Molekulargenetische und biochemische Untersuchungen zur Funktion und Struktur des Enzym II Mtl aus Escherichia coli K-12 Dissertation Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften des Fachbereichs Biologie/Chemie der Universität Osnabrück Vorgelegt von Şevket Turgut Osnabrück 2003
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Molekulargenetische und biochemische Untersuchungen …nbn:de:gbv:... · PEP Phosphoenolpyruvat ... Hinzu kommen die Fähigkeiten, Signale aus der Umgebung zu erkennen und weiterzuleiten,
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Molekulargenetische und biochemische Untersuchungen zur Funktion und Struktur
des Enzym IIMtl aus Escherichia coli K-12
Dissertation Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
des Fachbereichs Biologie/Chemie der
Universität Osnabrück
Vorgelegt von Şevket Turgut
Osnabrück 2003
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis .......................................................................................... I Abbildungsverzeichnis .................................................................................. II Tabellenverzeichnis ..................................................................................... III Abkürzungsverzeichnis ................................................................................ IV
I. Einleitung .............................................................................................1 II. Material und Methoden ....................................................................11
III. Ergebnisse .......................................................................................50
III.1. Selektion und Untersuchung entkoppelter Mutanten ....................... 50 III.1.1. Konstruktion von Stämmen zur Selektion entkoppelter Mutanten ......... 50 III.1.2. Entkoppelte Mutanten aus den Selektionen ....................................... 65 III.1.3. Entkoppelte Mutanten aus lokalisierter Mutagenese ........................... 69 III.1.4. Selektion von Suppressormutanten ................................................... 72 III.1.5. Charakterisierung der Mutanten ...................................................... 74
III.2. Topologieuntersuchungen am EIIMtl ................................................. 95 III.2.1. Konstruktion der erforderlichen Plasmide und Mutanten ..................... 96 III.2.2. Markierung der Einzel-Cystein MtlA-Mutanten ................................... 99 III.2.3. Reinigung und immunologischer Nachweis des MtlA-6His ............... 100 III.2.4. Ergebnisse der Biotinmaleimid-Markierungen ................................. 102
IV. Diskussion ......................................................................................107
IV.1. Für Transport und Phosphorylierung relevante AS im EIICMtl .......... 108 IV.1.1. Vergleich der Mutationen E218A, E218V und H256P ...................... 108 IV.1.2. Die AS 218 und 256 im Translokationsmodell ................................ 113
IV.2. Untersuchung der Sekundärstruktur des EIICMtl .............................. 121 IV.2.1. Mögliche Strukturen des EIICMtl ...................................................... 121
V. Zusammenfassung ..........................................................................133 VI. Literaturverzeichnis .......................................................................135 VII. Anhang .............................................................................................1
II Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
I. Einleitung .............................................................................................1
Abb.I.1. Transport und Phosphorylierung eines Substrats über ein PTS ............... 4 Abb.I.2. Modell der Sekundärstruktur des IICMtl-Transporters aus E.coli .............. 7 Abb.I.3. Modell der essentiellen Strukturelemente des PTS Transport-Systems
am Beispiel des EIIMtl ........................................................................ 9
II. Material und Methoden ....................................................................11
Abb.II.8.1. Substrataufnahme von D-Mtl ....................................................... 35 Abb.II.8.2. Schematische Darstellung eines Lineweaver-Burk-Diagramms ........ 37 Abb.II.8.3. Exemplarische Bindekurve ........................................................... 42
III. Ergebnisse .......................................................................................50
Abb.III.1.1. Wildtyp- und semisynthetischer Stoffwechselweg für den D-Mtl- Abbau in E.coli ......................................................................... 51
Abb.III.1.2. Schematische Darstellung der Konstruktion von F’lac::dalD ............. 52 Abb.III.1.3. Alternativer semisynthetischer Stoffwechselweg für den D-Mtl-
Abbau in E.coli ......................................................................... 58 Abb.III.1.4. Sequenz des Gens mtlA aus E.coli K-12 ...................................... 67 Abb.III.1.5. mtlA-Plasmid pGJ9 ................................................................... 70 Abb.III.1.6. SDS-Gel der Vesikel nach der Überexpression ............................. 83 Abb.III.1.7. Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel mit 1mM [14C]-D-Mtl ....... 84 Abb.III.1.8. Phos.-Aktivitäten von H256P-Mutanten mit 500µM [14C]-D-Mtl ..... 85 Abb.III.1.9. KM
app-Wert Messungen des WT-Stamms LGS322/pGJ9 für D-Mtl ... 88 Abb.III.1.10. KM
app-Wert Messungen von LGS322/pGJT9-5 für D-Mtl ............... 88 Abb.III.1.11. KM
app-Wert Messungen von LGS322/pDSM1 für D-Mtl ................. 89 Abb.III.1.12. KM
app-Wert Messungen von LGS322/pDSM2 für D-Mtl ................. 89 Abb.III.1.13. Nichtlineare Kinetik der KM
app-Messung von LGS322/pDSM2 ........ 91
Abb.III.2.1. SDS-Gel einer MtlA(His)6-Reinigung ........................................... 100 Abb.III.2.2. SDS-Gel nach dem Proteintransfer auf Membran ........................ 101 Abb.III.2.3. Immunologischer Nachweis des MtlA(His)6 .................................. 101 Abb.III.2.4. Biotinmaleimidmarkierungen und Nachweise des MtlA(His)6 ........ 103
IV. Diskussion ......................................................................................107
Abb.IV.1. Interpretation der nichtlinearen Kinetik von LGS322/pDSM2 .......... 111 Abb.IV.2. Vergleich der EIICMtl AS-Sequenzen aus E. coli und K. pneumoniae . 112 Abb.IV.3. Vergleich der EIICMtl AS-Sequenzen verschiedener Stämme ............. 114 Abb.IV.4. Bindung eines Phosphats bzw. Maleimids an ein Cystein ................ 122 Abb.IV.5. Ergebnisse aus Sequenz- und Strukturuntersuchungen
im Sekundärstrukturmodell des EIICMtl-Transporters aus E.coli ......... 123 Abb.IV.6. Vergleich der postulierten transmembranen Helices von EIICMtl und EIICGlc ....................................................................... 126 Abb.IV.7. TMHMM-Vorhersage der Topologien von EIICMtl und EIICGlc .......... 128 Abb.IV.8. Mögliche 2D-Strukturen des IICMtl-Transporters aus E.coli .............. 130 Abb.IV.9. Mögliche 3D-Strukturen des IICMtl-Transporters aus E.coli .............. 131
Tabellenverzeichnis III
Tabellenverzeichnis
II. Material und Methoden ....................................................................11
Tab.II.1.1. Bakterienstämme ......................................................................... 11 Tab.II.1.2. Phagen ....................................................................................... 12 Tab.II.1.3. Plasmide ..................................................................................... 13 Tab.II.1.4. Neukonstruierte und -isolierte Plasmide .......................................... 14 Tab.II.1.5. Oligonukleotide .......................................................................... 16 Tab.II.2. Häufig verwendete Puffer und Lösungen ......................................... 20 Tab.II.8.1. Zelltiter und Proteinmenge ............................................................ 34 Tab.II.8.2. Eingesetzte Zuckerkonzentrationen und dazugehörige cpm .............. 36
III. Ergebnisse .......................................................................................50
Tab.III.1.1. Plattentest zum Nachweis einer funktionellen DalD aus pHEXD ..... 54 Tab.III.1.2. Plattentest zum Nachweis einer funktionellen DalD aus pLSD101 . 55 Tab.III.1.3. Plattentest der Exkonjuganten aus der Kreuzung
CSH36 /F’lac::dalD /pLSD101 /pPSO110 X S136∆ ................... 56 Tab.III.1.4. Plattentest des Selektionsstammes LTK31 .................................... 57 Tab.III.1.5. Plattentest LTK31-1 und LTK31-2 .............................................. 59 Tab.III.1.6. Plattenmarkertest LTK32 und LTK32-1 ....................................... 60 Tab.III.1.7. Ursprüngliche AtlR- und AtlS-Phänotypen ..................................... 61 Tab.III.1.8. Neu beobachtete AtlR- und AtlS-Phänotypen ................................ 62 Tab.III.1.9. Plattentest P1.∆(crr)::kan X LGS31 ........................................... 63 Tab.III.1.10. Entkoppelnde Mutationen aus LGS322-1 /pGJ9∆137
und LGS324-1 /pGJ9∆137 ...................................................... 68 Tab.III.1.11. Phänotypen der entkoppelten Mutanten ..................................... 69 Tab.III.1.12. Austausche bei pGAL3-1, pGAL3-2 und pGAL3-3 ...................... 71 Tab.III.1.13. Austausche bei pGAL3-4 und pGAL3-5 ..................................... 72 Tab.III.1.14. Mutationen aus LGS322 /pGJT9-3 und LGS322 /pGJT9-4 ......... 74 Tab.III.1.15. Markertest entkoppelnder Mutanten in LGS322 und LGS322-1 ... 76 Tab.III.1.16. Plattentest der Stämmen LGS322, LGS322-1 und LTK31-2
mit den „Suppressormutationen“ ............................................... 78 Tab.III.1.17. Zellerträge und Generationszeiten der Stämme LGS322 und
LGS322-1 mit verschiedenen mtlA-Plasmiden ............................. 79 Tab.III.1.18. Mutanten aus dem Plasmid pMaHisMtlAPr ................................. 82 Tab.III.1.19. Gesamtproteinkonzentrationen der Vesikel ................................. 83 Tab.III.1.20. Spezifische Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel .................... 86 Tab.III.1.21. KM
app-Werte und V der mtlA-Mutanten für D-Mtl in LGS322 .......... 90 Tab.III.1.22. Stammabhängige Phänotypen von mtlA-Mutanten ...................... 92 Tab.III.1.23. Zusammengefasste Ergebnisse der EIIMtl-Mutanten
im Stamm LGS322 .................................................................. 94
Tab.III.2.1. Plasmide der Reihen pMMX5-3x und pMMX5-4x .......................... 98 Tab.III.2.2. Aktivitäten der „Cys-Scanning“-MtlA-Derivate ............................... 98 Tab.III.2.3. Ergebnisse der Biotinmaleimid-Markierungen ............................. 104
et al., 1966) zeigten bei einer Vielzahl von Kohlenhydraten die Beteiligung dieser
Systeme. Die der Phosphorylierung von Kohlenhydraten zu Grunde liegende allgemeine
Gesamtreaktion lautet:
Als weitere Besonderheit der PTSs wird deutlich, dass nicht ATP sondern
Phosphonenolpyruvat (PEP) als Phophorylgruppendonor dient. PEP steht dabei am
Anfang einer Phosphorylierungskaskade, an der folgend eine lösliche
Histidinproteinkinase EnzymI (EI; Gen ptsI) und das Histidin-Protein (HPr; Gen ptsH)
beteiligt sind. Die Gene ptsH und ptsI (und crr; Genprodukt EIIACrr) bilden ein Operon
(De Reuse & Danchin, 1988). Sie werden mit Ausnahme des Fruktose-PTS von allen
PTSs benötigt und daher zu den allgemeinen, substratunspezifischen Komponenten
gezählt. Die Übertragung der Phosphatgruppe vom PEP auf EI erfolgt durch
Autophosphorylierung des EI-Dimers an einem Histidin-Rest (Misset et al., 1980; Weigel
et al., 1982), welches seinerseits die Phosphorylgruppe auf einen Histidin-Rest des HPr
überträgt. Diesen allgemeinen PTS Komponenten stehen die Kohlenhydrat-spezifischen
EnzymeII (EIIs) gegenüber, mit denen das P~HPr in der Folge der
Phosphorylierungskaskade reagiert (Abb. I.1.).
Die bakteriellen PTSs sind aber nicht nur Kohlenhydrat-Transportsysteme,
vielmehr sind sie Teil eines zentralen Signaltransduktionssystems mit wichtigen
regulatorischen Funktionen, die sich über Katabolitenrepression, Induktorausschluss,
Chemotaxis und globale Regulation erstrecken (Postma et al., 1993; Lengeler &
Jahreis, 1996). Bisher sind bei E. coli K-12 über 20 verschiedene PTSs beschrieben, die
eine Vielzahl unterschiedlicher Substrate in die Zelle transportieren (Saier, 1993;
Lengeler et al., 1994; Postma et al., 1996; Tchieu et al., 2001).
4 I. Einleitung
Abb. I.1. Transport und Phosphorylierung eines Substrates über ein PTS In der Abbildung sind die biochemischen Reaktionen dargestellt, die an der Gruppentranslokation während des Transports und der Phosphorylierung eines Substrates über ein PTS beteiligt sind. Dargestellt sind ein membrangebundenes, substratspezifisches EnzymII, mit den speziellen Domänen IIC, IIB, IIA, sowie die allgemeinen PTS-Komponenten, EnzymI und HPr, mit den entsprechenden Phosphorylierungsstellen (nach Lengeler & Jahreis, 1996).
