun ternyata meningkatkan simpanan vitamin A dalam hati. Namun,
masih menjadi pertanyaan apakah esterifikasi retinol yang dihasilkan
dari pemecahan beta-carotene juga dipengaruhi oleh peningkatan
konsumsi beta-carotene tersebut. Untuk mengetahui hal inilah maka
diperlukan indentifikasi adanya aktivitas esterifikasi dalam mukosa
usus ayam. Demikian pula diperlukan karakterisasinya untuk memper
oleh kondisi optimal bagi penelitian selanjutnya.
BAliAN DAN METODA
Bahan Kimia. [15-3HJ all trans retinol dengan aktivitas spesifik
23.5 Ciimmol. Stok [3HJ retinol ini diambil seperlunya dan diencer
kan dengan etanol sehingga diperoleh kurang lebih 50.000 cpm serta
diperiksa distribusi radioaktivitasnya dengan HPLC (lihat HPLC dan
Gambar 1). Adanya radioakti vitas di seki tar daerah elusi standar
retinyl palmi tat yang dapat mengganggu uj i akti vitas esteri fikasi
(1ihat uj i ARAT) memerlukan pemurnian terhadap stok [3HJ retinol.
Hasil pemurnian dengan HPLC diuapkan, dilarutkan kembali dalam
etanol dan diperikasa ulang distritNJsi radioaktivitasnya (Gambar
IB). Stok [3UJ retinol yang telah dimurnikan disimpan pada suhu
* Microsome dipanaskan pada suhu 800C selama 30 menit.
terelusi bersama standar retinyl-palmitat adlah [3H]retinyl-palmitat
yang berasal dari radioaktif retinol [15-3H] dan palmitoyl-CoA. Hal
ini tidak terjadi bila palmitoyl-CoA digantikan oleh asam palmitat
(9). Pene lit ian HELGERUD et al. (4) dan HELGERUD et al. (5) dengan
menggunakan substrat berlabel [1-14C]palmitat membuktikan pula bahwa
radioaktivitas yang ditemukan dari hasil ekstraksi lemak tidak hanya
terdapat pada fraksi retinol saja, tetapi juga di daerah fraksi
retinyl palmitat.
lnkubasi tanpa BSA menghasilkan radiokatif retinyl palmi tat
sebesar 43% dari hasil inkubasi lengkap (percobaan 4). Hal ini me
nunjukan bahwa BSA diperlukan dalam sistim inkubasi di sini. BSA
diduga memiliki struktur yang meyerupai cRBP (cellur Retinol Binding
Protein) yang ditemukan dalam sel-sel usus halus dan hati (10,11,12)
BSA mampu mengikat retinol sehingga memungkinkan retinol lebih
mudah mengalami esterifikasi daripada dalam bentuk bebas terlarut
dalam larutan organik (9).
BiEat-siEat EsteriEikasi Retinol Jari Microsome Usu Ayam. Untuk
memperoleh kondisi optimal bagi aktivitas esterifikasi retinol, maka
diteliti berbagai pengaruh kondisi inkubasi terhadap pembentukan
[3H]retinYl palmitat. Gambar 4 menunjukan bahwa pembentukan retinyl
palmi tat naik perlahan selama awal 5 menit inkubasi dan naik hampir
803
-g 10oor-
X-~C-o 4
2
O'.~N'"""--- r~ ....5 10
Time (minute)
10-~
-000or-x 5-~c..0
o 5Time (minute)
10
Ganbar 3. Pembentukan (7+1)retinyl palmi tat oleh microsom ususayam. A, Inkubasi lengkap dengan microsom; B, Inkubasi dengan microsom yang telah dip anask an ; (J, memmjukkan standar retinol (1~5 - 3 menit) dan retinylpalmi tat (r - 9 menit). Kondisi dan prosedur inkubasiseperti tersebut dalam materi clan meto de
liner dari 5 sampai 15 menit inkubasi. lnkubasi lebih lama dari 15
menit hanya memberikan sedikit kenaikan terhadap pembentukan [3H]re
tinyl pelmi tat (panel A). Esterifikasi naik secara linier dengan
konsentrasi protein microsome sampai 240 ug per inkubasi (panel B)
dan mencapai maksimum pada konsentrasi palmitoyl-CoA 60 uM (panel
C). Est~rifikasi retinol mencapai maksimal pada pH 6,6 dan meningkat
antara temperatur 37°C sampai 45°C. Tanpa BSA t~rbentuk [3H]retinYl
palmi tat sekitar 45% dari kondisi optimal yang dicapai dengan mg/mlBSA.
