Márcia Almeida Galvão Teixeira Reação hansênica e imunidade: polimorfismos do gene NRAMP1(SLC11A1) em indivíduos paucibacilares e multibacilares atendidos em dois centros de referência no Recife, nordeste do Brasil Tese aprovada pelo Colegiado do Curso de Doutorado em Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito à obtenção do título de Doutora em Medicina Tropical Orientadora: Profa. Dra. Vera Magalhães da Silveira (UFPE) Co-orientador: Prof. Dr. Emmanuel Rodrigues de França (UPE) RECIFE 2009
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Márcia Almeida Galvão Teixeira
Reação hansênica e imunidade: polimorfismos do gene NRAMP1(SLC11A1) em indivíduos paucibacilares e multibacilares atendidos em dois centros de referência no Recife, nordeste do Brasil
Tese aprovada pelo Colegiado do Curso de Doutorado em Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito à obtenção do título de Doutora em Medicina Tropical
Orientadora: Profa. Dra. Vera Magalhães da Silveira (UFPE)
Co-orientador: Prof. Dr. Emmanuel Rodrigues de França (UPE)
RECIFE 2009
Teixeira, Márcia Almeida Galvão
Reação hansênica e imunidade: polimorfismos do gene NRAMP1(SLC11A1) em indivíduos paucibacilares e multibacilares atendidos em dois centros de referência no Recife, nordeste do Brasil / Márcia Almeida Galvão Teixeira. – Recife : O Autor, 2009.
Xiv + 91 folhas ; il., fig., tab. e quadros.
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Medicina Tropical, 2009.
Inclui bibliografia, anexos e apêndices.
1. Hanseníase. 2. Reações hansênicas. 3. Polimorfismo genético. 4. Fragmento de restrição. I. Título.
616-002.73 CDU (2.ed.) UFPE 616.998 CDD (22.ed.) CCS2009-162
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITORPROF. AMARO HENRIQUE PESSOA LINS
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROF. ANÍSIO BRASILEIRO DE FREITAS DOURADO
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDEPROF. JOSÉ TADEU PINHEIRO
DIRETOR SUPERINTENDENTE DO HOSPITAL DAS CLÍNICAS PROF. GEORGE DA SILVA TELLES
COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
PROFA. ROSÂNGELA CUNHA DUARTE COELHO
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃOEM MEDICINA TROPICAL
PROFA. HELOÍSA RAMOS LACERDA DE MELO
CORPO DOCENTE PERMANENTE
PROFA. CÉLIA MARIA MACHADO BARBOSA DE CASTROPROF. EDMUNDO PESSOA DE ALMEIDA LOPES NETOPROFA. ELIZABETH MALAGUEÑO DE SANTANAPROF. FÁBIO ANDRÉ DOS SANTOS BRAYNERPROFA. HELOÍSA RAMOS LACERDA DE MELOPROFA. MARIA AMÉLIA VIEIRA MACIEL
PROFA. MARIA DO AMPARO ANDRADE PROFA. MARIA ROSÂNGELA CUNHA DUARTE COELHO PROF. RICARDO ARRAES DE ALENCAR XIMENES PROFA. VALDÊNIA MARIA OLIVEIRA DE SOUZA PROFA. VERA MAGALHÃES DA SILVEIRA
CORPO DOCENTE COLABORADOR
PROFA. MARIA DE FÁTIMA PESSOA MILITÃO DE ALBUQUERQUEPROFA. SÍLVIA LEMOS HINRICHSEN
ii
DEDICATÓRIA
A Edgar,
pelo estímulo e apoio na realização desse trabalho;
Ao meus filhos Bárbara e Heitor,
por estarem juntos e compreenderem os momentos de ausência;
A minha avó materna (in memoriam),
por todos os conselhos e motivação para o estudo;
Aos meus pais,
Pelo carinho e dedicação.
iii
AGRADECIMENTOS
Aos pacientes que num gesto de desprendimento concordaram em participar do estudo.
Aos professores Vera Magalhães e Emmanuel França pela orientação, críticas e sugestões.
À dra. Ana Hatagima, Dra. Norma Lucena, Alessandra Ramos e os funcionários do laboratório do IMIP pela imensa colaboração na realização da genotipagem.
Aos colegas dras. Fátima Brito, Iara Santana, Márcia Oliveira, Miguel Vasconcelos, Jane Martins, Rosana Libório e a enfermeira Ivaneide pelo incentivo e colaboração no encaminhamento dos pacientes.
Aos funcionários do CISAM e da Policlínica Lessa de Andrade que me receberam de braços abertos e sempre prestativos.
Aos drs. Socorro Pereira, Luidson, Patrícia Moura e Tatiana pela orientação e ajuda nas questões relativas aos aspectos genéticos da pesquisa.
A dra. Ângela Rapela pelo tempo dedicado ao auxílio na preparação do projeto da tese.
Ao professor dr. Ricardo Ximenes e o estatístico Ulisses Montarroyos pela ajuda nas questões estatísticas.
Às médicas residentes do Hospital Oswaldo Cruz, Juliana Fontan, CláudiaElise Ferraz e Carolina Lins pela ajuda no atendimento aos pacientes.
Aos professores e colegas de pós-graduação, Walter Galdino e demais funcionários por estarem juntos e auxiliarem nessa caminhada.
Aos meus pares do Hospital Oswaldo Cruz pela boa vontade em flexibilizar horários.
iv
Resumo
A hanseníase é uma doença infecciosa que pode vir acompanhada das reações hansênicas que são quadros frequentes e importantes no contexto da doença, pois podem ser responsáveis pelo retratamento e pelas incapacidades. O entendimento dos padrões reacionais é primordial para o seu manejo. Vários são os fatores, dentre eles o genético, que podem influenciar no desenvolvimento das formas clínicas da hanseníase e das reações. Este trabalho consta de dois artigos. O primeiro cujo título é: “Características epidemiológicas e clínicas das reações hansênicas em indivíduos paucibacilares e multibacilares atendidos em dois centros de referência para hanseníase na cidade de Recife-PE”, teve a finalidade de descrever as características epidemiológicas e clínicas de 201 pacientes com história de quadro reacional. Variáveis epidemiológicas e clínicas como baciloscopia inicial, sexo, idade, fototipo, procedência, forma clínica, retratamento e tipo de tratamento e de reação, índice baciloscópico final e período de surgimento da reação em relação ao tratamento, foram avaliados. Para cálculo dos fatores de risco para as formas multibacilares foram realizadas análises univariada e multivariada. Sexo masculino, pele fototipo V, idade entre 30 - 44 anos e procedência do Recife caracterizaram a maioria da amostra. Em relação às características clínicas, a forma clínica borderline, tratamento regular, reação tipo I, neurite, presença de 10 a 20 nódulos e surgimento da reação hansênica durante o tratamento foram os achados mais frequentes. Pela análise univariada, os pacientes submetidos ao retratamento tiveram chance uma vez maior de serem multibacilares. Ainda em relação à comparação do quadro reacional entre indivíduos paucibacilares e multibacilares, pela análise multivariada, indivíduos do sexo masculino tiveram chance uma vez maior de serem multibacilares. As reações hansênicas se desenvolveram predominantemente durante o tratamento. O segundo artigo, sob o título: “Polimorfismos do gene NRAMP1 em indivíduos com reações hansênicas atendidos em dois centros de referência no Recife, Nordeste do Brasil” abordou o aspecto genético da amostra estudada no primeiro artigo, avaliando três polimorfismos do gene NRAMP1 por meio de um estudo comparativo e observacional, que através do polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP), investigou a frequência de três polimorfismos gênicos da proteína NRAMP1: 274C/T, D543N, 1729+55del4. O genótipo mutante 274 TT foi associado positivamente ao eritema nodoso (p=0,04) e negativamente à reação reversa (p=0,03). Esses resultados sugerem que o polimorfismo 274 C/T do gene NRAMP1 pode auxiliar na determinação da susceptibilidade à reação tipo II em indivíduos com hanseníase.
Palavras-chave: Hanseníase, reações hansênicas, polimorfismo genético, fragmento de restrição.
v
Abstract
Leprosy is a infectious disease and reactions are very frequent and responsible for retreatment and incapacities. The pattern of theses reactions is primordial to their management. Many factors including genetics can influence the development of paucibacillary, multibacilary and reactions. This study includes two articles. The first one, under the title “Clinical and epidemiological characteristics of the leprosy reactions in paucibacillary and multibacillary off two different reference hospitals in Recife – PE” described epidemiological and clinical characteristics of 201 patients with history of leprosy reactions. Initial baciloscopy, sex, age, skin phototype, origin, clinical form, retreatment, treatment and leprosy type, final baciloscopy and the relationship between the treatment period and the onset of the reaction were evaluated. Univariate and multivariate analysis were performed to calculate odds ration to multibacyllary forms. Male, Fitzpatick’s skin type V, age between 30-44 and origin from Recife were the majority of the sample. In attend to clinical characteristics, borderline type, regular treatment, reverse reaction, neuritis, 10 to 20 nodules and leprosy reaction developed during the treatment were the most frequent. Retreatment demonstrated statistical association with multibacillary forms on univariate analysis. Male had one more chance to have multibacilar form. The reaction developed mainly during the treatment. Within the second article, under the title “NRAMP1 gene polymorphisms in individuals with Leprosy reactions of two different reference hospitals in Recife, northeast of Brazil” broached genetics aspects of the sample studied in the first article analyzed, three NRAMP1 gene polymorphisms 274C/T, D543N and 1729+55del4 in a comparative and observational study typed by Restriction Fragment Length Polymorfism-Polimerase Chain (RFLP). The wild genotype 274 TT was associated with positivity of erythema nodosum leprosum (p=0,04) and with the negativity of the reversal reaction (p=0,03). The 274 C/T NRAMP1 polymorphism aids in the determination to the susceptibility to type II reaction in Leprosy patients.