I.4. Strukturelle und funktionelle Domänen der
EII-Permeasen
Auf der Grundlage von Sequenzvergleichen und Komplementationsstudien
lassen sich die Permeasen in fünf genetische Familien einteilen (Lengeler et al., 1994;
Lengeler & Jahreis, 1996). Ihnen liegt ein modularer Aufbau zu Grunde, der die drei
funktionell autonomen Domänen IIA, IIB und IIC (bzw. IIC und IID bei der Mannose
Familie) umfasst. Die Expression der EIIBMtl-Domäne von E. coli zeigte, dass EIIBMtl als
enzymatisch aktives Protein existieren kann und die in vitro Phosphorylierungsaktivität
zusammen mit EIIAMtl und EIICMtl wiederherstellen kann (Robillard et al., 1993).
Grundlegende Arbeiten hatte dabei vorher den einzelnen Domänen eine biochemische
Funktion zugewiesen (Grisafi et al., 1989; Van Weeghel et al., 1991a; Van Weeghel
et al., 1991b). In den jeweiligen Familien sind die Domänen in unterschiedlicher
Reihenfolge angeordnet und können frei oder fusioniert bzw. durch „Linker“ verbunden
vorliegen. Einander entsprechende Domänen aus einer PTS-Familie können sich
funktionell ersetzen. Die funktionelle Abhängigkeit des EIIScr von Crr (Lengeler et al.,
1982) sowie die Wiederherstellung des Glc+-Phänotyps in einer Crr--Mutante durch
Synthese eines intakten EIINag (Vogler et al., 1988) gehören zu den ersten Beispielen
funktioneller Übereinstimmung der strukturellen Domänen der PTS-
I. Einleitung 5
Transportkomponenten. Ein Grund dafür ist, dass innerhalb einer Familie die strukturell
und katalytisch relevanten Reste konserviert sind. Die Ähnlichkeit (% identische
Aminosäuren) innerhalb einer Familie in den relevanten Regionen reicht von nahezu
identisch (>98%) bis zu wenigen, lokal begrenzten Motiven. In funktionellen Bereichen
der einzelnen Domänen können die hochkonservierten Bereiche teilweise durch ein bis
zwei Aminosäuren definiert werden (Lengeler, 1990; Lengeler et al., 1994). Die aus
etwa 100 AS bestehende hydrophile IIA-Domäne enthält einen konservierten Histidin-
Rest, der durch P~HPr phosphoryliert werden kann. Ein konserviertes Cystein wird in der
etwa gleichlangen hydrophilen IIB-Domäne von IIA phosphoryliert. Mit etwa 350 AS
bildet die membrangebundene IIC-Domäne den größten Teil des EnzymII-Proteins. Der
hydrophobe Bereich dieser Domäne kann 6-8 transmembrane Helices ausbilden, die
eine große hydrophobe, zytoplasmatische Schleife flankieren. In dieser Schleife findet
man oft ein GXXE-Motiv, wobei der Glutaminsäure-Rest (E) in allen bisher bekannten EII
konserviert ist und in vergleichbarem Abstand immer durch einen hochkonservierten
hydrophilen Rest (His, Asn oder Gln) begleitet wird. Im Gegensatz zu der variablen
modularen Anordnung der Domänen untereinander, weist eine auffällig hohe
Konservierung bestimmter Strukturen und Motive auf relevante Bereiche in dem Enzym
hin (Lengeler & Jahreis, 1996). Es ist offensichtlich, dass man sich bei der Beantwortung
der vielfältigen Fragen nach Substratspezifität, Mechanismus und Kopplung des PTS-
abhängigen Transports auf diese konservierten Bereiche konzentrieren sollte.
I.5. Der EIIMtl-Transporter
Das E. coli EIIMtl besteht aus einer einzigen Polypeptidkette von 637 Aminosäuren
Länge, die durch das mtlA-Gen (Solomon & Lin, 1972; Jacobson et al., 1979; Lee &
Saier, 1983) kodiert wird. Mit den Genen mtlD (Mtl 1-P-Dehydrogenase; Davis et al.,
1988; Jiang et al., 1990) und mtlR (Repressor; Figge et al., 1994) bildet das mtlA-Gen
ein Operon (Genreihenfolge mtlA, D, R), welches bei 80,7min auf dem E. coli-
Chromosom kartiert (Solomon & Lin, 1972; Lengeler, 1975a). Nach Transport und
Phosphorylierung des D-Mannitols (Mtl) durch das EIIMtl wird Mtl-1-P durch die NAD-
abhängige Mtl-1-P-Dehydrogenase zu D-Fruktose-6-P umgewandelt (Wolff & Kaplan,
1956; Klungsöyr, 1966; Solomon & Lin, 1972). Die Regulation des Systems unterliegt
dem Mtl-Repressor (MtlR), der molekulare Induktor ist ausschließlich Mtl (Tanaka et al.,
1967; Lengeler & Steinberger, 1978).
6 I. Einleitung
Das EIIMtl-Protein lässt sich in drei funktionelle Domänen unterteilen (Abb. I.1.).
Die meist hydrophoben aminoterminalen AS der Position 1 bis 334 bilden die
membranüberspannende EIIC-Domäne (Abb. I.2.) mit der Substratbindestelle und der
Transporterfunktion (Grisafi et al., 1989; Lolkema et al., 1990; Briggs et al., 1992).
Das für die Übertragung der Phosphorylgruppe essentielle Cys-384 (Pas & Robillard,
1988a; Pas & Robillard, 1988b; Grisafi et al., 1989; Pas et al., 1991) befindet sich in
der folgenden hydrophilen EIIB-Domäne (AS 335 bis 457). Die AS 458 bis 637
gehören zur EIIA-Domäne, die ihrerseits das in der Phosphorylierungskette essentielle
konservierte His-554 enthält (Pas & Robillard, 1988b; Pas et al., 1991; van Weeghel et
al., 1991b, 1991c).
Die exakte Topologie der EIIC-Domäne wurde bisher noch nicht bestimmt.
Zahlreiche Untersuchungen deuten darauf hin, dass die funktionell aktive Form des
Proteins eine dimere Konformation aufweist (Übersicht bei Jacobson, 1992; Boer et al.,
1994; Boer et al., 1996; Koning et al., 1999; Heuberger et al., 2002). Hinsichtlich der
Sekundärstruktur wurde anhand von Hydropathiestudien ein Model mit sieben
transmembranen Segmente und einem periplasmatischen N-Terminus vorgeschlagen
(Lee & Saier, 1983). Dagegen führten die Ergebnisse von MtlA-PhoA-Fusionsstudien zu
einem Sekundärstrukturmodell mit sechs transmembranen α-Helices und einem
zytoplasmatischen N-Terminus (Sugiyama et al., 1991). Ergebnisse aus Tryptophan-
Fluoreszenzstudien unterstützen dieses Modell (Dijkstra et al., 1996). Weitere
Untersuchungen, deren Kern Hydrophobizitätsstudien und die Ermittlung einer
Konsensussequenz aus den EIICMtl verschiedener Stämme bildete, führten unter der
Berücksichtigung verschiedener Methoden zur Vorhersage von
Membranproteinstrukturen (Kyte & Doolittle, 1982; Engelman et al., 1986; von Heijne
& Gavel, 1988; von Heijne, 1992) zu einem EIIC-Modell aus 6 transmembranen
Helices, drei kurzen periplasmatischen und zwei großen zytoplasmatischen Schleifen
sowie einem zytoplasmatischen N-Terminus (Lengeler et al., 1994; Lengeler & Jahreis,
1996). Dieses Modell ist in Abbildung I.2., basierend auf einem Vergleich der aktiven
und näher charakterisierten EIICMtl-Aminosäueresequenzen von E. coli (Lee & Saier,
1983), S. carnosus (Fischer & Hengstenberg, 1992; Reiche et al., 1996), K.
pneumoniae (Otte & Lengeler, 2001), S. mutans (Honeyman & Curtiss, 2000) und B.
stearothermophilus (Henstra et al. 1996), dargestellt.
I. Einleitung 7
Abb. I.2. Modell der Sekundärstruktur des IICMtl-Transporters aus E. coli (nach Sugiyama et al., 1991 und Lengeler et al., 1994; verändert)
Dem Modell liegen die Ergebnisse aus Sequenzvergleichen und mtlA-phoA Fusionsstudien zu Grunde. Periplasmatische und zytoplasmatische Schleifen sind durch arabische Zahlen gekennzeichnet. Die postulierten transmembranen α-Helices sind durch römische Zahlen gekennzeichnet. In den verglichenen Sequenzen identische Proteine sind schwarz unterlegt. Blaue Kreise zeigen Lücken bzw. Insertionen in den verglichenen AS-Sequenzen an. Wichtige am Transportmechanismus beteiligte AS sind rot hervorgehoben. Leere Kreise stellen Aminosäuresequenzen unbestimmter Länge dar. Weitere Erläuterungen sind im Text zu finden.
Bereits die Betrachtung der Sequenzvergleiche lässt eine besondere Funktion der
Schleife 5 aufgrund der sehr hohen Konservierung der AS vermuten. Die Ähnlichkeit
liegt in dem 87 AS langen Bereich zwischen den vermuteten Helices IV und V bei 55,2%
identischen AS, während die Konservierung über das gesamte EIICMtl (AS 1-344) bei
8 I. Einleitung
38,4% liegt. Zudem befinden sich in der Schleife 5 mehrere konservierte Aminosäuren
die nachweislich eine wichtige Funktion beim Transportprozess haben. Dazu gehört im
EIIMtl das His195, welches essentiell für die Substratbindung zu sein scheint (Weng &
Jacobson, 1993). Darüber hinaus findet man in der Schleife 5 bei AS 254-257 mit der
Aminosäure-Folge -G-I-H-E- das in EII-Transportern hochkonservierte GXXE-Motiv
(Lengeler et al., 1990). Mutationen in diesem Bereich führten zum Verlust von
Bindungs- und Phosphorylierungsaktivität (Saraceni-Richards & Jacobson, 1997), zum
Verlust der Transportaktivität bei verbleibender Phosphorylierungsaktivität (Manayan et
al., 1988) oder zu einer Entkopplung von Transport und Phosphorylierung (Otte, 2000;
Turgut, diese Arbeit). Diese Ergebnisse deuten auf eine maßgebliche Beteiligung der
Aminosäuren des GIHE-Motivs an den komplexen Transport- und
Phosphorylierungsprozessen hin. Allerdings führten auch Austausche an dem
konservierten E218 (E218A, E218V) des EIICMtl zu einer funktionellen Entkopplung von
Transport und Phosphorylierung (Klawitter, 1992; Scholle, 1993; Heuel, 1997; Otte,
2000; Turgut, diese Arbeit), womit die gesamte Schleife 5 eine zentrale Struktur des
gekoppelten Transportprozesses zu sein scheint. Da dieser Prozess neben Transport und
Phosphorylierung auch die Bindung des Substrates beinhaltet, würde die Lokalisation
der oben genannten wichtigen Aminosäuren in einer zytoplasmatischen Schleife
widersinnig erscheinen. Überträgt man ein 1993 von Buhr & Erni für die Struktur vom
EIIGlc vorgeschlagenes Modell auf das EIIMtl, so würde ein Teil der Schleife 5 zu einem
transmembranen Bereich werden und das E257 des GIHE-Motivs im Periplasma liegen
(Lengeler et al., 1994). Allerdings gibt es auch für das von Lengeler vorgeschlagene
Sekundärstrukturmodell vom EIICMtl (Lengeler et al., 1994; Lengeler & Jahreis, 1996)
ein dreidimensionales Modell, das den Ergebnissen aus Sequenzanalysen,
Fusionsstudien und Hydrophobizitätstests entspricht. Nach diesem Modell von Lengeler
(Lengeler, 1990; Lengeler et al., 1994) faltet sich die Schleife 5 in das Innere des
EIICMtl-Transporters und bildet ein hydrophiles, katalytisches Zentrum (Abb. I.3.).
Da eine genaue Kenntnis der Struktur des EIICMtl einen wichtigen Fortschritt im
Verständnis der Funktion des Transportmechanismus bedeuten würde, wurde in dieser
Arbeit versucht, mit weiteren Experimenten zusätzliche Informationen zur Topologie zu
erhalten. Mit der gezielten Markierung von Cysteinen („Cystein-Scanning“) sollte vor
allem die relative Lage der offensichtlich funktionell sehr bedeutsamen Schleife 5
ermittelt werden.
I. Einleitung 9
Abb. I.3. Modell der essentiellen Strukturelemente des PTS Transport-Systems am Beispiel des EIIMtl (nach Lengeler, 1990)
Es sind die allgemeinen Komponenten der PTS (EnzymI, HPr) sowie das substratspezifische IIMtl aus E. coli schematisch dargestellt. Für EIIC werden sechs transmembrane α-Helices mit einer Schleife 5 postuliert, die sich in den von den α-Helices gebildeten Kanal hineinfaltet. In dem hydrophilen Kern befinden sich die für den Transport essentiellen Aminosäuren (siehe Text).
