Molekulárně biologická analýza klonální přestavby IgH B-buněk a TCR T-buněk metodou PCR Michaela Šváchová Ústav patologie FN Olomouc
Jan 05, 2016
Molekulárně biologická analýza klonální přestavby IgH B-buněk a TCR T-
buněk metodou PCR
Michaela Šváchová
Ústav patologie FN Olomouc
Klonalita
detekce klonality – diagnostika a klasifikace lymfoproliferativních onemocnění
polyklonalita – normální stav organizmu (benigní), přítomnost velkého počtu klonů s odlišnými přestavbami, schopné reagovat na velké množství antigenů
monoklonalita – patologický proces (maligní), nádorové proliferace odvozené od jedné transformované buňky, stejná genetická výbava
B- a T-lymfomy – populace s monoklonální přestavbou IgH B-buněk a TCR T-buněk
B- a T-lymfocyty
Lymfocyty – vznikají v kostní dřeni z pluripotentních kmenových buněk (lymfoidní linie)
Vývoj a diferenciace – B-lymfocyty – v embryonálních játrech
v kostní dřeni T-lymfocyty – v thymu
Jeden lymfocyt – jediná protilátka
B-lymfocyty – humorální imunitní reakce (produkují imunoglobuliny)
T-lymfocyty – buněčná imunita (vytvářejí antigen-specifické receptory na povrchu buňky)
Detekce klonální přestavby IgH B-buněk a TCR T-buněk u maligních lymfomů IgH B-buněk a TCR T-buněk genové
segmenty (subgeny) přeskupení subgenů (VDJ rekombinace) funkční strukturní gen funkční polypeptidové řetězce IgH a TCR
VDJ rekombinace – unikátní klonální marker
PCR – k detekci klonální přestavby u lymfoproliferativních onemocnění
Struktura imunoglobulinu Ig – 2 těžké (H) a 2 lehké (L) polypeptidové řetězce o stejné primární struktuře Spojeny disulfidovými vazbami Konstantní oblasti (C) – relativně neměnná sekvence AA Variabilní oblasti (V) – jednotlivé imunoglobuliny příslušného typu těžkého nebo
lehkého řetězce se navzájem liší sekvencí AA Variabilní oblast – FR I-IV tzv. úseky struktury základní (framework) CDR I-III hypervariabilní úseky, (complementarity determining region), oblasti
určující komplementaritu, vazebná místa pro antigen
T buněčný receptor TCR – heterodimer, spojuje disulfidovou vazbou glykoproteinové
řetězce αβ nebo γδ Většina T lymfocytů exprimuje na svém povrchu αβ řetězce, buňky
exprimující γδ tvoří asi 5% T buněčné populace Jednotlivé buňky exprimují buď αβ nebo γδ heterodimery Řetězce tvořeny V a C doménami
(kódované přeskupenými subgeny)
B-lymfocyt
IgH
Igκ exprese IgH/Igκ
delece Igκ
Igλ exprese IgH/Igλ
Izotypická exkluze
T-lymfocyt
TCRD
TCRG exprese TCRγδ
delece TCRD
TCRB
TCRA exprese TCRαβ
Imunoglobulin a přeskupení subgenů
Ig subgeny – lokalizovány na chromozomech 2, 22, 14
TCR subgeny – 14, 7 V – subgeny kódují variabilní oblast C – subgeny kódují konstantní oblast J – subgeny kódují 12-21 koncových
AA variabilní oblasti D – subgeny – každý kóduje asi 5 AA
CDRIII úseku VJ somatická rekombinace –
– κ a λ Ig řetězce
– α a γ TCR VDJ somatická rekombinace –
– IgH
– β a δ TCR
VDJ rekombinace Přeskupení TCR β
Rekombinace subgenů V, D a J řízena RAG1 a RAG2 rekombinázovými enzymy
RAG1 a RAG2 rozpoznávají specifické DNA sekvence RSS (rekombinační signální sekvence), lokalizované po obou stranách přeskupujících se subgenů
RSS obsahují heptamery a nonamery, oddělené od sebe 12 nebo 23 páry bazí, kde dochází ke štěpení DNA a k ligaci vytvořených kódujících spojů
Vytvoření funkčního Ig nebo TCR genového produktu
Zpracování bioptických vzorků, izolace DNA
Biopsie, tkáň fixovaná formalínem a zalitá do parafínu Odparafínování xylenem, promytí a odstranění xylenu etanolem Izolace DNA pomocí Puregene DNA Purification Kit Lýza buněk – lyzační pufr a proteináza K, inkubace přes noc při