Tabela 1 - Distribuição das variáveis de caracterização dos 201 pacientes
reacionais atendidos no CISAM e Policlínica Lessa de Andrade, 2007- 2008......76
Tabela 2 - Distribuição das frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos
274 C/T, D543N e 1729+55del 4 do gene NRAMP1 dos pacientes multibacilares
paucibacilares com reação hansênica...................................................................77
viii
Tabela 3 - Distribuição das frequências alélicas e genotípicas de cada
polimorfismo segundo baciloscopia e sexo dos pacientes.................................... 73
Tabela 4 - Distribuição das frequências alélicas e genotípicas de cada
polimorfismo segundo baciloscopia e fototipo dos pacientes................................ 78
Tabela 5 - Distribuição dos pacientes reacionais estudados quanto às
frequências genotípicas de cada polimorfismo e o tipo reacional..........................79
ix
Lista de Siglas e Abreviaturas
A AdeninaAIDS Acquired Immunodeficiency SyndromeAvaII Enzima de restrição - Anabaena variabilis II BAAR Bacilo Álcool Ácido ResistenteBB Borderline Borderline BCG Bacilo de Calmette e GuérinBT Borderline TuberculóideBL Borderline Lepromatosa BV Borderline Virchowiana C CitosinaC3D Componente plasmático da cascata do sistema complemento 3DCISAM Centro de Saúde Amaury de Medeiros CNDS Coordenação Nacional de Dermatologia SanitáriaDD Dimorfa – DimorfaDT Dimorfa – tuberculóideDV Dimorfa – VirchowianaENH Eritema Nodoso HansênicoEP Eritema Polimorfo ENN Eritema Nodoso NecrotizanteFIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz Fok I Enzima de restrição - Flavobacterium okeanokoites I G GuaninaGPDH Glicerol 3-fosfato desidrogenaseHIV Human Immunodeficiency VirusHLA Histocompatibility leukocyte antigen - Antígeno leucocitário humanoIBF Índice Baciloscópico Final (alta terapêutica)IBI Índice Baciloscópico Inicial (início de tratamento)IFN γ Interferon gamaIL Interleucina INOS Enzima Óxido Nítrico Sintetase LL Lepromatosa Lepromatosa MB MultibacilarMHC Complexo de Histocompatibilidade Principal MHD Hanseníase DimorfaMHI Hanseníase IndeterminadaMHT Hanseníase TuberculóideMHV Hanseníase VirchowianaMnl Enzima de restrição - Moraxella nonliquefaciens MS Ministério da SaúdeNRAMP1 Natural resistance associated macrophage protein 1 - proteína 1
associada à resistência natural do macrófagoOMS Organização Mundial de SaúdePARK 2 Parkinson familiar 2PARK G Parkinson familiar G PB Paucibacilar
x
PCR Polymerase Chain Reaction - Reação em Cadeia da PolimerasePQT PoliquimioterapiaRFLP Restriction Fragment Length Polymorfism- Polimerase Chain - Polimorfismo de fragmento de restrição RMP RifampicinaRNI Reativos intermediários do nitrogênioRR Reação ReversaSC ComplementoSINAN Sistema de Informação de Agravos de NotificaçãoSlc11a1 Solute carrier family 11, member 1SNP Single-nucleotide polymorphism - Polimorfismo de nucleotídeo único T TimidinaTGF-β1 Transforming growth factor beta 1- Fator beta 1de transformação de crescimento Th1 Linfócitos T helper 1Th2 Linfócitos T helper 2TLR Toll like receptors – Receptores tipo toll TNF- alfa Fator alfa de Necrose TumoralTT Tuberculóide tuberculóideVDR Gene do receptor de vitamina DVV VirchowianosWHO World Health Organization
úlceras; dor ou espessamento em um ou mais nervos periféricos (neurite);
linfadenopatia; irite; artrite e/ou artralgia e edema/ dor em mãos e pés. Também
foi considerada reação tipo II se fosse observado o eritema polimorfo isolado.
j) Índice baciloscópico final:
Definição: resultado da baciloscopia realizada no final do tratamento
conforme classificação da OMS.
Categorização:
paucibacilar (índice = 0.00)
multibacilar (índice >0,01)
não informado
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k) Período de surgimento da reação clínica:
Definição: período de tempo em relação ao tratamento em que surgiu a
reação hansênica que constava no prontuário ou referido pelo paciente.
Categorização:
antes do tratamento
no tratamento
menos de 6 meses após a alta
acima de 6 meses após a alta
acima de um ano após a alta
l) Regularidade do tratamento:
Categorização:
sem abandono por mais de 3 meses consecutivos
com abandono de tratamento por mais de 3 meses consecutivos
m) Retratamento:
Definição: se o paciente realizou novo tratamento para hanseníase, após
ter realizado o tratamento completo.
Categorização: sim/não
Qualidade dos instrumentos de medida
Padronização das técnicas
Na pesquisa foram empregados os seguintes métodos diagnósticos:
32
a) Baciloscopia: Isolamento do M. leprae segundo normas nacionais e
consiste de pequena incisão na pele feita com lâmina de bisturi nos seguintes
locais: 02 lóbulos de orelhas, cotovelo direito e lesão, coloração de Ziehl-Neelsen
e leitura pela escala logarítmica de Ridley, realizados no laboratório do
CISAM/UPE.
b) Extração, amplificação do DNA, digestão enzimática e
identificação dos polimorfismos através da técnica do polimorfismo de fragmento
de restrição (RFLP).
O DNA genômico foi extraído de leucócitos pelo protocolo de Lahiri e
Nurnberger86, e quantificado em gel de agarose pela comparação com padrões de
DNA.
A determinação dos polimorfismos foi realizada através da reação em
cadeia da polimerase (PCR) seguida pela técnica do polimorfismo de fragmento
de restrição (RFLP) proposto por Lui et al.78. A reação foi realizada em um total de
25µL contendo 50 ng a100 ng de DNA, Tris-HCL 10 mM (pH 9.0), KCl 50 mM,
MgCl 1,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 20 pmol de cada iniciador e uma unidade
de Taq DNA polymerase (Biotools, USA).
Os iniciadores utilizados na PCR foram: 5’-
TCGCACCATCCCTATACCCAG-3’ e 5’-TCTCGAAAGTGTCCCACTCAG-3’ para
o polimorfismo 274 C/T e 5’-GCATCTCCCCAATTCATGGT-3’ e 5’-
AACTGTCCCACTCTATCCTG-3’ para os polimorfismos D543N e 1729 + 55 del 4.
As condições da reação foram: um ciclo inicial de 94oC por 3 min, seguido de um
protocolo com 35 ciclos a 94oC por 1 min para desnaturação, 60oC por 1 min para
anelamento e 72oC por 1 min para extensão e um ciclo de extensão final de 72oC
33
por 10 min no termociclador Gradient da Eppendorf. As amostras foram
submetidas à amplificação do gene constitutivo GPDH como controle positivo de
reação e verificação da qualidade do DNA extraído. Como controle negativo da
reação, foram usados os reagentes da PCR, em ausência de DNA. O produto da
amplificação foi visualizado em gel de agarose a 2% corado pelo brometo de
etídeo (0,5µg/mL), sob luz ultravioleta e fotografado com filme Polaroid 667.
A segunda etapa do ensaio constou de digestão enzimática de 5 µL do
produto da PCR, adicionados a uma solução preparada com tampão (1x) de
reação NEBuffer4 (BioLabs®, United Kingdom). Para o polimorfismo 274 C/T a
PCR produziu fragmentos de 216 pares de bases (bp), os quais tratados pela
enzima de restrição Mnl I a 37°C durante 18 horas, definiram o alelo mutante (T)
correspondente aos fragmentos 167, 37 e 12bp e o alelo selvagem (C),
correspondente aos fragmentos 102, 65, 37 e 12bp. Para o polimorfismo D543N,
os fragmentos com 240 bp ou 244bp foram submetidos à enzima de restrição Ava
II, definindo o alelo mutante (A) correspondente aos fragmentos 201 e 39bp e o
selvagem (G) correspondente aos fragmentos 126, 79 e 39bp. Os fragmentos do
polimorfismo 1729 + 55del4, com 240bp ou 244bp, foram submetidos à enzima de
restrição Fok I definindo o alelo mutante (-TGTG), correspondente ao fragmento
240bp, e o alelo selvagem (+TGTG), com os fragmentos 211 e 33bp.
O produto da digestão foi visualizado em gel de poliacrilamida a 10% e
corado pela prata. O gel foi secado em filme celofane e arquivado para
determinação dos genótipos segundo o protocolo de Liu et al.78.
34
Métodos de coleta
Os pacientes que compareceram ao ambulatório de hanseníase do Centro
Integrado de Saúde Amaury de Medeiros (CISAM) e Centro de Saúde Lessa de
Andrade por demanda espontânea, foram convidados a participar do estudo e,
após explicação dos objetivos do mesmo e consentimento livre e esclarecido,
foram divididos em dois grupos: aqueles com baciloscopia inicial positiva e que
apresentaram reação hansênica, e o grupo comparativo que foi selecionado entre
os pacientes com baciloscopia inicial negativa.
Nos pacientes foram realizados exame clínico dermatológico e neurológico.
Os dados foram coletados através de um questionário, elaborado para este
estudo (Apêndice B) que se compõe de dados relativos à identificação,
diagnóstico e tratamento (dados do prontuário) e à caracterização do estado
reacional e genotipagem.
Após o procedimento anterior foi coletado de cada paciente sangue venoso
periférico, em torno de 7,0 ml em tubos vaicutaner contendo citrato de sódio,
estocados em refrigeração adequada no laboratório de biologia molecular do
Aggeu Magalhães – FIOCRUZ para obtenção das amostras de DNA.
Plano de tabulação e análise dos dados
Para avaliar a associação da variável dependente com cada uma das
variáveis independentes foi calculado o odds ratio (OR), intervalo de confiança e
valor de p (teste do Qui-quadrado - χ2).
35
Foi realizada uma análise multivariada através de modelo de regressão
logística. O modelo foi inicialmente saturado com a inclusão de todas as variáveis
que na análise univariada apresentaram valor de p<0,20 e foi testada a
significância estatística da retirada de cada uma das variáveis. A análise
multivariada foi utilizada em virtude da necessidade de lidar, simultaneamente,
com muitas variáveis, controlando o efeito de cada fator pelos outros fatores
estudados para verificar quais são independentes.
As frequências alélicas e genotípicas foram calculadas pela contagem gênica
direta.