Aber auch die Selektion von Mutationen, die den Transport entkoppeln, kann für
den Transport wichtige Aminosäuren identifizieren. Zusätzlich isolierte
Suppressormutanten könnten zudem noch Informationen über die relative Lage
einzelner Aminosäuren zueinander liefern. Wie bereits erwähnt, wurden schon einige
Mutationen charakterisiert, die zur Entkopplung des Transports von der
Bei Plasmiden mit geringer Kopienzahl wurde bei gleichem Ansatzvolumen die doppelte
Zellmenge eingesetzt. Zur Isolierung hochreiner Plasmid-DNA für Sequenzierungen
wurden das „Jet Star-Kit“ (Genomed) oder das ‚‚Flexi-Prep-Kit‘‘ (Pharmacia Biotech)
nach Angaben der Hersteller benutzt.
II. Material und Methoden 29
II.7.4. Bestimmung der DNA-Konzentration
Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte nach Sambrook et al. (1989)
durch die photometrische Messung der Extinktion der DNA-Proben bei 260nm. Dabei
entspricht OD260=1 etwa 50 µg/ml doppelsträngiger DNA. Um den Grad der
Verunreinigung durch Proteine zu ermitteln, wurde die Extinktion der Proben bei einer
Wellenlänge von 280nm gemessen. Reine Präparationen sollten einen Quotienten
OD260 / OD280 von 1,8 bis 2,0 aufweisen. Werte unter 1,8 erlauben keine exakte
Konzentrationsbestimmung.
II.7.5. DNA-Restriktion
Für die analytische oder präparative Spaltung von DNA wurden entsprechend
den Herstellerangaben 1-3 Einheiten des Restriktionsenzyms pro µg DNA (DNA-
Konzentration einer Miniplasmidisolierung: 0,5 bis 1,5µg/µl) zugegeben und bei der für
das Enzym optimalen Reaktionstemperatur im vom Hersteller empfohlenen Puffer
inkubiert. Zur Analyse wurde etwa eine Stunde, für Präparationen 2-3 Stunden und bei
Restriktionen mit chromosomaler DNA über Nacht verdaut. Bei Restriktionen mit mehr
als einem Enzym wurde der für alle Enzyme günstigste Inkubationspuffer oder der
‘‘One-Phor-All‘‘-Puffer PLUS (Pharmacia Biotech) verwendet. Vor der
gelelektrophoretischen Auftrennung wurde den Reaktionen 5xGLB zugegeben.
II.7.6. “Klenowbehandlung“ von DNA-Fragmenten
Zum Auffüllen 5’-überstehender Enden bzw. Abbau 3’-überstehender Enden
wurde eine Behandlung der DNA mit der Klenow-Polymerase nach Ausubel et al.
(1990) durchgeführt. Dieses Enzym besteht aus der großen Untereinheit der DNA-
Polymerase I (ohne 5’→3’ Exonuklease-Aktivität), die in Abwesenheit von dNTP
überstehende 3’-Enden abverdaut und 5’-überstehende Enden bei Zugabe eines dNTP-
Mixes auffüllen kann. Die entstehenden „glatten“ Enden wurden für Klonierungen von
PCR-Produkten oder zur Ligation von DNA-Enden, die mit unterschiedlichen Enzymen
geschnitten wurden, benötigt. Pro µg DNA wurden 0,5 Einheiten Klenow-Enzym und der
vom Hersteller empfohlene Puffer zugegeben und bei 30°C für 5min inkubiert.
Anschließend wurde der dNTP-Mix (50mM Tris-HCl, pH7,0 und je 125µM dATP, dCTP,
dGTP sowie dTTP) in einer Endkonzentration von 6,25µM zugegeben und der Ansatz
30 II. Material und Methoden
weitere 15min bei 30°C inkubiert. Nach Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 70°C für
15min wurde die DNA direkt zur Ligation eingesetzt.
II.7.7. Ligation von DNA-Fragmenten
DNA-Fragmente wurden durch Zugabe von 1 Einheit T4-DNA-Ligase (Life
Technologies oder Boehringer) je µg DNA und dem entsprechenden Ligase-Puffer
ligiert. Das zu ligierende Fragment wurde bei 3’- oder 5’-überhängenden Enden in etwa
5-fachem, bei der Ligation „glatter“ Enden in ca. 10-fachem Überschuß gegenüber
dem Vektor eingesetzt. Der Ligationsansatz, mit einem maximalen Volumen von 20µl,
wurde über Nacht bei 14°C inkubiert und konnte danach direkt zur Transformation
entsprechender Zellen eingesetzt werden.
II.7.8. DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung der DNA erfolgte entsprechend der Kettenabbruchmethode
nach Sanger (Sanger et al., 1977; Sanger 1981). Dabei wurde nach den Angaben des
Herstellers des „T7-SequencingTM-Kit“ der Firma Pharmacia vorgegangen. Zur
radioaktiven Markierung der DNA wurde [35S]-ATP eingesetzt. Um Kompressionen zu
beseitigen, wurde dem Ansatz falls erforderlich während der Primeranlagerung 1µl T4-
Gen32-Protein zugegeben (Kaspar et al. 1989). Je nach Stärke der radioaktiven
Markierung erfolgte die Exposition des Röntgenfilms für 12-24h. Beim Einsatz der
markierten Primer wurde das „Cy5TM AutoReadTM Sequencing Kit“ oder das „Thermo
Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP“ und
beim Gebrauch spezifischer, unmarkierter Primer der „Cy5TM-dATP Labelling Mix“
verwendet. Die Sequenzreaktion für das „Thermo Sequenase fluorescent labelled primer
cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP“ wurden in dem „1605 Air Thermo-Cycler“ der
Firma Idaho Technology Inc. (Idaho Falls, USA) nach folgendem Ansatz durchgeführt:
1,6µl Cy5-Primer [5µM]
2µl BSA [2,5mg/ml]
ca. 2ng DNA
ad 24µl H2O
II. Material und Methoden 31
Je 6µl wurden auf jeweils 2µl A-, C-, G-, T-Mix gegeben und in eine 10µl Glaskapillare
gezogen. Die Glaskapillaren wurden in den Thermocycler getan und folgendes
Programm gestartet.
4min 95°C Denaturierung 1 Zyklus
10sec 98°C Denaturierung
15sec X°C1 Anlagerung
30sec 72°C Elongation
25 Zyklen
4min 95°C Denaturierung 1 Zyklus 1 Die Anlagerungstemperatur X richtete sich nach der Tm (Schmelztemperatur) der Primer. Erfahrungsgemäß eignete sich als Anlagerungstemperatur die von Interaktiva angegebene Tm nach der „nearest neighbour“-Methode (Giesen et al. 1998).
Anschließend wurde 6µl des Gel-Lade-Puffers zugegeben. Die Auftrennung der Cy5-
Proben erfolgte mit Hilfe des ALFExpressTM der Firma Pharmacia (Freiburg).
II.7.9. Amplifikation von DNA mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgte nach einem Protokoll von Saiki et
al. (1985). Hierfür wurde der „1605 Air Thermo-Cycler“ der Firma Idaho Technology
Inc. (Idaho Falls, USA) verwendet. Dabei wurde nach Vorschrift der Firma gearbeitet
und folgender Standardansatz (50µl Gesamtvolumen) gewählt:
zentrifugiert und das getrocknete Sediment in einer adäquaten Menge H2O
aufgenommen.
II.7.11. Inaktivierung von Enzymen
Die Inaktivierung von Enzymen erfolgte einerseits durch 10min Hitzebehandlung
bei 65°C oder, falls erforderlich, durch dreimaliges Schockgefrieren in
Ethanol/Trockeneis mit anschließendem Auftauen in einem 70°C WB. Alternativ wurde
eine Phenolextraktion mit anschließender Ethanolfällung durchgeführt.
II.7.12. Primer-Phosphorylierung
Wenn es erforderlich war wurden Primer nach folgender Methode mit der T4-
Polynukleotid-Kinase von Boehringer phosphoryliert:
10µl Primer [10pmol/µl] 2,5µl Kinase-Puffer [10fach] 0,5µl T4-Polynukleotid-Kinase [10U/µl] 2,5µl ATP [10mM] 9,5µl H2O
II. Material und Methoden 33
Der 25µl-Ansatz wurde 30min bei 37°C im WB inkubiert. Die Reaktion wurde
anschließend durch 10min bei 70°C im WB beendet und anschließend bei -20°C
gelagert.
II.7.13. Gerichtete „Altered Sites II“-Mutagenese
Die Mutagenese mit dem „Altered Sites II in vitro Mutagenesis System“ von
Promega erfolgte nach Angabe des Herstellers mit phosphorylierten Mutagenese-
Primern. Dabei wurde die Variante unter Einsatz der Einzelstrang-DNA mit dem Stamm
BMH71-18 aus dem „Altered Sites I“-System verwendet.
II.7.14. Gerichtete „QuikChange™“-Mutagenese
Neuere Mutagenesen wurden mit dem „QuikChange™ Site-Directed
Mutagenesis Kit“ der Firma Stratagene durchgeführt. Hierfür wurde der „T-Gradient
Thermo-Cycler“ der Firma Biometra verwendet und nach Vorschrift der Firma folgender
Standardansatz (50µl Gesamtvolumen) gewählt:
5µl 10xPCR-Puffer
1µl Plasmid [10ng/µl]
1µl Primer (+) [10µM]
1µl Primer (-) [10µM]
1µl dNTP [je 2,5mM]
1µl Pfu-Turbo-Polymerase [2,5Units/µl]
40µl H2O
Für den Austausch von maximal zwei Basen wurde folgendes Programm in dem
Thermocycler durchgeführt.
10min 94°C Denaturierung 1 Zyklus
1min 94°C Denaturierung
1min 50°C Anlagerung
16min 68°C Elongation
18 Zyklen
10min 68°C Elongation 1 Zyklus
∞ 4°C Kühlung
34 II. Material und Methoden
Anschließend wurde durch Zugabe von 1µl des Restriktionsenzyms DpnI die
methylierte Matrizen-DNA 1,5h bei 37°C im WB abgebaut und 50µl superkompetente
XL1blue-Zellen mit 1µl der verdauten DANN transformiert.
II.8 Chemische und biochemisch-analytische Techniken
II.8.1. Bestimmung der Proteinkonzentration
Der Proteingehalt einer Probe wurde mit Hilfe des „Bio-Rad Protein Assay Dye
Reagent Concentrate“ nach Bradford (1976) den Angaben des Herstellers entsprechend
durchgeführt. Die Eichkurve wurde mit im Probenpuffer gelöstem Rinderserumalbumin
(BSA) aufgenommen.
II.8.2. Bestimmung der Zellzahl
Die Trübung des Mediums wurde photometrisch verfolgt. In MM wurde mit einer
Wellenlänge von 420nm gemessen, in LB0 bei einer Wellenlänge von 650nm. Zellzahl
und Proteinmenge ließen sich entsprechend einer Absorptionseinheit (OD=1) des
Spektralphotometers bei der entsprechenden Wellenlänge wie folgt bestimmen:
Tab.II.8.1. Zelltiter und Proteinmenge
WELLENLÄNGE (nm) ZELLTITER PROTEINMENGE (mg/ml)
650 1 x 109 0,25
420 5 x 108 0,125
Angegeben ist das Verhältnis von Proteinmenge und Zelltiter zu einer Absorptionseinheit bei verschiedenen Wellenlängen für Kulturen von E. coli K-12.
II.8.3. Bestimmung der spezifischen Transportaktivitäten
Zur Bestimmung der Transportaktivitäten wurden Transporttests nach Schmid et
al. (1982), durchgeführt. Die in vivo Bestimmungen der Transportaktivitäten wurden bei
25oC in Minimalmedium durchgeführt. Dazu wurden 1ml einer exponentiell
gewachsenen Zellsuspension mit einem Titer von 5x108 B/ml und 100µl radioaktives
Substrat in separaten Reagenzgläsern für 5min im Wasserbad bei 25oC äquilibriert. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe von 900ml Zellsuspension zum radioaktiven Substrat
II. Material und Methoden 35
gestartet. Zu verschiedenen Zeitpunkten (in der Regel: 10s, 20s, 30s, 40s) wurden
jeweils 200µl aus dem Teströhrchen entnommen, sofort über ein Membranfilter
(Schleicher und Schuell, Porengröße 0,6µm) abgesaugt und zweimal mit 1ml
raumtemperiertem MM+ gewaschen. Die Filter wurden anschließend getrocknet und in
5ml Szintillationsflüssigkeit Quicksafe N von Zinsser Analytic (Frankfurt/M) gegeben. Als
Nullwert galten Zellen, die plasmidkodiert kein zu untersuchendes Transportsystem
enthielten. Transportunabhängige, unspezifische Anlagerungen des radioaktiven
Substrates an diese Zellen wurden auf Eis gemessen. Die Bestimmung der cpm-Rate
erfolgte im Szintillationszähler „Liquid Scintillation Analyzer 1600TR“ von Canberra
Packard (Illinois). Vier zeitabhängige Werte einer Probe wurden graphisch aufgetragen.
