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Aus dem Medizinischen Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin
Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. H.W. Seyberth
Jetzt: Prof. Dr. R.F. Maier
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
AG Molekulare und Experimentelle Pharmakologie
Leiter: Prof. Dr. R.M. Nüsing
mRNA Expression elektrolytregulierender
Proteine an der Maus
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin
dem Fachbereich Medizin der
Philipps-Universität Marburg
vorgelegt
von
Christoph Michael Ludewig
aus Idstein
(geboren in Wiesbaden)
Marburg, 2007
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Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am: 23.10.2007 Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs Dekan: Prof. Dr. Maisch Referent: Prof. Dr. Nüsing 1. Korreferent: Prof. Dr. Gudermann
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung...................................................................................... 3
I.1. Bartter-Syndrom ............................................................................................. 3
I.1.1. Einführung................................................................................................ 3
I.1.2. Einteilung des Bartter-Syndroms ........................................................... 4
I.1.2.1. Beschreibung der Symptomatik....................................................... 4
I.1.2.2. Pathogenese........................................................................................ 7
I.1.2.2.1. Funktion und Eigenschaften der Ionen-Kanäle und -
Transporter................................................................................10
I.1.3. Therapie und Prognose.......................................................................... 15
I.2. Arachidonsäurestoffwechsel: Bedeutung der Cyclooxygenase und von
Prostaglandin-E2......................................................................................... 17
II. Material und Methoden ............................................................20
II.1. Material ........................................................................................................ 20
II.1.1. (Bio-) Chemikalien................................................................................ 20
II.1.2. Enzyme und Nucleinsäuren ................................................................. 20
II.1.3. Tiere, Tierfutter und Medikamente.................................................... 21
II.1.4. Instrumente und Apparaturen ............................................................ 21
II.1.5. Sonstige Materialien ............................................................................. 22
II.1.6. Software ................................................................................................. 22
II.2. Methoden ...................................................................................................... 23
II.2.1. Versuchsbedingungen und Präparation der Nieren.......................... 23
II.2.2. Isolierung und Quantifizierung von RNA .......................................... 24
II.2.3. DNAse-Verdau und Reverse Transkiption ........................................ 26
II.2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelelektrophorese ............. 28
III. Ergebnisse...................................................................................33
III.1. Verdünnungen ............................................................................................ 33
III.2. C57Bl6-Mäuse im Vergleich zu COX-2-/- und EP4-/- Mäusen: Expression
von Nierenproteinen ohne und mit Furosemidgabe................................ 37
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Inhaltsverzeichnis IV. Diskussion...................................................................................55
IV.1. Behandlung der Mäuse mit Furosemid: Modell für das antenatale
Bartter-Syndrom zur Untersuchung der Veränderungen von Protein-
expressionen in der Niere........................................................................... 55
IV.2. C57Bl6-Mäuse ohne und mit Furosemidbehandlung im Vergleich zu
COX-2-/- und EP4-/- Mäusen ...................................................................... 55
V. Zusammenfassung und Abstract..............................................71
V.1. Zusammenfassung........................................................................................ 71
V.2. Abstract......................................................................................................... 74
VI. Literatur
VII. Anhang
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Verzeichnis der Abkürzungen
Verzeichnis der Abkürzungen
A Ampere
AMP Adenosin-Monophosphat
ATP Adenosin-Triphosphat
BS Bartter-Syndrom
BSND BS with sensoneurinal Deafness (mit sensorineuronaler Taubheit)
°C Grad Celsius
cAMP cyclic-AMP (cyclisches-AMP)
CaSR calcium-sensible receptor (Calcium-sensibler Rezeptor)
CCD cortical collecting duct (kortikales Sammelrohr)
cDNA copy-DNA (kopierte-DNA)
Cl- Chlorid
ClC-K chloride-channel K (nierenspezifischer Chloridkanal K)
CNT connecting tubule (Verbindungstubulus)
COX Cyclooxygenase
DCT distal convolut (distales Konvolut)
DEPC Diethylpyrocarbonat
DNA Desoxyribonucleinsäure
dNTP Desoxyribonucleosidtriphosphat
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ENaC epithelialel Na-channel (epithelialer Natriumkanal)
EP E-Prostanoid
G Erdbeschleunigung
GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase
HCl Salzsäure
HPS Hyperprostaglandin-E2-Syndrom
HS Henle Schleife
JG juxtaglomerulär
K+ Kalium
KCC Kaliumchlorid Kotransporter
M Mol (Einheit)
MCD medullary collecting duct (medulläres Sammelrohr)
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Verzeichnis der Abkürzungen
Mg2+ Magnesium
mRNA messenger-RNA (Boten-RNA)
MQ-H2O deionisiertes Wasser (Milli-Q mittels Reinstwasser)
Na+ Natrium
NaCl Natriumchlorid
NCCT thiazide-sensitive NaCl Cotransporter
(Thiazid-senitiver NaCl Kotransporter)
Nedd-4 neuronal precusor cell expressed developmentally down-regulated 4
(aus neuronalen Vorläuferzellen exprimiertes entwicklungs-
geschichtlich herrunterreguliertes Protein 4)
NKCC Na-K-2Cl Cotransporter (Natrium-Kalium-2Chlorid Kotransporter)
NSAR nichtsteroidales Antirheumatikum
OMCD outer medullary collecting duct (äußeres medulläres Sammelrohr)
PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PGE2 Prostaglandin-E2
PGH2 Prostaglandin-H2
R2 lineare Regression
RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
RNA Ribonucleinsäure
ROMK renal outer medullary K (renaler Kalium Kanal des äußeren Marks K)
RT reverse Transkription
SGK Serum-Glucocorticoid regulierte Kinase
SLT salt losing tubolopathie (Salzverlusttubulopathie)
TAE Tris-Eisessig-EDTA
TAL thick ascending loop of Henle
(dicker aufsteigender Ast der Henle Schleife)
tAL thin ascending loop of Henle
(dünner aufsteigender Ast der Henle Schleife)
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
U Unit (Einheit)
UE Untereinheit
UV ultra-violett
V Volt
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Einleitung 3
I. Einleitung Die Einleitung befasst sich mit dem Bartter-Syndrom und den verschiedenen
Formen, dieser angeborenen Nierenerkrankung. Im Mittelpunkt stehen hierbei die
Elektrolytveränderungen und somit die jeweilige Expression der dafür verant-
wortlichen Ionen-Kanäle der Niere. Im Zusammenhang damit ist auch die
Prostaglandinbildung und deren Enzym Cyclooxygenase von Bedeutung.
I.1. Bartter-Syndrom
I.1.1. Einführung Die erste Beschreibung des Hyperprostaglandin-E2-Syndroms stammt aus dem Jahr
1957, als die amerikanischen Pädiater Rosenbaum und Hughes einen 2 Monate alten
Säugling beobachteten, der unter ausgeprägter Gedeihstörung, Dehydratation,
sporadisch auftretender Diarrhoe, therapieresistenter hypokalämischer Alkalose,
renalem Konzentraionsdefizit und Hyperkaliurie litt und mit 7 ½ Monaten in
extremer Dystrophie verstarb (Rosenbaum, Hughes, 1957).
5 Jahre später wurden durch Bartter et al. zwei ähnliche Fälle veröffentlicht, bei
denen zusätzlich eine hohe Aldosteron- und Reninaktivität nachgewiesen wurde, was
Bartter zu der Vermutung veranlasste, es könne sich um eine Angiotensin-II-
Resistenz mit kompensatorischer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-
Systems handeln, da zusätzlich der juxtaglomeruläre Apparat und die Macula densa
der Niere hypertrophiert waren (Bartter et al. 1962). Seitdem wurde bei Krankheits-
bildern mit hypokalämischer Alkalose und Hyperaldosteronismus kombiniert mit
Normotension vom Bartter-Syndrom gesprochen. Weitere Fälle führten zu einer
Differenzierung dieses Krankheitsbildes.
So hatten von Gitelman et al. im Jahr 1966 beschriebene Patienten eine erhöhte
Krampfbereitschaft mit Hypomagnesiämie und Hypokalzurie (Gitelman et al. 1966).
1971 publizierten Fanconi et al. 2 umfassende Fälle, die zu dem bestehenden
Symptomenkomplex noch Hyperkalziurie mit Nephrokalzinose und Osteopenie
aufwiesen. Auffällig war bei diesen Kindern außerdem ein in der Schwangerschaft
aufgetretenes Polyhydramnion (Fanconi et al. 1971).
Seyberth et al. beschrieben dieses Krankheitsbild mit Polyurie und einem
lebensbedrohlichen Salzverlust, assoziiert mit vermehrter Prostaglandinbildung
(Seyberth et al. 1985).
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Einleitung 4
In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, auf der Ebene von Kanalproteinen in der
Niere, die weiter unten beschriebenen pathogenetischen Modelle zu spezifizieren
bzw. genauere Aussagen über deren Regulation zu machen. Daher wurde zunächst
nach einem geeigneten Tiermodell gesucht. Takahashi et al. stellten 2000 ein Modell
vor, mit dem es möglich ist, das antenatale Bartter-Syndrom bei Mäusen zu
simulieren. Sie verglichen zu diesem Zweck Mäuse, bei denen durch homologe
Rekombination das Gen des NKCC2-Kotransporters (Slc12a1) inaktiviert wurde, mit
Mäusen, die das Schleifendiuretikum Furosemid erhielten, das den NKCC2-
Kotransporter inaktiviert. Da die Neugeborenen NKCC2-/- Mäuse bereits vor der
Entwöhnung verstarben, wurde der Versuch unternommen, sie mithilfe des COX-
Hemmers Indomethacin am Leben zu erhalten. Da dies erfolgreich war, konnten nun
die erwachsenen NKCC2-/- Mäuse mit den mit Furosemid behandelten, Wildtyp
Mäusen verglichen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Nierenparameter
beider Tiergruppen ähnlich waren, so dass das durch den Slc12a1-Gendefekt
hervorgerufene antenatale Bartter-Syndrom durch die Behandlung von Mäusen mit
Furosemid simuliert werden kann (Takahashi et al. 2000).
I.1.2. Einteilung des Bartter-Syndroms
I.1.2.1. Beschreibung der Symptomatik Da es sich beim Bartter-Syndrom nur um einen Überbegriff für die hereditären
Salzverlust-Tubulopathien handelt, waren bald weitere Unterteilungen nötig. Die
Nomenklatur erfolgte nach klinischen Symptomen, biochemischen Merkmalen sowie
der vermuteten Pathogenese.
Klinisch ist die Unterteilung in das antenatale und das klassische Bartter-Syndrom,
sowie das Gitelman-Syndrom sinnvoll (reviewed in Naesens et al. 2004).
Das antenatale Bartter-Syndrom (Bartter-Syndrom Typ I, II, IV, nach Hebert et al.
2003; auch Hyperprostaglandin-E2-Syndrom, nach Seyberth et al. 1985) ist durch ein
Polyhydramnion, Polyurie, sowie Polydypsie gekennzeichnet, wodurch es zu
lebensbedrohlichen Dehydratationen kommen kann. Obwohl die Nierenfunktion
oftmals gut erhalten ist, kommt es häufig zu Hyperkalziurie und Nephrokalzinose
(reviewed in Naesens et al. 2004).
Das klassische Bartter-Syndrom (Bartter-Syndrom Typ III) beginnt in den ersten
zwei Lebensjahren, oftmals erfolgt die Diagnose allerdings wesentlich später. Die
Patienten haben ebenfalls Polyurie und Polydypsie und tendieren daher zur
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Einleitung 5
Dehydratation. Ohne Behandlung sind Entwicklungsstörungen häufig. Biochemisch
handelt es sich um eine hypokalämisch, hypochlorämische metabolische Alkalose,
nahezu ohne Nephrokalzinose, da die Ausscheidung von Calcium im Urin nur
unwesentlich erhöht ist (reviewed in Naesens et al. 2004). Hingegen ist die
Hypokaliämie hier besonders stark ausgeprägt.
Beim antenatalen und klassischen Bartter-Syndrom sind zudem eine verminderte
Ausschüttung von Vasopressoren, Hyperplasie des juxtaglomerulären Apparates,
Thrombozytenaggregationsstörung und eine erhöhte Prostaglandin-E2 (PGE2)
Ausscheidung im Urin beobachtet worden (reviewed in Naesens et al. 2004).
Interessanterweise findet sich allerdings keine Erhöhung von PGE2 im Blut, wohl
aber in anderen Geweben (Seyberth et al. 1994). Weiterhin ist bei diesen Patienten
das Natrium intrazellulär erhöht, was durch eine erhöhte Membranpermeabilität
erklärbar ist (reviewed in Naesens et al. 2004).
Das Gitelman-Syndrom ist die mildeste Form des Bartter-Syndroms und wird daher
oft erst im Erwachsenenalter durch eine milde Hypokaliämie und Alkalose entdeckt.
Allerdings sind auch Fälle von Muskelschwäche, über regelmäßige Muskelkrämpfe
bis hin zur Tetanie aufgetreten. Weitere Symptome sind nächtlicher Harndrang,
Polydipsie, Polyurie, Durst, Hypotonie, Schwindel, Salzmangel, nächtliches Ein-
nässen. Ausserdem sind Gelenkschmerzen durch Chondrokalzinose bekannt. Bio-
chemisch handelt es sich ebenfalls um eine hypokalämisch metabolische Alkalose,
aber nicht verbunden mit einer Hyperkalziurie wie bei den anderen beiden Formen,
sondern kombiniert mit einer Hypokalziurie (reviewed in Naesens et al. 2004).
Zusätzlich kommt es zu einer hypermagnesiurischen Hypomagnesiämie, wodurch
sich auch die Muskelbeschwerden erklären lassen.
Eine vierte Form mit sensorischer Taubheit ist ebenfalls beschrieben (Landau et al.
1995).
In diesem Zusammenhang ist auch der autosomal-rezessiv vererbte Pseudohypo-
aldosteronismus Typ 1 zu nennen, bei dem es sich ebenfalls um eine Salzverlust-
tubulopathie handelt. Diesem liegt der Defekt des epithelialen Natriumkanals
(ENaC) zugrunde und die Symptome ähneln der Wirkung von Amilorid. Es kommt
also biochemisch zu Hyponatriämie, Hyperkaliämie und hyperchlorämischer meta-
bolischer Azidose.
Eine weitere Krankheit, bei der es sich ebenfalls um einen Defekt des ENaC-Kanals
handelt, ist das Liddle Syndrom. 1963 von Liddle et al. das erste mal als autosomal
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Einleitung 6
dominantes Syndrom beschrieben, ist es durch früh einsetzenden schweren Hyper-
tonus, Hypokaliämie, sowie metabolische Alkalose und supprimierte Plasma Renin
Aktivität und Aldosteron Level gekennzeichnet (Liddle et al. 1963; Warnock, 1998).
Neben dieser klinisch orientierten Einteilung ist es wichtig, die Pathogenese zu
verstehen, die in Tabelle 1 dargestellt ist.
Tabelle 1 Klassifikation der hereditären Salzverlusttubulopathien mit hypokalämischer Alkalose (modifiziert nach Naesens et al. 2004)
Klassifikation Gen/ Chromosom
Transport-defekt
Lokalisation Funktion
Bartter-Syndrom Typ I
(Furosemid-SLT)
antenatales BS
SLC12A1
15q15-21
NKCC2 TAL Na+-Cl- -
Wiederaufnahme
TAL
K+ Versorgung
(NKKC2)
Bartter-Syndrom Typ II
(Furosemid-SLT)
antenatales BS
KCNJ1
11q24-25
ROMK
CCD renale Ausscheidung
von K+
TAL Cl- - Wiederaufnahme
distaler
Tubulus
Cl- - Wiederaufnahme
Bartter-Syndrom Typ III
(Furosemid-Thiazid-SLT)
klassisches BS
CLCNKB
1p36
ClC-Kb
CCD Cl- - Wiederaufnahme
tAL β-UE (ClC-Ka)
TAL β-UE (ClC-Kb)
BSND
1p31
Barttin
vaskuläre Stria β-UE (ClC-Ka/Kb)
Bartter-Syndrom Typ IV
(Furosemid-SLT)
antenatales BS
Cl- - Wiederaufnahme
CLCNKA
CLCNKB
1p36
ClC-Ka
ClC-Kb
tAL
TAL → CCD Cl- - Wiederaufnahme
Bartter-Syndrom Typ V
(Furosemid-SLT)
antenatales BS
CASR
3q13.3-q21
CaSR TAL Hemmung NKCC2,
ROMK und Na+-K+-
ATPase
Gitelman-Syndrom
(Thiazid-SLT)
SLC12A3
16q13
NCCT distaler
Tubulus
Na+-Cl- -
Wiederaufnahme
SLT = Salzverlusttubulopathie; NKCC2 = Na+-K+-2Cl--Kotransporter; ROMK = K+-Kanal; ClC = Cl--Kanal; CaSR = Ca2+-sensibler Rezeptor; NCCT = Na+-Cl--Kotransporter; TAL = Dicker aufsteigender Ast der Henle Schleife; tAL = Dünner aufsteigender Ast der Henle Schleife; CCD = Kortikales Sammelrohr; HS = Henle Schleife; UE = Untereinheit
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Einleitung 7
I.1.2.2. Pathogenese
Um die Pathogenese zu verstehen, ist es erforderlich, sich das Zusammenspiel der
verschiedenen Ionenkanäle in der Niere anzusehen (s. Abb. 1 und 2).
Abb. 1a: Ionenkanäle der Niere Abb. 1b: Ionenkanäle der Niere (distaler Tubulus) (distaler Tubulus /Sammelrohr)
Zelle Interstitium Lumen
3 Na+
2 K+
Na+-K+-ATPase
K+
Cl -
KCC 1, 3, 4
Cl - ClC-K BS Typ III
Barttin BS Typ IV
K+ 2 Cl -
Na+
NKCC 2 BS Typ I
K+
ROMK-2 BS Typ II
Ionenkanal
Ionenkanal
Interstitium Interstitium
passiver Transport aktiver Transport
aktiver Transport
3 Na+
2 K+
NCCT GitelmanSyndrom
Na+
Cl -
Zelle ZelleLumen Lumen
ROMK
K+
Na+
3 Na+
2 K+
Na+-K+-ATPase
Na+-K+-ATPase
ENaC α, β, γ
NEDD-4
Cl -
Chlorid-Kanal
passiver Transport
aktiver Transport
Abb. 2: Nephron (schematisch) Abb. 1c: Ionenkanäle der Niere (TAL)
Wie in Tabelle 1, sowie den Abbildungen 1c und 2 ersichtlich, ist der Gendefekt
beim Bartter-Syndrom Typ I - IV vor allem im dicken aufsteigenden Ast der Henle-
Schleife lokalisiert.