A análise estatística foi realizada pelos programas MSOffice Excel versão
2003 para o gerenciamento do banco de dados; Statistical Package for Social
Sciences (SPSS) for Windows versão 12.0, para a execução dos cálculos
estatísticos, elaboração e edição de gráficos e MSOffice Word versão 2003, para
elaboração das tabelas. Foram empregados os testes Qui-quadrado (Mantel-
Haenszel), para testar associação entre variáveis qualitativas, e exato de Fisher,
nos casos em que o valor esperado era menor que cinco, ambos em nível de
significância de 0,05.
Considerações éticas
Os pacientes que participaram do estudo assinaram um termo de
consentimento (Apêndice A) e foram esclarecidos dos riscos e benefícios além da
confidencialidade da pesquisa.
O projeto teve a aprovação do Comitê de Ética do CISAM por meio do
CAAE nº. 0009.0.250.250-07 (Anexo I).
36
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Características epidemiológicas e clínicas das reações
hansênicas em indivíduos paucibacilares e multibacilares
atendidos em dois centros de referência para hanseníase na
cidade de Recife - PE
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Características epidemiológicas e clínicas das reações hansênicas em
indivíduos paucibacilares e multibacilares atendidos em dois centros de
referência para hanseníase na cidade de Recife - PE
Márcia Almeida Galvão Teixeira1
Vera Magalhães da Silveira2
Emmanuel Rodrigues de França3
1 Professora assistente do Departamento de Dermatologia da Universidade de Pernambuco (UPE) – Recife (PE), Brasil2 Doutora em Doenças Infecciosas e Parasitárias pela Universidade Federal de São Paulo, Unifesp. Professora titular do Departamento de Medicina Tropical da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) – Recife (PE), Brasil3 Doutor e Livre-Docente em Dermatologia. Professor Adjunto e Chefe do Serviço de Dermatologia da Faculdade de Ciências Médicas de Pernambuco, Universidade de Pernambuco (UPE) – Recife (PE), Brasil
Endereço para correspondência: Rua Jornalista Guerra de Holanda, 158, apto 1102 Casa Forte. CEP 52061010 Recife, PE, Brasil Fone: (81) 34272268/92454349. e-mail: [email protected] do estudo: Centro de Saúde Amaury de Medeiros da Universidade de Pernambuco e Policlínica Lessa de Andrade - Recife, PE.
Os autores do trabalho não receberam apoio financeiro e não têm conflito de interesse.
Características epidemiológicas e clínicas das reações hansênicas em
indivíduos paucibacilares e multibacilares atendidos em dois centros de
referência para hanseníase na cidade de Recife - PE
Resumo
Introdução: As reações são frequentes e importantes no contexto da hanseníase, representando uma significativa parcela de pacientes com incapacidades e submetidos ao retratamento. A caracterização clínico-epidemiológica dos padrões reacionais é primordial para o manejo desses pacientes. O objetivo desse trabalho é descrever as características epidemiológicas e clínicas das reações hansênicas em indivíduos paucibacilares e multibacilares. Métodos: Estudo transversal onde foram avaliados 201 pacientes com história de quadro reacional, atendidos em dois centros de referência para tratamento da hanseníase. Variáveis como baciloscopia inicial, sexo, idade, fototipo, procedência, forma clínica, tipo de tratamento e de reação, índice baciloscópico final e período de surgimento da reação em relação ao tratamento foram avaliados. A análise estatística foi realizada usando-se frequências simples. Para cálculo dos fatores de risco para as formas multibacilares, foram realizadas análises univariada e multivariada.Resultados: Sexo masculino, idade entre 30-44 anos, fototipo V, a forma clínica borderline, tratamento regular, reação tipo I, neurite, presença de 10 a 20 nódulos e surgimento da reação hansênica durante o tratamento foram os achados mais frequentes. Os indivíduos do sexo masculino apresentaram associação estatisticamente significante com a forma multibacilar.Conclusões: Predominaram os indivíduos do sexo masculino que se associaram a um maior risco de desenvolvimento da forma multibacilar. A forma clínica borderline prevaleceu entre os pacientes reacionais e as reações hansênicas foram mais frequentes durante o tratamento. Os pacientes multibacilares foram mais propensos ao retratamento, e aqueles com reações tipo I e II, apresentaram maior frequência de neurite, linfadenopatia, artrite e irite do que aqueles com reação isolada.
Palavras-chave: Hanseníase; Reações hansênicas; Epidemiologia; Sinais e Sintomas.
45
Abstract
Background: The reactional onsets are frequent in cases of leprosy and important in the context of the disease, representing a significant portion of patients undergoing retreatment and disabilities. The characterization of clinical and epidemiological patterns of reactional onsets is essential for the management of these patients.Objectives: To describe the epidemiological and clinical characteristics of reactions in paucibacillary and multibacillary individuals in a population sample in the city of Recife in order to assist the management of reactional onsets.Methods: Cross-sectional study evaluated 201 patients with history of the reactional onsets, seen at two referral centers for treatment of leprosy. Variables such as initial baciloscopy, sex, age, skin type, origin, clinical presentation, retreatment and type of reaction, final baciloscopy index and period of reaction onset in relation to the treatment were evaluated. Statistical analysis were performed using simple frequencies. Risk factors for multibacillary were analyzed with univariate and multivariate analysis.Results: Male, age between 30 – 44, phototype V, borderline clinical form, regular treatment, type I reaction, neuritis, presence of 10 to 20 nodules and sprouting of the leprosy reaction during the treatment had been the most frequent findings. Male patients showed significant statistical association with the multibacillary form.Conclusions: Prevailed male patients that showed significant statistical association with the multibacillary form. The borderline form prevailed among reational patients and the leprosy reactions were more frequent during the treatment. Multibacillary patients were more susceptive to the retreatment and those with type I and type II reactions had neuritis, Linphadenopathy, arthritis and iritis more frequently than those with isolate forms.
Keywords: Leprosy; Leprosy reactions; Epidemiology, Signs and Symptoms.
46
Introdução
Os indivíduos hansenianos podem ser surpreendidos por quadros ou
estados reacionais, intercorrências no curso da doença, que estão presentes em
cerca de 10% a 50% dos casos, principalmente nas formas multibacilares e
constituem importantes fatores de risco para retratamento, além de responsáveis
por abandono de tratamento e incapacidades1,5.
Brito4, em 2004, estudando 310 pacientes hansenianos,
observou que aqueles que sofriam com episódios reacionais após alta,
apresentavam três vezes mais possibilidades de retratamento por recidiva que o
grupo controle.
As reações hansênicas refletem fenômeno de hipersensibilidade aguda
diante dos antígenos do Mycobacterium leprae15 e decorrem de processo
imunológico acompanhado de aumento de citocinas pró-inflamatórias,
principalmente IFN-γ, entre outras8,13, além de imunocomplexos19
.
Os quadros reacionais podem surgir antes ou, mais frequentemente, durante
ou após o tratamento. A duração e o número desses surtos reacionais dependem
muitas vezes da forma clínica, bem como do índice baciloscópico inicial2,11.
As reações hansênicas são classificadas em dois tipos de acordo com Ridley
e Jopling20: reação hansênica tipo I ou reversa (RR), que acomete indivíduos
paucibacilares e multibacilares e envolve a imunidade celular, e a reação
hansênica tipo II com os tipos Eritema Nodoso Hansênico (ENH), Eritema
Polimorfo (EP) e Eritema Nodoso Necrotizante (ENN), com participação mais
efetiva da imunidade humoral e acomete os indivíduos multibacilares. A neurite
pura ou isolada pode ser classificada como reação tipo I ou um terceiro tipo de
47
reação hansênica. A reação tipo I pode ser ascendente, quando há aumento da
imunidade específica ou descendente quando há uma queda da imunidade,
sendo a expressão clínica das reações ascendentes e descendentes,
semelhantes24.
Episódios de reação tipo I ou reversa acometem entre 10% e 33% dos
pacientes com hanseníase e surgem geralmente, durante o tratamento ou após o
primeiro ano da alta e apresentam as seguintes características clínicas: infiltração
de lesões antigas associada ao surgimento de novas lesões em forma de
manchas ou placas infiltradas, eritema, dor, lesões vésico-bolhosas, ulcerações,
hiperestesia, parestesia, mal-estar, dor ou espessamento de nervos periféricos
com perda da função sensitivo-motora e, mais raramente, febre, déficit da função
neural na ausência de sintomas (neuropatia silenciosa), acometendo
principalmente os nervos ulnar e tibial posterior1,16.
As reações tipo II são caracterizadas pelo surgimento abrupto de nódulos
que podem variar de poucos a inúmeros, de coloração rósea, que podem evoluir
para necrose, nas formas mais graves do ENH (eritema nodoso necrotizante).
Também vem acompanhadas de sintomatologia relacionada ao acometimento
ocular, hepático, esplênico, de linfonodos, peritônio, testículos, articulações,
tendões, músculos, ossos e rins. Pode haver febre e leucocitose 17. Geralmente
apresentam-se em múltiplos episódios18.
O uso de corticóides no tratamento da reação reversa e da talidomida para o
tratamento do eritema nodoso é recomendado pela organização mundial de
saúde9,26.
48
As reações hansênicas constituem intercorrências na doença, com sinais e
sintomas que levam o paciente ao sofrimento e sequelas neurológicas, muitas
vezes mais expressivas que as esperadas na hanseníase sem quadro reacional.
Elas representam fenômenos imunológicos, frequentemente pouco entendidos
que se refletem em quadro clínico peculiar exigindo a atenção do dermatologista.
Este trabalho objetivou a descrição das características clínicas de pacientes
com hanseníase reacional atendidos em dois centros de referência na cidade de
Recife, Nordeste do Brasil.
Métodos
Por meio de um estudo transversal foram investigados 201 pacientes com
história de quadro reacional hansênico, atendidos nos ambulatórios de
hanseníase em duas unidades de referência (Centro Integrado de Saúde Amaury
de Medeiros e Policlínica Lessa de Andrade) da cidade do Recife–PE, no período
de março de 2007 a dezembro de 2008.
Para classificação dos pacientes segundo forma baciloscópica, adotaram-se
os critérios da OMS, que consistem na pesquisa de BAAR em material linfo-
cutâneo e na apresentação clínica. Foram classificados como paucibacilares, os
pacientes hansenianos com: baciloscopia inicial negativa, menos de cinco lesões
e de um tronco nervoso afetado. Os pacientes multibacilares foram selecionados
entre os que apresentavam baciloscopia inicial positiva. Indivíduos com a forma
neurítica pura de hanseníase não participaram do estudo.