Dabei zeigte sich, dass die Aufnahme des Substrates schon nach 10s nicht mehr linear
erfolgte (s. Abb.II.8.1. Substrataufnahme von D-Mtl). Daher wurde der Wert nach zehn
Sekunden für die Berechnung der spezifischen Transportaktivität auf eine Minute
hochgerechnet. Die Auswertung erfolgte nach folgender Formel:
spezifische Transportaktivität =
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅
Protein mg min nmol
V V t ODK ∆cpm V 4
BF650
A
mlcpm
∆cpm = Gezählte Impulse pro Minute abzüglich Nullwert
K = Substratkonzentration der radioaktiven Stammlösung [mol/l]
OD650 = gemessene Extinktion der eingesetzten Zellsuspension bei 650nm
t = Zeitpunkt der Probenentnahme [min]
VA = Volumen des Ansatzes [ml] (hier: 1)
VB = Volumen der eingesetzten Bakteriensuspension [ml] (hier: 0,9)
VF = auf den Filter gegebenes Probenvolumen [ml] (hier: 0,2)
Z = radioaktive Zerfallsrate der Stammlösung [cpm/ml]
4 = Umrechnungsfaktor für die Berechnung der Proteinmenge aus der Extinktion (OD650=1 entspricht 0,25mg Protein/ml)
36 II. Material und Methoden
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 10 20 30 40t [sec]
cpm
[10
-3]
Abb.II.8.1. Substrataufnahme von D-Mtl Exemplarisch ist die Aufnahme von Mannitol in LGS322/pGJ9 dargestellt ( = LGS322/pGJ9; = Nullwert). Es ist zu sehen, dass die lineare Aufnahme spätestens nach zehn Sekunden endet.
Um aus den spezifischen Transportaktivitäten KM-Werte ermitteln zu können,
wurden die Messungen bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen durchgeführt. Die
jeweiligen Konzentrationen und radioaktiven Zerfallsraten der in einem Verhältnis von
1:10 im Test eingesetzten Zuckerlösungen sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
Tab. II.8.2. Eingesetzte Zuckerkonzentrationen und dazugehörige cpm
D-Mtl Konz. [µM] 3 5 7 10 15 20 30 50 100
cpm [x10-3] 31 53 78 107 168 210 197 210 236
II.8.4. Ermittlung des KM-Wertes und Vmax nach der „Lineweaver-Burk“-
Transformationsvorschrift
Bei Enzymen variiert die Katalysegeschwindigkeit V mit der Substratkonzentration
[S]. V ist definiert als die Anzahl der pro Sekunde entstehenden Mole eines Produkts.
Die Maximalgeschwindigkeit Vmax wird erreicht, wenn alle Bindungsstellen am Enzym mit
II. Material und Methoden 37
Substrat gesättigt sind. Die Bedeutung des KM-Wertes geht aus der Michaelis-Menten-
Gleichung hervor:
Mmax
K SS
VV +
=
Bei sehr kleinen Substratkonzentrationen – wenn [S] viel kleiner als KM – gilt:
V = [S]Vmax/KM; das heißt, die Geschwindigkeit ist der Substratkonzentration direkt
proportional. Bei hohen Substratkonzentrationen wird V = Vmax; das bedeutet, dass die
Geschwindigkeit maximal ist, unabhängig von der Substratkonzentration. Bei [S] = KM
ist V = Kmax/2. Der KM-Wert entspricht daher der Substratkonzentration, bei der die
Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte ihres Maximalwertes erreicht. Um die Michaelis-
Menten-Beziehung in Form einer Geraden wiederzugeben, nimmt man von beiden
Seiten der Gleichung den Kehrwert:
][1 1 1
max
M
max SVK
VV ∗+=
Trägt man 1/V gegen 1/[S] auf, so ergibt sich ein Lineweaver-Burk-Diagramm
mit dem Ordinatenabschnitt 1/Vmax und der Steigung KM/Vmax.
1/V
Steig
ung = KM
/Vma x
0
y-Achsenabschnitt = 1/Vm a x
1/[ ]S
x-Achsenabschnitt =-1/K
M
Abb.II.8.2. Schematische Darstellung eines Lineweaver-Burk-DiagrammsDer Schnittpunkt der x- und y-Achse entspricht dem Nullpunkt beider Achsen
38 II. Material und Methoden
Durch Variation der Substratkonzentration bei den Transportmessungen konnten
über die oben angegebenen Grundlagen die Größen KMapp und Vmax in den einzelnen
Fällen ermittelt werden. Mittelwerte mehrerer Messungen wurden durch die Formel
nx∑ ermittelt, wobei x die Werte der einzelnen Messungen und n die Anzahl der
Messungen sind. Die Standardabweichung als Maß dafür, wie weit die jeweiligen Werte
um den Mittelwert streuen, wurde nach folgender Formel berechnet:
( )( )1
22
−
−∑ ∑nn
xxn.
II.8.5. Ermittlung des Kd-Wertes
Die Ermittlung des Kd-Wertes der Bindekinetik von dem EIIMtl und dessen
Varianten wurde mit der Fluss-Dialyse („flow dialysis“; Vos et al., nicht veröffentlicht) an
der Reichsuniversität in Groningen (RUG) durchgeführt. Dabei wird das aus einer
Dialysekammer austretende freie radioaktive D-Mtl in Abhängigkeit von vorhandenen
EIIMtl-Vesikeln bei steigender D-Mtl-Konzentration gemessen. Das freie D-Mtl diffundiert
bei 25°C durch eine Dialysemembran aus der Dialysekammer in die Flusskammer. Dort
wird ein Fluss-Puffer (25mM Tris, pH 7,6) mit einer Rate von 230µl pro Minute durch
die Flusskammer geleitet und in Fraktionen gesammelt. Die zu diesem Zweck
eingesetzten Vesikel wurden mit der „French-Press“ hergestellt. Im Einzelnen wurde der
Versuch wie folgt durchgeführt.
Bindetest mit Vesikeln
430µl Reaktionsmix wurden mit 20µl Vesikeln zu einer Endkonzentration von
25mM Tris [pH 7,6], 5mM DTT, 5mM MgCl2 und 0,25% dPEG (v/v) gemischt und
10min bei 25°C equilibriert. Anschließend wurden 380µl des Reaktionsmix in die
dreimal mit H2O gewaschene Dialysekammer pipettiert. Zu dem Zeitpunkt t=0min
wurde 1µl [3H]-D-Mtl [10µM] zugegeben. Bei t=1min wurden in fünf Fraktionen jeweils
6 Tropfen aufgenommen. Im Folgenden wurde zu bestimmten Zeitpunkten weiteres
[3H]-D-Mtl zugegeben und weitere Fraktionen aufgenommen:
II. Material und Methoden 39
t = 3min + 2µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 4min je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
t = 6min + 2µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 7min je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
t = 9min + 2µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 10min je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
t = 12min + 2µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 13min je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
t = 15min + 4µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 16min je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
t = 18min + 8µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 19min je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
Die aufgenommenen Fraktionen wurden mit 2ml Scintillationsflüssigkeit versetzt
und in dem Scintillationszähler gemessen. Über die kontinuierliche Zugabe erreicht man
annähernd einen Konzentrationsgradienten von 26nM - 524nM [3H]-D-Mtl in der
Dialysekammer. Allerdings muss die gleichzeitige unabhängige Diffusion des Mannitols
aus der Kammer („leakage“) berücksichtigt werden. Zu diesem Zweck wurden zwei
„Leerwertmessungen“ durchgeführt, die später in die Berechnung des Kd-Wertes
5mM MgCl2; 0,25% dPEG) wurden in die dreimal mit H2O gewaschene Dialysekammer
pipettiert und 10min bei 25°C äquilibriert. Bei t.=.0min wurden 20µl [3H]-D-Mtl
[10µM] zu einer Endkonzentration von 500nM zugegeben. Nach 20sec wurden in fünf
40 II. Material und Methoden
Fraktionen jeweils sechs Tropfen aufgenommen. Die Aufnahme der Fraktionen wurde
jeweils nach 5min:20sec und 10min:20sec wiederholt. Die aufgenommenen Fraktionen
wurden mit 2ml Scintillationsflüssigkeit versetzt und in dem Scintillationszähler
gemessen.
Berechnung des Kd-Wertes (pers. Mitteilung E. Voss / RUG)
Für die mathematische Umsetzung der erhaltenen Werte wurden drei
Gleichungen zu Grunde gelegt, die in ihrer Kombination mit Hilfe eines
Näherungsprogramms zu der Berechnung des Kd-Wertes führen:
s0x)-(s0 n0 n ∗=
n = Konzentration der Bindestellen in Dialysekammer [nM]
n0 = Anfängliche Konzentration der Bindestellen in Dialysekammer [nM]
s0 = Konzentration der [3H]-D-Mtl Stocklösung [nM]
x = Menge des zugegebenen [3H]-D-Mtl [nM]
Diese Gleichung korrigiert die Konzentration der vorhandenen Bindestellen, die
durch Zugabe von weiterem Mannitol verdünnt wird. Je mehr Mannitol (x) zugegeben
wird, desto kleiner wird die Konzentration der freien Bindestellen.
2 xn 4 - n) x (k
- 2
n) x (k b2 ∗∗++++
= (1)
b = Menge des an das Enzym gebundenen [3H]-D-Mtl [nM]
k = Kd-Wert des Enzyms
x = Menge des zugegebenen [3H]-D-Mtl [nM]
n = Konzentration der Bindestellen in Dialysekammer [nM]
Dieser Gleichung liegt das Verhältnis zwischen Enzym (E), Substrat (S) und
Enzym-Substrat-Komplex (ES) zugrunde. Im chemischen Gleichgewicht gilt:
E + S ⇔ ES
II. Material und Methoden 41
Für den Kd-Wert ergibt sich folgende Gleichung: [ES]
[S] [E] Kd = (2)
In der Gleichung entspricht die Menge des an das Enzym gebundenen [3H]-D-
Mtl dem Enzym-Substrat-Komplex: [ES]x=xb. Die Anzahl der Bindestellen in der
Dialysekammer ergibt sich aus der Summe von freiem Enzym und mit Substrat
gebundenem Enzym: [E]x+x[ES]x=xn. Ähnlich verhält es sich bei der
Substartkonzentration. Sie ist die Summe aus freiem Substrat und Enzym-Substrat-
Komplex: [S]x+x[ES]x=xx. Ersetzt man in den letzten beiden Gleichungen [ES] durch b,
so ergibt sich für Ex=xn-b und Sx=xx-b. Wenn man die neuen Parameter in die
Gleichung für den Kd-Wert (1) einsetzt; erhält man:
bb) -(x b) -(n k = (3)
Über die Umstellung der Gleichung (3) nach null ergibt sich:
0 x n b k) n (x - 2b =∗+∗++ (4)
Die Auflösung der Gleichung (4) nach b ergibt wiederum die Gleichung (1) mit
der es möglich ist, die Menge des an das Enzym gebundenen [3H]-D-Mtl zu berechnen.
2b) -(x r3 b) -(x r2 r1 y ∗+∗+=
y = freies [3H]-D-Mtl, dass durch die Membran dialysiert ist [cpm]
x = Menge des zugegebenen [3H]-D-Mtl [nM]
b = Menge des an das Enzym gebundenen [3H]-D-Mtl [nM]
r1 = 0
r2 = wird über die Leerwerte ermittelt
r3 = 0
Diese Gleichung berechnet die Menge an freiem [3H]-D-Mtl [nM], dass durch
die Membran dialysiert ist. Dieser Wert steht natürlich in Zusammenhang mit dem in der
Dialysekammer vorhandenen Enzym, dass eine Bindung eingehen kann (b) und dem
zugegebenen [3H]-D-Mtl (x). Weiterhin wird die Hintergrundstrahlung durch r1
42 II. Material und Methoden
einbezogen, wurde aber hier gleich null gesetzt, da dies schon bei den Messwerten
berücksichtigt wurde. Gleiches gilt für den Wert r3, der die Bindung an die
Dialysekammer darstellt. Diese Bindung konnte nicht festgestellt werden und somit
wurde dieser Wert ebenfalls gleich null gesetzt. Der Wert r2 ergibt sich aus der
Auswertung der Leerwertmessungen.
Aus den Werten der zweiten Leerwertmessung wurde eine lineare Regression
erstellt aus deren Geradengleichung (y=mx+b) die „leakage“-Rate (-m/b ∗ 100%)
berechnet wurde. Um r2 zu ermitteln, wurde in einer Kombination aller drei
Gleichungen unter Eingabe der ersten Leerwertmessung und des ersten Wertes der
zweiten Leerwertmessung eine Näherungsrechnung durchgeführt. Alle
enzymabhängigen Werte (n, n0, k, b) wurden in dieser Rechnung gleich null gesetzt, da
kein Enzym vorhanden ist.
0100020003000400050006000700080009000
10000
0 100 200 300 400 500 6003H-Mtl [nM]
cpm
Abb. II.8.3. Exemplarische Bindekurve Dargestellt ist eine Bindekurve für die Bindung von [3H]-D-Mtl an das 6His-Tag EIIMtl (H6wt). ( = Leerwertmesspunkte; gepunktete Linie = lineare Regression der Leerwertmesspunkte;
= Bindekurve H6wt).