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Einleitung 8
Da der Wirkstoff Furosemid ebenfalls in diesem Bereich ansetzt (Blockade des Na+-
K+-2Cl--Kotransporters (NKCC2)), werden diese Syndrome auch als Furosemid-
ähnliche-Salzverlusttubulopathien bezeichnet. Bilanzierend lässt sich sagen, dass die
in Abbildung 1c angeführten Kanäle für den Transport von Natriumchlorid aus dem
Tubuluslumen ins Interstitium zuständig sind, der für die Harnkonzentrierung
essentiell ist. Treibende Kraft ist hierbei die Na+-K+-ATPase, die unter Energie-
aufwand Natrium aus der Zelle ins Interstitium transportiert. Somit entsteht ein
Gradient, über den der Na+-K+-2Cl--Kotransporter Natrium zusammen mit Chlorid
und Kalium aus dem Tubulus in die Zelle transportiert. Der Defekt des Gens
SLC12A1 führt dazu, dass NKCC2 seine Funktion verliert (Bartter-Syndrom Typ I).
Wichtig ist außerdem, dass dieser Gradient auch aufrechterhalten wird, dazu muss
das Kalium wieder aus der Zelle gelangen, was über den luminalen K+-Kanal ROMK
(renal outer-medullary K+) möglich ist. Kalium muss deshalb zurück ins Lumen, weil
es dort eine wesentlich niedrigere Konzentration als Natrium und Chlorid hat und
deshalb der begrenzende Faktor für den Na+-K+-2Cl--Kotransporter ist. Dieses
System bricht zusammen, wenn, wie beim Bartter-Syndrom Typ II, die Funktion von
ROMK ausfällt (Defekt des Gens KCNJ1). Weiterhin wird Chlorid basolateral aus
der Zelle ins Interstitium transportiert, was entweder über einen Kalium-Chlorid
Kotransporter (KCC1-4) oder über einen Chlorid-Kanal (ClC-Kb), (Defekt des Gens
CLCNKB beim Bartter Syndrom Typ III, typisches Bartter-Syndrom) abläuft. Barttin
hingegen stimuliert den ClC-Ka und ClC-Kb Kanal, daraus erklären sich die
Symptome des Bartter Syndroms Typ IV (Mutation des Barttin Gens BSND), das
zusätzlich mit Taubheit verbunden ist (reviewed in Naesens et al. 2004). Ebenfalls
mit Taubheit verbunden ist ein von Schlingmann et al. beschriebener Fall, bei dem
ein Kind eine ähnliche Symptomatik zeigte, wie beim Bartter Syndrom Typ IV.
Hierbei handelt es sich allerdings um einen kombinierten Defekt der Gene CLCNKA
und CLCNKB und dementsprechend einen Ausfall der Kanäle ClC-Ka und ClC-Kb,
ohne dass das Barttin-Gen BSND betroffen ist (Schlingmann et al. 2004). Chlorid
führt durch seinen Gradienten über der Zellmembran dazu, dass Magnesium und
Calcium passiv interzellulär vom Lumen ins Interstitium folgen. Außerdem ist
Chlorid wichtig, um die Elektronenbilanz neutral zu halten, das heißt, wird es durch
die Blockade von ClC-K nicht ins Interstitium transportiert, ist auch weniger
Natrium-Resorption möglich.
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Einleitung 9
Beim Bartter-Syndrom Typ V (in der Abb. nicht gezeigt) handelt es sich um einen
Defekt des extrazellulären Calcium-Ionen sensitiven Rezeptor (CaSR). Dieser ist G-
Protein gekoppelt und reagiert auf erhöhte extrazelluläre Konzentrationen von
Calcium, indem er NKCC2, ROMK und die Na+-K+-ATPase hemmt. Der Kanal
befindet sich auf der basolateralen Seite des dicken aufsteigenden Astes der Henle-
Schleife (reviewed in Hebert, 2003).
Die verminderte Resorption von Natrium-Chlorid beim Bartter- sowie auch beim
Gitelman-Syndrom (s.u.) erklärt auch die spätere Hypokaliämie, denn wenn Natrium
in der Henle-Schleife und dem distalen Tubulus nicht ausreichend resorbiert wird,
muss der Natrium-Verlust im Sammelrohr durch einen Natrium-Kalium Austausch
ausgeglichen werden. Dies ist aber nicht im vollen Umfang möglich, da hier
normalerweise nur noch die Feinregulation stattfindet.
Als weiteres Krankheitsbild ist das Gitelman-Syndrom bekannt. Hierbei ist der
NCCT-Transporter (Na+-Cl--Kotransporter) defekt (s. Abb. 1a), was zu Symptomen
führt, die einer Behandlung mit Thiazid-Diuretika (daher auch Thiazid-ähnliche
Salzverlusttubulopathie) ähneln, die ebenfalls an diesem Transporter ansetzen. Da
der Mechanismus über NCCT nur für 7 % der Natrium-Ausscheidung über die Niere
verantwortlich ist (Naesens et al. 2004), erklärt sich die relative milde Ausprägung
der Bartter-Symptomatik. NCCT ist im distalen Tubulus des Nephrons lokalisiert
und fördert die Resorption von Natrium und Chlorid vom Lumen des Tubulus ins
Interstitium.
Die biochemischen Parameter des autosomal-rezessiv vererbten Pseudohypoaldo-
steronismus Typ 1 erklären sich durch den Defekt des epithelialen Natriumkanals
(ENaC) im Sammelrohr (s. Abb. 1b). Hier ist die Resorption von Natrium aus dem
Lumen ins Interstitium nicht mehr möglich, und somit findet die Kaliumsekretion,
die dem elektrochemischen Ausgleich dient, auch nicht mehr statt. Daraus folgt, dass
im Gegensatz zum Bartter-Syndrom beim Pseudohypoaldosteronismus Typ 1 eine
Hyperkaliämie vorliegt.
Genau umgekehrt verhält es sich beim Liddle Syndrom, bei dem der ENaC Kanal
zwar ebenfalls mutiert, jedoch in diesem Fall vermehrt vorhanden ist (s. Abb. 1b). Es
wird somit gesteigert Natrium rückresorbiert, und es kommt im Gegenzug zur ver-
mehrten Kaliumsekretion. Durch die vermehrte Natriumwiederaufnahme wird auch
Wasser aus dem Tubulus reabsorbiert und es kommt zum Hypertonus.
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Einleitung 10
I.1.2.2.1. Funktion und Eigenschaften der Ionen-Kanäle und -Transporter
Na+-K+-ATPase:
Die Funktion der Na+-K+-ATPase in der Niere besteht darin, Natrium im Austausch
mit Kalium aus der Zelle ins Interstitium zu transportieren. Dies ist im Bezug auf die
Niere vor allem für die Natrium-Reabsorption essentiell.
Die Na+-K+-ATPase besteht aus verschiedenen Untereinheiten, bekannt sind die
α,β,γ-Untereinheit (UE). Die minimale funktionale Einheit besteht aus einer α (1-4)
und einer β (1-3) Einheit (reviewed in Blanco, Mercer 1998), wobei α die
funktionale Einheit und β für die Struktur essentiell ist (Hasler et al. 1998). Die
kleine γ UE ist in manchen Nierenabschnitten vorhanden und moduliert die Kinetik
der Pumpe (Crambert, Geering 2003). α1 scheint die hauptsächliche oder einzige
Untereinheit zu sein, die entlang des Nephrons exprimiert wird (Lucking et al. 1996).
Aldosteron wirkt in der Niere am Aldosteron-sensitiven distalen Nephron, dem
Verbindungs-Tubulus und dem Sammelrohr. Summa et al. wiesen nach, dass die
Wirkung von Aldosteron auf die im Sammelrohr befindliche Na+-K+-ATPase, also
vermehrte Expression, mit der α1-UE verknüpft ist. (Summa et al. 2003).
ClC-K:
Es gibt 2 ClC-K Chlorid Transporter, die in der Niere vorkommen, ClC-K1 (bei der
Maus; entspricht dem menschlichen Ka) und ClC-K2 (bei der Maus; entspricht dem
menschlichen Kb, Lokalisation auf Chromosom 1p36, Gen CLCNKB (Saito-Ohara
et al. 1996)). Obwohl sich beide strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sie sich
in ihrer Lokalisation innerhalb der Niere.
ClC-K1 wird im dünnen aufsteigenden Ast der Henle-Schleife exprimiert, findet sich
aber auch in anderen Regionen des distalen Nephrons (Waldegger et al. 2002).
ClC-K2 befindet sich vor allem im distalen Nephron (dicker aufsteigender Ast der
Henle-Schleife) an der basolateralen Membran (Yoshikawa et al. 1999) und spielt
dort bei der Chlorid Resorption eine wichtige Rolle. Beim Defekt des ClC-K2
kommt es zum klassischen Bartter-Syndrom. Dieses ist weniger schwer ausgeprägt,
als die antenatalen Formen. So führt das Bartter-Syndrom Typ IV (Defekt des
BSND-Gens) zu einem wesentlich schwereren Krankheitsbild. Bei diesem Typ ist
das Protein Barttin, ein Stimulator für ClC-K1 und K2, betroffen. Daraus lässt sich
schließen, dass ClC-K1 einen zusätzlichen Effekt, im Vergleich zum reinen ClC-K2
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Einleitung 11
Ausfall beim klassischen Bartter-Syndrom, für die Ausprägung der Krankheit hat.
(Waldegger et al. 2002). Das gleiche gilt für den von Schlingmann et al. beschrie-
benen Fall, bei dem die Gene von ClC-Ka und ClC-Kb unabhängig voneinander
mutiert waren (Schlingmann et al. 2004).
ClC-K1 ist für die hohe Chlorid-Permeabilität im dünnen aufsteigenden Ast der
Henle-Schleife verantwortlich und ist somit notwendig für die Urinkonzentrierung,
ClC-K1-/- Mäuse weisen einen Defekt in der Fähigkeit auf den Urin zu konzentrieren
(Uchida, 2000). Wolf et al. zeigten an Ratten, dass Furosemid die ClC-K1 mRNA
Expression in der inneren Medulla der Niere um die Hälfte vermindert. Parallel dazu
veränderte sich das Barttin. Dies weist auf den Versuch hin, über diesen Mecha-
nismus die Wasser- und Salz-Homöostase zu erhalten (Wolf et al. 2003).
ROMK:
Die ROMK-Kanäle (renal outer-medullary K+) gehören zur Familie der ATP-
regulierten-einwärtsgerichteten-niedrigspannungs K+-Kanäle, die vor allem für die
Kalium Sekretion von Bedeutung sind (Giebisch, 1995). Beim Menschen sind fünf
Formen des ROMK-Proteins bekannt, die durch Splicing des gleichen Gens
entstehen (Shuck et al. 1994). Diese Kanäle sind vor allem im dicken aufsteigenden
Ast der Henle Schleife und im kortikalen Sammelrohr lokalisiert. In der Henle
Schleife wird das Kalium auf der apikalen Seite durch ROMK aus der Zelle trans-
portiert, um den elektrochemischen Gradienten für den Na+-K+-2Cl--Kotransporter
aufrechtzuerhalten, zusätzlich fördert das entstehende lumenpositive Membranpoten-
tial die Reabsorption von Magnesium und Calcium auf dem parazellulären Weg. Im
Sammelrohr ist ROMK an der Kaliumsekretion aus der Zelle ins Lumen beteiligt
(Frindt et al. 1989). Das entsprechende Gen ist KCNJ1 und liegt auf Chromosom
11q24-25 (Simon et al. 1996; Károlyi et al. 1997). Es ist beim Bartter-Syndrom Typ
II geschädigt.
NKCC2:
Der bumetanide-sensitive Na+-K+-2Cl--Kotransporter (NKCC) gehört in die Familie
der Kation-Cl--Kotransporter. In der NKCC Gruppe gibt es zwei Isoformen: NKCC1,
ein weit verbreiteter Karrier, der auf der basolateralen Seite von polarisierten Zell-
Typen exprimiert wird (Haas, Forbush III, 2000; Lytle et al. 1995; Mount et al. 1998)
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Einleitung 12
und NKCC2, ein nierenspezifischer Karrier, der an der luminalen Membran des
dicken aufsteigenden Astes der Henle Schleife sowie in der Macula Densa vorkommt
(Mount et al. 1999; Nielsen et al. 1998; Obermuller et al. 1996). Das entsprechende
Gen ist das SLC12A1 auf Chromosom 15q15-21 (reviewed in Naesens et al. 2004)
und ist beim Bartter Syndrom Typ I geschädigt. Der Ionentransport von NKCC
beträgt, abgesehen vom Tintenfisch-Axon, immer 1 Natrium, 1 Kalium und 2
Chlorid. Im Zusammenspiel mit dem ROMK-Kanal, der das Kalium „recycled“,
sowie der Na+-K+-ATPase, die den Gradienten für Natrium aufrechterhält und dem
Chlorid-Kanal (ClC-K), über den Cl- die Zelle verlassen kann (Abb. 1c), ist NKCC2
für die Nettoresorption von Natriumchlorid aus dem Tubuluslumen der Niere nach
basolateral verantwortlich. Somit ist er ein wichtiger Baustein für die Konzen-
trierungsfähigkeit der Niere. PGE2 kann über den EP3-Rezeptor und ein inhibitor-
isches G-Protein die Adenylatcyclase hemmen, was zu einer erniedrigten Konzen-
tration von cAMP führt und somit die NKCC2 Expression hemmt (reviewed in
Shankar, Brater 2003). Schleifendiuretika, wie Furosemid, blockieren den NKCC2
Karrier und verhindern somit eine effektive Konzentrierung des Harns.
NCCT:
Der Thiazide-sensitive Natriumchlorid-Kotransporter (NCCT) ist vom Gen
SLC12A3 auf Chromosom 16q13 kodiert, das beim Gitelman-Syndrom geschädigt
ist (Simon et al. 1996; Lemmink et al. 1998). Es sind verschiedene Mutationen dieses
Gens bekannt (Lemmink et al. 1998). Dieser Kanal wird im distalen gewundenen Tu-
bulus exprimiert (Plotkin et al. 1996) und ist dort an der Natriumchlorid-Resorption
beteiligt (Abb. 1a). Durch eine basolaterale Na+-K+-ATPase wird die intrazelluläre
Natriumkonzentration niedrig gehalten und bildet somit einen Gradienten für Na-
trium vom Lumen in die Zelle, durch den der Na+-Cl--Kotransporter (NCCT) ange-
trieben wird. Das Chlorid kann durch einen basolateralen Chloridtransporter wieder
aus der Zelle entweichen, so dass eine Netto Natrium-chlorid-Resorption besteht.
Beim NCCT handelt es sich somit um einen elektroneutralen Ionentransporter.
KCC:
Die Kaliumchlorid-Kotransporter (KCC) gehören zur Familie der anorganischen,
elektroneutralen Kationen-chlorid Kotransporter, zu der auch der Na+-K+-2Cl--Ko-
transporter (NKCC) und der NaCl-Kotransporter (NCC) gehören (Holtzman et al.
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Einleitung 13
1998). Es sind vier verschiedene KCC-Kanäle (KCC1-4) bekannt. KCC1 kommt in
vielen Geweben, auch in der Niere, vor (Gillen et al. 1996; Kumar et al. 1996),
KCC2 ist neuronal exprimiert (Payne 1997; Payne et al. 1996). Das entsprechende
Gen liegt auf Chromosom 16q22.1 (Gillen et al. 1996; Frengen et al, 1995). KCC3
liegt auf Chromosom 5p15.3 und ist ebenfalls weit verbreitet, vor allem aber in Herz
und Niere. KCC4 hingegen, der in Muskel, Gehirn, Lunge, Herz und Niere
exprimiert wird, liegt auf Chromosom 15q14 (Mount et al. 1999). KCCs werden
nicht vom Mebranpotential beeinflusst, jedoch aktiviert, wenn die Zelle in einem
hypotonen Zustand ist und fungieren somit als Volumenregulatoren, da sie durch
Ionenausschleusung aus der Zelle auch das Volumen vermindern (Cossins, Gibson,
1997; Lauf et al. 1992). Außerdem sprechen sie auf die Diuretika Bumetanide und
Furosemid an, allerdings mit einer niedrigeren Affinität als NKCC (Gillen et al.
1996; Payne, 1997). Die Expression der Kanäle KCC1, 3, 4 erfolgt entlang des
gesamten Nephrons, einschließlich des Glomerulus (Liapis et al. 1998). Im dicken
aufsteigenden Ast der Henle Schleife ist der Kaliumchlorid-Kotransport auf der
basolateralen Seite lokalisiert und ist somit an der Natriumchloridresorption dieses
Teils des Nephrons beteiligt (Greger, Schlatter, 1983).
ENaC, Nedd-4, SGK:
Der Amilorid-sensitive ephiteliale Natrium-Kanal (ENaC) reguliert viele physiolo-
gische Funktionen im distalen Kolon, dem Lungenepithel, den Gangzellen der exo-
krinen Drüsen und auch im distalen Nephron (reviewed in Garty, Palmer, 1997).
Dort wird er in der zweiten Hälfte des distalen Konvoluts (DCT2), im
Verbindungstubulus (CNT), im kortikalen Sammelrohr (CCD) und im medullären
Sammelrohr (MCD) exprimiert, wobei es im distalen Konvolut eine Überschneidung
mit dem thiazid-sensitiven Natriumchlorid-Kotransporter (NCC) gibt (Duc et al.
1994; Schmitt et al. 1999; Loffing et al. 2000). Diese relativ breite Überschneidung
gilt aber nur für die Maus und die Ratte, beim Menschen ist ENaC nur in einem
kleineren Stück im distalen Konvolut angesiedelt, die Überschneidung ist also
geringer, beim Hasen kommt ENaC im DCT überhaupt nicht vor (Biner et al. 2002).