49
Considerou-se reação reversa, ou tipo I, a que apresentasse pelo menos
uma das seguintes características: infiltração em lesões prévias de hanseníase
acompanhadas de edema e dor, surgimento de novas lesões em forma de placas
eritemato-infiltradas, tricofitóides com distúrbios de sensibilidade, ou
espessamento em um ou mais nervos periféricos associado a quadro doloroso.
Essas características poderiam estar associadas a outros achados, como febre,
mal-estar, hipersensibilidade palmar e plantar, lesões vésico-bolhosas, ulceração
e edema em mãos e pés16.
Foi caracterizada como reação tipo II, ou eritema nodoso hansênico, aquela
que apresentasse nódulos eritematosos, dolorosos espontaneamente ou à
palpação, isolados ou associados a qualquer uma das manifestações: febre, mal-
estar, astenia, vesículas/bolhas ou úlceras, espessamento doloroso em um ou
mais nervos periféricos, linfadenopatia, irite, artrite ou artralgia e edema ou dor em
mãos e pés16.
A reação tipo II foi quantificada pela contagem do número de nódulos nos
seguimentos corporais afetados: membros inferiores e abdome ou membros
superiores, tórax e face e foi considerada leve, na presença de menos de 10
nódulos, moderada quando havia 10 a 20 nódulos e severa, em presença de mais
de 20 nódulos por seguimento corporal afetado.
Considerou-se tratamento regular aquele no qual não houve abandono por
mais de três meses consecutivos e tratamento irregular quando houve abandono
de tratamento por mais de três meses.
O esquema terapêutico de hanseníase foi considerado padrão, quando do
uso das drogas preconizadas pela OMS durante um ano para as formas
50
multibacilares e seis meses para as formas paucibacilares. Classificou-se o
esquema como alternativo na ocorrência do uso de outras drogas ou de tempo de
tratamento diferente.
A coleta de dados constou de entrevista, anamnese, exame físico, consulta
ao prontuário e preenchimento de protocolo específico. Descreveram-se as
variáveis relativas a fototipo segundo Fitzpatrick6 (tipo I, II, III, IV, V e VI),
procedência e forma clínica (tuberculóide (TT), borderline (BT, BB e BL) e
lepromatosa (LL)). Compararam-se as características clínicas entre os pacientes
reacionais avaliando: idade, sexo, baciloscopia inicial e final, tipo de tratamento
(convencional ou alternativo), tipo de reação (I ou II), aspectos clínicos da reação,
tempo de surgimento da reação em relação ao início do tratamento e drogas
utilizadas.
Com o objetivo de identificar os principais fatores de risco para o indivíduo
ser multibacilar, fez-se uma análise univariada, comparando a proporção dessa
forma baciloscópica nas diferentes categorias pelo teste Qui-Quadrado de
Pearson10,27.
Para análise multivariada, optou-se pela técnica de regressão logística10,
incluindo as variáveis que apresentaram nível de significância menor que 0,20, na
análise univariada. A seleção das variáveis foi feita através do método stepwise
forward, estabelecendo-se nível de significância de 0,05 para entrada de variáveis
e de 0,10 para saída. As variáveis selecionadas tiveram suas interações
analisadas em uma matriz de correlação, sendo incorporadas ao modelo todas as
interações com coeficiente de correlação ≥0,5.
51
O gerenciamento do banco de dados foi realizado com o programa MS
Office Excel® versão 2003; a análise estatística, com o programa Statistical
Package for Social Sciences (SPSS®) for Windows versão 12.0, e a confecção de
gráficos e tabelas com o MS Office Word® versão 2003.
O projeto teve a aprovação do Comitê de Ética, cujo registro no CAAE foi
0009.0.250.250-07.
Resultados
Quanto às variáveis de caracterização dos pacientes, foi possível identificar
um predomínio do sexo masculino (65,2%), da faixa etária entre 30 e 44 anos
(34,3% - Tabela 1). Houve maior frequência de pacientes com fototipo V (74;
36,8%) e procedência da cidade do Recife (129; 64,2%).
Do total de indivíduos estudados, 100(49,8%) foram classificados como
paucibacilares e 101(50,2%) como multibacilares, dentre os quais se constatou
um predomínio de baciloscopia menor que três (73; 72,3%)(Tabela 1).
Dentre os 28(27,7%) pacientes com baciloscopia inicial ≥3,00, cerca de 17%
(5/28) foram tratados por 24 meses e 10% (3/28) foram retratados. Um total de 80
(39,8%) pacientes foram submetidos a nova baciloscopia após tratamento,
havendo predomínio de baciloscopia negativa nesses indivíduos.
A reação hansênica de 151(75,1%) pacientes foi classificada como tipo I;
enquanto que 31(15,4%) tiveram-na do tipo II e 19(9,5%) tiveram reação tipo I e
tipo II. Em todos os casos, o início da reação hansênica foi mais frequente
durante o tratamento (67,7%) ou num período menor que seis meses após a alta
52
medicamentosa. Para esses pacientes, a droga de escolha foi a prednisona,
administrada a 95% deles, isolada (75,6%) ou associada à talidomida (19,4%)
(Tabela 1). Dos pacientes estudados, 87% (175/201), foram submetidos ao
tratamento padrão e 90% (180/201), ao tratamento regular.
Quanto à distribuição dos pacientes segundo a reação hansênica, expressa
na Tabela 1, identificou-se que as do tipo I ocorreram mais frequentemente nos
pacientes na faixa etária de 30 a 59 anos, paucibacilares ou multibacilares com
baciloscopia <3,00 e com início durante o tratamento da hanseníase ou após um
ano do término da alta medicamentosa. As reações do tipo II se caracterizaram
por predominarem em pacientes na faixa etária de 30 a 44 anos, multibacilares e
com baciloscopia ≥3,00.
Houve associação significante entre baciloscopia menor que 3,00 e reação
tipo I e baciloscopia ≥3,00 e a reação tipo II (p<0,001).
53
Tabela 1 - Distribuição das características demográficas e clínicas dos 201
pacientes reacionais atendidos no CISAM e Centro de Saúde Lessa de Andrade
Início da reação hansênicaNo tratamento 136 (67,7) 99 (65,6) 21 (67,7) 16 (84,2)< 6 meses da alta 38 (18,9) 28 (18,5) 8 (25,8) 2 (10,5)6 – 12 meses da alta 9 (4,5) 6 (4,0) 2 (6,5) 1 (5,3)> 1 ano da alta 18 (8,9) 18 (11,9) 0 (0,0) 0 (0,0)
NOTAS: 1 – base de cálculo percentual - 201 pacientes. 2 – valor de p significante
Constatou-se também que a distribuição das reações hansênicas, associou-
se à forma baciloscópica, sendo mais frequente a reação tipo I em paucibacilares
e tipo II em multibacilares (p<0,001).
As variáveis sexo, início da reação e retratamento foram incluídas na análise
multivariada e submetidas à regressão logística, por apresentarem valor de p
menor que 0,20, cujos resultados estão apresentados nas Tabela 2 e 3.
Observou-se que pacientes do sexo masculino tinham chance aproximadamente
uma vez maior de serem multibacilares quando comparados às mulheres (Tabela
3).
57
Tabela 3 - Regressão logística da variável sexo com a forma multibacilar em 201
indivíduos reacionais
Variável independente Coeficiente p Odds Ratio IC 95%
Sexo (Masculino x Feminino) 0,59 0,049 1,81 1,01 - 3,43
Constante -0,72 0,008
Discussão
A identificação e o manejo dos pacientes com episódios reacionais
hansênicos constituem um desafio para o clínico, porque esses episódios
requerem diagnóstico precoce, já que as sequelas são graves. Quando os
quadros reacionais são tardios, após a alta medicamentosa, aumenta a
dificuldade em diagnosticar devido à necessidade de diferenciação com os
quadros de recidiva. O retardo no diagnóstico diferencial entre recidiva e reação
hansênica acarretará atraso também na conduta terapêutica, o que contraria o
atendimento das necessidades dos pacientes por intervenções rápidas.
A caracterização clínica dos pacientes reacionais pode contribuir
positivamente nesse sentido, do que deriva a importância dos resultados aqui
apresentados, já que os estudos sobre reação hansênica em população
nordestina são escassos.
Em relação ao sexo dos pacientes, observou-se maior frequência de
quadros reacionais em homens, numa proporção de 1,87:1,00 homens:mulheres,
contrariando a distribuição populacional da cidade do Recife, que se igualava a
58
0,8:1,00, estatísticas de 2007. Considerando que a expectativa de vida da mulher,
desde a adolescência, é maior que a do homem, a maior proporção de homens
reacionais hansênicos pode ser uma característica da doença3.
A proporção do presente estudo foi menor que a de 3,75:1,00, identificada
em pesquisa de reações hansênicas entre pacientes tailandeses24, porém maior
que a de 1,18:1,00, constatada entre 290 pacientes, no Rio de Janeiro25, e de
1,32:1,00, na cidade de Uberaba, entre 149 pacientes21.
No presente estudo, ao incluir a variável sexo na análise multivariada
(Tabelas 2 e 3), para determinação dos fatores de risco para formas
multibacilares, e consequentemente, para predisposição aos quadros reacionais
mais graves, comprovou-se que indivíduos do sexo masculino tinham chance 0,81
vezes maior de serem multibacilares. Esse fato aponta para a necessidade de um
acompanhamento mais cuidadoso dos pacientes do sexo masculino, por
apresentarem maior propensão às formas mais graves de reação.
Quanto à distribuição etária, apesar da maior frequência da reação tipo I
numa faixa mais ampla (entre 30 e 59 anos) que aquela de pacientes com reação
tipo II (entre 30 e 44 anos) (Tabela 1), essa variável não se associou a maior risco
de desenvolvimento da forma multibacilar (Tabela 2). Mesmo assim, dois
aspectos dessa distribuição etária são relevantes. Em primeiro lugar, deve-se
considerar que o adoecimento de homem na idade entre 30 e 49 anos exerce
impacto psicossocial, devido à maior atividade laborativa nessa faixa etária. Em
segundo lugar, é preocupante o achado de crianças menores de quinze anos de
idade com reação hansênica, principalmente pela consideração de que, nessa
59
faixa etária, devem ter maior convívio com membros familiares, indicando que sua
contaminação foi domiciliar.