Mit Hilfe der „leakage rate“ und des r2-Wertes konnte die Referenzgerade für
die enzymunabhängigen [3H]-D-Mtl-Dialyse erstellt werden. Diese grafische Darstellung
der [3H]-D-Mtl-Dialyse verläuft nicht mehr linear, wenn bindendes Enzym vorhanden ist
(siehe Abb. II.8.3.). Die Bindekurve wird unter Berücksichtigung der gemessenen cpm
und den Werten r2 und „leakage-rate“ abgeleitet. Aus der Abweichung dieser Kurve
II. Material und Methoden 43
von der Leerwertgeraden lassen sich über ein Computerprogramm die Konzentration
und der Kd-Wert des untersuchten Enzyms berechnen.
II.8.6. Test der PTS-abhängigen in vitro Phosphorylierung
Die in den Kd-Wert-Bestimmungen eingesetzten Vesikel wurden vorher auf ihre
Phosphorylierungsaktivität getestet. Dazu wurde an der RUG der PEP-abhängige
Phosphorylierungs-Test nach Robillard und Blaauw (1987) durchgeführt. Die
spezifischen Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel wurden in 25mM Tris-HCl (pH
Die Nitrocellulose wurde 5sec in Wasser inkubiert, bevor sie wie alle anderen
Hybridisierungs-Komponenten 30min bei RT in dem Hybridisierungspuffer (25mM Tris,
192mM Glycin, 20% (v/v) Methanol [pH 8,3]) equilibriert wurde. Die Hybridisierung
48 II. Material und Methoden
wurde wie oben beschrieben aufgebaut und die Transferparameter abhängig von der
Gelgröße eingestellt. Bei zwei kleinen Gelen (jeweils ca. 8,5cm x 5cm x 1,5mm) wurden
60min Transfer bei 20V gewählt. Die Membran wurde anschließend mit Ponceau S
(0,2% (w/v) in 3% (v/v) TCA) gefärbt um die Übertragung zu bestätigen. Nachdem die
Membran mit H2O entfärbt wurde, erfolgte ein 20minütiger Waschschritt in TNT (20mM
Tris/HCl [pH 7,5], 0,5M NaCl, 0,05% (v/v) Tween 20) bei RT. Anschließend wurde die
Membran ÜN bei 4°C in TNT/3% (w/v) BSA (Albumine Bovine Fraction V, BIOMOL, D-
22769) geblockt.
In dem folgenden Schritt wurde die Reaktion mit dem Penta-His Antikörper von
QIAGEN (mouse anti-(H)5, Cat. No. 34660) durchgeführt. Dazu wurde die Membran
1h bei RT mit 6ml Antikörper-Lösung (TNT, 1% (w/v) BSA, 0,067µg/ml Penta-His AK) in
einer verschweißten Plastiktasche inkubiert. Die Membran wurde dann drei mal 10min
bei Raumtemperatur in TNT gewaschen.
Anschließend wurde die Membran mit der Meerrettich-Peroxidase
(„Horseradishperoxidase“, N31430. Pierce, Rockford, IL 61105), die 1:10000 in
TNT/1% (w/v) BSA verdünnt wurde, 1,5h bei RT in einer verschweißten Plastiktasche
inkubiert. Die Membran wurde dann wieder drei mal 10min bei Raumtemperatur in
TNT gewaschen.
Die darauf folgende Chemilumineszens-Reaktion wurde nach Angaben des
Herstellers mit der „Western Blot Chemiluminescence Reagent“ (NEN Life Science
Products, Boston, MA 02118-2512) durchgeführt. Der Nachweis der
Chemilumineszens wurde bei unterschiedlichen Expositionszeiten zwischen 10 und
60sec auf dem „Hyperfilm ECL“ (Amersham Pharmacia Biotech UK Limited)
durchgeführt.
II.8.10.2. Nachweis der Biotinmaleimid-Markierung
Der Nachweis der Biotinmaleimid-Markierung erfolgte ähnlich wie unter
II.8.10.1. beschrieben. Es wurden lediglich andere spezifische Antikörper eingesetzt. Da
bei der Methode des Cystein-Scanning das Biotinmaleimid den ersten Antikörper
darstellt und die Bindung schon während der Markierung erfolgte, fiel dieser
Inkubationsschritt weg. In der zweiten Antikörperreaktion wurde das Streptavidin-
Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (RPN 1231)“ (SHRPC) von Amersham Pharmacia
Biotech UK Limited statt HRP eingesetzt. Die Membran wurde in 10ml Antikörperlösung
II. Material und Methoden 49
(TNT, 1% (w/v) BSA, 2µl SHRPC) bei 4°C in einer verschweißten Plastiktasche inkubiert.
Alle folgenden Schritte wurden wie beschrieben durchgeführt.
II.9. Computerprogramme
Die Auswertung der DNA- und Protein-Sequenzen erfolgte mit Hilfe folgender
Programme:
BLAST, The NCBI BLAST family of programs (Altschul et al., 1997)
DNASIS for Windows, Version 2 (Hitachi Software; San Bruno)
AlLIGN, Version 1.01 (Scientific u. Educational Software, 1989)
Vector NTI Suite, Version 6.0 (InforMax, Inc.; No. Bethesda, MD 20852)
TMHMM (Transmembrane Hidden Markov Model, Sonnhammer et al., 1998)
50 III. Ergebnisse
III. Ergebnisse III.1. Selektion und Untersuchung entkoppelter Mutanten
Während des Transportvorganges eines hochaffinen Substrates über das
Phosphoenolpyruvat-abhängige Kohlenhydrat:Phosphotransferasesystem wird das
Substrat normalerweise durch eine Phosphorylierung chemisch modifiziert. Dabei wird
davon ausgegangen, dass bei hochaffinen Substraten der Transport über die
Zytoplasmamembran und die anschließende Phosphorylierung gekoppelt ablaufen. Es
sind sowohl bei Escherichia coli als auch bei Klebsiella pneumoniae entkoppelte EIIMtl
Mutanten beschrieben worden (Klawitter, 1992; Scholle 1993; Heuel, 1997; Otte,
2000), bei denen Transport und Freisetzung des Substrates in das Zytoplasma
unabhängig von der Phosphorylierung ablaufen. Diese Mutanten geben Hinweise auf
wichtige am Transportprozess beteiligte Aminosäuren und deren Einfluss auf die
Kopplung von Translokation des Substrates und Energetisierung des Transporters.
Daher war es von großem Interesse, die Selektionssysteme zu optimieren, um weitere
Mutanten zu selektionieren und diese anschließend zu charakterisieren.
III.1.1. Konstruktion von Stämmen zur Selektion entkoppelter Mutanten
Die früheren und in dieser Arbeit verwendeten Selektionssysteme benutzen einen
semisynthetischen Stoffwechsel, der es E. coli ermöglicht, unphosphoryliertes („freies“)
D-Mannitol zu verstoffwechseln. Da die Mtl.1P-Dehydrogenase nicht in der Lage ist,
unphosphoryliertes Mtl umzusetzen, wurde in früheren Ansätzen der Stamm LGS323
(∆(mtlAPA‘) MtlD+) mit den Plasmiden pGJ9∆137 (mtlAPA’) und pASL14 (dalD+K+)
transformiert (Scholle, 1993). Die carboxyterminale Deletion des mtlA in dem Plasmid
pGJ9∆137 beinhaltet die Nukleotidsequenz, welche für die AS His554 der IIAMtl-
Domäne kodiert, wodurch ein gekoppelter Transport von Mtl verhindert wird. Eine
direkte Phosphatgruppenübertragung von HPr auf das Cys384 der IIBMtl-Domäne ist
nicht möglich (Scholle, 1993). Das Gen dalD codiert für die D-Arabinitol-
Dehydrogenase (DalD) aus Klebsiella oxytoca M5a1, welche sowohl unphosphoryliertes
D-Arabinitol (Atl) als auch unphosphoryliertes D-Mannitol (Mtl) als Substrat erkennt und
III. Ergebnisse 51
eine Umsetzung zu D-Xylulose (Xul) bzw. D-Fructose (Fru) katalysiert (Wood et al.,
1961; Tanaka et al., 1967; Charnetzky & Mortlock, 1974; Lengeler 1975b; Heuel et
al., 1998). Bei der Selektion auf Wachstum mit D-Mtl erhält man Mutanten, die den
entkoppelten Transport von D-Mtl ermöglichen (siehe Abb. III.1.1.). Die
Reproduzierbarkeit dieses Systems scheiterte jedoch an der starken Kurierung des
Plasmides pASL14. Um eine Kurierung und somit den Verlust der Fähigkeit, freies
Mannitol umzusetzen, zu verhindern, musste dalD auf stabilere Plasmide kloniert
werden.
Abb.III.1.1. Wildtyp- und semisynthetischer Stoffwechselweg für den D-Mtl-Abbau in E. coli
Unter I. WT ist der D-Mtl-Abbau im WT und unter II. mtlA∆137 der semisynthetische D-Mtl-Abbau in LGS322-1 /pGJ9∆137 dargestellt. Rote Pfeile: Stoffwechselweg für den normalen, d.h. gekoppelten Transport von D-Mtl über ein Wild-Typ II.CBAMtl. Unterbrochene rote Pfeile ( ): kein Transport. Grüne Pfeile: Stoffwechselweg bei entkoppeltem Transport von D-Mtl. Die IIC-Domäne mit entkoppeltem Transport ist mit einem Stern versehen (IICMtl*). Orangefarbene Pfeile: Phosphatgruppenübertragung über allgemeine PTS-Komponenten. Unterbrochene orangefarbene Pfeile ( ): keine Phosphatgruppenübertragung. Grau schattiert: Deletierte Domäne des II.CBAMtl. ~AS: An der Phosphatgruppenübertragung beteiligte Aminosäuren. MtlD: Mtl.1P-Dehydrogenase. DalD: D-Arabinitol-Dehydrogenase. Weitere Erläuterungen siehe Text und Abkürzungsverzeichnis.
52 III. Ergebnisse
Abb. III.1.2. Schematische Darstellung der Konstruktion von F’lac::dalD
Die einzelnen Schritte der Konstruktion werden im nachfolgendenText näher beschrieben. Die grafisch hervorgehobenen genetischen Elemente sind nicht maßstabsgetreu dargestellt. bla = Gen für eine β-Lactamase (Ampicillin-Resistenz, ApR). IR = zwei sich invertiert wiederholende Sequenzen (ermöglichen die Transposition von TnLSD101). mks = multiple Klonierungsstelle. ori = Replikationsursprung des Plasmides pBR322. spc = Gen für eine Spectinomycin-Resistenz (SpR).
III. Ergebnisse 53
III.1.1.1. In vivo Klonierung von dalD auf ein F’-Plasmid
In einem ersten Ansatz wurde das Gen dalD in den Niedrigkopien-Vektor pHEX3
(Heuel, 1997) kloniert. Das resultierende Plasmid pHEXD zeigte jedoch eine für das
Selektionssystem zu hohe Kurierungsrate. Da F’-Plasmide eine hohe Stabilität in
Bakterien zeigen, wurde anschließend das F’lac als Träger des Gens dalD gewählt.
Bei der Konstruktion des F’lac::dalD -Plasmides wurde nach Schmid et. al. (1991)
und Zeppenfeld et. al. (2000) das Gen zwischen zwei sich invertiert wiederholende
Sequenzen („inverted repeats“ = IR) kloniert, um es so als Transposon springen zu
lassen. Das verwendete Plasmid pTIM101 erlaubt zusätzlich eine „Blau/Weiß-Selektion“
durch α-Komplementation, trägt eine multiple Klonierungsstelle aus dem pHEX3, ein Ω-
Fragment zur Verhinderung unphysiologischer Expression durch einen fremden,
stromaufwärts liegenden Promotor und eine Spectinomycin-Resistenz. Das Gen für die
Transposase (tnpA), welche das Springen des Transposons ermöglicht, wird von einem
weiterem Plasmid pPSO110 exprimiert, wodurch eine Stabilisierung des Transposons in
einem pPSO110-freien Stamm gewährleistet ist. Im folgenden werden die Einzelschritte
beschrieben, welche zur Konstruktion des Plasmides F’lac::dalD durchgeführt wurden
(siehe Abb. III.1.2.).
Konstruktion des Plasmids pHEXD (dalDK’)
Das erste für den semisynthetischen Stoffwechsel benötigte Gen dalD stammt aus
Klebsiella oxytoca M5a1. Es kodiert für eine D-Arabinitol-Dehydrogenase (DalD) und
wurde aus dem Plasmid pGHL3 (Heilenmann, unveröffentlicht) in die mks des
Niedrigkopie-Vektors pHEX3 subkloniert. Ein Doppelverdau von pGHL3 mit den
Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI ergab u.a. ein 2,7kb großes dalD/dalK‘-
Fragment, welches anschließend mit dem entsprechend verdauten Vektor pHEX3 zum
neuen Plasmid pHEXD ligiert wurde. Die Funktionalität der D-Arabinitol-Dehydrogenase
(DalD) aus pHEXD wurde in dem Stamm LGS322 getestet. Der Stamm LGS322 kann
über das Glukose-PTS (II.CBAGlc) freies D-Arabinitol transportieren (Budde, 1991),
welches ohne DalD nicht verstoffwechselt wird.