ENaC nimmt an der Feinregulation der Natriumreabsorption teil, die u.a. durch die
Hormone Vasopressin, das Mineralkortikoid Aldosteron, sowie Insulin und
Proteasen vermittelt wird (Kemendy et al. 1992; Kleyman et al. 1994; Marunaka et
al. 1992; Vallet et al. 1997). Außerdem wird die ENaC Aktivität von intrazellulären
Page 18
Einleitung 14
Ionen, wie etwa Natrium, Calcium oder Wasserstoff gesteuert (Awayda, 1999;
Chalfant et al. 1999; Palmer, Frindt, 1987; Loffing et al. 2000). Es gibt drei
homologe Untereinheiten: α-, β- und γ–ENaC, die zusammen den Kanal bilden, fehlt
die α-Untereinheit, gibt es keinen Ionenfluss, fehlen β- oder γ– Untereinheit, ist der
Fluss erniedrigt (Canessa et al. 1994). Die α-Untereinheit liegt beim Menschen auf
Chromosom 12p13.3. Die β- und γ-Untereinheiten sind beide auf Chromosom
16p12-p13 lokalisiert (reviewed in Gormley et al. 2003). Letztere kommen in
Vesikeln vor und werden dann in die apikale Zellmembran eingebaut. Die α-
Untereinheit kommt nicht in Vesikeln vor, was für eine unabhängige Regulation der
α-Untereinheit gegenüber den β- und γ-Untereinheiten spricht (Hager et al. 2001).
Beim Typ I Pseudohypoaldosteronismus, einer Krankheit, die durch Volumen-
verringerung und Hypotonie charakterisiert ist, wurde eine Mutation einer ENaC
Untereinheit nachgewiesen (Chang et al. 1996), ebenso beim Liddle-Syndrom, das
durch Volumenvergrößerung und Hypertonie gekennzeichnet ist (Hansson et al.
1995; Shimkets et al. 1994).
Ein erst vor kurzer Zeit entdeckter Regulationsmechanismus läuft über die Proteine
Nedd4 und SGK 1 ab.
Nedd4 (neuronal precusor cell expressed developmentally down-regulated 4) ist ein
Protein, das im embryonalen Mäusegehirn in hoher Konzentration vorliegt, während
der Entwicklung jedoch herrunterreguliert wird. Exprimiert wird es, zusammen mit
ENaC, in den Hauptzellen von kortikalem (CCD) und äußerem medullären
Sammelrohr (OMCD) des distalen Nephrons, aber auch in den Atemwegen und in
distalen Lungenepithelien (Staub et al. 1997).
Es gibt zwei Nedd4-Formen in der Maus, mNedd4-1 und mNedd4-2 (Kamynina et
al. 2001), die humane Homologe haben hNedd4-1 (Chromosom 15q21.1) und
hNedd4-2 (Chromosom 18q21), beide haben eine Hect-Domäne, die als ubiquitin-
protein Ligase fungiert und vier WW-Domänen, die für die Verbindung mit dem PY-
Muster von ENaC verantwortlich sind (reviewed in Gormley et al. 2003). Durch
diese Verbindung kommt die Hect-Domäne in die Nähe des ENaC-Kanals und dieser
kann dadurch mit Ubiquitin markiert (‚ubiquitiniert’), endozytiert und lyso-
somal/proteosomal abgebaut werden (Malik et al. 2001). Nedd4-2 scheint allerdings
funktionell wichtiger in der ENaC Regulierung in vivo zu sein (Kamynina et al.
2001). Beim Liddle Syndrom kommt es zu einer Deletion des PY-Musters, an dem
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Einleitung 15
die WW Domäne des Nedd4 ansetzt. Es wird vermutet, dass der fehlende Abbau von
ENaC über Nedd4 der Grund für die erhöhte ENaC Dichte ist (Staub et al. 1996).
Ein weiteres Protein, das in die Regulation des epithelialen Natriumkanals eingreift,
ist die SGK (Serum- und Glucocorticoid-regulierte Kinase). Es sind drei Formen
bekannt, SGK 1 liegt auf Chromosom 6q23, SGK 2 und SGK 3 auf Chromosom 20
und 18 (reviewed in Gormley et al.), wobei nur SGK 1 in der ENaC-Regulation eine
Rolle zu spielen scheint, da sowohl mRNA als auch Protein innerhalb der ersten 30
min. nach Aldosteronbehandlung, durch vermehrte Genexpression, induziert werden
(Chen et al. 1999; Naray-Fejes-Toth, Fejes-Toth, 2000). Es wird vermutet, dass SGK
nicht nur direkt auf ENaC wirkt, sondern auch indirekt über ein PY-Muster mit
hNedd4-2 interagiert, indem es dieses phosphoryliert und damit inaktiviert und somit
den Abbau des ENaC Kanals reduziert (Snyder et al. 2002).
I.1.3. Therapie und Prognose
Da eine Heilung dieser Krankheiten nicht möglich ist, kann es bei der Therapie
bisher nur darum gehen, die Symptomatik so gut wie möglich zu beherrschen.
Wichtig bei allen Formen des Bartter-Syndroms ist vor allem eine ausreichende Salz-
und Flüssigkeitszufuhr, die gegebenenfalls auch parenteral erfolgen muss.
Da vor allem beim antenatalen Bartter-Syndrom das Hyperprosaglandin-E2 massiv
erhöht ist, ist die Therapie mit einem Cyclooxygenase(COX)-Hemmer angezeigt.
Dieser kann die pathologisch erhöhte Diurese um bis zu 50 % erniedrigen (Seyberth
et al. 1985; Köckerling et al. 1996; Nüsing et al. 2001; Reinalter et al. 2002).
Besonders gut eignet sich hier Indomethacin, das weniger gastrointestinale
Nebenwirkungen hat als die anderen nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAR) und
das den Hyperprostaglandin-E2-Spiegel besser senkt als diese (Seyberth et al. 1994).
Nebenwirkungen dieser Therapie sind vorübergehender Haarausfall, aber vor allem
das Maskieren von Infektionskrankheiten durch das ausbleibende Fieber (Seyberth et
al. 1994). Zusätzlich muss der Kaliumspiegel im Plasma kontrolliert werden und bei
Hypokaliämie entsprechend Kalium substituiert werden. Beim Gitelman-Syndrom ist
es außerdem angebracht, die Hypomagnesiämie durch eine Therapie mit Magne-
siumpräparaten wenigstens teilweise zu beheben (Köckerling et al. 1998).
Die Prognose des antenatalen Bartter-Syndrom hängt entscheidend vom Grad der
Frühgeburtlichkeit, sowie der Optimierung des perinatalen Managements ab
Page 20
Einleitung 16
(Köckerling et al. 1998). Einige beschriebene Fälle von psychomotorischer Retard-
ierung sind wahrscheinlich auf postpartale Entgleisungen des Wasser- und Salzhaus-
haltes sowie auf allgemeine Probleme der Frühgeburtlichkeit zurückzuführen
(Schwartz et al. 1996; Seidel et al. 1995; Seyberth et al. 1998). Bei früher und
konsequenter Behandlung ist die Prognose allerdings recht gut. Dies gilt auch für die
milderen Formen, also das klassische Bartter- und das Gitelman-Syndrom.
Umgekehrt ist die Therapie beim Pseudohypoaldosteronismus Typ 1. Neben einer
adäquaten Natrium- und Flüssigkeitssubstitution, muss die Kaliumzufuhr reduziert
werden, bei bedrohlichen Hyperkaliämien muss gegebenenfalls auf die Gabe von
Ionenaustauschern zurückgegriffen werden (Köckerling et al. 1998). Allerdings ist
auch hier der Einsatz von COX-Hemmern gerechtfertigt, da Prostaglandin-E2
sekundär erhöht ist (Bommen et al. 1982; Rampini et al. 1978). Die Prognose hängt
maßgeblich von der Prävention neonataler Dehydratationszustände und Elektrolyt-
entgleisungen und auch vom Ausmaß der Beteiligung anderer Organsysteme ab
(Köckerling et al. 1998).
Page 21
Einleitung 17
I.2. Arachidonsäurestoffwechsel: Bedeutung der Cyclooxygenase und von
Prostaglandin-E2
Um zu verstehen, welche Auswirkungen die Prostaglandine, vor allem Prostaglandin
E2, auf die Nierenfunktion haben und wie darin eingegriffen wird, ist es wichtig,
deren Entstehung aus der Fettsäure Arachidonsäure zu kennen. Auch die möglichen
Regulationsmechanismen spielen eine wichtige Rolle.
Abb. 3
Arachidonsäuremetabolismus
ProstaglandinSynthase (Peroxidase und Cyclooxygenase)
Hydro(pero)xy-Fettsäuren
Leukotriene
Prostaglandine z.B. ProstaglandinE2Thromboxane
Prostaglandin H2
Lipoxygenase
Arachidonsäure
Phospholipase A2
Phospholipid (in Zellmembranen)
Prostacycline
Arachidonsäure ist eine essentielle Fettsäure, das heißt, sie muss dem Körper
zugeführt, bzw. kann, nur aus dem Körper zugeführten Fettsäuren, synthetisiert
werden. Sie wird vor allem für den Einbau in Phospholipide der Plasmamembranen
gebraucht.
Durch das Enzym Phospholipase A2 wird sie wieder aus der Plasmamembran
freigesetzt und steht für die Bildung von Eicosanoiden zur Verfügung. Über ver-
schiedene enzymatische Stoffwechselwege (Prostaglandinsynthase, Lipoxygenase)
kann sie in Prostaglandine (PG), Prostacycline, Thromboxane und Leukotriene
überführt werden.
Page 22
Einleitung 18
Diese Stoffe werden auch als Gewebshormone bezeichnet und werden in allen
Organsystemen gebildet. Sie wirken im direkten Umfeld ihres Produktionsortes
(auto- oder parakrine Wirkung) und regulieren vielfältige Zellfunktionen.
In der Niere ist vor allem das PGE2 von Bedeutung. Lokal in der Niere erhöhte
PGE2-Werte sind als Ursache für die hypokalämische Alkalose des antenatalen
Bartter-Syndroms bekannt (Gill et al. 1976). Der vermutete Pathomechanismus spielt
sich im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife ab. Es wird angenommen, dass
PGE2, vermittelt über einen EP3-Rezeptor und ein inhibitorisches G-Protein, die
Adenylatcyclase hemmt. Dadurch wird ATP vermindert zu cAMP abgebaut, das den
Chlorid-Kanal (ClC-K) (Köckerling et al. 1998), sowie den Na+-K+-2Cl—Kotrans-
porter (NKCC2) (reviewed in Shankar, Brater, 2003) stimuliert und damit die Reab-
sorption fördert. Fällt dieser Stimulus weg, können dem Chlorid kein Natrium,
Magnesium und Calcium folgen bzw. kann Natriumchlorid nicht resorbiert werden
und damit kommt es zu einer verminderten Konzentrierungsfähigkeit des Harns.
Darüber hinaus sind in der Macula Densa, die den aufsteigenden Ast der Henle
Schleife mit dem Glomerulus verbindet, der NKCC2 und der ROMK Transporter
exprimiert. In der Macula Densa wird die Salzionenkonzentration gemessen und es
kann per Feedbackmechanismus das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS)
aktiviert werden. Man vermutet, dass dieser Mechanismus über COX-2 und PGE2
reguliert wird. Wenn nun, wie es beim antenatalen Bartter-Syndrom/ Hyperprosta-
glandin-E2 Syndrom der Fall ist, NKCC2 oder ROMK ausfallen, ist über den oben
beschriebenen Mechanismus auch die Chloridkonzentration erniedrigt. Dies führt zu
einer erhöhten COX-2 Expression und somit auch zu erhöhter Produktion von PGE2.
In diesem Zusammenhang ist noch die Bedeutung des Prostaglandinrezeptors EP4 zu
nennen, über dessen Vermittlung, in den juxtaglomerulären Zellen, vermutlich das
RAAS durch eine erhöhte cAMP Konzentration stimuliert wird. (Nüsing et al. 2001;
Nüsing et al. 2005). Laut Tang et al. führt die über EP4 erhöhte cAMP Konzentration
zusätzlich zu einer Vasodilatation der afferenten Arteriole (Tang et al. 2000).
PGE2 entsteht aus PGH2. Dieses wird aus der Arachidonsäure durch die
Prostaglandinsynthase synthetisiert, die als membrangebundenes Haem- und
Glykoprotein sowohl Peroxidase- als auch Cyclooxygenaseaktivität besitzt. Dies
erklärt, dass bei Hemmung der Cyclooxygenase PGH2 und somit auch PGE2
vermindert gebildet werden.
Page 23
Einleitung 19
Es gibt verschiedene Cyclooxygenasen (COX). In der Niere spielen besonders COX-
1 und COX-2 eine Rolle, die dort vermutlich eine antagonistische Rolle spielen.
COX-2 Inhibition führt zu einer Verminderung des Blutflusses im Nierenmark,
daraus resultierend wird der Urin-Fluss vermindert und damit der Druckeffekt von
Angiotensin II erhöht (Qi et al. 2002).
COX-1 und 2 unterscheiden sich aber auch in der Expression in der Niere. Während
beide im Glomerulus, den papillären interstitiellen Zellen und den renalen Gefäßen
nachweisbar sind, ist COX-1 im Sammelrohr besonders ausgeprägt exprimiert, wo-
hingegen COX-2 dort bisher nur bei Mäusen nachgewiesen wurde. In der Macula
densa und dem dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife ist COX-2 bei Versuchs-
tieren nachweisbar, bei Primaten und Menschen ist es bisher nur gelungen, bei über
60 jährigen COX-2 in diesen Regionen zu detektieren, wobei dies mit dem erhöhten
Renin Wert bei älteren Menschen in Verbindung gebracht wurde (reviewed in Khan
et al. 2002). Das COX-2 auch bei Patienten mit antenatalem Bartter-Syndrom in der
Macula densa vorkommt, wiesen Kömhoff et al. nach (Kömhoff et al. 2000).
Bei der Beobachtung der Wirkung von selektiven COX-2 Hemmern im Vergleich zu
COX-1 und -2-Hemmern (NSAR) fiel auf, das die renale Wirkung der NSARs, akute
Verschlechterung der Nierenfunktion, mit Natrium-Retention, Ödemen, Hypertens-
ion und Hyperkaliämie, ebenfalls bei den selektiven COX-2 Hemmern auftreten.
Dies gilt vor allem für die Situation des physiologischen Stresses, was sich daraus
erklärt, dass in diesem Fall die Konzentration der Vasokonstriktoren im Blut erhöht
ist, und als Gegengewicht die Prostaglandine, vor allem PGE2, vermehrt gebildet
werden, um eine ausreichende renale Durchblutung zu sichern. (Breyer et al. 2001).
Diese Wirkung macht man sich bei hohem Salz- und Wasserverlust, wie dies beim
antenatalen Bartter-Syndrom der Fall ist, zunutze.
Besonders mit dem nichtselektiven COX-Hemmer Indomethacin wurden hier gute
Erfahrungen gemacht (Seyberth et al. 1994). In neueren Studien wurde eine ebenso
gute Wirksamkeit, wie die von Indomethacin, bei den selektiven COX-2 Hemmern
Nimesulide und Rofecoxib beobachtet, außerdem sind die Nebenwirkungen auf den
Gastrointestinaltrakt geringer (Nüsing et al. 2001, Reinalter et al. 2002).
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Material und Methoden 20
II. Material und Methoden
II.1. Material
II.1.1. (Bio-) Chemikalien Bromophenol blue Roth, Karlsruhe
Chloroform Merck, Darmstadt
DEPC (Diethyl Pyrocarbonate) Sigma, Steinheim
DTT (0,1M) Invitrogen, Karlsruhe
EDTA (25mM) (pH 8,0) Invitrogen, Karlsruhe
EDTA (0,5M) (pH 8,0) Sigma, Steinheim
Eisessig Merck, Darmstadt
Ethanol (absolut) Riedel-de Haen®, Seelze
Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe
First Strand Buffer (5x) Invitrogen, Karlsruhe
H2O (RNAse frei) Ambion, Huntingdon,
Cambridgeshire (UK)
Isopropanol (2-Propanol) Merck, Darmstadt
PCR-Puffer (10x) Sigma, Steinheim
peq Gold RNA Pure™ peq lab Biotechnologie, Erlangen
rRNasin® (Rnase Inhibitor) (40 U/μl) Promega, Madison Wi (USA)
SeaKem® LE Agarose Cambrex Biosciences,
Rockland M.E. (USA)
Sucrose (w/v) Sigma, Steinheim
TRIS Base Roth, Karlsruhe
Xylene cyanol ff Sigma, Steinheim
II.1.2. Enzyme und Nucleinsäuren 100 Base-Pair-Ladder Amersham Biosciences,
Buckinghamshire (GB)
DNAse I (Amplification Grade) Invitrogen, Karlsruhe
dNTP (10mM) Amersham Biosciences,
Buckinghamshire (GB)
oligo(dT) 12-18 Primer 0,5 μg/μl Invitrogen, Karlsruhe
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Material und Methoden 21
Primer Eurogentec, Köln
SuperScript™ II (RNAse H- RT) Invitrogen, Karlsruhe
Taq DNA Polymerase (5 U/μl) Sigma, Steinheim
II.1.3. Tiere, Tierfutter und Medikamente Altromin Standard Diät 1320 (Ratten/Mäuse) Altromin Gesellschaft für
Tierernährung mbH, Lage
C57B16 Mäuse Charles River Lab. Inc. Wilmington,
MA, USA
COX-2-/- Mäuse Prof. Robert Langenbach, Research
Triangle Park, North Carolina, USA
EP4-Rezeptor-/- Mäuse Prof. Schuh Narumija, Kyoto
University, Japan
Forene (Isofluran) Abbot, Wiesbaden
Furosemide Sigma, Steinheim
Ketavet (Ketaminhydrochlorid) 100 mg/ml Pharmacia, Erlangen
Rompun (Xylazinhydrochlorid) 2 %ig Bayer Vital, Leverkusen
II.1.4. Instrumente und Apparaturen Elektrophoresebecken: Model B1 OWL Separation Systems,
Porthsmouth HN (USA)
Gelbilddokumentationssystem Vilber Lourmat, Marne la Vallée
(France)
Heizblock: Digi-Block® JR Laboratory Devices, Holliston MA
(USA)
Heizblock: Dri-Block® DB-2D Techne Duxford, Cambridge (UK)
Heizblock: Eppendorf Thermomixer 5436 Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg
PCR-Automat: T-Gradient Thermoblock Biometra, Göttingen
Photometer: Gene Quant II
(RNA/DNA Calc.) Pharmacia Biotech, Cambridge (UK)
Polytron Typ PTA 10-35 Kinematica, Luzern (CH)
Präzisionsküvette
aus Quarzglas (SUPRASIL®) Hellma®, Müllheim
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Material und Methoden 22
Spannungsgerät: Consort E321 (250/100) Consort nV, Turnhout (Belgien)
Vortexer: VF2 Janke & Kunkel;
IKA®-Labortechnik, Staufen
Waage: KB 600-2 Kern & Sohn, Balingen
Zentrifuge: Biofuge fresco Heraeus Instruments, Hanau
Zentrifuge,Vortex: Combi Spin FVL-2400 BioSan Medical-Biological Research
& Technologies, Riga (Latvia)
Zentrifuge: Sigma 110 Sigma Laborzentrifugen,
Osterode am Harz
II.1.5. Sonstige Materialien Epi-Cups (1,5ml) Eppendorf, Hamburg
Falcon® Tubes (14ml, sterile) Becton Dickinson Labware,
Le Pont de Claix (France)
PCR Soft Tubes (0,2ml) Biozym scientific, Hess. Oldendorf
II.1.6. Software Bio Capt MW Version 11.01 for Windows M8S Instruments Trading Inc.