O predomínio do fototipo V e da procedência da cidade do Recife entre os
pacientes (Tabela 1) pareceu refletir tão somente a cor da pele de habitantes da
cidade e a situação geográfica dos centros de referência, que foram escolhidos
por locais da presente pesquisa.
Do ponto de vista clínico, a associação da forma multibacilar com contagem
de BAAR igual ou maior que 3,00 e desenvolvimento de reação tipo II isolada
(58,8%) esteve em consonância com os achados de Saunderson et al. e com a
OMS22,26.
O predomínio de pacientes multibacilares com baciloscopia menor que 3,00
(72,3%; Tabela 1) pode induzir ao raciocínio de que essa associação indicaria
melhor prognóstico, pela menor carga bacilar. No entanto, quando se observa a
frequência de ambos os quadros reacionais nos multibacilares, este foi mais
frequente (21,4% - 6/28), nos multibacilares com baciloscopia igual ou maior que
3,00. Tais pacientes apresentam um quadro clínico mais grave com sinais e
sintomas incapacitantes como neurite, edema e dor em mãos e pés, bolhas e
úlceras, linfadenopatia e artrite (Figuras 1 e 2).
A baciloscopia, tanto inicial, quanto final, é um exame que integra o arsenal
diagnóstico da hanseníase e não se encontra limitado, mesmo em países de
baixa renda e em desenvolvimento. A pesquisa de BAAR pode auxiliar no
direcionamento do diagnóstico diferencial entre recidivas e desencadeamento de
reação hansênica.
60
A não realização da baciloscopia após tratamento na maioria dos pacientes
deste estudo pareceu um reflexo negativo das recomendações do Ministério da
Saúde quanto ao manejo do paciente hansênico. Se, ao diagnóstico, a
baciloscopia é um critério essencial e as reações hansênicas são reconhecidas
como eventos graves e como desafio para serem diferenciadas de recidiva,
principalmente em longo prazo após alta medicamentosa, deveria haver
obrigatoriedade da baciloscopia de controle para agilizar esse diagnóstico. A falta
de obrigatoriedade para tal procedimento pode contribuir para que o exame de
pacientes em controle seja preterido, em benefício daqueles em primeiro episódio,
principalmente quando se considera a carência de recursos humanos nos
serviços de saúde.
Guerra et al.9 ressaltam que a redução do índice baciloscópico diminui as
chances de reação. Ainda que se lançasse mão do exame histopatológico, uma
importante ferramenta para diferenciar a reação tipo I da recidiva, seus resultados
não substituem a baciloscopia para estimativa de risco de desenvolvimento da
reação hansênica. Ele comprova o tipo de reação e a distingue da recidiva, além
do que não está disponível para rotina, mesmo nos centros de referência para
hanseníase7.
Um fato relevante, neste trabalho, é que o primeiro episódio de reação
hansênica, tanto tipo I como tipo II, surgiu na maioria (86,6%) dos indivíduos
ainda durante o tratamento ou após seis meses da alta. A presença de estados
reacionais durante o tratamento parece ser reflexo do comportamento
imunológico do indivíduo e reforça a teoria de que o próprio tratamento
(persistência de bacilos ainda viáveis) pode ser um fator precipitante para o
61
surgimento do quadro reacional. Em pacientes com grande carga bacilar, a
presença contínua de antígenos de bacilos mortos aumenta o risco de reações
hansênicas já que esta eliminação bacilar é lenta e depende do sistema
fagocitário do indivíduo na ordem de 0,6 a 1,0 log/ano. Esse mecanismo também
explica porque as reações podem ocorrer logo após alta medicamentosa14,23.
No presente estudo, o surgimento do eritema nodoso ainda durante o
tratamento contrariou os achados de Kumar et al.12, que avaliando as
características epidemiológicas de uma grande coorte na Índia, observaram que
essa reação é mais frequente no primeiro ou segundo ano após alta da terapia
multidroga. O fato de a clofazimina ser utilizada durante o tratamento da
hanseníase e ter efeito antiinflamatório poderia justificar o surgimento tardio do
quadro reacional na forma lepromatosa.
O uso de talidomida em sete pacientes com a reação Tipo I (Tabela I), pode
refletir as dificuldades de condução diagnóstica e terapêutica que as reações
hansênicas demandam, como por exemplo, a alternância dos tipos reacionais em
multibacilares.
A constatação de que os pacientes multibacilares tiveram maior chance de
necessitar retratamento (Tabela 2) trouxe informação adicional aos achados de
um estudo tipo caso-controle, também realizado em população recifense4, no qual
o retratamento foi três vezes mais frequente nos indivíduos reacionais.
No presente estudo, o predomínio da forma borderline foi um achado
coerente com o critério de inclusão de pacientes reacionais, já que a
característica dessa forma clínica é a instabilidade clínica e imunológica com a
maior susceptibilidade aos quadros reacionais16.
62
Comparativamente, a reação tipo II é mais agressiva que a reação tipo I,
mas essa observação só está adequada aos pacientes multibacilares, porque
podem desenvolver ambas, isolada ou alternadamente17. Assim os pacientes
paucibacilares, não sujeitos à reação tipo II, estiveram menos expostos a
complicações, mas é importante ressaltar que tal achado não é tranquilizador,
pois essas reações são acompanhadas de neurite que é responsável por danos e
sequelas importantes1,11,17.
Conclusões
A partir das observações epidemiológicas e clínicas, os achados do presente
estudo, sugeriram que os pacientes reacionais do sexo masculino associaram-se
ao maior risco de desenvolvimento da forma multibacilar. A forma clínica
predominante foi a borderline, com desenvolvimento de reações hansênicas mais
frequentemente durante o tratamento. Os pacientes multibacilares foram mais
propensos ao retratamento e aqueles com reações tipo I e II, apresentaram maior
frequência de neurite, linfadenopatia, artrite e irite do que aqueles com reação
isolada.
Agradecimentos
Aos pacientes que, num gesto de desprendimento, concordaram em
participar do estudo e aos colegas dermatologistas e demais funcionários do
CISAM e da Policlínica Lessa de Andrade.
63
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Polimorfismos do gene NRAMP1 em indivíduos com reações
hansênicas atendidos em dois Centros de Referência no Recife,
Nordeste do Brasil
66
Polimorfismos do gene NRAMP1 em indivíduos com reações hansênicas atendidos em dois Centros de Referência no Recife, Nordeste do Brasil
Márcia Almeida Galvão Teixeira1
Norma Lucena-Silva2
Alessandra de Luna Ramo3
Ana Hatagima4
Vera Magalhães5
___________________________1Professora Assistente da Faculdade de Ciências Médicas, Universidade de Pernambuco; Policlínica Lessa de Andrade, Recife-PE, Brasil . Endereço para correspondência: Rua Jornalista Guerra de Holanda, 158, apto 1102 Casa Forte. CEP 52061010 Recife, PE, Brasil Fone: 55(81) 34272268 e-mail: [email protected] em biologia molecular. Laboratório de Biologia Molecular do Instituto de Medicina Integrada Prof. Fernando Figueira de Pernambuco, Recife-PE, Brasil3Biomédica. Laboratório de Biologia Molecular do Instituto de Medicina Integrada Prof. Fernando Figueira de Pernambuco, Recife-PE, Brasil4Doutora. Laboratório de Genética Humana do Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil5Professora titular da disciplina de doenças infecciosas e parasitárias do curso de medicina da Universidade Federal de Pernambuco, Recife - PE, Brasil
Locais do estudo: Centro de Saúde Amaury de Medeiros da Universidade de Pernambuco, Recife, PE, Brasil, Instituto de Medicina Integrada Prof. Fernando Figueira, Recife, PE, Brasil e Universidade Federal de Pernambuco
67
RESUMO
Para investigar susceptibilidade às reações hansênicas, três polimorfismos do gene natural resistance-associated macrophage protein (NRAMP1), foram determinados em 201 pacientes, atendidos em dois centros de referência no Recife, entre 2007 e 2008, sendo 100 paucibacilares e 101 multibacilares. A determinação dos polimorfismos 274C/T, D543N e 1729+55del4 do gene NRAMP1 foi realizada utilizando a técnica do polimorfismo de fragmento de restrição em DNA extraído de leucócitos de sangue periférico e as estimativas das frequências alélicas e genotípicas foram feitas por contagem direta. Os genótipos predominantes foram: CC (51,8%) para 274C/T, GG (86,6%) para D543N e +-TGTG (59,9%) para 1729+55del4. O genótipo mutante 274 TT predominou na negatividade da reação reversa (p=0,03) e na positividade do eritema nodoso (p=0,04). Nossos resultados sugerem que o polimorfismo 274 C/T do gene NRAMP1 pode auxiliar na determinação da susceptibilidade à reação tipo II em indivíduos com hanseníase.
Palavras-chave: Hanseníase, polimorfismo de fragmento de restrição.
68
ABSTRACT
To investigate susceptibility to leprosy reactions, according three natural resistance-associated macrophage protein (NRAMP1) gene polymorphisms, sample blood from 201 patients of two different reference hospitals in Recife, between 2007 and 2008, were examined. The individuals were divided in two groups: paucibacillary (100) and multibacillary (101). 274C/T, D543N and 1729+55del4 polymorphisms typed by restriction fragment length polymorphism, allelic and genotypic frequencies were calculated by direct genic count. The main genotype found were: CC (51, 8%) to 274C/T, GG (86,6%) to D543N and +-TGTG (59,9%) to 1729+55del4. The wild genotype 274 TT prevailed on the negativity of the reversal reaction (p=0,03) and in the positivity of erythema nodosum leprosum (p=0,04). The 274 C/T NRAMP1 polymorphism aids in the determination to the susceptibility to type II reaction in Leprosy patients.
Key- words: leprosy, restriction fragment length polymorphism.
69
Introdução
A hanseníase é uma doença complexa, cujo desfecho resulta de uma
combinação entre a ação do Mycobacterium leprae, fatores ambientais,
socioeconômicos e a predisposição individual21.