54 III. Ergebnisse
Tab. III.1.1. Plattentest zum Nachweis einer funktionellen DalD aus pHEXD
Platten1 Stamm
McC Atl MM Atl LB0
LGS322 /pHEX3 s - +
LGS322 /pHEXD 2+ + + 1Supplementation mit den entsprechenden Antibiotika, Kohlenhydraten und Aminosäuren (siehe Abkürzungsverzeichnis) wie im Teil II der Arbeit angegeben. Phänotyp der Kolonien auf McC-Platten: 3+ = dunkelrot mit trübem Hof; 2+ = dunkelrot; + = rot; (+) = rosa ; (w) = rosa mit weißem Rand; w = weiß; s = sensitiv; - = kein Wachstum. Phänotyp der Kolonien auf MM-Platten: + = Wachstum; (+) = schwaches Wachstum, auf den Platten erst nach 2-3 Tagen sichtbar; - = kein Wachstum. Phänotyp auf LB0-Platten: + = Wachstum; (+) = schwaches Wachstum; - = kein Wachstum.
Der Markertest zeigt, dass dalD vom Plasmid pHEXD in ausreichender Menge
exprimiert wird, und somit ein schnelles Wachstum auf freiem D-Arabinitol ermöglicht
(Phänotyp Atl2+). LGS322/pHEX3 ist ohne dalD auf D-Arabinitol sensitiv Phänotyp, was
vermutlich auf eine intrazelluläre Anhäufung von D-Atl 5-P zurückzuführen ist.
Konstruktion des Plasmids pLSD101 mit dem Transposon TnLSD101
Um das dalD+/dalK‘-Fragment des Plasmids pHEXD auf ein F’lac-Plasmid
springen zu lassen, musste es vorher in ein künstliches Transposon kloniert werden.
Dieses Transposon wurde durch die beiden IRs auf dem Plasmid pTIM101 gebildet. Das
dalD+/dalK‘-Fragment wurde folglich mit den Restriktionsenzymen ClaI und SacI (SstI)
aus dem Plasmid pHEXD geschnitten und in die entsprechenden Stellen der mks des
Plasmides pTIM101 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pLSD101 genannt.
Die Funktionalität von pLSD101 wurde in dem Stamm LGS322/pGJ9∆137
E218A überprüft. Der Austausch E218A, der in mtlA∆137 kodiert wird, ermöglicht den
Transport von freiem D-Mannitol in die Zelle (Klawitter, 1992; Scholle 1993; Otte,
2000) und eine funktionelle DalD den zum Wachstum notwendigen Abbau von
D-Mannitol. Folglich wurde das Plasmid in den benannten Stamm transformiert und das
Wachstum auf D-Mtl und D-Atl getestet (Tab. III.1.2.).
III. Ergebnisse 55
Tab. III.1.2. Plattentest zum Nachweis funktioneller DalD aus pLSD101
Platten1 Stamm LGS322
McC Mtl Cam/Spc
McC Mtl Cam
McC Mtl Spc
MM Mtl Cam/Spc
MM Atl Cam/Spc
/pGJ9∆137 E218A
- w - - -
/pLSD101 - - w - -
/pGJ9∆137 E218A /pLSD101
2+ 2+ 2+ + +
1Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
Der neue Stamm LGS322 /pGJ9∆137 E218A /pLSD101 zeigt ausreichende
Expression von DalD, um eine entkoppelte IIMtl-Mutante auf freiem D-Mannitol bzw.
D-Arabinitol wachsen zu lassen.
Konstruktion des Kreuzungs-Stammes STL136 mit dem Plasmid F’lac::dalD
Der Stamm CSH36 mit den Plasmiden F’lac, pLSD101 (TnLSD101) und
pPSO110 (tnpA+) wurde benötigt, um das Transposon TnLSD101 mit dalD+/dalK‘ auf
das F’lac -Plasmid springen zu lassen. Kompetente Zellen des Stammes CSH36 /F’lac
wurden parallel mit den beiden Plasmiden pLSD101 und pPSO110 transformiert und
die Selektion auf LB0Cam/Spc-Platten durchgeführt. Gereinigte und getestete Kolonien
der gesuchten Exkonjuganten (CSH36 /F’lac /pLSD101 /pPSO110) wurden in
LB0Cam/Spc angeimpft, über Nacht bei 37°C und anschließend für 3 Tage jeweils bei
RT oder im Kühlschrank inkubiert. In dieser Zeit sollte die Transposition F’lac::TnLSD101
ermöglicht werden. Darauffolgend wurden die Kulturen in LB0 gewaschen und eine
Flüssigkreuzung mit dem Stamm S136-3 durchgeführt. Das Ausstreichen auf
LB0Spc/Kan - Platten selektionierte die S136-3-Stämme, welche das F’lac::TnLSD101
erhalten hatten. 56 Exkonjuganten wurden auf LB0-Platten gereinigt und anschließend
getestet, wovon sechs Kolonien den folgenden Phänotyp zeigten (Tab. III.1.3.).
56 III. Ergebnisse
Tab. III.1.3. Plattentest der Exkonjuganten aus der Kreuzung CSH36 /F’lac::dalD /pLSD101 /pPSO110 X S136∆
Platten1 Stamm
McC Glc
McC Lac
McC Mtl
LB0
Amp LB0
Cam LB0
Spc LB0
Kann
CSH36 /F’lac::TnLSD101 /pPSO110 /pLSD101
2+ + 2+ + + + -
S136-3 w w w - - - +
S136-3 F’lac::TnLSD101
w + w - - + +
1Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1. Angegeben sind die Ergebnisse vom Donor, Rezipienten und Exkonjuganten.
Der neue Stamm S136-3/F’lac::TnLSD101 zeigt die gewünschten Phänotypen und
wurde STL136 genannt. Mit Hilfe dieses Stammes konnte das F’lac::TnLSD101 (im
folgenden kurz F’lac::dalD genannt) in die verschiedenen Stämme zur Mutantenselektion
und -Charakterisierung gekreuzt werden.
III.1.1.2. Konstruktion der Selektions-Stämme LGS31-1, LGS322-1 und
LGS323-1
Für die Verstoffwechselung von D-Mannitol wurde das F’lac::dalD in die
gewünschten Selektionsstämme LGS31, LGS322 und LGS323 gekreuzt. Zur
Gegenselektion wurden die Rezipientenstämme mit dem Plasmid pGJ9∆137E218A
transformiert. Dies ermöglichte in Verbindung mit F’lac::dalD eine Gegenselektion auf
MM Mtl-Platten. Zudem kodiert das Plasmid eine Chloramphenicol-Resistenz, die
ebenfalls zur Selektion genutzt werden konnte.
Die Stämme LGS31/pGJ9∆137 E218A, LGS322/pGJ9∆137 E218A und
LGS322/pGJ9∆137E218A wurden jeweils mit dem Stamm STL136 gekreuzt und auf
MM-Mtl.Cam- und MM-Mtl.Cam/Spc-Platten ausgestrichen. Gereinigte und getestete
Exkonjuganten wurden in MM.Gly-Medium angeimpft und die ÜK dreimal in neues
Medium überimpft. Anschließend wurde eine geeignete Verdünnung der Kulturen auf
LB0-Platten ausgestrichen. Dabei zeigte sich bei etwa 2% der getesteten EK ein Verlust
des Plasmides. Die kurierten Stämme LGS31./F’lac::dalD, LGS322-/F’lac::dalD und
LGS323./F’lac::dalD wurden entsprechend LGS31-1, LGS322-1 und LGS323-1
genannt.
III. Ergebnisse 57
III.1.1.3. Konstruktion des Selektions-Stammes LTK31 (∆mtlA MtlD+
recA+ ∆(ptsHIcrr)::kan)
In einem zweiten Selektionssystem wurde die Phosphorylierungskette nicht in dem
EIIMtl-Transporter sondern an den allgemeinen PTS-Komponenten des Stammes LGS31
unterbrochen (Abb.III.1.3.). Mit Hilfe einer P1-Transduktion wurde eine ∆(ptsH ptsI
crr)::kan-Kasette aus dem Stamm TP2811 in den Stamm LGS31 gekreuzt. Die
Integration der ∆(ptsH ptsI crr)::kan-Kasette in das Chromosom von LGS31 bewirkt eine
Deletion der Gene ptsH, ptsI und crr. Folglich werden das HPr (ptsH) und EI (ptsI) der
allgemeinen PTS-Komponenten sowie das EIIAGlc (crr) nicht mehr exprimiert. Da die
Methode eine Rekombination in vivo erfordert, wurde der Stamm LGS31 (recA+) den
∆recA-Stämmen LGS322 und LGS323 vorgezogen. Die Selektion erfolgte auf
LB0Kan/Str-Platten und ergab eine für diese Methode hohe Transduktionsrate. Nach der
Reinigung auf LB0-Platten wurden 56 EK in einem Plattentest überprüft, wovon 51 das
gewünschte Ergebnis zeigten (Tab. III.1.4.).
Tab. III.1.4. Plattentest des Selektionsstammes LTK31
Platten1 Stamm
McC Mtl
McC Glc
McC Fru
McC Gal
LB0
Str LB0
Kan LB0
Tet LB0
Spc
LGS31 w 3+ 3+ s + - - -
LTK31 w w w s + + - - 1Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
Die gewünschten Transduktanten zeigten einen KnR/Pts--Phänotyp (Glc-, Fru-).
Der resultierende Stamm wurde LTK31 genannt.
Konstruktion der Selektions-Stämme LTK31-1 und LTK31-2 mit den Plasmiden F’lac::dalD (DalD+ SpcR) u. pUR404 (scr+ ScrR- TetR)
Für die Selektion von entkoppelten Mutanten war es erforderlich, dass im Stamm
LTK31 die Gene dalD und scrK vorhanden waren (Abb.III.1.3.). Nach der Reduktion
von D-Mannitol durch DalD muss die entstandene D-Fruktose für eine weitere
Verstoffwechselung phosphoryliert werden. Da das EIIFru als Folge der Deletion der
Gene für die allgemeinen PTS-Komponenten inaktiviert wurde, erhielt LTK31 alternativ
das konjugierbare Plasmid pUR404. Dieses exprimiert aufgrund einer Deletion in scrR
58 III. Ergebnisse
konstitutiv scrK, welches für die ATP-abhängige D-Fruktose-Kinase ScrK kodiert (Schmid
et al. 1988, Aulkemeyer et al. 1991).
Abb.III.1.3. Alternativer semisynthetischer Stoffwechselweg für den D-Mtl-Abbau in E. coli
III. WT ∆ptsHIcrr: Semisynthetischer D-Mtl-Abbau in LTK31-1/pGJ9. Unterbrochene rote Pfeile ( ): kein normaler Transport. Grüne Pfeile( ): Stoffwechselweg bei entkoppeltem Transport von D-Mtl. IICMtl*: IICMtl mit entkoppeltem Transport. Grau schattiert: Allgemeine PTS-Komponenten, deren Gene deletiert wurden. DalD: D-Arabinitol-Dehydrogenase. ScrK: D-Fruktose-Kinase. Weitere Erläuterungen siehe Text und Abkürzungsverzeichnis.
In den Stamm LTK31 wurde deshalb zunächst das F‘lac::dalD aus LGS31-1
gekreuzt und auf LB0Kan/Spc-Platten selektioniert. Gereinigte und getestete
Exkonjuganten (LTK31./F‘lac::dalD) wurden LTK31-1 genannt. Der Rezipient LTK31-1
wurde anschließend mit dem Donorstamm PS5 /pUR404 gekreuzt und auf
LB0Kan/Spc/Tet-Platten ausgestrichen. Nach Reinigung auf LB0-Platten wurde der
Exkonjugations-Stamm LTK31-1./pUR404 in einem Plattentest identifiziert und LTK31-2
1Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
Der Stamm LTK31-1 zeigte die durch das F‘lac::dalD vermittelte Spectinomycin-
Resistenz und LTK31-2 zusätzlich die von pUR404 kodierte Tetracyklin-Resistenz. Das
Plasmid pUR404 vermittelte keinen Scr+-Phänotyp in LTK31-2, da das EIIScr die EIIAGlc-
Domäne (crr) benötigt (Tab. III.1.5.).