ImageJ 1,32j Wayne Rasband,
National Institiutes of Health (USA)
GraphPad Prism Version 4.02 for Windows GraphPad Software, San Diego
California USA
Page 27
Material und Methoden 23
II.2. Methoden
II.2.1. Versuchsbedingungen und Präparation der Nieren
Versuchsbedingungen Es wurden für die Versuche unterschiedliche Linien von Mäusen genutzt. Die
Genehmigung der Tierversuche war durch das Regierungspräsidium Gießen ge-
geben. Die Tiere wurden nach 21 Tagen von ihren Eltern getrennt und genotypisiert.
Zu Beginn der Versuche waren die Tiere zwischen 8 und 12 Wochen alt. Die
Versuchstiere wurden unter Standardbedingungen gehalten: das Licht war täglich
von 6 Uhr morgens bis 18 Uhr abends an, und es herrschten konstant 23 °C in den
Versuchsräumen, die Tiere bekamen Futter (Altromin Standard-Diät 1320) und
Wasser ad libitum. Die Versuche dauerten jeweils 10 Tage. Es wurden pro Gruppe
zwölf Referenz- sowie zwölf Versuchstiere eingesetzt. In der ersten Gruppe waren
zwölf C57Bl6 Kontrolltiere, sowie zwölf Mäuse, deren Trinkwasser 1 mg/ml
Furosemid enthielt. Diese Tiere hatten zusätzlich Zugang zu einem Salzstein, um die
hohen Salzverluste ausgleichen zu können. In der zweiten Gruppe gab es den
gleichen Versuchsaufbau, allerdings wurden hier COX-2-/- Mäuse verwendet und in
der dritten Gruppe, wiederum unter gleichen Bedingungen, EP4-Rezeptor-/- Mäuse.
Präparation der Nieren Zur Entnahme der Nieren wurden die Tiere narkotisiert.
Narkose:
Nach einer Kurznarkose mit Isofluran bekam die Maus eine i. p. (intra peritoneale)
Narkose mit Ketamin(Ketaminhydrochlorid 100 mg/ml)-Xylazin(Xylazinhydro-
chlorid 2 %ig) 1:1 2 μl/g Maus. Die Spritze mit Narkotikum wurde von der rechte
Leistenbeuge nach oben medial eingestochen, bis das Peritoneum durchstochen war,
die Nadel nach oben medial ventral ausgerichtet und dann das Narkotikum
eingespritzt.
Bei tiefer Narkose (die Maus reagiert nicht, wenn sie am Zehenansatz gezwickt
wird), wurde die Maus mit Kanülen auf einer Styroporplatte fixiert (an der Achsel-
und Leistenfalte).
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Material und Methoden 24
Der so fixierten Maus wurde am Übergang von der Regio inguinalis zur Regio pubis
die Haut mit der Schere durchtrennt, und der Schnitt nach distal zu den Hinterpfoten
und nach oben bis zum Diaphragma verlängert.
Nun wurde die Bauchaorta der Maus freigelegt und mit einer Kanüle punktiert, das
Blut wurde auf diese Weise so weit wie möglich aus dem Blutkreislauf der Maus
entfernt (etwa 0,5 ml). Nachdem man die Nieren freigelegt hatte, konnte man diese
mit der Schere heraustrennen. Die so entnommenen Nieren wurden in flüssigem
Stickstoff gekühlt, bis sie, bei – 80 °C eingefroren wurden, um dann weiterver-
arbeitet zu werden.
II.2.2. Isolierung und Quantifizierung von RNA
Die Isolierung der RNA aus den gefrorenen Nieren erfolgte nun in 4 Schritten:
1. Homogenisierung
Jeweils eine halbe Niere wurde im gefrorenen Zustand in ein Rundröhrchen, in das
zuvor 1 ml peq Gold RNA Pure™ gegeben wurde, überführt, anschließend wurde die
Probe für einige Sekunden im Polytron homogenisiert und für 5 Minuten auf Eis
gestellt.
2. RNA-Extraktion
In eine Probe wurden 150 μl Chloroform gegeben und diese 15 Sekunden kräftig
vermischt. Nachdem die Probe erneut für 15 Minuten auf Eis gestanden hatte, wurde
1 ml der Gewebelösung in ein 1,5 ml Epi-Cup überführt und anschließend für 20
Minuten zentrifugiert (13000 g, 4°C). Dadurch bildeten sich 2 Phasen: eine untere
gelbliche Phenol-Chloroform-Phase, die DNA und Proteine enthielt, und eine obere
wässrige, in der die RNA enthalten war.
3. RNA-Präzipitation
Die wässrige Phase wurde nun in ein neues Cup überführt, und das entsprechende
Volumen an Isopropanol zugefügt. Nach erneutem Vermischen und Kühlen bei –80
°C für 30 Minuten wurde die Probe nochmals 30 Minuten zentrifugiert (13000 G,
4°C).
4. Waschen der RNA
Der wässrige Überstand wurde abgenommen und das RNA-Präzipitat mit 1 ml
70%igen Ethanol durch Vortexen und anschließendes Zentrifugieren (10 Minuten,
Page 29
Material und Methoden 25
13000 G, 4°C) gewaschen. Dieser Waschschritt wurde wiederholt und der wässrige
Überstand soweit wie möglich abgenommen. Anschließend wurde die Probe für 10
Minuten an der Luft trocknen gelassen. Zuletzt wurde das Präzipitat in 50 μl RNAse
freiem TE (pH = 8) gelöst, die Probe 10 Minuten bei 70°C erwärmt und anschließend
wieder auf Eis gestellt.
Quantifizierung der isolierten RNA
Die Konzentration der RNA in den Proben wurde mit Hilfe eines
Spektralphotometers bestimmt. Dafür wurden die Proben 1:100 verdünnt. Das Gerät
maß RNA-Proben in UV-Zellen gleichzeitig bei Wellenlängen von 230 nm, 260 nm
und 280 nm. Dabei dienten 260 nm und 280 nm der Quantifizierung und Berechnung
zur Reinheitsprüfung, während 230 nm zur Hintergrundskompensation (Proteine)
gebraucht wurde. Die Nucleinsäureprobe galt als ausreichend rein, d.h. frei von
Proteinen, wenn galt: 2 > A260/A280 ≥ 1,7 und A230 < A260 > A280. Nur
dementsprechende Proben wurden zur reversen Transkription weiterverwendet. Die
RNA-Proben wurden auf 1 μg/ 7,5 μl eingestellt und bei –80°C gelagert.
T(RIS)E(DTA) (RNAse frei) (pH =8):
TRIS (1 M, pH 8,0) 1 ml
EDTA (0,5 M (pH 8,0) 200 μl ad 100 ml mit MQ H2O
autoklavieren
Diethyl-Pyrocarbonate-H2O:
Reinst H2O wird mit 0,1% DEPC versetzt, über Nacht stehen gelassen und dann
autoklaviert.
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Material und Methoden 26
II.2.3. DNAse-Verdau und Reverse Transkiption DNAse-Verdau
Um zu gewährleisten, dass bei der später folgenden Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) keine DNA mehr vorhanden ist, die das Ergebnis verfälschen könnte, wurde
vor der reversen Transkiption ein DNAse Verdau vorgenommen. Dies erfolgte nach
folgendem Protokoll:
• 7,5 μl der RNA (= 1μg RNA) wurden in ein 1,5 ml Eppi-Cup pipettiert.
• Zu jeder Probe wurden nun 2,5 μl des DNAse-Mastermixes (2 μl 5 X Puffer,
0,5 μl DNAse I) zugefügt und das Gemisch 15 Minuten bei 37°C inkubiert.
• Anschließend wurde zu jeder Probe 1 μl EDTA (25 mM) gegeben und die
Proben kurz durchmischt und abzentrifugiert.
• Dann blieben die Proben 10 Minuten bei 65°C stehen, kamen kurz auf Eis,
und wurden dann erneut abzentrifugiert.
Reverse Transkiption
Um die RNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelelektrophorese zu
detektieren und quantifizieren, musste die mRNA zuvor in copyDNA (cDNA) um-
geschrieben werden. Die Synthese der cDNA mittels einer reversen Transkiptase
(einer RNase-H--Mutante der Moloney-Maus-Leukämie-Virus-Reversen-Transkript-
ase, SuperScript™ II der Firma Invitrogen), sowie entweder oligo(dt) als Primer (um
die komplette RNA umzuschreiben) oder einem Gemisch aus spezifischen Primern
für folgende Proteine: SGK, KCC1, KCC3, KCC4. Für diese Proteine wurde eine
spezifische Transkription gewählt, um die Selektivität zu erhöhen und das Signal zu
verbessern. Die reverse Transkription erfolgte unter folgenden Bedingungen:
• Zu den 11 μl (enthielten die RNA) aus dem oben beschriebenen DNAse-
Verdau wurde entweder 1 μl oligo(dt) oder 1 μl des spezifischen Primer-
Gemisches (10μM) hinzugegeben. Wichtig war, dass auf Eis pipettiert und
mit der Pipette gemixt wurde.
• Nachdem die Proben 10 Minuten bei 70°C inkubiert wurden, kamen sie für
eine Minute auf Eis und wurden anschließend zentrifugiert.
• Der während der Inkubation vorbereitete RT-Mastermix aus 2 μl 5 X Puffer
Page 31
Material und Methoden 27
(250 mM TRIS-HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) + 1 μl d NTP
(10 mM) + 2 μl DTT (0,1 M) + 1 μl DEPC-H2O + 1 μl SuperScript™ II + 1 μl
rRNasin® (Rnase Inhibitor) (40 U/μl) wurde kurz durchmischt und zentrifu-
giert, danach wurden 8 μl des Mastermixes zu den bestehenden 12 μl gegeben
und die so entstandene Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
• Nun erfolgte eine Inkubation von 50 Minuten bei 42°C und eine weitere für 5
Minuten bei 95°C.
• Dann kam die Probe erneut auf Eis und wurde noch einmal abzentrifugiert.
Die so gewonnene cDNA diente als Vorlage für die PCR und wurde zwischenzeitlich
bei –20°C gelagert. Zur Vermeidung von Kontamination bzw. Reaktion der RNA-
Proben mit Ribonucleasen wurde stets mit Einmalhandschuhen und autoklavierten
Plastikartikeln auf Eis bzw. bei 4°C gearbeitet.
Primer für die reverse Transkription:
SGK 5’-CGA GAC TGC CAA GCT TCC-3’
KCC1 5’-CGG ATC CAT TTC CAC TGC-3’
KCC3 5’-AGC TGG CAC CTG TCA ACC-3’
KCC4 5’-GGC CTG GCT TTT CTC TCC-3’
Page 32
Material und Methoden 28
II.2.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelelektrophorese Die PCR erlaubt es, gezielt DNA-Abschnitte, die von zwei bekannten DNA-
Sequenzen eingerahmt werden, zu amplifizieren. Die Stränge der Ziel-DNA werden
durch Erhitzen in Einzelstränge getrennt. Danach wird die Reaktion abgekühlt, um
die Hybridisierung der Primer zu ermöglichen. Von diesen ausgehend synthetisiert
die DNA-Polymerase in Gegenwart von allen vier dNTPs neue komplementäre
DNA-Stränge. Dieser Zyklus wird mit derselben Reaktionsmischung 20-40 mal
wiederholt, so dass es zu einem exponentiellen Anstieg der Produkte kommt, die
zwischen diesen Sequenzen liegen. Hierzu wurde in dieser Arbeit folgender Ansatz
und folgendes Programm benutzt.
PCR-Ansatz:
DEPC-H2O 12,5 μl
cDNA (1 :10 verdünnt) 2 μl
10 X Taq-Puffer 2 μl
dNTP (2mM) 1 μl
Vorwärts-Primer (10 μM) 1 μl
Rückwärts-Primer (10 μM) 1 μl
Taq-Polymerase (5 U/μl) 0,5 μl
PCR-Programm
Schritt 1: Denaturierung 95°C 5 min
Beginn Schleife
Schritt 2: Denaturierung 95°C 45 sec
Schritt 3: Anlagerung der Primer 65°C 60 sec
Schritt 4: Verlängerung der Primer 72°C 60 sec
Ende Schleife Wiederholung: 34 Mal
Page 33
Material und Methoden 29
Primer für die PCR (in Klammern: Accessionsnumber der Gendatenbank):
GAPDH vorwärts 5’-GAC CAC AGT CCA TGC CAT CAC TGC-3’
(M32599) rückwärts 5’-GCT GTT GAA GTC GCA GGA GAC AAC-3’
(Chan et al. 2002) 340 Basenpaare
ROMK vorwärts 5’-TGG TCT CCA AAG ATG GAA GG-3’
(AF012834) rückwärts 5’-AAG CAG AAA AAT GGC AGT GG-3’
356 Basenpaare
NCCT vorwärts 5’-TTT TCT GGA CCA CCA TCT CC-3’
(U61085) rückwärts 5’-GTT CTT GCC ATA GCC TTT GC-3’
371 Basenpaare
ClC-K1 vorwärts 5’-CAG CCC TCT TTC TAC GAT GG-3’
(NM_024412) rückwärts 5’-CTC TCT GGT CTC CAC CAA GG-3’
213 Basenpaare
Na+-K+- vorwärts 5’-TGT GAT TCT GGC TGA GAA CG-3’
ATPase α1 rückwärts 5’-TCT TGC AGA TGA CCA AGT CG-3’
(BC010319) 206 Basenpaare
NKCC2 vorwärts 5’-GGA TCC AAC CAA TGA CAT CC-3’
(U20973) rückwärts 5’-CCA GCA AGA ATC CCA GTA GC-3’
306 Basenpaare
ENaC β vorwärts 5’-CCC CAC CCA GCA ACT AGT GAA CTC AAA-3’
(NM_011325) rückwärts 5’-AAA GCA CGT GTT CCC CTT TCA AGA CTT-3’
(Chan et al. 2002) 420 Basenpaare
ENaC γ vorwärts 5’-GAC TCT CTT CCT GAC ACA AAT GGT CCT-3’
(NM_011326) rückwärts 5’-ACA CAC ATT CTC ACA CAT ACA CAT ACT-3’
(Chan et al. 2002) 749 Basenpaare
Page 34
Material und Methoden 30
NEDD-4 vorwärts 5’-GCG ATT TGT GAA CCG TAT CC-3’
(U96635) rückwärts 5’-GCT CTT GGC AGC TTA TCA GG-3’
375 Basenpaare
SGK vorwärts 5’-GAA CAC GGC TGA GAT GTA CG-3’
(NM_011361) rückwärts 5’-ATA GGA GAA GCC GAG GAA GG-3’
370 Basenpaare
KCC1 vorwärts 5’-GGC TGT GGA CTT TCT TCT GC-3’
(AF121118) rückwärts 5’-GGT AAC AAT GGC CAG AAT GG-3’
374 Basenpaare
KCC3 vorwärts 5’-ACA CTT CCC GGT CTG TAT GC-3’
(AF211854) rückwärts 5’-GAC CGA GGG AAA GAA GAT CC-3’
379 Basenpaare
KCC4 vorwärts 5’-CTG GTA CTA CGC CCT TTT CG-3’
(AF087436) rückwärts 5’-GTG CCC TCT AGC ACA GAT CC-3’
300 Basenpaare
Für den PCR-Ansatz wurden je ein genspezifisches Primerpaar für GAPDH, ROMK,
NCCT, ClC-K1, Na+-K+-ATPase α1, NKCC2, ENaC β, ENaC γ, NEDD-4, SGK,
KCC1, KCC3 oder KCC4 verwendet.
Die PCR-Produkte wurden mit 6x-Probenpuffer (4 μl pro Ansatz) versetzt, je 10 μl
davon auf ein 1,6 %iges Agarosegel aufgetragen, dem 0,75 μl Ethidiumbromid bei-
gegeben waren und elektrophoretisch in 1x TAE-Puffer aufgetrennt (35 Minuten,
120 V/100 mA). Als Längenstandard diente eine 100-Basenpaare-Leiter. Die Banden
konnten nun unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Die Dokumentation erfolgte
mit einer Dokumentationseinrichtung der Firma Vilber Lourmat, sowie des Pro-
gramms Bio Capt MW Version 11.01 for Windows.
Page 35
Material und Methoden 31
6x Probenpuffer:
Bromphenol blue 0,25 %
Xylene cyanol ff 0,25 %
Sucrose (w/v) 40 % in MQ-H2O
50x TAE-Puffer:
TRIS Base (2 M) 242 g
Eisessig (100 %) 57,1 ml
EDTA (0,5 M, pH 8) 100 ml ad 1 l mit MQ-H2O
Agarosegel 1,6 %ig:
1,2 g Agarose
75 ml 1x TAE
0,75 μl Ethidiumbromid
Die Methode, welche reverse Transkription und PCR kombiniert, wird RT-PCR
genannt. Sie ist sehr sensitiv, selbst geringe RNA-Mengen können detektiert werden
(Wang et. al 1989). Dies liegt daran, dass die cDNA exponentiell vervielfältigt wird.