O número global de casos de hanseníase tem mostrado tendência de
declínio desde o ano de 2001, exceto em regiões da África e no Brasil, que
mantêm alta endemicidade. Nas regiões Norte e Nordeste estão presentes 40%
dos novos casos de hanseníase do Brasil28.
As reações hansênicas são fenômenos de hipersensibilidade a antígenos
do M. leprae25. Os principais tipos de reação são: a reação reversa (tipo I) e o
eritema nodoso hansênico (tipo II). A reação tipo I pode estar presente em
indivíduos com as formas clínicas paucibacilares ou multibacilares, enquanto que
a reação tipo II acomete pacientes multibacilares4.
Os episódios reacionais estão presentes em cerca de 10% a 50% dos
pacientes, predominando nas formas clínicas multibacilares. Podem surgir em até
cinco anos após o aparecimento da doença e são responsáveis por sequelas
importantes e dificultam o diagnóstico diferencial com a recidiva da doença, e,
portanto, a conduta terapêutica11,26.
A teoria que admite que a incapacidade de destruição dos bacilos de
Hansen pelos macrófagos pode ser influenciada por polimorfismos gênicos tende
a ganhar força nos últimos anos1,6. Tem-se postulado que um conjunto de genes
pode modificar a susceptibilidade à hanseníase e às diferentes formas
clínicas3,6,13,21,23.
70
O gene da proteína 1 associada à resistência natural do macrófago (natural
resistance associated macrophage protein 1 - NRAMP1) tem sido relacionado à
defesa inata, bem como à adquirida, que confere resistência a parasitas
intracelulares, por sua atividade estar diretamente ligada ao processamento dos
antígenos bacterianos pelas células fagocitárias8,12.
Ferreira et al.13, estudando o polimorfismo (GT)n do NRAMP1, observaram
que os indivíduos com resposta negativa à lepromina, ou seja, Mitsuda negativos,
que expressavam um determinado tipo de alelo desse polimorfismo,
apresentavam sete a oito vezes mais chances de desenvolver a hanseníase,
concluindo haver relação entre variações polimórficas e susceptibilidade à
doença.
O gene da NRAMP1 localiza-se na região 2q35 do cromossoma 2 e a
proteína codificada por ele é detectada no compartimento lisossomal de
macrófagos, monócitos e leucócitos periféricos, como também no fígado, baço e
pulmões, após indução por linfocinas e produtos bacterianos18,20, exercendo a
função de uma bomba de efluxo de cátions divalentes, como Fe++ e Mn++9,22. A
remoção destes íons, essenciais para a sobrevivência do microorganismo no
macrófago, resulta em restrição da multiplicação e propagação intracelular do
patógeno, além de privar a bactéria da produção de enzimas protetoras (catalase
e superóxido dismutase), que neutralizam a ação de componentes oxigênio
reativos produzidos pelo macrófago7, 16, 22.
A codificação da proteína nos indivíduos NRAMP1 leva a uma atividade
macrofágica adequada, um padrão de resposta Th1 e tendência ao indivíduo ser
paucibacilar. Especula-se que isto ocorra quando há a expressão dos alelos
71
selvagens, C para 274 C/T, G para D543N e +TGTG para o polimorfismo
1729+55del412.
Algumas mutações no gene NRAMP1 anulam a resistência natural a
infecções pelo Mycobacterium. Liu et al.17, investigando 80 pacientes com
tuberculose, descreveram nove polimorfismos, dentre eles o 274C/T, que decorre
de uma troca de bases citosina (C) por timina (T) na posição 274 do éxon 3, o
polimorfismo D543N, no qual há troca de bases guanina (G) por adenina (A) na
posição 1703 do éxon 15, e o terceiro polimorfismo 1729+55del4, no qual há
deleção das bases TGTG na região 3’ não traduzida (3’UTR). Concluíram que as
variantes NRAMP1 podem ser úteis para análise genética da susceptibilidade
humana à hanseníase, em analogia à verificada para parasitoses intracelulares,
porque esses polimorfismos são importantes reguladores das vias de ativação de
macrófagos.
Meisner et al.19, tomando como base a associação entre polimorfismo da
NRAMP1 e susceptibilidade à tuberculose, compararam a distribuição do
polimorfismo 1729+55del4 na hanseníase e observaram maior frequência de
heterozigose entre multibacilares.
O objetivo deste estudo foi investigar a associação entre três polimorfismos
do gene NRAMP1 e as reações hansênicas em pacientes multibacilares e
paucibacilares.
Métodos
Amostra. Realizou-se um estudo comparativo, observacional envolvendo
201 indivíduos hansenianos com quadro reacional, excluída a forma neurítica
72
pura de hanseníase, oriundos da demanda espontânea ou encaminhados por
outros serviços da rede pública e acompanhados nos ambulatórios de hanseníase
do Centro Integrado de Saúde Amaury de Medeiros (CISAM)/Universidade de
Pernambuco e da Policlínica Lessa de Andrade, em Recife, nos anos de 2007 e
2008.
As reações hansênicas foram classificadas de acordo com os critérios de
Ridley e Joppling24, em tipo I ou tipo II. O paciente com reação tipo I ou reversa
caracterizava-se clinicamente por: infiltração de lesões antigas associadas ao
surgimento de novas lesões em forma de manchas ou placas infiltradas, eritema,
dor, lesões vésico-bolhosas, ulcerações, parestesia, mal-estar, febre, dor ou
espessamento de nervos periféricos. Como reação tipo II ou eritema nodoso
considerou-se o quadro caracterizado pelo surgimento de nódulos disseminados,
febre e neurite4.
Cem pacientes (49,8%) foram paucibacilares, pois apresentavam
baciloscopia inicial negativa antes do tratamento, menos de cinco lesões cutâneas
e até um tronco nervoso afetado, enquanto que 101 (50,2%) foram multibacilares,
ou seja, tinham baciloscopia inicial positiva.
O tipo de pele foi baseado na classificação de Fitzpatrick14 que contempla a
cor dos olhos, cabelos e da pele. Os tipos I, II e III corresponderam à pele branca,
os tipos IV e V, à parda, e o tipo VI, à negra.
O protocolo constou de exame clínico dermatológico e realização de
coleta de 7,5mL de sangue venoso periférico para análises genética e
molecular.
Determinação dos polimorfismos. A determinação dos polimorfismos foi
realizada através da reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida pela técnica
73
do polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) proposto por Lui et al.17. A
reação foi realizada em um total de 25µL contendo 50 ng a100 ng de DNA, Tris-
HCL 10 mM (pH 9.0), KCl 50 mM, MgCl 1,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 20 pmol
de cada iniciador e uma unidade de Taq DNA polymerase (Biotools, USA).
Os iniciadores utilizados na PCR foram: 5’-
TCGCACCATCCCTATACCCAG-3’ e 5’-TCTCGAAAGTGTCCCACTCAG-3’ para
o polimorfismo 274 C/T e 5’-GCATCTCCCCAATTCATGGT-3’ e 5’-
AACTGTCCCACTCTATCCTG-3’ para os polimorfismos D543N e 1729 + 55 del 4.
As condições da reação foram: um ciclo inicial de 94oC por 3 min, seguido de um
protocolo com 35 ciclos a 94oC por 1 min para desnaturação, 60oC por 1 min para
anelamento e 72oC por 1 min para extensão e um ciclo de extensão final de 72oC
por 10 min no termociclador Gradient da Eppendorf. As amostras foram
submetidas à amplificação do gene humano constitutivo gapdH como controle
positivo de reação e verificação da qualidade do DNA extraído. Como controle
negativo da reação, foram usados os reagentes da PCR, em ausência de DNA. O
produto da amplificação foi visualizado em gel de agarose a 2% corado pelo
brometo de etídeo (0,5µg/mL), sob luz ultravioleta e fotografado com filme
Polaroid 667.
A segunda etapa do ensaio constou de digestão enzimática de 5 µL do
produto da PCR, adicionados a uma solução preparada com tampão (1x) de
reação NEBuffer4 (BioLabs®, United Kingdom). Para o polimorfismo 274 C/T a
PCR produziu fragmentos de 216 pares de bases (bp), os quais tratados pela
enzima de restrição Mnl I a 37°C durante 18 horas, definiram o alelo mutante (T)
correspondente aos fragmentos 167, 37 e 12 bp e o alelo selvagem (C),
74
correspondente aos fragmentos 102, 65, 37 e 12 bp. Para o polimorfismo D543N,
os fragmentos com 240 ou 244bp foram submetidos à enzima de restrição Ava II,
definindo o alelo mutante (A) correspondente aos fragmentos 201 e 39bp e o
selvagem (G) correspondente aos fragmentos 126, 79 e 39bp. Os fragmentos do
polimorfismo 1729 + 55del4, com 240p ou 244bp, foram submetidos à enzima de
restrição Fok I definindo o alelo mutante (-TGTG), correspondente ao fragmento
240 bp, e o alelo selvagem (+TGTG), com os fragmentos 211 e 33bp.
O produto da digestão foi visualizado em gel de poliacrilamida a 10% e
corado pela prata. O gel foi secado em filme celofane e arquivado para
determinação dos genótipos segundo o protocolo de Liu et al.17.
Devido a dificuldades técnicas, a determinação dos polimorfismos 274 C/T
e D543N foi possível nas amostras de DNA de 197 indivíduos (100 multibacilares
e 97 paucibacilares), enquanto o polimorfismo 1729 + 55del4 foi determinado nas
amostras de 172 indivíduos (85 multibacilares e 87 paucibacilares).
A análise estatística foi realizada pelos programas MSOffice Excel versão
2003 para o gerenciamento do banco de dados; Statistical Package for Social
Sciences (SPSS) for Windows versão 12.0, para a execução dos cálculos
estatísticos, elaboração e edição de gráficos e MSOffice Word versão 2003, para
elaboração das tabelas. Foram empregados o teste Qui-quadrado (Mantel-
Haenszel), para testar associação entre variáveis qualitativas, e o teste exato de
Fisher, nos casos em que o valor esperado foi menor que cinco, ambos em nível
de significância de 0,05.
O projeto teve a aprovação do Comitê de Ética, cujo registro no CAAE foi
0009.0.250.250-07.
75
Resultados
A amostra foi constituída em sua maioria por homens, indivíduos fototipo V,
com idade entre 30-44 anos e procedentes de Recife (Tabela 1).