Konstruktion des Stammes LTK32-1 ( ∆(ptsHI crr)::kan Mak+ )
Der Stamm JWL300 zeigt eine erhöhte Expression (Mak+) des normalerweise
kryptisch vorliegenden mak-Lokus. Diese Mutation ermöglicht dem PtsI--Stamm JWL300
das Wachstum auf D-Fruktose (Aulkemeyer et al. 1991). Ein P1-Phagenlysat aus dem
Donor JWL300 wurde zur Transduktion in den Rezipienten LTK31 eingesetzt und die
Transduktanten auf MM Fru-Platten selektioniert. Dabei waren nach sechs Tagen ca. 50
Kolonien auf der Selektionsplatte zu sehen. Auf der Platte mit der negativen Kontrolle
wuchsen ebenfalls nach sechs Tagen 3 Kolonien, die als Spontanmutationen klassifiziert
aber nicht genauer charakterisiert wurden. Nach Reinigung und Identifizierung wurde
der LTK31 Mak+-Stamm LTK32 genannt. Über eine Konjugation mit LGS322-1 wurde
das F‘lac::dalD in den Rezipienten LTK32 gekreuzt. LTK32-/F‘lac::dalD wurde LTK32-1
genannt. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Phänotypen, die bei der Konstruktion und
Kontrolle der Stämme betrachtet wurden.
60 III. Ergebnisse
Tab. III.1.6. Plattenmarkertest LTK32 und LTK32-1
Platten1 Stamm
MM Fru MM Scr LB0
Kann LB0
Spc
JWL300 Mak+ (+) - - -
LTK31 ∆(ptsHI crr) - - + -
LTK32 ∆(ptsHI crr) Mak+ (+) - + -
LGS322-1 F‘lac::dalD + - - +
LTK32-1 F‘lac::dalD ∆(ptsHI crr) Mak+
(+) - + +
1Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
LTK32 zeigt die Fähigkeit auf Fructose (MM Fru = (+)) zu wachsen, welche aus
dem Stamm JWL300 in LTK31 tranzduziert werden konnte. Es bestätigte sich das
erwartete sehr langsame Wachstum auf dieser Kohlenstoffquelle. Das für die Selektion
erforderliche DalD konnte mit dem Plasmid F‘lac::dalD aus LGS322-1 in LTK32 gekreuzt
werden (LTK32-1 auf LB0Spc = +), (Tab. III.1.6.).
III.1.1.4. Vergleich der eingesetzten Selektionssysteme
In erster Linie sollte bei der Konstruktion der neuen Systeme eine hohe
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erreicht werde, die bei pASL14 als Folge starker
Plasmidkurierung nicht gegeben war. Das stabile Einzelkopieplasmid F‘lac::dalD erlaubte
sowohl die Selektionen neuer Mutationsarten bzw. -orte als auch die Bestätigung der
erhalten Mutationen.
Vergleich der Stämme LGS322 und LGS323 (nach Scholle, 1993)
Der Transport von Atl über das EIIMtl weist auf einen funktionellen Einbau der
Translokationsdomäne des EIIMtl hin. Dieser Hinweis ist besonders bei Mtl--Mutanten
hilfreich, die den Transport betreffen. Mit dem Stamm LGS323 sollte der Transport von
D-Arabinitol über ein plasmidkodiertes, verkürztes EIIMtl getestet werden. Dazu musste
der WT-Transport von D-Atl in LGS322 ausgeschaltet werden. Der Stamm LGS323
wurde als AtlR Variante von LGS322 selektioniert (Scholle, 1993). LGS322 ist auf McC
Atl sensitiv, kann aber mit einem DalD+-Plasmid zu Atl+ transformiert werden. Die
Sensitivität von LGS322 wird auf eine cytoplasmatische Anhäufung von D-Atl-P
III. Ergebnisse 61
zurückgeführt, die mit der Verstoffwechselung von D-Atl oder D-Atl-P durch DalD
verhindert werden kann (Scholle, 1993). Der Stamm LGS323 erschien dagegen sowohl
mit als auch ohne DalD auf McC Atl weiß. 1991 zeigte Budde, dass auch das Glukose-
PTS (IICBAGlc) Atl transportieren kann, wohingegen alle anderen bekannten Atl-
Transportsysteme (Gat-PTS, Gut-PTS, Fru-PTS, Mtl-PTS) in LGS322 inaktiviert sind. Der
Stamm LGS323 zeigte bei Transporttests mit α-Methyl-Glukose, welches bei einer
Testkonzentration von 25µl über ein aktives Glc-PTS aufgenommen wird, keine
Transportaktivität, wohingegen der Elternstamm LGS322 eine Transportaktivität von 14
[nmol pro mg Protein pro Minute] aufwies. Weiterhin war LGS322/pJOE637 Scr+
während LGS323/pJOE637 einen Scr—Phänotyp zeigte. Das Plasmid pJOE637 (scr+)
vermittelt nur bei Vorhandensein eines intakten EIIAGlc (crr+) einen Scr+-Phänotyp. Die
AtlR von LGS323 wurde daraufhin auf eine Mutation in crr (crr-) zurückgeführt.
Tab. III.1.7. Ursprüngliche AtlR- und AtlS-Phänotypen (nach Scholle, 1993)
Platten1 Stamm
Relevanter Genotyp McC Atl McC Scr McC Glc
α-Me-Glc Tp2
LGS322 ∆mtlA ptsG+crr+ s w 3+ 14
LGS323 ∆mtlA ptsG+ w w 2-3+ 0
LGS322 /pASL14 ∆mtlA ptsG+crr+
/dalD 3+ n.g. 3+ n.g.
LGS323 /pASL14 ∆mtlA ptsG+
/dalD w n.g. 2-3+ n.g.
LGS322 /pJOE637
∆mtlA ptsG+crr+
/scr+ s 3+ n.g. n.g.
LGS323 /pJOE637
∆mtlA ptsG+
/scr+ w w n.g. n.g.
1Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1. 2Die Anzucht der Zellen für den α-Me-Glc-Transporttest erfolgte zur Messung des uninduzierten Basalniveaus in MM CAA (0,1%) ohne Zugabe von Glukose. 14C-α-Me-Glc wurde in einer Endkonzentration von 25µM zugegeben. Die Messwerte sind in [nmol × min-1 × mg Protein-1] angegeben.
Der in dieser Arbeit eingesetzte LGS323 aus der Glyzerinkultur von Scholle
zeigte jedoch auf Atl und Scr einen abweichenden Phänotyp. Diese Variante von
LGS323 wurde LGS324 genannt.
62 III. Ergebnisse
LGS324 zeigte mit DalD einen 2+ Phänotyp auf McC Atl, war aber ohne DalD
noch AtlR. Zudem war LGS324./pJOE637 Scr+. Eine Mutation in crr konnte damit
weitestgehend ausgeschlossen werden (WT-Expression von NagE vorausgesetzt; Vogler
et al., 1988). Um die Auswirkungen einer authentischen crr--Mutation auf den Atl-
Phänotyp festzustellen, wurden mit Hilfe einer Genkassette eine crr-Deletionen in den
Stamm LGS31 eingeführt. In den RecA--Stämmen LGS322 und LGS324 konnte keine
eindeutige Insertion der Genkassette erreicht werden (Tab. III.1.8.).
Tab. III.1.8. Neu beobachtete AtlR- und AtlS-Phänotypen
Platten1 Stamm Genotyp
McC Atl McC Scr
LGS322 ptsG+crr+ s w
LGS324 ptsG+crr+ w w
LGS322 /pHEXD ptsG+crr+ /dalD 2+ w
LGS324 /pHEXD ptsG+crr+ /dalD 2+ w
LGS322 /pJOE637 ptsG+crr+/scr+ s 3+
LGS324 /pJOE637 ptsG+crr+/scr+ w 3+ 1Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
Mit Hilfe einer P1-Transduktion wurde die ∆(crr)::kan-Kasette aus LLR103 in
LGS31 gekreuzt. Die Selektion erfolgte auf LB0Kan/Str-Platten. Nach Ausplattierung des
halben Transduktionsansatzes und Inkubation ÜN wurden 400 EK gezählt. Nach der
Reinigung auf LB0-Platten wurden 14 EK in einem Plattentest auf Kan- und Str-Resistenz
überprüft. Der transduzierte Stamm LGS31 wurde LGT31 genannt. Außerdem wurden
die Transduktanten mit den Plasmiden pJOE637 (scr+) bzw. pHEXD (dalD) transformiert,
um eine Kontrolle auf den Scr- und Atl-Phänotyp zu ermöglichen. Der Stamm LTK31
(∆(ptsH ptsI crr)::kan) wurde ebenfalls eingesetzt.
Aus dem Markertest (Tab. III.1.9.) ergaben sich folgende Beobachtungen: Eine
crr-Deletion konnte keine vollständige Atl-Resistenz bewirken. LGT31/pJOE637 (scr+)
war Scr-, was auf eine korrekte Insertion der Genkassette hinweist. LGT31 war weniger
sensitiv als der Elternstamm LGS31, wies aber mit dalD einen Atl+-Phänotyp auf. Die
crr-Deletion reduzierte die Sensitivität, wobei allerdings immer noch Atl in die Zelle
III. Ergebnisse 63
transportiert werden konnte. Folglich war die Atl-Resistenz von LLR103 nicht alleine auf
∆crr zurückzuführen.
Tab. III.1.9. Plattentest P1.∆(crr)::kan X LGS31
Platten 1 Stamm
McC Atl MM Xyl LB0Kan + scr 2
McC Scr Tet + dalD 3
McC Atl Cam
LGS322 ∆mtlA ∆recA s 2+ - 3+ 2+
LGS323 ∆mtlA ∆recA Atlr 4 w 2+ - w W
LGS324 ∆mtlA ∆recA Atlr w 2+ - 3+ 2+
LLR103 ∆crr ∆mtlAP,O w 2+ + (w) W
LGS31 ∆mtlA ss 5 2+ - 3+ 2+
LGT31 ∆mtlA ∆crr s 2+ + (w) 2+
LTK31 ∆mtlA ∆(ptsHI crr) w 2+ + w 2+ 1 Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1. 2 Die Stämme der jeweiligen Zeile wurden mit dem Plasmid pJOE637 (scr+) transformiert. 3 Die Stämme der jeweiligen Zeile wurden mit dem Plasmid pHEXD (dalD) transformiert (Ausnahme: 4 Die Daten für LGS323 wurden aus der Tabelle III.1.8. übernommen). 5 ss = supersensitiv: kein Wachstum auf der Platte, kein Papillenwachstum.
Die Phänotypen aller Stämme auf McC Atl mit und ohne dalD zeigten, dass der
Transport von Atl nicht zwangsläufig zu einer Sensitivität führte. Die Stämme LGS324
und LTK31 waren ohne dalD AtlR aber mit dalD Atl+.
Aus den Beobachtungen geht hervor, dass mehrere Faktoren zu einer Resistenz
bzw. Sensitivität führen. In Bakterien ist die Anhäufung von phosphorylierten
Zwischenprodukten häufig die Ursache toxischer Effekte (Ferenci und Kornberg, 1973;
Lengeler, 1975; Solomon und Lin, 1972). D-Atl-P kann von E. coli K-12 nicht weiter
verstoffwechselt werden und wirkt so auf die Zellen toxisch. Der Transport von D-Atl
kann über das EIIGlc erfolgen. Ob bei dem Transport eine teilweise oder vollständige
Phosphorylierung des Substrates stattfindet, ist nicht bekannt. Die Phosphorylierung von
D-Atl könnte daher durch das EIIGlc, der Xylulose-Kinase XylB (Scangos und Reiner,
1979) oder eine weitere unbekannten Kinase erfolgen. Eine Deletion von crr verhindert
in jedem Fall den gekoppelten Transport von D-Atl über das EIIGlc durch die Repression
der Expression des EIIGlc. Ein entkoppelter Transport würde aber immer noch freies D-Atl
in die Zelle bringen. Bei einer Anhäufung von Arabinitol kann XylB D-Atl
phosphorylieren und zu einer Sensitivität führen (Scangos und Reiner, 1979). Dagegen
64 III. Ergebnisse
wird in Gegenwart von dalD D-Atl zu D-Xylulose (Charnetzky und Mortlock, 1974a) und
D-Xylulose durch XylB zu D-Xylulose-5iP verstoffwechselt (Lawlis et al., 1984), welches in
den Pentosephosphat-Zyklus eingespeist werden kann. Eine Resistenz kann vorliegen,
wenn der Transport von D-Atl oder dessen Phosphorylierung verhindert wird. Eine XylB--
Mutante mit dalD würde dementsprechend zu einer nicht toxischen Anhäufung von D-
Xylulose und einem Atl--Phänotyp führen. Alle AtlR- und AtlS-Stämme zeigten jedoch den
gleichen Xyl+-Phänotyp. Eine durch die beschriebenen Ergebnisse nicht ersichtliche
Kombination dieser Faktoren ist in dem Stamm LGS323 zu erwarten.
Für die Selektionssysteme konnte kein Stamm konstruiert werden, der die
relevanten Eigenschaften von LGS323 besaß. Die weiteren Versuche wurden
hauptsächlich mit dem Stamm LGS322 durchgeführt.