Die Schwierigkeit liegt nun darin, eine quantitative Aussage zu treffen, da Unter-
schiede in der Effizienz bei der RNA-Isolierung, der reversen Transkription und der
Amplifikation auftreten können (Chelly et. al 1988). Deshalb wurde die endogene
GAPDH-Sequenz als interner Standard gewählt. Da es sich bei GAPDH um ein
konstitutiv exprimiertes Protein handelt, konnte man davon ausgehen, dass die
Konzentration an GAPDH-RNA in den zu vergleichenden Proben immer gleich hoch
war. Wichtig war nun, das sich GAPDH während der PCR noch im linearen Bereich
befand, da man zwar theoretisch davon ausgehen kann, dass sich die Ziel-DNA wie
in der folgenden Formel verhält: N = N0 * 2 n (N = Anzahl der Amplifikate, N0 =
Anzahl der Kopien der ursprünglichen DNA-Matritze, n = Anzahl der Vermehr-
ungszyklen), unter experimentellen Bedingungen sich die zu vervielfältigenden
Sequenzen jedoch nicht beliebig lange exponentiell vermehren. Es kommt im Laufe
späterer Zyklen irgendwann zu einem Plateau- oder Sättigungseffekt, da sich die
Produktionsrate vermindert. Daher wurde GAPDH in einer Verdünnungsreihe
getestet, wobei man bei einer Verdünnung von 1:500, der aus der mRNA result-
ierenden cDNA, im linearen Bereich arbeitete. Auch für die cDNA der anderen
Page 36
Material und Methoden 32
untersuchten Proteine wurden entsprechende Verdünnungsreihen durchgeführt, und
es wurde mit den in Tab. 2 (s. Ergebnisteil) aufgeführten Verdünnungen gearbeitet.
Die cDNA-Konzentration der anderen Kanalproteine wurde ins Verhältnis zur
GAPDH-cDNA gesetzt, womit man das relative Expressionsniveau der Kanäle
berechnen und sie damit vergleichen konnte.
Mit dem Programm Imagej konnten die verschiedenen Banden aufgrund ihrer Grau-
stufen quantitativ verglichen werden. Jede PCR-Reaktion wurde im Doppel durchge-
führt. Nach Auswertung wurde der Mittelwert hieraus ermittelt.
Anschließend wurden die Ergebnisse mithilfe des t-Tests auf signifikante Unter-
schiede getestet. Das Konfidenzintervall betrug p < 0,05 das heißt bei einem p ≤ 0,05
wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den Probereihen festgestellt. In den
Abbildungen wurden Signifikanzen mit einem * gekennzeichnet.
Page 37
Ergebnisse 33
III. Ergebnisse
III.1. Verdünnungen
Wie schon unter Material und Methoden beschrieben bleibt die Amplifikation der
c-DNA bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), nicht beliebig lange im expo-
nentiellen Bereich, sondern es kommt im Laufe der Zeit zu einem Sättigungs- oder
Plateaueffekt. Daher ist es vor Durchführung der Versuche wichtig, festzustellen, bei
welchen Verdünnungen die Amplifikation noch im linearen Bereich liegt. Aus
diesem Grund wurde eine Verdünnungsreihe der c-DNA mit den Primern aller
verwendeten Proteine durchgeführt. Diese sind sowohl in den Abbildungen 3-15 als
Ergebnis der Gelelektrophorese als auch graphisch dargestellt.
Abb. 3b: GAPDH Verdünnung - Grafik
R2 = 0,9295
02000400060008000
10000
1:1 1:5 1:10 1:100 1:1000 1:10000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Abb. 4b: NKCC2 Verdünnung - Grafik
R2 = 0,9206
0
2000
4000
6000
8000
1:100 1:500 1:1000 1:5000 1:10000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Abb. 5b: ROMK Verdünnung - Grafik
Abb. 3.a: GAPDH Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:1000 1:100 1:10 1:5 1:1
Abb. 4a: NKCC2 Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:500 1:100
Abb. 5a: ROMK Verdünnungsreihe
Verd. 1:100 1:10 1:1
R2 = 0,8545
0
2000
4000
6000
8000
1:1 1:10 1:100 1:1000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Page 38
Ergebnisse 34
Abb. 6b: KCC1 Verdünnung - Grafik
Abb. 7b: KCC3 Verdünnung - Grafik
R2 = 0,9916
0
2000
4000
6000
8000
1:1 1:10 1:100 1:1000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Abb. 8b: KCC4 Verdünnung - Grafik
R2 = 0,8552
0
2000
4000
6000
8000
1:1 1:10 1:100 1:1000 1:10000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Abb. 9b: ClC-K1 Verdünnung - Grafik
Abb. 6a: KCC1 Verdünnungsreihe
Verd. 1:1000 1:100 1:10 1:1
Abb. 7a: KCC3 Verdünnungsreihe
Verd. 1:1000 1:100 1:10 1:1
Abb. 8a: KCC4 Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:1000 1:100 1:10 1:1
Abb. 9a: ClC-K1 Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10
R2 = 0,9899
02000400060008000
10000
1:1 1:10 1:100 1:1000
Verdünnungrel.
Ein
heit
R2 = 0,9516
0
2000
4000
6000
8000
1:10 1:100 1:1000 1:10000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Page 39
Ergebnisse 35
Abb. 10b: NCCT Verdünnung - Grafik
R2 = 0,8903
02000400060008000
10000
1:10 1:100 1:1000 1:10000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Abb. 11b: Na+-K+-ATPase Verd. - Grafik
R2 = 0,8389
02000400060008000
10000
1:10 1:100 1:1000 1:10000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Abb. 12b: ENaC-β Verdünnung - Grafik
R2 = 0,893
0
2000
4000
6000
8000
1:100 1:500 1:1000 1:5000 1:10000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Abb. 13b: ENaC-γ Verdünnung - Grafik
Abb. 10a: NCCT Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10
Abb. 12a: ENaC-β Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:500 1:100
Abb. 13a: ENaC-γ Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10
Abb. 11a: Na+-K+-ATPase Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10
R2 = 0,9704
02000400060008000
1000012000
1:10 1:100 1:1000 1:10000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Page 40
Ergebnisse 36
Abb. 14b: Nedd-4 Verdünnung - Grafik
R2 = 0,965
0
2000
4000
6000
1:10 1:100 1:1000 1:10000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Abb. 15b: SGK Verdünnung - Grafik
Abb. 14a: Nedd-4 Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:5000 1:1000 1:100 1:10
Abb. 15a: SGK Verdünnungsreihe
Verd. 1:10000 1:1000 1:100 1:10
R2 = 0,7397
0
2000
4000
6000
8000
1:10 1:100 1:1000 1:10000
Verdünnungrel.
Ein
heit
Aus der Auswertung der Abbildungen ergaben sich für die c-DNA der Proteine
folgende Verdünnungen, die bei allen weiteren PCRs verwendet wurden.
Kanalprotein bzw. Protein Verdünnung der c-DNA Größe der Fragmente
GAPDH (Chan et al. 2002) 1 : 500 340 Basenpaare NKCC 2 1 : 2000 306 Basenpaare ROMK-2 1 : 20 356 Basenpaare KCC1 1 : 50 374 Basenpaare KCC3 1 : 50 379 Basenpaare KCC4 1 : 500 300 Basenpaare ClC-K1 1 : 500 213 Basenpaare NCCT 1 : 600 371 Basenpaare Na+-K+-ATPase α1 1 : 1200 206 Basenpaare ENaC β (Chan et al. 2002) 1 : 2000 420 Basenpaare ENaC γ (Chan et al. 2002) 1 : 500 749 Basenpaare NEDD-4 1 : 500 375 Basenpaare SGK 1 : 2000 370 Basenpaare Tab. 2 Verwendete Verdünnungen der c-DNA für die PCR; Größe der jeweiligen DNA-Fragmente
Page 41
Ergebnisse 37
III.2. C57Bl6-Mäuse im Vergleich zu COX-2-/- und EP4-/- Mäusen: Expression
von Nierenproteinen ohne und mit Furosemidgabe
Einer Gruppe von jeweils zwölf C57Bl6-, COX-2-/-- sowie EP4-/--Mäusen wurde
zehn Tage lang mit dem Trinkwasser Furosemid zugeführt, während eine ent-
sprechende Kontrollgruppe von ebenfalls je zwölf Mäusen unter Standardbeding-
ungen gehalten wurde. Danach wurden die Tiere getötet. Die Nieren wurden ent-
nommen, bei – 80°C tiefgefroren und anschließend die RNA aufbereitet und in
cDNA umgeschrieben. In den aus den Vorversuchen gewonnenen Verdünnungen
wurde die cDNA zusammen mit den jeweiligen Primern in der PCR vervielfältigt.
Nachdem die Ergebnisse der Proben unter Zuhilfenahme der Gelelektrophorese
dargestellt und mittels eines Videodokumentationssystems gespeichert wurden,
konnten sie aufgrund der unterschiedlichen Graustufen mithilfe des Programms
ImageJ miteinander verglichen werden. Als Bezugsgröße diente GAPDH, ein
konstituiv exprimiertes Protein (Haushaltsfunktion), zu dem alle Ergebnisse in
Relation gesetzt wurden und so vergleichbar sind.
In den Abbildungen (Abb. 19-54) sind die PCR-Ergebnisse der Furosemid-
behandelten Gruppen sowie der Kontrollgruppen im Original dargestellt (n=12).
Rechts dargestellt ist die Mittlung der jeweiligen Graustufenauswertung, die die
relative Expression zu GAPDH (Abb. 16-18) darstellt. Diese Weise der semi-
quantitativen Analyse erlaubt den relativen Vergleich zwischen den jeweiligen
Verum- und Plazebogruppen.
Page 42
Ergebnisse 38
Abb. 16: GAPDH (Referenz) – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid
Abb. 17: GAPDH (Referenz) – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid
Abb. 18: GAPDH (Referenz) – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid
Der bumetanide-sensitive Natrium-Kalium-2Chlorid Kotransporter (NKCC2) ist für
die Netto-Resorption von Natrium und Chlorid, aus dem Tubulus ins Interstitium, im
dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife verantwortlich. Er wird durch das
Schleifendiuretikum Furosemid gehemmt.
Die Ergebnisse zeigen, dass Furosemid bei den C57Bl6-Mäusen langfristig zu einer
Abnahme der NKCC2 mRNA-Konzentration in der Niere führt, in Zahlen ausge-
drückt findet eine Reduktion von 100 % auf 59 % statt, was einer signifikanten
Abnahme entspricht.
Dagegen findet sich bei den COX-2-/- sowie den EP4-/- Mäusen im Versuch mit
Furosemid eine Zunahme der mRNA-Konzentration von 100 % auf 134 % bzw.
113 % gegenüber den nicht mit Furosemid behandelten Mäusen. Dies ist aber
lediglich als Tendenz zu werten, da es sich in beiden Fällen um keine signifikanten
Unter-schiede handelt.
Page 43
Ergebnisse 39
Abb. 19: NKCC2 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 20: NKCC2 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 21: NKCC2 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Page 44
Ergebnisse 40
Abb. 22: ROMK – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 23: ROMK – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 24: ROMK – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Der ROMK-Kanal (renal outer-medullary K+) ist in der Niere im dicken
aufsteigenden Ast der Henle Schleife lokalisiert, wo er in der apikalen Membran sitzt
und den Gradienten für NKCC2 aufrechterhält. Außerdem befindet er sich im
kortikalen Sammelrohr, in dem er an der Kaliumsekretion teilnimmt. Unter Furo-
semidgabe an die C57Bl6-Mäuse ist ein signifikanter Abfall der mRNA-Konzen-
tration von ROMK in der Niere von 100 % auf 68 % zu verzeichnen.
Page 45
Ergebnisse 41
Dagegen kommt es im Versuchsaufbau mit den COX-2-/- Mäusen unter der Furo-
semidbehandlung zur Zunahme der ROMK mRNA-Konzentration von 100 % auf
170 %. Dies ist ein signifikanter Anstieg.
Bei den EP4-/- Mäusen ist die Tendenz eines Anstieges der renalen mRNA-Kon-
zentration unter der Gabe des Schleifendiuretikums zu erkennen (100 % zu 118 %;
nicht signifikant).
Abb. 25: KCC1 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 26: KCC3 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 27: KCC4 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Page 46
Ergebnisse 42
Abb. 28: KCC1 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 29: KCC3 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 30: KCC4 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Page 47
Ergebnisse 43
Abb. 31: KCC1 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 32: KCC3 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 33: KCC4 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Die Kaliumchlorid-Kotransporter (KCC) werden im hypotonen Zustand aktiviert und
dienen somit als Volumenregulatoren (Cossins, Gibson, 1997; Lauf et al. 1992). Die
Expression der KCC1, 3 und 4 findet entlang des gesamten Nephrons statt (Liapis et
al. 1998). Unter den Versuchsbedingungen ohne Furosemid, war für die C57Bl6-
Mäuse, im Vergleich zu denen mit Furosemid, ein Abfall der mRNA in der Niere um
Page 48
Ergebnisse 44
etwa die Hälfte erkennbar, für KCC1 von 100 % auf 45 %, für KCC3 von 100 % auf
54 % und für KCC4 von 100 % auf 42 % (signifikante Abfälle).
Dagegen zeigten die COX-2-/- Mäuse eine tendenzielle Zunahme der mRNA Kon-
zentration bei allen drei Kanälen, wenn sie mit dem Schleifendiuretikum behandelt
wurden, im Vergleich zu den Standardbedingungen; im einzelnen waren das: bei
KCC1 von 100 % auf 156 %, bei KCC3 von 100 % auf 131 %, bei KCC4 von 100 %
auf 108 % (alle nicht signifikant).
Bei den EP4-/- Mäusen ist erneut eine signifikant reduzierte mRNA-Konzentration zu
sehen, wenn die Mäuse das Medikament bekamen. Es handelt sich hierbei um fol-
gende Abnahmen (gegenüber Standardbedingungen): Die KCC1 mRNA-Konzentrat-
ion nimmt von 100 % auf 57 % ab, während die für KCC3 und KCC4 von 100 % auf
61 bzw. 63 % abnimmt.
Page 49
Ergebnisse 45
Abb. 34: ClC-K1 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 35: ClC-K1 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 36: ClC-K1 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Der Chloridtransporter ClC-K1 ist für die hohe Chlorid-Permeabilität im dünnen
aufsteigenden Ast der Henle-Schleife verantwortlich und ist somit notwendig für die
Urinkonzentration. Die mRNA-Konzentration dieses Transporters wird in der Niere,
Page 50
Ergebnisse 46
unter der Gabe von Furosemid an die C57Bl6-Mäuse, nahezu nicht verändert.
Gleiches gilt für die COX-2-/- Mäuse.
Bei den EP4-/- Mäusen kommt es jedoch zu einer deutlichen Abnahme der mRNA
Konzentration von ClC-K1. Bei den Versuchen zeigte sich ein Abfall der ClC-K1
mRNA-Konzentration, unter der Verabreichung von Furosemid, von 100 % auf
49 %, gegenüber den nicht mit Furosemid behandelten Mäusen.
Abb. 37: NCCT – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 38: NCCT – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 39: NCCT – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Page 51
Ergebnisse 47
Der Thiazide-sensitive Natriumchlorid-Kotransporter (NCCT) wird im distalen
Konvolut exprimiert. Dort ist er an der Natriumchlorid-Resorption beteiligt. Unter
Furosemidbehandlung der C57Bl6-Mäuse zeigt sich auf der Ebene der mRNA der
Niere, im Vergleich zum Versuch ohne Furosemid, eine signifikante Abnahme der
Expression von 100 % auf 67 %.
Im Gegensatz dazu, kommt es bei den COX-2-/- Mäusen zu keiner signifikanten
Veränderung der NCCT mRNA-Konzentration, unter der Behandlung mit dem
Schleifendiuretikum. Es ist von der Tendenz her jedoch eine Zunahme zu erkennen;
von 100 % auf 123 %.
Für die EP4-/- Mäuse ändert sich die mRNA-Konzentration ebenfalls nicht
signifikant.
Page 52
Ergebnisse 48
Abb. 40: Na+-K+-ATPase – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 41: Na+-K+-ATPase – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 42: Na+-K+-ATPase – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Die Natrium-Kalium-ATPase (Na+-K+-ATPase) ist eine von Energie in Form von
Adenosintriphosphat (ATP) abhängige Ionenpumpe. In der Niere kommt sie vor
allem an der basolateralen Seite der Tubuluszellen vor und ist dort für den Austausch
von 3 Natrium gegen 2 Kalium zuständig, wobei das Natrium aus der Zelle ins Inter-
stitium transportiert wird und das Kalium den umgekehrten Weg nimmt. Daher
Page 53
Ergebnisse 49
nimmt die Na+-K+-ATPase an der Resorption von Natrium ins Interstitium und der
Sekretion von Kalium in den Tubulus teil.
Als Resultat des Versuches kann man festhalten, das die mRNA der Na+-K+-ATPase
unter den Bedingungen des erhöhten Salz- und Wasserverlustes, wie dies unter Furo-
semid der Fall ist, in der Niere hochreguliert wird. Effektiv findet eine signifikante
Zunahme um 38 %, von 100 % auf 138 %, statt.
Das Ergebnis der COX-2-/- Mäuse unterscheidet sich von dem der C57Bl6-Mäuse.
Unter Furosemidbehandlung ergibt sich hier nahezu keine Veränderung der mRNA
Konzentration in der Niere.
Ein ähnliches Ergebnis ist bei den EP4-/- Mäusen zu beobachten. Hier findet sich
ebenfalls keine signifikante Veränderung.
Abb. 43: ENaC β – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 44: ENaC γ – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Page 54
Ergebnisse 50
Abb. 45: ENaC β – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 46: ENaC γ – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 47: ENaC β – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 48: ENaC γ – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Page 55
Ergebnisse 51
Der Amilorid-sensitive ephiteliale Natrium-Kanal (ENaC) wird in der Niere im
distalen Nephron exprimiert und nimmt dort an der Feinregulation der Natrium-
reabsorption teil. Er besteht aus drei homologen Untereinheiten. Neben der nicht
untersuchten α-Untereinheit gibt es noch β- und γ-ENaC, die in Vesikeln
vorkommen und aus diesen in die apikale Zellmembran eingebaut werden. Die
mRNA-Konzentration in der Niere dieser beiden Einheiten der C57Bl6-Mäuse, ist
unter der Behandlung mit Furosemid (β-ENaC: 146 %; γ-ENaC: 137 %) signifikant
erhöht, im Vergleich zu Standardbedingungen (100 %).
Eine ähnliche Beobachtung lässt sich unter der Gabe von Furosemid an die COX-2-/-
Mäuse machen. Hier findet sich zwar keine signifikante Änderung der mRNA
Expression der β- und γ-ENaC Untereinheiten im Vergleich zu Normalbedingungen,
allerdings ist eine tendenzielle Zunahme unter der Diuretikagabe zu erkennen.