KESIMPULAN
Dari keseluruhan hasil di atas dapat disimpulkan bahwa identifi
kasi pembentukan [3H]retinYl palmitat dari inkubasi [3H]retinol clan
804
palmitoyl-CoA beserta microsom dapat dideteksi dengan bantuan HPLC.
Aktivitas esterifikasi retinol pada mucosa usus ayam ini dikatalisis
oleh Acyl-CoA:retinol acyl traferase yang terdapat dalam microsome.
Kondisi optimal ARAT ini dapat dikarakterisir dan dapat digunakan
untukmenentukan aktivitas terhadap berbagai perlakuan percobaan.
UCAPAN TERIMKASIH
Terimaksih yang sebesar-besarnya kepada Prof. Soichi Masushige
atas segal a bimbingannya selama penulis melaksanakan penelitiannya
kepada Dr. Kato atas saran dan kritiknya; kepada Mr. Furusho atas
saran dan bantuan teknis yang diberikan; serta Mr. Ota yang telah
memberi ijin untuk menggunakan fasili tas di Pusat Radioisotop Tokyo
University of Agriculture yang dipimpinnya.
DAFTAR PUSTAKA
1. BAURENFEIND, J.C., Carotenoid vitamin A precursors and analog infoods and feeds, J. Agric. Food Chem. 20-3 (1972) 456.
2. OLSON, J.A., The conversion of radioactive B-carotene into
vitamin A by the rat intestine in vivo, J. Biol. Chem. 2362 (1961) 349.
3. GOODMAN, D.S., Vitamin A metabolism, Federation Proc. 39 (1980)2716.
4. HEGERUD, P, PETERSON, L.B., and NORUM, K.R., Acyl CoA:retinol
aclyltransferase in rat small intestine: its activity and someproperties of the enzymic reaction, J.Lipid Res 23 (1982) 609.
5. HEGERUD, P, PETERSON, L.B., and NORUM, .K.R., Retinol esterification by microsome from the mucosa of human small
intestine;evidence for acyi-coenzyme A retinol acyl transferaseactivity, J. Clin. Invest. 71 (1982) 747.
6. MAC DONALD, P.N., and ONG, D.E., Evidence for a lecithin
retinol acyltransferase activity in the rat small intestine,J.Biol Chem. 263-25 (1988) 12478.
805
7. FUTTERMAN, S., and ANDREWS, J.S. The composition of livervitamin A ester and the synthesis of vitamin A ester by liver
microsome, J. BioI. Chem. 239-12(1964)4077
8. SKLAN, D., Carotene-cleavage activity in chick intestinal mucosa
cytosol:association with a high-moleculer-weight lipid-protein
aggregate fraction and partial characterization of the activity, British J. Nutr. 50 (1983)417
9. ROSS, A.C., Retinol esterification by rat liver microsome;evidence for a fatty acyl coenzyme A: retinol acytransferese.
J.Biol Chern. 257-5 (1982) 2453.
10. ONG, D.E., KAKKAD, B, and MAC DONALD, P.N., . Acyl-CoA-Inde
pendent esterification of retinol bound to cellular
retinol-binding protein (type II) by microsome from rat smallintestine, J.Biol.Chem 6(1987)2729
11. OGN, D.E., MAC DONALD, P.N., and GIBITOSI, A.M., Esterification
of retinol in rat liver; Possible participication by cellular
'retinol-binding protein and cellular retinol-binding proteinIL, J. BioI. Chern. 263-12 (1988) 5789.
12. YOST, R.W., HARRISON, E.H., and ROSS, A.C., Esterification byrat liver microsome os retinol bound to cellular retinol
binding protein, J. Biol.Chem 5(1989) 18693
806
20 C3-oo 2o,....
x-~a...o
o
A
5 is 25 35
Time (minute)
10- B0 00,....xc-'"
~C-O
o 60 120 240
Microsomal Protein f,ug}
-0._01::1,....
X-10~C-0;)
o30 60 120
Palmitoyl-CoA CuM)
00o-J
5D
f(E
2F-0.4
000 0o ':
,....,.... ..
ft~1X ;2
~c-C- O2
°01
aLl.,,. 0
10[) 37!;J50 2.55
261:1j!;
pH
Temperature r~C)Bovine Serum Albumin(mg/ml)
Gani>ar4. Pengaruh-penganil waktu (A); konsentrasi protein rnicrosorre(B); konsentrasi palrnitoyl-CoA(C); pH(D); suhu(EJ; clan. BSA(F). Setiap titik adalah nilai rata-rata hasil percobaan secara duplo yang telah dikoreksidengan kontrol dari inkti:>asi tanpa rnicrosorre atau rengan rnicrosorreyang telah dipanaskan