Tabela 1 - Distribuição das variáveis de caracterização dos 201 pacientes reacionais atendidos no CISAM e Policlínica Lessa de Andrade, 2007-2008
Variáveis n (%) Sexo
MasculinoFeminino
131 (65,2) 70 (34,8)
Cor da peleFototipo IIIFototipo IVFototipo VOutros
As distribuições das frequências alélicas e genotípicas de cada polimorfismo
nos indivíduos reacionais multibacilares e paucibacilares foram verificadas. Os
alelos C, G e +TGTG foram os mais frequentes para os polimorfismos 274 C/T,
D543N e 1729+ 55del4, respectivamente, independente da classe bacilar. Quanto
aos genótipos, as maiores frequências foram observadas para CC, GG e +-TGTG.
Não se observaram diferenças significantes na distribuição genotípica entre
pacientes multibacilares, quando comparados aos paucibacilares (Tabela 2).
76
Tabela 2 – Distribuição das frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos 274 C/T, D543N e 1729+55del4 do gene NRAMP1 dos pacientes multibacilares e paucibacilares com reação hansênica
Genótipos: cálculo do Qui-quadrado comparativo de cada genótipo com a soma dos outros do mesmo polimorfismo
Na Tabela 3, estão apresentadas as distribuições das frequências alélicas
e genotípicas dos polimorfismos segundo sexo dos pacientes.
Tabela 3 - Distribuição das frequências alélicas e genotípicas de cada polimorfismo segundo baciloscopia e sexo dos pacientes
* Teste exato de Fischer. Genótipos: cálculo do Qui-quadrado comparativo de cada genótipo com soma dos outros do mesmo polimorfismo
77
0,840,580,450,73
40 (58,8)28 (41,2)
9 (26,5)22 (64,7)3 (8,8)
64 (60,4)42 (39,6)17 (32,1)30 (56,6)
6 (11,3)
0,940,420,170,45*
27 (58,7)19 (41,3)
8 (34,8)11 (47,8)
4 (17,4)
72 (58,0)52 (41,0)16 (25,8)40 (64,5)6 (9,7)
+TGTG-TGTG
++TGTG+-TGTG--TGTG
1729+55del4
0,230,21
72 (94,7)4 (5,3)
34 (89,5)4 (10,5)
106 (89,8)12 (10,2)47 (79,7)12 (20,3)
0,48*0,47*
54 (93,1)4 (6,9)
25 (86,2)4 (13,8)
136 (95,8)6 (4,2)
65 (91,5)6 (8,5)
GA
GGGA
D543N
0,640,750.960,68*
55 (72,4)21 (27,6)20 (52,6)15 (39,5)3 (7,9)
89 (75,4)29 (24,6)33 (55,9)23 (39,0)3 (5,1)
0,320,220,241,00*
43 (74,1)15 (25,9)17 (58,6)
9 (31,0)3 (10,4)
95 (66,9)47 (33,1)32 (45,0)31 (43,7)
8 (11,3)
CT
CCCTTT
274C/T
pFEM (n,%)MASC (n,%)pFEM (n,%)MASC (n,%)
PAUCIBACILARES MULTIBACILARES ALELO /GENÓTIPO
POLIMORFISMO
0,840,580,450,73
40 (58,8)28 (41,2)
9 (26,5)22 (64,7)3 (8,8)
64 (60,4)42 (39,6)17 (32,1)30 (56,6)
6 (11,3)
0,940,420,170,45*
27 (58,7)19 (41,3)
8 (34,8)11 (47,8)
4 (17,4)
72 (58,0)52 (41,0)16 (25,8)40 (64,5)6 (9,7)
+TGTG-TGTG
++TGTG+-TGTG--TGTG
1729+55del4
0,230,21
72 (94,7)4 (5,3)
34 (89,5)4 (10,5)
106 (89,8)12 (10,2)47 (79,7)12 (20,3)
0,48*0,47*
54 (93,1)4 (6,9)
25 (86,2)4 (13,8)
136 (95,8)6 (4,2)
65 (91,5)6 (8,5)
GA
GGGA
D543N
0,640,750.960,68*
55 (72,4)21 (27,6)20 (52,6)15 (39,5)3 (7,9)
89 (75,4)29 (24,6)33 (55,9)23 (39,0)3 (5,1)
0,320,220,241,00*
43 (74,1)15 (25,9)17 (58,6)
9 (31,0)3 (10,4)
95 (66,9)47 (33,1)32 (45,0)31 (43,7)
8 (11,3)
CT
CCCTTT
274C/T
pFEM (n,%)MASC (n,%)pFEM (n,%)MASC (n,%)
PAUCIBACILARES MULTIBACILARES ALELO /GENÓTIPO
POLIMORFISMO
A distribuição dos polimorfismos segundo cor da pele, entre multibacilares
e paucibacilares, encontra-se na Tabela 4, na qual não foram identificadas
diferenças significantes. Os fototipos I, II e III formaram o grupo A e os fototipos
IV,V e VI o grupo B.
Tabela 4 - Distribuição das frequências alélicas e genotípicas de cada polimorfismo segundo baciloscopia e fototipo dos pacientes
*Teste de Fisher. Genótipos: cálculo do Qui-quadrado comparativo de cada genótipo com soma dos outros do mesmo
polimorfismo.
Na Tabela 5 está apresentada a distribuição dos genótipos segundo tipos
reacionais. Foi possível identificar diferenças significantes relacionadas ao
genótipo mutante 274 TT. Em pacientes com genótipo TT, a reação tipo I foi
menos frequente, diferindo dos pacientes com reação tipo II, nos quais foi mais
frequente.
78
0,450,510,880,71*
67(57,8)49 (42,2)16 (27,6)35 (60,3)7 (12,1)
37 (63,8)21 (36,2)10 (34,5)17 (58,6)
2 (6,9)
0,940,77*0,320,68*
79 (58,1)57 (41,9)20 (29,4)39 (57,4)
9 (13,2)
20 (58,8)14 (41,2)
4 (23,5)12 (70,6)
1 (5,9)
+TGTG-TGTG
++TGTG+-TGTG--TGTG
1729+55del4
0,080,07
118 (89,4)14 (10,6)52 (78,8)14 (21,2)
60 (96,8)2 (3,2)
29 (93,5)2 (6,5)
0,230,38*
159 (95,8)7 (4,2)
76 (91,6)7 (8,4)
31 (91,2)3 (8,8)
14 (82,4)3 (17,6)
GA
GGGA
D543N
0,990,640.340,38*
98 (74,2)34 (25,8)35 (53,0)28 (42,4)3 (4,6)
46 (74,2)16 (25,8)18 (58,1)10 (32,2)
3 (9,7)
0, 150,380,910,20*
111 (66,9)55 (33,1)39 (47,0)33 (39,8)11 (13,2)
27 (79,4)7 (20,6)
10 (58,8)7 (41,2)0 (0)
CT
CCCTTT
274C/T
pB* (n,%)A* (n,%)pB* (n,%)A* (n,%)
PAUCIBACILARESMULTIBACILARESALELO /GENÓTIPO
POLIMORFISMO
0,450,510,880,71*
67(57,8)49 (42,2)16 (27,6)35 (60,3)7 (12,1)
37 (63,8)21 (36,2)10 (34,5)17 (58,6)
2 (6,9)
0,940,77*0,320,68*
79 (58,1)57 (41,9)20 (29,4)39 (57,4)
9 (13,2)
20 (58,8)14 (41,2)
4 (23,5)12 (70,6)
1 (5,9)
+TGTG-TGTG
++TGTG+-TGTG--TGTG
1729+55del4
0,080,07
118 (89,4)14 (10,6)52 (78,8)14 (21,2)
60 (96,8)2 (3,2)
29 (93,5)2 (6,5)
0,230,38*
159 (95,8)7 (4,2)
76 (91,6)7 (8,4)
31 (91,2)3 (8,8)
14 (82,4)3 (17,6)
GA
GGGA
D543N
0,990,640.340,38*
98 (74,2)34 (25,8)35 (53,0)28 (42,4)3 (4,6)
46 (74,2)16 (25,8)18 (58,1)10 (32,2)
3 (9,7)
0, 150,380,910,20*
111 (66,9)55 (33,1)39 (47,0)33 (39,8)11 (13,2)
27 (79,4)7 (20,6)
10 (58,8)7 (41,2)0 (0)
CT
CCCTTT
274C/T
pB* (n,%)A* (n,%)pB* (n,%)A* (n,%)
PAUCIBACILARESMULTIBACILARESALELO /GENÓTIPO
POLIMORFISMO
Tabela 5 - Distribuição dos pacientes reacionais estudados quanto às frequências genotípicas de cada polimorfismo e o tipo reacional
*Teste de Fisher.
Genótipos: cálculo do Qui-quadrado comparativo de cada genótipo com soma dos outros do mesmo polimorfismo.
Discussão
O estudo da associação entre três polimorfismos do gene NRAMP1 e as
reações hansênicas em pacientes multibacilares e paucibacilares baseou-se nas
evidências de que a susceptibilidade, resistência e apresentações clínicas da
hanseníase poderem ser atribuídas aos polimorfismos genéticos1,13,19,20. No
entanto não se localizou qualquer publicação dessa associação com as reações
hansênicas, daí a importância desta pesquisa.
No presente estudo, ao relacionar as frequências alélicas e genotípicas dos
polimorfismos da NRAMP1 com os resultados da baciloscopia inicial dos
pacientes, que espelha a multiplicação do M. leprae, não se encontrou associação
significante. O mesmo foi observado também em relação ao sexo e ao fototipo.