Bei den EP4-/- Mäusen lässt sich dagegen keine einheitliche Aussage machen. Die
mRNA-Konzentration der β-Untereinheit zeigt eine deutliche Abnahme um 54 %,
von 100 % auf 46 % unter der Behandlung mit dem Schleifendiuretikum. Dies ist
signifikant. Bei der γ- Untereinheit ändert sich die mRNA-Konzentration jedoch
nicht (100 % zu 100 %).
Page 56
Ergebnisse 52
Abb. 49: Nedd 4 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 50: Nedd 4 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 51: Nedd 4 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Nedd-4 ist ein Protein, das beim Abbau von ENaC eine Rolle spielt, ENaC wird
markiert (‚ubiquitiniert’), endozytiert und lysosomal/proteosomal abgebaut (Malik et
al. 2001).
Unter den Versuchsbedingungen zeigt sich, dass die in der Niere vorkommende
mRNA unter Furosemidbehandlung, im Vergleich mit den Standardbedingungen,
Page 57
Ergebnisse 53
tendenziell erniedrigt wird und zwar um 16 %, dieser Wert ist jedoch nicht
signifikant.
Die Behandlung mit dem Schleifendiuretikum führt auch bei den COX-2-/- Mäusen
eher zu einer Abnahme der Nedd-4 mRNA-Konzentration in der Niere. Auch hier
handelt es sich aber um keinen signifikanten Unterschied.
Demgegenüber zeigen die EP4-/- Mäuse, die mit Furosemid behandelt wurden,
gegenüber denen die keines erhielten, einen kleinen Anstieg der Nedd-4 mRNA-
Konzentration, der jedoch ebenfalls nicht signifikant ausfällt.
Abb. 52: SGK 1 – C57Bl6-Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Abb. 53: SGK 1 – COX-2-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM
Abb. 54: SGK 1 – EP4-/- Mäuse
ohne Furosemid
mit Furosemid n=12 ± SEM; * p ≤ 0,05
Page 58
Ergebnisse 54
Die SGK 1 (Serum- und Glucocorticoid-regulierte Kinase 1) wirkt vermutlich auf der
einen Seite direkt stimulierend auf ENaC, andererseits aber auch indirekt durch die
Inaktivierung von Nedd-4. In der Niere findet unter den Versuchsbedingungen bei
den C57Bl6-Mäusen mit Furosemidbehandlung, gegenüber dem Versuch ohne Furo-
semid, eine Abnahme der SGK 1 mRNA-Konzentration von 100 % auf 57 % statt
(signifikanter Unterschied).
Bei den COX-2-/- Mäusen ist zwar eine Zunahme der mRNA-Konzentration von
100 % auf 120 % bei Furosemidgabe gegenüber Standardbedingungen zu beobach-
ten, dieser Unterschied ist jedoch nicht signifikant.
Beim EP4-/- kommt es, wie auch schon bei den C57Bl6-Mäusen, zu einem signi-
fikanten Abfall der SGK 1 mRNA-Konzentration unter der Gabe des Diuretikums. In
diesem Fall war eine Abnahme von 100 % auf 72 % zu sehen.
Page 59
Diskussion 55
IV. Diskussion
IV.1. Behandlung der Mäuse mit Furosemid: Modell für das antenatale
Bartter-Syndrom zur Untersuchung der Veränderungen von Protein-
expressionen in der Niere
Warum ist es wichtig, zu wissen wie sich verschiedene (Kanal)proteinexpressionen
in der Niere beim antenatalen Bartter-Syndrom sowie bei dessen Behandlung verän-
dern?
Es ist bekannt, dass das antenatale Bartter-Syndrom mithilfe eines Cyclooxygenase-
Inhibitors (COX-Hemmer) positiv beeinflusst werden kann, indem die übermäßige
Produktion von Prostaglandin-E2 unterdrückt wird. Wie sich aber die Expressionen
der Kanalproteine und deren Steuerungsproteine verändern, ist bisher nur in An-
sätzen beschrieben. Hier könnte demnach ein weiterer Ansatzpunkt liegen, das
antenatale Bartter-Syndrom zu behandeln und mit einer spezifischeren Therapie die
Nebenwirkungen, die bei der Behandlung mit COX-Hemmern auftreten, zu
reduzieren.
IV.2. C57Bl6-Mäuse ohne und mit Furosemidbehandlung im Vergleich zu
COX-2-/- und EP4-/- Mäusen
Die COX-2 spielt bei der Pathogenese des antenatalen Bartter-Syndroms eine
wichtige Rolle. Die verminderte Chlorid-Aufnahme in die Zelle durch Ausfall oder
Blockade des Natrium-Kalium-2Chlorid-Kotransporter (NKCC2), in der luminalen
Membran des kortikalen Teils der Henle Schleife, führt durch die erniedrigte
Chloridkonzentration zur Aktivierung der p38MAP-Kinase, die eine Erhöhung der
COX-2 Transkription bedingt. Dadurch erhöht sich der Prostaglandin-E2-Spiegel und
es kommt zur vermehrten cAMP Bildung in den juxtaglomerulären Zellen, die
wiederum zu einer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS)
führt. Es wird vermutet, dass der Prostaglandinrezeptor EP4 bei dieser Signalkette
eine wichtige Rolle spielt (Nüsing et al. 2005; Breyer & Breyer, 2000). Zusätzlich ist
ein direkter Zusammenhang zwischen Reninkonzentration und der Konzentration
von COX-2 bekannt, was nicht zuletzt durch die parallele Abnahme beider
Konzentrationen (wenn sie, wie oben beschrieben, erhöht sind), unter der
Page 60
Diskussion 56
Behandlung mit COX-2 Hemmern ersichtlich ist (reviewed in Breyer et al. 2001). Da
das von COX-2 produzierte Prostaglandin E2 (PGE2), vermutlich über die Rezept-
oren EP2 und/oder EP4, in der Niere vasodilatatorisch wirkt (Breyer & Breyer,
2000), ist somit neben der vermuteten Hemmung von bestimmten Kanalproteinen,
ein Teil der erhöhten Ausscheidung von Salz und Wasser durch die erhöhte
Durchblutung der Niere erklärbar.
PGE2 inhibiert in vitro im medullären dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife
und im Sammelrohr die Natriumchlorid Absorption, vermutlich über die PGE2-
Rezeptoren EP3 und EP1. Außerdem ist es dafür bekannt, die renale Wasser-
Exkretion zu erhöhen (reviewed in Breyer et al. 2001).
Die oben genannten Beobachtungen erklären, warum Indomethacin, als unspezifi-
scher COX-Hemmer, sowie spezifische COX-2-Hemmer wie Rofecoxib oder Nime-
sulide, sich positiv auf die Erkrankung des antenatalen Bartter-Syndroms auswirken.
Durch COX-2 Hemmung ist eine deutliche Abnahme der renalen PGE2-Produktion
zu sehen, aber auch das Urinvolumen, die Natriumausscheidung und der medulläre
Blutfluss in der Niere sind erniedrigt (Reinalter et al. 2002, Nüsing et al. 2001).
Die hier aufgeführten Hypothesen führen zwangsläufig zu der Fragestellung, welche
Veränderungen auf Kanalproteinebene durch das Schleifendiuretikum Furosemid, als
Modell für den diuretikaähnlichen Wasser- und Salzverlust, wie er beim antenatalen
Bartter-Symptomenkomplex zu finden ist, stattfinden. Außerdem interessiert es
welche Rolle in diesem Zusammenhang COX-2 und der Prostaglandinrezeptor EP4
spielen, respektive wie sich durch COX-2 und EP4 die Kanalexpressionen in der
Niere verändern.
Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass der
durch Furosemid blockierte NKCC2, bei Wildtyp Mäusen (C57Bl6) unter der Be-
handlung mit Furosemid auf mRNA Ebene bedeutsam herunterreguliert wird.
Dies steht im Gegensatz zu den Arbeiten von Moreno et al., sowie Wolf et al., bei
denen keine signifikanten Veränderungen der mRNA Expression gefunden werden
konnten (Moreno et al. 1998; Wolf et al. 2001). Moreno et al. untersuchten nur den
Kortex, hingegen fanden Wolf et al. sowohl im Kortex, als auch in äußerer und
innerer Medulla keinen Unterschied in der mRNA Expression. Eine Möglichkeit für
diesen Widerspruch ist, dass Moreno et al. und Wolf et al. Ratten und nicht Mäuse
verwendeten und außerdem die mRNA nicht mit der Polymerase-Kettenreaktion
Page 61
Diskussion 57
(PCR), sondern mithilfe anderer Methoden dargestellt wurde (s. Tab. 3). Ein weiterer
Unterschied liegt in der jeweiligen Versuchsdauer, sowie der Art der Furosemid-
applikation. Während Moreno et al. den Tieren über 7 Tage Furosemid intra-
peritoneal spritzten, verwendeten Wolf et al. eine osmotische Pumpe über 6 Tage
Versuchsdauer. In der vorliegenden Arbeit wurde den Tieren das Furosemid über 10
Tage per Trinkwasser zugeführt. Aus diesen Angaben lässt sich die Hypothese
aufstellen, dass Furosemid längere Zeit braucht, um die Veränderungen auf mRNA
Ebene zu bewirken. Dies deckt sich mit der Beobachtung von Juliane Wolf (ebenfalls
Forschungsgruppe Prof. Dr. Nüsing, nicht veröffentlichter Versuch), dass ein Teil-
effekt des Furosemids, der über Prostaglandin-E2 vermittelt wird, erst nach mehreren
Tagen der Applikation des Schleifendiuretikums zum Tragen kommt.
In einer weiteren Arbeit von 2003 zeigten Na et al., dass das NKCC2-Protein unter
Furosemidgabe im Kortex, sowie der äußeren Medulla vermehrt exprimiert wurde
(Na et al. 2003). Die abweichenden Ergebnisse lassen sich durch die Tatsache er-
klären, dass nicht die mRNA, wie in der vorliegenden Arbeit, sondern das Protein
NKCC2 untersucht wurde, was auf eine posttranskriptionale Veränderung schließen
lässt. Es bleibt zu erwähnen, dass es sich beim Versuch von Na et al. ebenfalls um
Ratten und nicht um Mäuse handelte und auch nicht, wie in dieser Arbeit, die
komplette Niere untersucht wurde, sondern nur Teilbereiche (Kortex und äußere
Medulla).
Es ist auch durchaus denkbar, dass sich NKCC2, nach der Gabe eines Schleifen-
diuretikums, in bestimmten Teilbereichen der Niere unterschiedlich verändert. Hier
sind genauere Untersuchungen erforderlich um diesen Sachverhalt zu klären.
Betrachtet man die Ergebnisse der COX-2-/- und EP4-/- Mäuse, so wird deutlich, dass
bei diesen Mäusen NKCC2 unter Furosemidgabe nicht, wie bei den Wildtypmäusen,
herunterreguliert wird. Hier findet sich kein signifikanter Unterschied beider
Versuchsgruppen, es ist aber eine Tendenz zu erkennen, dass NKCC2 durch das
Schleifendiuretikum hochreguliert wird. Bei den COX-2-/- Mäusen ist Prostaglandin-
E2 vermindert, da COX-2 fehlt, während es bei den EP4-/- Mäusen nicht mehr am
Prostaglandinrezeptor EP4 binden kann.
Dies führt zu der Hypothese, dass die Transkription des NKCC2-Transporters, der im
dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife lokalisiert und für die hohe Ionen-
konzentration im Mark der Niere mit verantwortlich ist, durch erhöhte Prostaglandin-
E2-Werte, über den EP4-Rezeptor gehemmt wird. Bei der Gabe von Furosemid und
Page 62
Diskussion 58
beim Hyperprostaglandin-E2-Syndrom (HPS), ist PGE2 erhöht. Es ist somit denkbar,
dass PGE2 auf diese Art und Weise zusätzlich zum Wasser- und Salzverlust beiträgt,
was auch mit den Beobachtungen übereinstimmt, dass COX-2-Hemmer zu einer
wesentlichen Verbesserung des HPS beitragen, indem die Urinausscheidung ver-
mindert wird.
Eine Antwort auf die Frage, warum das Renin in der Niere hochreguliert wird liefert
folgender Sachverhalt, der sich durch die Aufgabe des juxtaglomerulären Apparates
erklären lässt. Wird NKCC2 in den juxtaglomerulären-Zellen unter Furosemidgabe
herunterreguliert, bzw. gehemmt, sinkt in diesen Zellen die Chloridkonzentration. Es
wird vermutet, dass diese erniedrigte Ionenkonzentration zur vermehrten Bildung
von PGE2 über COX-2 führt und über den PG-Rezeptor EP4 eine Aktivierung des
Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems stattfindet (Nüsing et al. 2005), um mehr
Wasser und Salze zu resorbieren. Zusätzlich würde, wie oben bereits angenommen,
die NKCC2-Transporterkonzentration weiter abnehmen. Der Kreislauf von
erniedrigtem NKCC2 erhöhtem PGE2 weiter erniedrigtem NKCC2 würde sich
somit im Sinne eines Circulus Vitiosus verstärken und könnte durch die Gabe eines
COX-2-Hemmers durchbrochen werden.
Natürlich muss bei diesen Hypothesen berücksichtigt werden, dass NKCC2 unter der
Furosemidgabe ohnehin blockiert ist und beim HPS ein Defekt dieses Transporters
vorliegen kann. Eine Restfunktion des Transporters ist aber in beiden Fällen noch zu
erwarten, so dass sich die Erklärungen auf eben diese Restfunktionen beziehen.
Auch für den Kaliumkanal ROMK (renal outer-medullary K+) machten Wolf et al.
die Beobachtung, dass sich die mRNA Konzentration unter 6 tägiger Furosemidgabe
nicht veränderte (Wolf et al. 2001). Der Vergleich der Versuchsbedingungen, die für
die unterschiedlichen Ergebnisse verantwortlich sein können, wurde schon für
NKCC2 abgehandelt (s. oben und Tab.). ROMK, sowohl im dicken aufsteigenden
Ast der Henle Schleife, als auch in den juxtaglomerulären Zellen mit NKCC2 co-
lokalisiert, ist für eine Art ‚Recycling’ zuständig, das heißt für den Rücktransport
von Kalium aus der Zelle in den Tubulus, wodurch die notwendige Kaliumkon-
zentration für das Funktionieren des NKCC2-Kotransporters aufrechterhalten wird.
Somit ist die signifikante Abnahme der mRNA-Expression von ROMK in dieser
Arbeit bei den C57Bl6 Mäusen, unter Furosemidgabe und die Zunahme bei den
COX-2-/- (signifikant) und den EP4-/- Mäusen (tendenziell ansteigend, nicht
Page 63
Diskussion 59
signifikant) unter der Gabe des Diuretikums nicht überraschend. Auch hier darf an-
genommen werden, dass über erhöhtes PGE2 und die Wirkung am EP4-Rezeptor der
ROMK-Kanal herunterreguliert wird.
Abb. 55 Schaubild zur möglichen Wirkung von PGE2 auf die Kanäle NKCC2 und ROMK
Furosemid NKCC2 ⇓
COX-2 ⇑ PGE2 ⇑ vermehrte Bindung am Rezeptor EP4
HPS ROMK ⇓ HPS = Hyperprostaglandin-E2-Syndrom
Um diese Theorie zu stützen ist es jedoch erforderlich, genauere Untersuchungen zu
machen, in welchen Bereichen des Nephrons NKCC2 und ROMK in welcher Weise
verändert und beeinflusst werden, da es durchaus möglich ist, dass sich die Kanal-
expressionen beispielsweise im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife anders
verhalten, als in den juxtaglomerulären Zellen, wobei aber auch eine parallele
Entwicklung möglich ist. Darüber hinaus muss die Proteinexpression nicht zwangs-
läufig mit der mRNA Konzentration übereinstimmen, da es auch andere Regulations-
mechanismen, wie beispielsweise eine vermehrte oder verminderte Translation, gibt.
Page 64
Diskussion 60
Tab. 3 Veränderungen ausgewählter Kanalproteine unter Furosemidgabe
Kanal-
protein
Veränderung bei
Furosemidgabe
Lokalisation
in der Niere
Verwendete
Verfahren
Versuchstier Autor
NKCC2 mRNA: ⇔ äußere
Medulla
nichtradioaktiver
Northern-Blot
Wistar Ratte Moreno
et al.
1998
mRNA: ⇔ Kortex,
äußere/innere
Medulla
Ribonuclease
Protection Assay
Sprague-
Dawley Ratte
Wolf et
al. 2001
Protein: ⇑
Protein: ⇑
Kortex
äußere
Medulla
Immunblotting/
Immunhistochemie
Sprague-
Dawley Ratte
Na et al.
2003
ROMK mRNA: ⇔ Kortex,
äußere/innere
Medulla
Ribonuclease
Protection Assay
Sprague-
Dawley Ratte
Wolf et
al. 2001
ClC-K1 mRNA : ⇔
mRNA : ⇔
mRNA : ⇓
Kortex
äußere
Medulla
innere
Medulla
mRNA in situ
Hybridisierung,
Microdissektion,
Real-Time-PCR
Sprague-
Dawley Ratte
Wolf et
al. 2003
Na+-K+-
ATPase
mRNA : ⇔
(α1-Untereinheit)
Kortex,
äußere/innere
Medulla
nichtradioaktive
Dot-Blot-Analyse
Wistar Ratte Merino
et al.
2000
Proteinaktivität: ⇑ Sammelrohr Mikrodissektion,
Aktivitätsassay
Sprague-
Dawley Ratte
Buffin-
Meyer et
al. 2004
NCCT mRNA: ⇔ Kortex semiquantitative
PCR
Wistar Ratte Moreno
et al.
1998
mRNA : ⇑
mRNA: ⇔
Kortex
äußere/innere
Medulla
Ribonuclease
Protection Assay
Sprague-
Dawley Ratte
Wolf et
al. 2001
Protein:
∅_Spironolacton_⇑
⊕_Spironolacton_⇔
mRNA : ⇔
Kortex Immunoblotting
(Protein)/ Northern-
Blot-Analyse
(mRNA)
Sprague-
Dawley Ratte
Abdallah
et al.
2001
Protein : ⇔ Kortex Immunblotting/
Immunhistochemie
Sprague-
Dawley Ratte
Na et al.
