Molekulárně cytogenetické vyšetření Metoda FISH
Molekulárně cytogenetické vyšetření
Metoda FISH
Pacient
Základní cytogenetické vyšetření chromozomů (karyotypizace)
Molekulárně cytogenetické vyšetření
Příbuzní pacienta
Molekulárněbiologické vyšetření
Molekulárně cytogenetická vyšetření
• Identifikují změny chromozomů molekulárně biologickými metodami
• Příklady metod– hybridizace in situ a její modifikace (CGH, M-FISH,
fiber FISH atd.)– Genové čipy, resp. array CGH, DNA microarray atd.– PRINS, PCR in situ– fluorescenční kvantitativní PCR– metody založené na dodatečné amplifikaci navázané
sondy (MLPA, MAPH)
• K vyšetření většinou postačí jádra interfázních buněk (s výjimkou M-FISH)
Hybridizace
cílová DNA
sonda
denaturace
hybridizace
Hybridizace
• Molekulární (na izolované DNA)
• In situ (v původních buněčných
strukturách – tj. interfázních jádrech,
metafázních chromozomech, popř. celých
buňkách)
Test• 10 minut
• Nezapomeňte uvést své jméno a verzi,
kterou píšete.
• Otázky zaměřené na výběr z více variant
mohou mít jednu i více správných
odpovědí.
Sonda (probe, „próba“)
• Úsek DNA, eventuálně RNA komplementární k určité sekvenci na vyšetřované DNA (target DNA, resp. cílové DNA)
• Plazmid (15 – 20 kbp), fágová DNA, kosmid (popř. jiné kombinace fágové a plazmidové DNA – PAC, BAC), YAC (až 1,5 Mbp)
• Též možno připravit jako PCR-produkt amplifikací vybraného úseku DNA
Značení sond
• Radioaktivní
• Enzymatické
• Fluorescenční
– Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
• Neznačné sondy (značíme vyšetřovanou
DNA)
– např. u CGH, resp. array CGH (genové čipy)
Značení sond
• Přímé
• Nepřímé (biotin, antigenní látka)
– možnost amplifikace signálu
– zdlouhavá manipulace, větší fluorescenční (popř.
radioaktivní) pozadí
FITC - avidin FITC - avidinanti avidin biotin
cílo
vá D
NA
biotin
sond
a
Metody značení sond
• Přímá chemická adice
„reportérské“ molekuly
• PCR se značenými dNTP
• Nick-translace
FISH
Typy sond• Satelitní
– Centromerické
– Telomerické
• Lokus specifické
(„genové“)
• Malovací
(„painting probes“;
celochromozomové)
Satelitní sondy – chromozom 7
Satelitní sondy Centromerická sonda na X – DXZ1
Možný karyotyp 45,X nebo 46,XY
X- a Y-centromerická sonda
X-centromerická sonda – vyšetření marker chromozomu
marker = derivovaný chromozom X
Výsledek hybridizace s telomerickou sondou
Lokus specifická sonda – detekce regionu SRY
Lokus specifická sonda – detekce mikrodelece chromozomu 7q11.23
Jako kontrola byla použita centromerická sonda (D7Z1).
Lokus specifické sondy – vyšetření amplifikace onkogenu HER2/NEU
Normální nález
Amplifikace prokázána
Malovací sondy – současné vyšetření chromozomů 1, 4 a 8
Malovací sondy nelze použít při vyšetření interfázních jader!
Malovací sondyVýsledek hybridizace s malovací
sondou pro chromozom 19
Malovací sondy – detekce nebalancované translokace
chromozomů 11 a 21
t(11;21)
Kdy je třeba indikovat FISH?• V materiálu nejsou přítomny mitózy
– Neúspěšná kultivace– Odebranou tkáň nelze kultivovat (preimplantační vyšetření,
rychlá prenatální vyšetření, vyšetření solidních tumorů, popř. sekčního materiálu z jiných tkání)
• Verifikace složitějších chromozomových přestaveb, identifikace marker chromozomů
• Verifikace mozaiky (zejména nízkofrekvenční)• Diagnostika submikroskopických (kryptických)
chromozomových přestaveb– Mikrodeleční syndromy– Amplifikace onkogenů a mikrodelece tumor-supresorových genů
u malignit
Referáty
Referáty
• M-FISH – 7 min
• CGH – 7 min
• (fiber FISH – 5 min )
Praktické úkoly
viz „Praktická cvičení z klinické cytogenetiky“ – kapitola 9
9.4 Úkol 2 (str. 40)
• 46,XX nebo 47,XXY
• Indikujeme vyšetření
se sondou pro
chromozom Y.
9.5 Úkol 3 (str. 40)
• Pravděpodobně mozaika:
• 45,X/46,XX
• 46,XY/46,XX
• 47,XXY/46,XY
• 45,X/47,XXY
9.6 Úkol 4 (str. 41) – 1. část
9.6 Úkol 4 – 1. část
• 5 signálů svědčí o trizomii chromozomu 13
nebo chromozomu 21
• Signálem jsou označeny:
– 2 větší akrocentrické chromozomy (tj. 13)
– 3 menší akrocentrické chromozomy (tj. 21)
• Výsledek svědčí pro trizomii chromozomu
21 – tj. Downův syndrom.