79
pNÃO n (%)SIM n (%)pNÃO n (%)SIM n (%)
Reação tipo IIReação tipo IPolimorfismo
0,93
0,68
0,30*
38 (29,2)
79 (60,8)
13 (10,0)
12 (28,6)
24 (57,1)
6 (14,3)
0,46
0,29
0,42
6 (23,1)
18 (69,2)
2 (7,7)
44 (30,1)
85 (58,2)
17 (11,7)
1729+55del4 ++TGTG
+-TGTG
--TGTG
0,77127 (86,4)
20 (13,6)
44 (88,0)
6 (12,0)
0,61*27 (87,1)
4 (12,9)
144 (86,7)
22 (13,3)
D543N GG
GA
0,77
0,35
0,04
77 (52,4)
61 (41,5)
9 (6,1)
25 (50,0)
17 (34,0)
8 (16,0)
0,68
0,36
0,03*
15 (48,4)
10 (32,2)
6 (19,4)
87 (523,4)
68 (41,0)
11 (6,6)
274C/T CC
CT
TT
Genótipo
pNÃO n (%)SIM n (%)pNÃO n (%)SIM n (%)
Reação tipo IIReação tipo IPolimorfismo
0,93
0,68
0,30*
38 (29,2)
79 (60,8)
13 (10,0)
12 (28,6)
24 (57,1)
6 (14,3)
0,46
0,29
0,42
6 (23,1)
18 (69,2)
2 (7,7)
44 (30,1)
85 (58,2)
17 (11,7)
1729+55del4 ++TGTG
+-TGTG
--TGTG
0,77127 (86,4)
20 (13,6)
44 (88,0)
6 (12,0)
0,61*27 (87,1)
4 (12,9)
144 (86,7)
22 (13,3)
D543N GG
GA
0,77
0,35
0,04
77 (52,4)
61 (41,5)
9 (6,1)
25 (50,0)
17 (34,0)
8 (16,0)
0,68
0,36
0,03*
15 (48,4)
10 (32,2)
6 (19,4)
87 (523,4)
68 (41,0)
11 (6,6)
274C/T CC
CT
TT
Genótipo
Uma resposta imune inata efetiva em combinação com a baixa virulência
do M. leprae está associada à resistência para o desenvolvimento da
hanseníase25. Desse processo, participam os receptores de reconhecimento de
padrões, como os Toll-like (TLRs), que são essenciais para a identificação de
patógenos pelos macrófagos e pelas células dendríticas, os quais induzem à
resposta imune Th1 ou Th2, que pode ser influenciada pela expressão de
determinados alelos do gene NRAMP110.
A proteína NRAMP1 está localizada no compartimento endossômico ou
lisossômico maduro de macrófagos ativados pela presença da M. leprae e
determina a liberação do sinal intracelular para a migração de endossomos ou
lisossomos e fusão destes no mecanismo de regulação da multiplicação
bacteriana. Genótipos selvagens da NRAMP1 promovem migração rápida dessas
vesículas do sistema de Golgi para a região celular contendo fagossomos com M.
leprae, diferente do que ocorre nos genótipos mutantes8. Essa ação dos
genótipos da NRAMP1 depende também do equilíbrio iônico e do transporte de
cátions divalentes (Fe2+, Zn2+ e Mn2+), para manutenção do pH intracelular que
assegura a ação da peptidase para processamento antigênico endossomal,
impedindo o desenvolvimento e a multiplicação do Mycobacterium leprae no
macrófago 8,9,15,27.
Defeitos na produção da proteína codificada pelo NRAMP1, decorrentes da
ação de determinados alelos mutantes, podem levar a uma síntese protéica
inadequada e, consequentemente, à replicação bacteriana por falha da atividade
macrofágica. Esses achados foram confirmados por Abel1 e Meisner19 ao
80
identificarem, em população vietnamita, africana e chinesa, polimorfismos
envolvidos na hanseníase, dentre eles o 274C/T, o D543N e o 1729+55del4.
Pode-se afirmar que o gene mutante suprime a ativação macrofágica,
facilitando a multiplicação bacteriana e, consequentemente, favorecendo a forma
multibacilar5. Analogamente, indivíduos com composição gênica selvagem teriam
maior atividade dos macrófagos, o que dificultaria a reprodução bacteriana,
levando à forma paucibacilar.
No entanto essa lógica parte da premissa de que a multiplicação bacteriana
estaria relacionada à composição gênica da NRAMP1, independente da ação de
outros fatores, o que não tem sido corroborado por Abel et al1 ao alertarem que a
composição gênica interfere sobre a susceptibilidade à infecção bacteriana, mas
não a sua progressão.
Na presente pesquisa, o genótipo heterozigótico +TGTG/-TGTG do
polimorfismo 1729+55del4 foi semelhante entre paucibacilares e multibacilares,
diferindo do observado por Meisner et al19, que ao estudarem hanseníase na
população africana, verificaram predomínio de heterozigose entre multibacilares.
Quando se analisou a associação entre a composição genotípica dos
polimorfismos 274C/T, D543N e 1729+55del4e da NRAMP1 com as reações
hansênicas tipo I e tipo II, independente das formas multibacilar ou paucibacilar,
foi possível identificar diferença significante. O genótipo mutante TT do
polimorfismo 274C/T associou-se à presença da reação tipo II, restrita à forma
multibacilar, e ausência da reação tipo I.
Soo et al.27 testaram a hipótese de que a NRAMP1 influencia o padrão de
resposta imunológica, estudando cobaias com leishmaniose, e concluíram que os
81
alelos selvagens da NRAMP1 elicitavam predominantemente linfócitos T helper I,
ou seja, reação Th1, enquanto que os alelos mutantes induziam reações Th2.
Para investigar a influência da NRAMP1 na resposta imunológica adquirida
contra a M. leprae, Alcais et al2 realizaram análise de ligação entre a região
genômica NRAMP1 e a intensidade da reação de Mitsuda em 118 componentes
de 20 famílias nucleares com hanseníase, no Vietnã, ao identificarem essa
associação, concluíram que a expressão da NRAMP1 influencia na diferenciação
das reações imunológicas Th1/Th2.
Scollard et al25, em extensa revisão de artigos publicados entre 1990 e
2006, sobre os diversos aspectos da hanseníase, consideraram importante a
associação entre as formas mais graves e o padrão de citocinas Th2, ficando as
formas leves relacionadas ao padrão Th1.
Essas comprovações parecem reforçar os resultados da presente
pesquisa, os quais acrescentaram ao conhecimento da hanseníase a associação
entre a resposta imune e o genótipo TT do polimorfismo 274C/T. Esse resultado
permitiu especular que o padrão genotípico do NRAMP1 mantém uma relação
mais estreita com a reação imunológica do que com a multiplicação bacteriana,
representada pela baciloscopia.
Conclusão
Os resultados deste presente estudo sugerem que o polimorfismo 274 C/T
do gene NRAMP1 pode auxiliar na determinação da susceptibilidade à reação tipo
II em indivíduos com hanseníase.
82
Agradecimentos
Aos colegas dermatologistas e demais funcionários do CISAM e da
policlínica Lessa de Andrade e aos pacientes que, num gesto de desprendimento,
concordaram em participar do estudo.
83
Referências
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As reações hansênicas são quadros frequentes e constituem importantes
episódios no contexto da hanseníase, porque são responsáveis por retratamento
e incapacidades.
O estudo de fatores que podem predispor ao surgimento das reações como
o fator genético, inclusive o polimorfismo de gene NRAMP1, se reveste de
importância.
Neste estudo avaliaram-se as características clínicas de 201 pacientes
reacionais paucibacilares e multibacilares, cujas conclusões foram que as reações
hansênicas predominaram os indivíduos do sexo masculino que se associaram a
um maior risco de desenvolvimento da forma multibacilar. A forma clínica
borderline prevaleceu entre os pacientes reacionais e as reações hansênicas
foram mais frequentes durante o tratamento. Os pacientes multibacilares foram
mais propensos ao retratamento, e aqueles com reações tipo I e II, apresentaram
maior frequência de neurite, linfadenopatia, artrite e irite do que aqueles com
reação isolada.
Quanto aos polimorfismos estudados entre os pacientes reacionais
concluiu-se que as variações alélicas e genotípicas do polimorfismo 274 C/T do
gene NRAMP1 parecem estar mais relacionadas ao tipo de reação do que à
baciloscopia.
86
Apêndice A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título: Reação hansênica e imunidade: polimorfismos do gene NRAMP1(SLC11A1) em indivíduos paucibacilares e multibacilares atendidos em dois centros de referência no Recife, nordeste do Brasil
Eu,........................................................................................................................................aceito participar de forma voluntária desta pesquisa na qual procurarei contribuir respondendo a perguntas sobre a minha doença através de um questionário e doação única de 7,5 ml de sangue, realizada por pessoa designada pela equipe da pesquisador. Sei que este estudo não trará nenhum benefício imediato para mim. Entretanto, os resultados obtidos nesta pesquisa poderão contribuir para um melhor entendimento da hanseníase. Não haverá qualquer despesa para mim e as informações sobre minha pessoa e minha doença são confidenciais.Os riscos a que estarei exposto são: dor, infecção, sangramento e manchas arroxeadas no local, que serão minimizados com cuidados de higiene na coleta e a pressão local após a coleta do sangue. Estarei livre para interromper a qualquer momento. O acompanhamento da minha doença não será alterado, caso eu desista de participar deste estudo.
Este projeto foi avaliado comitê de ética do CISAM que faz parte da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP/CNS/Ministério da Saúde, Brasília). Qualquer dúvida ligarei para o centro de ética médica do CISAM, cujo número é 33021716 ou procurarei a pesquisadora responsável, Márcia Almeida Galvão Teixeira, no seguinte endereço: rua Arnóbio Marques S/N –Hospital Oswaldo Cruz - ambulatório de dermatologia ou pelo fone 34215003 ou no centro de saúde Lessa de Andrade (fone: 32327694)
Sendo assim, concordo em participar como voluntário não remunerado dessa pesquisa, estando ciente dos riscos e benefícios desses procedimentos para minha pessoa, conforme exposto acima. Sei que tenho a liberdade de retirar meu consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo sem que isso traga prejuízo para mim. Visto que nada tenho contra a pesquisa, concordo em assinar o presente termo de consentimento em duas vias (uma ficará comigo).
Informo que o trabalho "Características epidemiológicas e clínicas das
reações hansênicas em indivíduos paucibacilares e multibacilares atendidos
em dois centros de referência para hanseníase na cidade de Recife-PE"
foi recebido pela Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, em
13/10/09 e registrado com o nº 3396.
Atenciosamente,
Valquiria CunhaSecretária/RSBMT
Prezada Doutora Márcia,
Informo que o trabalho "Poliformismo do gene NRAMP1 em indivíduos com reações hansêncicas atendidos em dois Centros de Referência no Recife, Nordeste do Brasil" foi recebido pela Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, em 05/10/09 e registrado com o nº 3391. Oportunamente, entrarei em contato com Vossa Senhoria.