2003
Page 65
Diskussion 61
α-ENaC mRNA: ⇑ Kortex,
äußere/innere
Medulla
Ribonuclease
Protection Assay
Sprague-
Dawley Ratte
Wolf et
al. 2001
Protein: ⇑
Protein: ⇑
Kortex
äußere
Medulla
Immunblotting/
Immunhistochemie
Sprague-
Dawley Ratte
Na et al.
2003
β-ENaC Protein: ⇑
Protein: ⇑⇑⇑⇑
Kortex
äußere
Medulla
Immunblotting/
Immunhistochemie
Sprague-
Dawley Ratte
Na et al.
2003
γ-ENaC Protein: ⇑
Protein: ⇑⇑
Kortex
äußere
Medulla
Immunblotting/
Immunhistochemie
Sprague-
Dawley Ratte
Na et al.
2003
Betrachtet man nun die apikal im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife lokal-
isierten Kaliumtransporter KCC1, 3, 4, so sind auch hier ähnliche Beobachtungen
wie bei den luminal gelegenen NKCC2 und ROMK zu machen, was durch das Zu-
sammenspiel der verschiedenen Kanäle erklärbar ist (s. auch Abb. 1, Abschnitt I.).
Aus den im Ergebnisteil dargestellten Grafiken (s. Abschnitt III.) wird ersichtlich,
dass bei den C57Bl6 Mäusen, unter der Behandlung von Furosemid, ein signifikanter
Abfall der mRNA-Konzentrationen der Kanäle KCC1, 3 und 4 zu beobachten ist,
während die COX-2-/- Mäuse unter der Gabe von Furosemid keine signifikante Ver-
änderung, tendenziell aber eine leichte Zunahme, bei allen drei KCC-Kanälen zeigen.
Dieselbe Beobachtung konnte man auch bei den Kanälen ROMK und NKCC2
machen, so dass hier von einem ähnlichen Wirkprinzip ausgegangen werden kann
(siehe oben), allerdings mit dem Unterschied, dass diese Downregulation der mRNA,
im Falle der KCC-Kanäle, nicht EP4 vermittelt zu sein scheint. Hier lässt sich im
Gegensatz zu den oben genannten Kanälen eine signifikante Abnahme der KCC
mRNA Konzentrationen unter der Gabe von Furosemid an die EP4-/- Mäuse beo-
bachten, ähnlich wie zuvor bei den Wildtypmäusen. Demzufolge besteht die
Möglichkeit, dass das erhöhte PGE2 hier über einen anderen EP-Rezeptor wirkt.
An dieser Stelle muss natürlich ebenfalls berücksichtigt werden, dass Furosemid die
KCC-Kanäle hemmt, wenn auch nicht so stark wie NKCC2 (Gillen et al. 1996;
Payne 1997) und sich die Regulation nur auf die nicht gehemmten Anteile auswirkt.
Page 66
Diskussion 62
Außerdem sind die Kanäle nicht nur in der Henle Schleife, sondern entlang des
gesamten Nephrons exprimiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit beziehen sich auf die
ganze Niere.
Abb. 56 Schaubild zur möglichen Wirkung von PGE2 auf die Kanäle KCC1, 3, 4
Furosemid
COX-2 ⇑ PGE2 ⇑ vermehrte Bindung am Rezeptor KCC1, 3, 4 ⇓
HPS (nicht EP4) HPS = Hyperprostaglandin-E2-Syndrom
Ein weiterer Kanal der im aufsteigenden Ast der Henle Schleife lokalisiert ist, ist der
Chloridkanal ClC-K1, der im Unterschied zu den bisher behandelten Kanälen nicht
im dicken Teil, sondern im dünnen Teil dieses Astes vorkommt. In dieser Arbeit ist
auf mRNA Ebene ein tendenzieller Abfall unter der Gabe von Furosemid bei den
C57Bl6-Mäusen, zu beobachten (nicht signifikant). Wolf et al. haben bei ihren
Versuchen ebenfalls keinen signifikanten Unterschied der mRNA-Konzentration für
ClC-K1 im Kortex und in der äußeren Medulla beobachten können. Dagegen war in
der inneren Medulla ein Abfall der mRNA-Konzentration unter der Gabe des
Schleifendiuretikums zu sehen (Wolf et al. 2003). In dieser Arbeit ist für die ClC-K1
mRNA unter Furosemidgabe bei den C57Bl6- und COX-2-/- Mäusen kein signi-
fikanter Unterschied zu sehen (minimaler Abfall), während bei den EP4-/- Mäusen
bei Gabe des Schleifendiuretikums eine signifikante Abnahme zu erkennen ist. Es
scheint hier keine Regulation über COX-2 unter der Furosemidgabe stattzufinden.
Das Ergebnis der EP4-/- Mäuse passt allerdings nicht ins Bild. Eine mögliche
Erklärung: ein anderer Mechanismus führt bei Furosemidgabe zu Veränderungen am
EP4 Rezeptor, dieser fiele im Knockoutfall weg; es muss aber auch an eine mögliche
Regulation über COX-1 gedacht werden. Hier sind weitere Versuche zu diesem
Thema nötig.
Page 67
Diskussion 63
Im distalen Tubulus der Niere befindet sich der Thiazid-sensitive Natrium-Chlorid-
Kotransporter (NCCT). In einigen Versuchen wurde bisher, vornehmlich an Ratten,
die Veränderung des NCCT-Kanals auf die Gabe von Furosemid getestet. So fanden
Wolf et al. heraus, dass die mRNA des Kanals sich unter Furosemidgabe in innerer
und äußerer Medulla nicht verändert, während sie für den Kortex eine Zunahme der
mRNA feststellten (Wolf et al. 2001). Dagegen wurde bei den Versuchen von
Moreno et al., Abdallah et al., sowie Na et al. keine Veränderung der Kortex mRNA-
Konzentration des NCCT-Kanals gefunden, wenn die Tiere mit Furosemid behandelt
wurden (Na et al. 2003; Abdallah et al. 2001; Moreno et al. 1998; s. auch Tab. 3).
Abdallah et al. beobachteten eine Zunahme der Proteinkonzentration, die durch
Spironolacton unterdrückt wurde, wofür sie einen Aldosteroneffekt verantwortlich
machten (Abdallah et al. 2001).
Die unterschiedlichen Ergebnisse in den Arbeiten, sowie der hier vorliegenden, sind
möglicherweise auf die differierenden Versuchsbedingungen zurückzuführen (s.
Tab.).
In den Versuchen an den C57Bl6 Mäusen in dieser Arbeit, konnte auf mRNA Ebene
eine signifikante Abnahme zwischen den Mäusen, die das Schleifendiuretikum be-
kamen und denen die es nicht bekamen, festgestellt werden. War hingegen das COX-
2 Gen ausgeschaltet (COX-2-/- Mäuse), war eine leichte Zunahme der mRNA unter
Furosemid zu erkennen (nicht signifikant), was auf eine Unterdrückung der NCCT-
Expression durch das PGE2 hinweist. Dieser Mechanismus scheint, wie bei NKCC2
und ROMK auch, über den EP4-Rezeptor zu laufen, da die EP4-/- Mäuse ebenfalls
keine signifikante Veränderung der mRNA unter der Behandlung zeigten. Dies gilt,
wie auch bei den anderen Kanälen, immer mit der Einschränkung, das andere EP-
Rezeptor-/--Tiere nicht getestet wurden.
Auch hier erklärt sich die Wirkung einer Herunterregulation dieses Kanals aus seiner
Funktion. Der in der luminalen Membran des distalen Tubulus der Niere vor-
kommende Transporter sorgt für die Netto-Resorption von NaCl, aus dem Tubulus in
die Zelle. Der Antrieb stammt aus der basolateral sitzenden Na+-K+-ATPase.
Unter Furosemidgabe wird die NaCl Resorption erniedrigt, daher kommt es zur
erhöhten Ausscheidung von Salzen und Wasser, diese Wirkung ist teilweise durch
einen COX-2 Hemmer blockierbar, der eine erniedrigte PGE2 Konzentration zur
Folge hat, dessen Wirkung über EP4 vermittelt zu sein scheint. Daraus ergibt sich
Page 68
Diskussion 64
auch hier eine weitere Möglichkeit, wie der COX-2 Hemmer auf das antenatale
Bartter-Syndrom wirken könnte.
Abb. 57 Schaubild zur möglichen Wirkung von PGE2 auf den NCCT Kanal
Furosemid
COX-2 ⇑ PGE2 ⇑ vermehrte Bindung am EP4-Rezeptor NCCT ⇓
HPS HPS = Hyperprostaglandin-E2-Syndrom
Die Natrium-Kalium-ATPase (Na+-K+-ATPase) ist in der Niere weit verbreitet und
erfüllt dort die Funktion, Natrium aus der Zelle ins Interstitium zu transportieren,
meist um einen Gradienten für die Natriumresorption aus dem Tubulus in die Zelle
zu schaffen, und im Gegenzug Kalium in die Zelle zu bringen, das diese dann durch
Kaliumkanäle entsprechend des Gradienten wieder verlässt. Damit ist sie ent-
scheidender Antrieb für die Salz- und Wasserresorption. Da die Na+-K+-ATPase in
der Niere so weit verbreitet ist, lässt sich durch die Ergebnisse dieser Arbeit natürlich
keine Aussage machen wie sie sich in bestimmten Bereichen der Niere verändert,
sondern es ist nur eine Aussage für die komplette Niere möglich. Für diese lässt sich
die Beobachtung machen, dass sich unter der Furosemidgabe an die C57Bl6-Mäuse
eine Zunahme der Konzentration der Na+-K+-ATPase mRNA feststellen lässt, wobei
in dieser Arbeit die α-1 Untereinheit untersucht wurde.
Im Jahr 2000 machten Merino et al. die Beobachtung, dass sich die mRNA der Na+-
K+-ATPase (α-1 Untereinheit) in Kortex, sowie äußerer Medulla und innerer
Medulla nicht verändert, wenn den Versuchstieren Furosemid verabreicht wurde.
Allerdings muss angemerkt werden, dass es sich bei den verwendeten Tieren um
Ratten handelte, andere Verfahren zur Bestimmung der mRNA-Konzentration ver-
wendet wurden und natürlich muss auch der Aspekt in Betracht gezogen werden,
dass die Versuchsdauer in diesem Fall nur 7 Tage (Merino et al. 2000, s. auch Tab.
3) und nicht wie in vorliegender Arbeit 10 Tage betrug, so dass die Unterschiede
auch hierdurch begründet sein können .
Buffin-Meyer et al. beschrieben 2004, dass die Proteinaktivität der Na+-K+-ATPase
unter der Gabe des Schleifendiuretikums Furosemid im Sammelrohr zunahm
(Buffin-Meyer et al. 2004). Hier besteht natürlich die Möglichkeit, dass diese
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Diskussion 65
Erhöhung der Aktivität durch eine erhöhte Konzentration oder durch katalytische
Faktoren gesteuert sein kann. Demnach ist auch eine erhöhte Transkription der
mRNA in Betracht zu ziehen.
Eine weitere Beobachtung in der vorliegenden Arbeit ist, dass sich die mRNA-
Konzentrationen der ATPase unter Furosemidgabe bei den COX-2-/-, sowie den
EP4-/- Mäusen nicht signifikant ändern, wenn die Mäuse das Schleifendiuretikum
erhalten. Aus diesen Daten lässt sich vermuten, dass es, vermittelt über COX-2,
dadurch erhöhtem PGE2 und dessen Wirkung am Rezeptor EP4, unter der Gabe von
Furosemid zu einer vermehrten Transkription der Na+-K+-ATPase kommt. Betrachtet
man diese Annahme im Zusammenhang mit der Beobachtung von Buffin-Meyer et
al., dass die Proteinaktivität im Sammelrohr zunimmt, lässt sich die folgende
Hypothese aufstellen: Zum Ausgleich des erhöhten Wasser- und Salzverlustes unter
Furosemidgabe, wird die Konzentration der Na+-K+-ATPase im Sammelrohr
(wahrscheinlich über die vermehrte Transkription) erhöht, um im Zusammenspiel
mit anderen Kanälen (z.B. dem epithelialen Natrium-Kanal - ENaC, siehe unten) die
Natriumrückresorption zu fördern. Um weiteren Aufschluss über diese These zu
erhalten, sind detailliertere Untersuchungen der Veränderung der Na+-K+-ATPase
sowohl auf Protein, als auch auf mRNA Ebene in bestimmten Bereichen der Niere
notwendig.
Wie bereits erwähnt befindet sich der epitheliale Natriumkanal (ENaC) vor allem im
Sammelrohr der Niere. Na et al. konnten 2003 an Ratten zeigen, dass die Expression
der Untereinheiten β und γ dieses Kanals auf Proteinebene im Kortex zunimmt, wenn
den Ratten Furosemid verabreicht wurde. In der äußeren Medulla fanden sie sogar
für die β-Untereinheit eine sehr starke und die γ-Untereinheit eine starke Zunahme,
unter den zuvor genannten Bedingungen (Na et al. 2003).
Wie oben gezeigt, war auch in der vorliegenden Arbeit bei den C57Bl6-Mäusen eine
signifikante Zunahme unter derselben Medikation zu beobachten, die mRNA
Konzentration stieg sowohl für die β-, als auch für die γ-Untereinheit an.
Eine andere Beobachtung lässt sich bei den COX-2-/- Mäusen machen. Bei beiden
Untereinheiten ist keine signifikante Veränderung zu erkennen, bei ENaC β ist aber
ein tendenzieller Anstieg zu sehen.
Page 70
Diskussion 66
Dagegen ist aus den Ergebnissen für die EP4-/- Mäuse ersichtlich, dass die Unter-
einheit β des ENaC-Kanals unter der Gabe des Schleifendiuretikums einen signi-
fikanten Einbruch in der Konzentration der mRNA zeigt, während es für die γ-
Untereinheit zu keiner Konzentrationsveränderung kommt.
Aus diesen Daten lässt sich die Hypothese aufstellen, dass COX-2 einen positiven
Einfluss auf die Kanalexpression von ENaC (γ-, aber auch β-Untereinheit) hat und
diese über PGE2 und den EP4-Rezeptor ablaufen. Da es sich bei EP4 um einen
Prostaglandin-E2-Rezeptor handelt und es bei der β-Untereinheit zu einer derart
starken Abnahme kommt, ist die Annahme berechtigt, dass es sich bei dem hier be-
teiligten Prostaglandin, um zusätzlich von der Cyclooxygenase-1 katalysiertes
handelt. Dazu passt die Beobachtung, dass im Sammelrohr sehr viel COX-1 ex-
primiert ist und bei den COX-2-/- Mäusen, für ENaC β tendenziell ein Anstieg der
mRNA-Konzentration zu verzeichnen ist, der ähnlich hoch wie bei den C57Bl6-
Mäusen ausfällt (im Gegensatz dazu aber nicht signifikant ist). Es liegt hier also die
Vermutung nahe, das ENaC β vornehmlich über COX-1 und ENaC γ zum größten
Teil über COX-2 reguliert werden, es also für beide Untereinheiten unterschiedliche
Regulationsmechanismen gibt. Diese Beobachtung ist insofern interessant, als dass
man weiß, das ENaC α unabhängig von den beiden anderen Kanaluntereinheiten
reguliert wird.
Wie auch schon bei der Na+-K+-ATPase erwähnt, passt der vermutete Regulations-
mechanismus gut zu der Annahme, dass unter der Gabe des Diuretikums versucht
wird, in den distalen Bereichen des Nephrons das zuvor entstandene Resorptions-
defizit auszugleichen. Der größte Resorptionsanteil liegt aber im proximalen
Tubulus, daher ist dies nur bedingt möglich.
Da der Verlust von Wasser und Salzen bei den COX-2-/- und den EP4-/- Mäusen nicht
mehr so hoch ist, ist die reaktive Zunahme bei Gabe des Diuretikums an diese Mäuse
auch nicht mehr nötig.
Bei der Hochregulation von ENaC und der Na+-K+-ATPase darf aber auch die
Möglichkeit eines anderen Feedbackmechanismus nicht vergessen werden. In diesem
Fall wäre durch den hohen renalen Wasser- und Mineralienverlust ebenfalls eine
erhöhte Rückresorption nötig. Da durch die in der Henle Schleife runterregulierten
Kanäle, sowie der Downregulierung von NCCT, ein Konzentrationsdefizit bestünde,
würde die Niere in diesem Fall versuchen, dieses dann über distal gelegene Kanäle
auszugleichen. Dabei würden ENaC und die Na+-K+-ATPase nur indirekt über das
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Diskussion 67
von den Cyclooxygenasen produzierte PGE2 beeinflusst, nämlich über die Re-
gulation der Kanäle in der Henle-Schleife und von NCCT. Auch hier sind weitere
Untersuchungen nötig.
Zusätzlich wurden die SGK (Serum- und Glucocorticoid-regulierte Kinase) als
Stimulator von ENaC und Nedd-4 (neuronal precusor cell expressed developmentally
down-regulated 4), das beim ENaC Abbau eine Rolle spielt, untersucht.
Erstaunlicherweise war bei SGK eine Abnahme (signifikant) der mRNA-Kon-
zentration zu sehen, wenn man den C57Bl6-Mäusen das Schleifendiuretikum
verabreichte. Ebenso verhielt es sich bei den EP4-/- Mäusen, während sich für die
COX-2-/- Mäuse kein signifikanter Unterschied feststellen ließ. Diese Ergebnisse
passen nicht zu der Erwartung, dass SGK, wie auch ENaC hochreguliert werden,
wenn der Salz- und Wasserverlust steigt. Möglicherweise handelt es sich hierbei um
einen Feedbackmechanismus mit ENaC.
Betrachtet man die Nedd-4 Ergebnisse, so wird klar, dass es hier nicht zu
signifikanten Veränderungen der Protein-mRNA kommt. Nedd-4 scheint daher an
der Regulation bei Furosemidgabe nicht entscheidend teilzunehmen.
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Diskussion 68
Abb. 58 Schaubild zur möglichen Wirkung der Cyclooxygenase-1 und -2 im Sammelrohr der Niere
Furosemid
COX-2 ⇑ vermehrter NaCl-/H2O-Verlust COX-1/-2 ⇑ PGE2 ⇑
HPS vermehrte Bindung EP4-Rezeptor Na+-K+-ATPase α1 ⇑
ENaC β,γ ⇑ HPS = Hyperprostaglandin-E2-Syndrom
Daraus lässt sich abschließend die Vermutung aufstellen, dass unter den Beding-
ungen des vermehrten Wasser- und Salzverlustes, wie es beim antenatalen Bartter-
Syndrom sowie bei der Furosemidgabe der Fall ist, folgendes Kompensationsschema
greift: Die Cyclooxygenase-2 bildet vermehrt Prostaglandin-E2, dieses stimuliert den
EP4-Rezeptor, der seinerseits auf mRNA-Ebene dafür sorgt, dass die Natrium-
Kalium-ATPase (α1-Untereinheit) und ENaC γ vermehrt, während SGK, eventuell
über einen Feedbackmechanismus, vermindert produziert werden. Die COX-1 ist
möglicherweise für die Hochregulation von ENaC β, über EP4, verantwortlich.