9.6 Úkol 4 – 2. část – a)
a) Pacient s t(14;21) ... 5 signálů
2 x 21, 1 x der(21;14), 2 x 13
13 13 14 der(14;21)
21 21
Pacient s robertsonskou translokací der(14;21)
9.6 Úkol 4 – 2. část – b)
b) Pacient s t(21;21) ... 4 signály (1 fúzní)
1 x 21, 1 x der(21;21), 2 x 13
13 13 14 14
21 der(21;21)
Pacient s robertsonskou translokací der(21;21)
9.6 Úkol 4 – 2. část – c)
c) Pacient s t(13;21) ... 4 signály (1 fúzní)
2 x 21, 1 x der(13;21) – fúzní, 1 x 13
13 der(13;21) 14 14
21 21
Pacient s robertsonskou translokací der(13;21)
9.6 Úkol 4 – 2. část – d), e), f)
d) Přenašeč s t(14;21) ... 4 signály
1 x 21, 1 x der(14;21), 2 x 13
e) Přenašeč s t(21;21) ... 3 signály (1 fúzní)
1 x der(21;21) – fúzní, 2 x 13
f) Přenašeč s t(13;21) ... 3 signály (1 fúzní)
1 x 21, 1 x der(13;21) – fúzní, 1 x 13
9.6 Úkol 4 – 2. část – g), h)
g) Pacient s t(13;13) ... 4 signály (1 fúzní) 2 x 21, 1 x der(13;13) – fúzní, 1 x 13
h) Přenašeč s t(13;13) ... 3 signály (1 fúzní) 2 x 21, 1 x der(13;13) - fúzní
13 der(13;13)
21 21
der(13;13)
21 21
Pacient Přenašeč
Nejednoznačné výsledky při hybridizaci centromerických
sond pro chromozomy 13 a 21 (resp. 14 a 22) jsou důvodem, že při prenatálním vyšetření
aneuploidií těchto chromozomů požíváme lokus specifické
sondy.
9.7 Úkol 5 (str. 42)
• Plod je postižen Downovým syndromem (viz obr. 9.4B)
• V případě chromozomu 13 je nález normální.
• Zdvojené signály se vyskytují u jader v G2 fázi.
Prenatální vyšetření aneuploidií chromozomů 13, 21 a 18 pomocí
centromerických a lokus specifických sond
Interpretujte molekulárně cytogenetický nález.
Prenatální vyšetření aneuploidií chromozomů 13, 21 a 18 pomocí
centromerických a lokus specifických sond
Trizomie chromozomu 18
Edwardsův syndrom
9.8 Úkol 6 (str. 42 – 43)
• Marker chromozom vznikl z chromozomu 13 nebo 21 (viz obr. 9.5A).
• Další možnosti vyšetření – malovací nebo lokus specifické sondy; popř. připravit z markeru sondu a sledovat, se kterými chromozomy hybridizuje.
• Zjistit, zda zdravá matka nebo zdravý otec mají ve svém karyotypu stejný chromozom.
9.9 Úkol 7 (str. 43)
PACIENT 1 PACIENT 2
delece 7q11.23
9.9 Úkol 7 (str. 43)
• U pacienta 1 je mikrodelece 7q11.23
prokazatelná – chybí signál lokus
specifické sondy na kritickém regionu
• Lze potvrdit diagnózu Williams-Beuren
syndrom.
Syndrom Williams-Beuren• irides stellatae
• hypertelorismus
• otevřená ústa, silné rty
• abnormální dentice
• supravalvulární aortální
stenóza
• hyperkalcémie,
hypoparathyreoidismus
• psychomotorická retardace
• mikrodelece chromozomu
7q11.23„elfin face“
Supravalvulární aortální stenóza
9.9 Úkol 7 (str. 43)
• U pacienta 2 mikrodelece není
prokazatelná. Možné důvody:
– Delece nebo jiná mutace malého rozsahu v
kritickém regionu.
– Postižení v jiném lokusu
– Afekce na negenetické bázi (vliv teratogenů
během těhotenství?)
9.10 Úkol 8 (str. 44)
Syndrom DiGeorge
• vrozená srdeční vada – nejčastěji Fallotova tetralogie
• nízká hladina ionizovaného vápníku v krvi (hypokalcémie)
• aplázie, popř. hypoplázie thymu – v některých případech vede k defektu imunity
• rozštěp patra, popř. gotické patro• abnormální obličejové rysy
Syndrom DiGeorge - facies
Syndrom DiGeorge – typické znaky
Nejčastějším cytogenetickým nálezem je mikrodelece dlouhých ramének chromozomu 22 (22q11.2).
hypertelorismus
mikromandibulaníže nasedající dysplastický ušní boltec
„antimongoloidní“ směr očních
štěrbin
9.10 Úkol 8 (str. 44)
Sonda pro kritický region – lokus HIRA na 22q11.2 (červeně značena)
Kontrolní sonda – lokus ARSA v subtelomerické části 22q (zeleně značena)
9.10 Úkol 8 (str. 44)
• Mikrodelece chromozomu 22q11
prokázána – diagnózu syndrom DiGeorge
lze potvrdit.
• Vyšetřit familiární výskyt, zejména u matky
(vzhledem k nápadné stigmatizaci)
– 50% pravděpodobnost přenosu mikrodelece
na každého potomka.
Na shledanou!
M-FISHMulticolor FISH
Zpět k referátům
Značení sond pro M-FISH
M-FISH – normální chromozomy
M-FISH – translokace t(9;22)
Multicolor banding
Zpět k referátům
CGHKomparativní genomová
hybridizace
Zpět k referátům
CGH
CGH chromozomy po hybridizaci
CGH – uspořádané chromozomy
CGH – normální nález
CGH – abnormální nález
Genový čip (DNA-microarray)
normální DNA
vyšetřovaná DNA
Genový čip (DNA-microarray)
Zpět k referátům