56°C Odstranění RNA inkubací lyzátu s RNázou při 37°C Odstranění (vysrážení) proteinů přidáním precipitačního roztoku Vysrážení DNA izopropanolem Promytí DNA 70% etanolem, odpaření etanolu Hydratace DNA hydratačním pufrem Kontrola kvality a množství DNA měřením na spektrofotometru při
260 a 280 nm Kontrolní PCR k ověření integrity a amplifikovatelnosti vyšetřované
DNA
Kontrolní PCR -zjištění integrity a amplifikovatelnosti
vyšetřované DNA
DN
A M
AR
KE
R
DN
A M
AR
KE
R
100 bp
200 bp
300 bp
400 bp
100 bp
200 bp
300 bp
400 bp
Polymerázová řetězová reakce PCR
Metoda pro mnohonásobnou amplifikaci specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace
Reakční směs obsahuje: - templátovou DNA - primery (oligonukleotidy) - dNTP (směs nukleotidů) - PCR vodu - PCR pufr - roztok MgCl2 - enzym – termostabilní DNA
polymerázu, vyznačující se 5´→3´polymerázovou a
3´→5´exonukleázovou aktivitou
PCR-Polymerázová řetězová reakce Amplifikace hypervariabilních oblastí VDJ Primery – specifické ke konzervovaným oblastem FR1 – FR3, JH Multiplex PCR – použití více párů primerů, nutná optimalizace
z důvodu možné kompetice mezi primery Nested PCR – odstupňovaná PCR, vyšší specifita, primární produkt
získaný pomocí 1. sady vnějších primerů je amplifikován pomocí 2. sady vnitřních primerů
Seminested PCR – jeden z párů primerů je použit v 1. i 2. kole PCR
VH
FR1 CDR1
DH JH
FR2
JH2
FR3
JH1
JH primers
N NFR1 FR2 FR3 FR4CDR1 CDR2
CDR3FR1
Stanovení klonality T-buněk
75 bp
100 bp
200 bp
+ + +---
- - - DN
A M
AR
KE
R
Vγ11-Jγ11 TβD1-TβJ2 TβD2-TβJ2
monoklonální band
Stanovení klonality B-buněk
+ ++ ++++
+
FR1 FR2 FR3
- - -
100 bp
200 bp
300 bp
DN
A M
AR
KE
R
500 bp
monoklonální band
Interpretace a limitace výsledků PCR Polyklonalita – smear Monoklonalita – band Monoklonalita na polyklonálním pozadí – příměs reaktivních
buněk Bialelické přeskupení – obě alely – dva bandy Klonalita nemusí znamenat malignitu „Lineage infidelity“ – fenomén nevěry k příslušné buněčné
linii (prekurzorová B-ALL, AML) Pseudoklonalita (vysoká senzitivita PCR může způsobit
amplifikaci několika málo přeskupení, což může být chybně interpretováno jako klonální přeskupení)
Falešně negativní výsledky – chybné nasedání primerů např. v důsledku mutací vyšetřované DNA
Falešně pozitivní výsledky – využití heteroduplexní analýzy
Heteroduplexní analýza PCR produktu denaturace 5 min při 94°C
rychlá náhodná renaturace 1 hod při 4°C indukce homo nebo heteroduplexních formací heteroduplexy – různá migrační rychlost – polyklonální lymfoproliferace homoduplexy – identická migrační rychlost – monoklonální proliferace
před
po
Srovnání barvení EtBr × GelRed
EtBr
GelRed
Závěr Záchytnost metody – 60-100% odhalených skutečně klonálních
lymfoproliferací (závisí na vlastnostech analyzované tkáně)
Vysoký záchyt – B-chronická lymfatická leukémie, leukémie z vlasatých buněk, lymfom z plášťových buněk Nižší záchyt – folikulární lymfom, difuzní velkobuněčný B-lymfom (důsledek somatických hypermutací u germinálních a postgerminálních lymfomů) Citlivost metody – odhalení klonality v případě výskytu alespoň 5%
buněk s klonální přestavbou ve vyšetřovaném vzorku
Kvalita vyšetřované tkáně – způsob zpracování (fixace formalínem – degradace DNA, cross reakce mezi vlákny DNA, sekvenční alterace atd. – selhání PCR)
vhodnější tkáň nativní, mražená, příp. fixovaná fixativy na bázi etanolu
Fixace tkáně /nekropsie/
100 bp
200 bp
100 bp
200 bp
300 bp 400 bp
VAKUUM
FFPE
sval
uzlin
a
játr
a
myo
kard
ledv
ina
plíc
e
pros
tata
uzlin
a
D
NA
mar
ker