Natürlich müssen diese Vermutungen durch weitere Versuche, vor allem der tat-
sächlichen Proteinexpression und auch der Messung der Cyclooxygenase-1 Kon-
zentration, weiter untersucht werden.
Unterstützend könnte in diesem Fall die über das Renin-Angiotensin-Aldosteron-
System (RAAS) erhöhte ENaC-Konzentration wirken, so dass sich diese Mech-
anismen vermutlich ergänzen, da durch Aldosteron vor allem die α-Untereinheit des
ENaC-Proteins erhöht wird (Masilamani et al. 1999).
Auch die Beobachtung, dass die Hemmung der Cyclooxygenase-2 zu einer
verringerten Ausscheidung führt, steht dazu nicht im Widerspruch, da, wie oben be-
reits diskutiert, die Regulation der Urinmenge und Konzentration hauptsächlich über
die Kanäle des dicken aufsteigenden Astes der Henle Schleife und des proximalen
Tubulus abläuft.
Page 73
Diskussion 69
Wenn man nun alle Ergebnisse der vorliegenden Arbeit im Zusammenhang be-
trachtet, lässt sich sagen, dass die Kanalexpressionen von NKCC2, ROMK, KCC1,
3, 4, sowie NCCT von COX-2 produziertem PGE2 vermindert werden können und
zusätzlich ein oder mehrere Kanäle gehemmt bzw. defekt sein können, was im Zu-
sammenspiel zum exzessiven Salz- und Wasserverlust führt. Auf der anderen Seite
wird, wie oben bereits erläutert, versucht, durch die im Sammelrohr exprimierten
Cyclooxygenase-1 und -2, dadurch erhöhtes PGE2, dessen Bindung an EP4 und die
resultierende Hochregulation der Proteine Na+-K+-ATPase und ENaC, den zuvor
entstandenen Verlust auszugleichen. Dies geschieht im Zusammenspiel mit dem über
COX-2 aktivierten RAAS (s. Abb. 59). Dass ein Ausgleich dieses Verlustes nicht
vollständig möglich ist, hängt damit zusammen, dass im Sammelrohr normalerweise
nur noch die Feinregulation stattfindet und daher der große Verlust aus dem Bereich
der Henle Schleife nur eingeschränkt werden kann.
Es stellt sich an dieser Stelle die Frage, warum es durch erhöhtes PGE2 überhaupt zu
einer Steigerung der Ausscheidung kommt.
Im gesunden Organismus ist dies durchaus als sinnvoll anzusehen, da PGE2 als
Entzündungsmediator zu einer erhöhten Durchblutung im Bereich des Entzündungs-
gebiets, sowie der Niere führt und es durch die vermehrte Ausscheidung über die
Niere zu einer Reduktion eventueller Giftstoffe im Körper kommen kann. Im Falle
einer Erkrankung wie dem antenatalen Bartter-Syndrom aber, kann es durch die
vermehrte renale Ausscheidung zu lebensbedrohlichen Dehydratationszuständen,
sowie Mineralstoffmangel kommen. Um die Behandlungsmöglichkeiten für die meist
jungen Patienten zu verbessern, sind zusätzliche und weiterführende Grundlagen-
forschungen auf diesem Gebiet unverzichtbar.
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Diskussion 70
Abb. 59 Schaubild zur möglichen Wirkung des Furosemid/ Pathogenese des antenatalen Bartter-Syndroms
Furosemid
Blockade bzw. Defekt von NKCC2 oder ROMK NaCl- und H2O-Ver Cl--Konz. in
HPS im dicken aufsteigenden Teil der Henle Schleife lust über Niere ⇑ JG-Zellen ⇓
COX-2 in TAL
Henle-Schleife, dist. Tubulus JG-Zellen ⇑
COX-2 ⇑ NKCC2/ROMK
COX-1 und -2 Bindung am PGE2 mRNA in TAL/ PGE2 in TAL
im Sammelrohr ⇑ EP4-Rezeptor NKCC-2 ⇓ JG-Zellen ⇓ JG-Zellen ⇑
ROMK ⇓
PGE2 im KCC1,3,4 ⇓ Bindung am
Sammelrohr ⇑ NCCT ⇓ EP4-Rezeptor
Na+-K+-ATPase α1 ⇑ Natriumrückresorption Renin
ENaC β,γ ⇑ im Sammelrohr über ENaC α ⇑ Aktivierung des
erhöhtes ENaC RAAS
HPS = Hyperprostaglandin-E2-Syndrom; NKCC2 = Natrium-Kalium-2Chlorid-Kotransporter; ROMK =
Kaliumkanal; COX = Cyclooxygenase; PGE2 = Prostaglandin-E2; TAL = dicker aufsteigender Ast der Henle
Schleife; JG-Zellen = juxtaglomeruläre Zellen; RAAS = Renin-Angiotensin-Aldosteron-System; Na+-K+-ATPase
= Natrium-Kalium-ATPase; ENaC = epithelialer Natriumkanal; SGK = Serum- und Glucocorticoid-regulierte
Kinase; Nedd-4 = neuronal precusor cell expressed developmentally down-regulated 4; EP4 =
Prostaglandinrezeptor
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Zusammenfassung und Abstract 71
V. Zusammenfassung und Abstract V.1. Zusammenfassung
Das Hyperprostaglandinsyndrom (HPS), auch antenatales Bartter-Syndrom genannt,
stellt eine Salzverlusttubulopathie dar, die durch Mutationen in den Genen für die
Proteine NKCC2, ROMK, Barttin oder ClC-Kb hervorgerufen werden kann.
Klinisch ist ein massiver Salzverlust zu beobachten, der einhergeht mit stark erhöhter
Reninaktivität (aktiviertes RAAS) und einer hohen PGE2-Ausscheidung. Unbe-
handelt führt diese Erkrankung zum Tod des Kindes. Durch lebenslange Gabe eines
Prostglandinsynthese-Hemmers, wie dem Indomethacin, und ausreichende Salz- und
Wasseraufnahme, ist eine wesentliche Unterdrückung der Symptomatik zu erreichen.
Verschiedene Arbeiten weisen auf eine pathogenetische Rolle des Enzyms COX-2
(verantwortlich für die PGE2-Bildung) und des PGE2-Rezeptorsubtyps EP4 hin.
Die Erkrankung des HPS wurde im Tiermodell durch die Gabe des NKCC2-Hemm-
stoffs Furosemid, einem Schleifendiuretikum, simuliert. Dieses wurde über 10 Tage
mittels Trinkwasser kontinuierlich zugeführt. Ziel der Arbeit war, Expressionsver-
änderungen verschiedener Proteine, die am Elektrolyttransport der Niere beteiligt
sind, zu untersuchen. Diese Untersuchungen wurden an C57Bl6-Wildtypmäusen ver-
gleichend zu COX-2- und EP4-Knockout-Mäusen durchgeführt.
Die Nieren behandelter und nichtbehandelter Tiere (Gruppengröße n=12) wurden
entnommen, die RNA isoliert und anschließend die mRNA der Proteine NKCC2,
ROMK, KCC1, 3, 4, ClC-K1, NCCT, Na+-K+-ATPase, ENaC β und γ, SGK und
Nedd-4 mittels PCR-Technik untersucht. Die relative mRNA-Expression wurde auf
die von GAPDH normiert.
Die durchgeführten Analysen zeigen, dass NKCC2, ROMK, sowie die Kalium-
chloridkanäle KCC1, 3, 4 und auch NCCT unter der Gabe von Furosemid bei den
Wildtypmäusen (C57Bl6), herunterreguliert wurden, bei den COX-2-/- Mäusen
hingegen waren die mRNA-Konzentrationen nicht erniedrigt, beim ROMK-Kanal
waren sie sogar erhöht. Diese Beobachtung weist auf eine Expressionsregulation
über die Cyclooxygenase-2 und PGE2 hin und dies könnte zum klinisch beobachteten
Wasser- und Salzverlust beitragen. Untersuchungen an EP4-/- Mäusen weisen darauf
hin, dass diese PGE2-abhängige Regulation, außer im Fall von KCC1, 3 und 4, über
den EP4 Rezeptor vermittelt wird.
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Zusammenfassung und Abstract 72
Ein anderes Bild ist für die Expression des Natriumkanals ENaC zu beobachten. Die
untersuchten β- und γ- Untereinheiten zeigen unter der Gabe von Furosemid eine
Zunahme der mRNA-Konzentrationen beim Wildtyp, während sich bei den COX-2-/-
Mäusen keine signifikanten Änderungen zeigen. Erstaunlicherweise war bei den
EP4-Rezeptor-/- Mäusen ein deutlicher Abfall der β-Untereinheit zu verzeichnen,
während bei der γ-Untereinheit kein Unterschied nachzuweisen war.
Es ist bekannt, dass infolge des Ausfalls bzw. der Hemmung von NKCC2 oder
ROMK ein erhöhter renaler Wasser- und Salzverlust aufgrund mangelnder Konzen-
trierungsfähigkeit im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife vorliegt. Außer-
dem wird vermutet, dass aus dem gleichen Grund im juxtaglomerulären Apparat,
über die verminderte Chloridkonzentration, die COX-2 und die Reninexpression
gesteigert wird. Würden nun die ohnehin gehemmten oder vermindert exprimierten
Kanäle noch zusätzlich über COX-2 herunterreguliert, wie es die Ergebnisse
annehmen lassen, wäre ein Circulus vitiosus von erniedrigter Kanalkonzentration
erhöhter COX-2 Konzentration erniedrigter Kanalkonzentration gegeben, der
durch die Gabe eines COX-2 Hemmers durchbrochen werden könnte.
Auf der anderen Seite lassen die Ergebnisse eine weitere Annahme zu: Neben dem
schon bekannten Regulationsmechanismus über das erhöhte Renin, der über eine
Aktivierung des RAAS zu einer erhöhten α-ENaC Konzentration führt, scheinen
parallel dazu die β- und γ-Untereinheiten des Natriumkanals hochreguliert zu wer-
den. Dieser Mechanismus läuft im Fall von ENaC γ vermutlich über die Cyclo-
oxygenase-2 und den Rezeptor EP4 ab. Die Cyclooxygenase-1, die wie ENaC auch
stark im Sammelrohr exprimiert wird, könnte für das erhöhte PGE2 verantwortlich
sein, das möglicherweise ebenfalls über EP4 zur Hochregulation von ENaC β führt.
Dieser Mechanismus wurde in der vorliegenden Studie jedoch nicht überprüft. Damit
würden die drei Untereinheiten zwar parallel zueinander hochreguliert und somit
eine Wirkungsverstärkung erreichen, allerdings über unterschiedliche Mechanismen.
Es bleibt zu bedenken, dass der Salz- und Wasserverlust durch die Vorgänge im
Sammelrohr nur vermindert wird, da ein wesentlicher Teil der Harnkonzentrierung
im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife stattfindet, in der ein defekter oder
blockierter Kanal die Ausschöpfung des vollen Konzentrationspotentials nicht zu-
lässt.
Page 77
Zusammenfassung und Abstract 73
Um diese Hypothese weiter zu verfolgen, sind in Zukunft weitere Versuche auf
Grundlage dieser Arbeit nötig, die neben den mRNA-Konzentrationen auch die ent-
sprechenden Proteinkonzentrationen bzw. Kanalaktivitäten messen.
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Zusammenfassung und Abstract 74
V.2. Abstract
The hyperprostaglandin E syndrome (HPS), which is also known as antenatal Bartter
syndrome, is a salt loss tubulopathy, evoked by mutations in the genes of the proteins
NKCC2, ROMK, Barttin or ClC-Kb. Clinically, a massive salt loss can be seen,
accompanied by enormously increased renin activity (activated RAAS) and high
prostaglandine E2 (PGE2) excretion. If not treated, this disease leads to the death of
the affected child. By lifelong administration of a prostaglandin synthesis inhibitor,
like Indomethacin, and sufficient salt and water intake, considerable suppression of
the symptoms can be achieved. Different papers point out a pathogenetic role of the
enzyme COX-2 (responsible for the generation of PGE2) and the PGE2 receptor-
subtype EP4.
In this study, the HPS was simulated in an animal model, by administering the
NKCC2-inhibitor furosemide, a loop diuretic. It was mixed into the drinking water
for ten days. The aim of this dissertation was to investigate the modifications of
expression of different proteins, which are involved in the transport of electrolytes in
the kidney. These investigations were carried out on C57Bl6 wildtype mice
compared to COX-2 and EP4 knockout mice.
The kidneys of treated and untreated animals (n = 12) were extracted and the RNA
was isolated. Afterwards, the mRNA of the proteins NKCC2, ROMK, KCC1, 3, 4,
ClC-K1, NCCT, Na+-K+-ATPase, EnaC β and γ, SGK and Nedd-4 was examined
using the PCR-technique. The relative expression of mRNA was standardized to that
of GAPDH.
The results of the analysis show that NKCC2, ROMK, as well as the potassium-
chloride-channels KCC1, 3, 4 and NCCT were downregulated by administering
furosemid to C57Bl6-mice, while the mRNA concentrations of the COX-2-/- mice
were not decreased and in the case of ROMK even increased. These observations
indicate that the expression is regulated by Cyclooxygenase-2 and PGE2 and that this
could be one of the reasons for the clinically seen salt and water loss. The
investigations of the EP4-/- mice allow the assumption that this PGE2 related
regulation could be mediated by the EP4 receptor, with the exception of KCC1, 3, 4.
The results are different in terms of the ENaC channel. The investigated subunits β
and γ show an increase of the mRNA-concentrations in the wildtype mice when
furosemide is given, however there were no significant differences for the COX-2-/-
Page 79
Zusammenfassung und Abstract 75
mice. Astonishingly, a significant β subunit decrease of EP4-receptor-/- mice could
be noticed whereas the γ-subunit expression remained stable.
It is postulated that there is an increased water and salt loss caused by the deficit or
the inhibition of NKCC2 or ROMK which leads to inadequate ability for urine to
concentrate in the thick ascending limb of Henle. Furthermore, it is suspected that,
for the same reason, the expression of COX-2 and renin in the juxtaglomerular
apparatus is increased by a decreased chloride concentration. If the already decreased
or inhibited exprimated channels were additionally downregulated by COX-2, as
could be supposed according to the previous results, there would be a circulus
vitiosus of decreased channel concentration increased COX-2 concentration
decreased channel concentration, which could be interrupted by the administering of
a COX-2 inhibitor.
The results also permit a further assumption: Besides the already known mechanism
of regulation by increased renin, which leads to an increased α-ENaC concentration
by RAAS, β- and γ-subunits seem to be simultaneously upregulated to this. This
mechanism is probably regulated by Cyclooxygenase-2 and the receptor EP4 for
ENaC γ. Cyclooxygenase-1, which is, like ENaC, also strongly exprimated in the
collecting duct, could be responsible for the increased PGE2 which, perhaps via EP4
as well, leads to an increase of ENaC β. This mechanism was not investigated in this
essay. According to that thesis, the three subunits would be simultaneously up-
regulated which would cause a stronger effect, although this would be achieved by
different mechanisms.
It should be considered, that salt and water loss is only decreased by the processes in
the collecting duct. The reason for this is that a big part of the urine concentration
takes place in the thick ascending limb of Henle, where a defect or inhibited channel
does not allow the exhaustion of the full potential of concentration.
In order to investigate this hypothesis further, more experiments would be necessary
that base on the present examination, which, apart from the mRNA concentration,
measure protein concentration and channel activities as well.
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Anhang
VII. Anhang
Verzeichnis der akademischen Lehrer
Meine akademischen Lehrer waren die Damen und Herren:
In Marburg: Aumüller, Adamkiewicz, Barth, Basler, Baum, Becker, Behr,
Bertalanffy, Bien, Christiansen, Cetin, Czubayko, Daut, Eilers, Feuser, Fuchs,
Gerdes, Geus, Gotzen, Gress, Griss, Grzeschik, Gudermann, Hasilik, Hertl,
Hofmann, Jungclas, Kann, Kill, Klenk, Klose, Koolman, Krause, Kretschmer, Krieg,
Kroll, Lang, Langer, Lill, Löffler, Maier, Maisch, Mandrek, Moll, Moosdorf, Müller,
Mueller, Mutters, Neubauer, Nüsing, Oertel, Remschmidt, Renz, Röhm, Rothmund,
Schäfer, Schmidt, Schnabel, Schuhmacher, Seitz, Seyberth, Steiniger, Stiletto,
Studer, Vogelmeier, Voigt, Wagner, Weihe, Werner, Wulf
In Kassel Siebert und in London (St. Helier) Bending
Page 91
Anhang
Danksagung
Als erstes möchte ich meinem Doktorvater Prof. Dr. Rolf Nüsing für die Überlassung
des Themas und die sehr gute Betreuung während der Durchführung der Arbeit
danken. Er hatte immer ein offenes Ohr und ihm verdanke ich produktive Gespräche,
die sich positiv auf den Fortgang der Arbeit ausgewirkt haben, sowie viele
zusätzliche Ideen.
Des weiteren möchte ich mich bei Anika Schuster und Antje Treude für die
Unterstützung vor allem im Zusammenhang mit den Tierversuchen bedanken, die
mir vieles erleichtert haben, sowie allen anderen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen
der AG Molekulare und Experimentelle Pharmakologie in der Kinderklinik Marburg
für freundliche Hilfe oder einfach nur nette Gespräche, durch die die Arbeit sehr viel
kurzweiliger wurde. Kym Turner danke ich für die Korrektur des Abstracts.
Ein ganz besonderer Dank geht an meine Familie und Großeltern, vor allem aber
meine Eltern für die tolle Unterstützung nicht nur während der Doktorarbeit, sondern
auch für die Ermöglichung des Studiums, ohne das die Arbeit nie zustande
gekommen wäre. Auch bei meiner Freundin Sandra möchte ich mich für den
Beistand, insbesondere während der Abfassung der Arbeit, bedanken.