LGS322-1 (∆mtlA ∆gut DalD+) /pGJ9∆137 (mtlAPA’)
Von den oben genannten Selektionssystemen wurde im Lauf der Arbeit
hauptsächlich der Stamm LGS322-1./pGJ9∆137 benutzt. Parallel durchgeführte
Selektionen mit den Stämmen LGS31-1.(∆mtlA dalD+)./pGJ9∆137 und LGS324-1
(∆mtlA ∆gut dalD+ AtlR) /pGJ9∆137 ergaben keine neuen Mutationsarten.
Abb. III.1.4. Sequenz des Genes mtlA aus E. coli K-12 (nach Lee & Saier, 1983 - korrigiert 1993)
Dargestellt ist die Nukleotidsequenz in dem Bereich deslA in E. coli K-12. Die vermuteten -35 und -10-Regionen (Davis et al., 1988; Jiang et al., 1990) und die mögliche Ribosomenbindestelle (RBS) sind in Boxen mit darüber angegebenen Konsensussequenzen dargestellt. Der mögliche Transkriptionsstartpunkt der mRNA-Synthese ist mit +1 gekennzeichnet (Davis et al., 1988). Die Zählung beginnt mit dem Adenin des ATG-Startcodons. Farblich hervorgehoben sind folgende Sequenzteile: blau = Start- und Stoppkodon; grün = Erkennungssequenzen relevanter Restriktionsenzyme; rot = relevante Tripletts für wichtige AS; orange = Ende des mtlA∆137-Fragmentes.
III.1.2.1. Entkoppelte Mutanten aus den Selektionen LGS322-1 (∆mtlA ∆gut DalD+) /pGJ9∆137 (mtlAPA’) und LGS324-1 (∆mtlA ∆gut DalD+ AtlR) /pGJ9∆137 (mtlAPA’)
Bei den Selektionen in den beiden oben genannten Stämmen waren nach 4-6
Tagen wenige (0-5) mögliche Mutanten auf den Platten zu erkennen. Erwartungsgemäß
dauerte es bei 30°C und 42°C 2-3 Tage länger bis Kolonien zu erkennen waren. Mit
68 III. Ergebnisse
Ausnahme der Mutation E218V wurden die erhaltenen Mutationsarten bei allen
Temperaturen isoliert. Die Variante E218V konnte nur einmal bei 37°C isoliert werden.
Temperaturabhängige Wachstumsunterschiede stellten sich in allen untersuchten Fällen
als chromosomal codiert heraus. Bei 22 unabhängig voneinander isolierten Mutanten
wurden folgende entkoppelte Mutationen identifiziert:
Tab. III.1.10. Entkoppelnde Mutationen aus LGS322-1 /pGJ9∆137 und LGS324-1 /pGJ9∆137
Phänotyp
E218A E218V H256P
Mutation in Selektionstemp.
bp 653 GAA GCA
bp 653 GAA GTA
bp 767 CAC CCC
30 [°C] 2 - 3
37 [°C] 5 (2) 1 6 (3)
42 [°C] 2 - 3
Gesamt 9 1 12
Die Tabelle gibt die Art und Anzahl der erhaltenen Mutationen bei unterschiedlichen Temperaturen wieder. Die betroffenen Nukleotide und deren Nummern sind blau hervorgehoben (Zählung wie in Abb. III.1.4.). In Klammern ist der Anteil der Mutanten aus LGS324-1 angegeben.
In neun Fällen führte die Transversion des zweiten Adenins in dem Triplett 218
(GAA) zu Cytosin zu dem Aminosäureaustausch E218A (Glutaminsäure zu Alanin). Eine
weitere Transversion in demselben Nukleotid zu Thymin führte zu dem AS-Austausch
E218V (Glutaminsäure zu Valin). Zwölf Mutationen betrafen das Adenin in dem Triplett
256 (CAC). Diese bewirkten eine Transversion zu Cytosin und damit den AS-Austausch
H256P (Histidin zu Prolin). Bei der Selektion mit den beiden Stämmen zeigte sich, dass
die Inkubationstemperatur vermutlich keinen Einfluss auf die Art der Mutation hatte. Die
Plasmide mit den jeweiligen Mutationen wurden folgendermaßen benannt:
Plasmid resultierender AS-Austausch
pGJ9∆EA = E218A pGJ9∆EV = E218V pGJ9∆HP = H256P
Die Eigenschaften der Plasmide sind nachfolgend in der Tab. III.1.11.
dargestellt.
III. Ergebnisse 69
III.1.2.2. Entkoppelte Mutanten aus der Selektion LTK31-2 (∆mtlA ∆(ptsH ptsI crr)::kan DalD+ ScrK+) /pGJ9 (mtlA)
Die Selektionen mit diesem Stamm wurden bei 37°C auf MM-Mtl-Cam-Platten
durchgeführt. Dabei wurden nach 3 Tagen 3-6 Kolonien je Platte beobachtet. Von acht
unabhängig isolierten und untersuchten Mutanten zeigten sechs den Austausch E218A
(Transversion GAA GCA) und zwei den Austausch H256P (Transversion CAC
CCC). Somit wurde mit diesem System keine neue Mutation selektioniert, allerdings
konnten die Ergebnisse aus dem vorangegangenen System bestätigt werden. Die
Phänotypen aller entkoppelten Mutanten sind in der folgenden Tabelle III.1.11.
dargestellt. Die verwendeten Plasmide sind wie oben beschrieben aus den originalen
Mutanten konstruiert worden und entsprechen den Phänotypen der ursprünglich
isolierten Mutanten.
Tab. III.1.11. Phänotypen der entkoppelten Mutanten
Markerplatten1 Stamm McC Mtl MM Mtl LB0Cam LB0Spc
LGS322-1 w - - +
LGS322-1 /pGJ9∆137 w - + +
LGS322-1 /pGJ9∆EA 2+ + + +
LGS322-1 /pGJ9∆EV 2+ + + +
LGS322-1 /pGJ9∆HP 2+ + + +
1 Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
III.1.3. Entkoppelte Mutanten aus lokalisierter Mutagenese
Um auf einem weiteren Weg zeigen zu können, dass die beobachteten
Phänotypen von der beschriebenen Mutation abhängen, wurden die entsprechenden
Mutationen durch lokalisierte Mutagenese in das Plasmid pGJ9 eingeführt. Dadurch
konnten auch die Auswirkungen der Mutationen in einem nicht deletierten mtlA
(EIIMtlABC) untersucht werden. Um ein mit dem pGJ9∆137 vergleichbares
Deletionsplasmid zu erhalten, wurde anschließend über vorhandene Restriktionsenzym-
Schnittstellen eine Deletion eingeführt (siehe III.1.3.2.). Weiterhin bot sich die
Möglichkeit einen Doppelaustausch in den betroffenen Tripletts einzuführen, um bei
Wachstumsuntersuchungen und der Selektion von Suppressormutanten Reversionen zu
erschweren.
70 III. Ergebnisse
III.1.3.1. Konstruktion des Plasmides pGAL3 (mtlA’) und seiner mutierten Derivate Die lokalisierte Mutagenese wurde nach dem „Altered Sites“ in vitro
Mutagenese System von Promega ausgeführt. Dazu musste ein Fragment aus mtlA,
welches das zu mutierende Triplett enthält, in den Mutagenese-Vektor pALTER-1
kloniert werden. Das Plasmid pGJ9 (Abb. III.1.5.) wurde mit HindIII verdaut und das
resultierende
2,1kb-mtlA’-Fragment in die entsprechende HindIII-Restriktionsschnittstelle von
pALTER-1 kloniert. Die korrekte Ausrichtung des Fragments wurde mit einer BamHI-
Restriktionsanalyse überprüft und die beiden Enden des Fragments über Sequenzanalyse
identifiziert. Das Plasmid wurde pGAL3 genannt. Das System mit dem Mutagenese-
Vektor pALTER-1 verwendet zur Erhöhung der Mutagenese-Ausbeute ein Ampicillin-
Reperatur-Oligonukleotid. Nach durchgeführter Mutagenese besitzt der Vektor die
Antibiotikaresistenzen gegen Tetracyklin und Ampicillin. Während der Mutagenese
wurde festgestellt, dass es eine Tandem-Duplikation einer 11bp langen Sequenz (5’-
GGCGTGCTGCT-3’) in mtlA (Basen 676-686) und in der Tet-Resistenz von pALTER-1
(876-886) gibt, die häufiger zu Deletionen führte. Daher wurde im Folgenden immer
eine Selektion mit Tetracyklin durchgeführt, um das Vorkommen deletierter Plasmide zu
unterdrücken.
SalI
(575
0)
ATG (1/5882)
Hin
dIII
(30)
SnaB
I (11
32)
∆137
(153
2)
Bam
HI (
1978
)H
inC
ladI
II (2
135)
I (21
41)
(574
6)
mtlA tet’ ‘tetp15A ori cat
pGJ9
Abb. III.1.5. mtlA-Plasmid pGJ9 (nach Grisafi et al., 1989)
Schematische Darstellung des mtlA-Plasmids pGJ9. Die Position der Erkennungssequenzen der relevanten Restriktionsenzyme und die Deletion ∆137 sind in Klammern angegeben. Die Zählung beginnt mit dem Adenin des ATG-Startcodons (1/5882).
III. Ergebnisse 71
Konstruktion der Plasmide pGAL3-1, pGAL3-2 und pGAL3-3 mit zweifachem
Basenaustausch
Die Konstruktion der Plasmide erfolgte durch den Einsatz der Mutagenese-Primer
E218A (+), E218V (+) und H256P (+). Bei der Auswahl der neuen Codone wurde
nach zwei Kriterien vorgegangen:
1. Es mussten mindestens zwei Basenaustausche im Codon für eine Reversion zu
der WT-Aminosäure an der jeweiligen Stelle erforderlich sein.
2. Von den verbleibenden Codonen wurde das mit der häufigsten Verwendung
(„codon usage“) in mtlA in E. coli gewählt.
In der folgenden Tabelle sind die aus der Mutagenese resultierenden
Doppelaustausche dargestellt, wie sie durch einzelsträngige Sequenzierung
nachgewiesen wurden.
Tab. III.1.12. Austausche bei pGAL3-1, pGAL3-2 und pGAL3-3 1
Plasmidname Mutagenese-Primer
Basenaustausch Basennummern2
pGAL3-1 E218A (+) GAA GCC 652-654
pGAL3-2 E218V (+) GAA GTC 652-654
pGAL3-3 H256P (+) CAC CCA 766-768 1 Phänotypen in Teil III.1.5.1. 2 Zählung wie in Abb. III.1.4.
Konstruktion der Plasmide pGAL3-4 und pGAL3-5 mit zweifachen AS-Austauschen
Die Konstruktion dieser Plasmide erfolgte durch den gleichzeitigen Einsatz zweier
Mutagenese-Primer in einem Mutageneseansatz. Damit konnten die unterschiedlichen
Mutationen, die einen entkoppelten Transport von D-Mannitol ermöglichen, kombiniert
und ihr Phänotyp untersucht werden. Dabei wurden die Kombinationen, die für die AS-
Austausche E218A (+)/H256P(+) und E218V(+)/H256P(+) kodieren, gewählt. In der
folgenden Tabelle sind die resultierenden Nukleotid-Austausche dargestellt, wie sie
durch einzelsträngige Sequenzierung nachgewiesen wurden.
72 III. Ergebnisse
Tab. III.1.13. Austausche bei pGAL3-4 und pGAL3-51
Plasmidname Mutagenese-Primer
Basenaustausch Basennummern2
pGAL3-4 E218A (+)
H256P (+)
GAA GCC (CTG CAG)3 CAC CCA
652-654 685-687 766-768
pGAL3-5 E218V (+) H256P (+)
GAA GTC CAC CCA
652-654 766-768
1.Phänotypen in Teil III.1.5.1. 2.Zählung wie in Abb. III.1.4. 3-unbeabsichtigter Austausch L229Q (Leucin zu Glutamin).
III.1.3.2. Klonierung der Plasmidreihe pGJT9 mit einem vollständigen
mtlA-Gen
Die mutierten mtlA-Fragmente mussten aus den vorangehend beschriebenen
pGAL3-Plasmiden über einen HindIII-Verdau zurück in den mtlA-Vektor pGJ9 kloniert
werden. Dafür wurde zur Vereinfachung das Plasmid pGJ9dHindIII konstruiert, dem das
entsprechende HindIII-Fragment fehlte. Die mtlA HindIII-Fragmente aus den mutierten
pGAL3-Plasmiden wurden nach der Klonierung in pGJ9dHindIII einzelsträngig
sequenziert und die neu konstruierten wie in Tab.II.1.4. Plasmide benannt.
Um ein dem pGJ9∆137 entsprechendes Deletionsplasmid zu erhalten, wurden
die neuen Plasmide mit SnaBI und ClaI verdaut. Anschließend wurde der um ca. 1kb
verkürzte Vektor nach einer Klenow-Behandlung religiert. Die dadurch entstandenen
Plasmide trugen mtlA’-Gene, die eine Deletion des für das Cys384 aus Domäne IIBMtl
und das His554 aus IIAMtl kodierenden Bereiches aufwiesen (Vgl. Abb. III.1.4.). Die
Aus der Selektion von Suppressormutanten in Stämmen mit entkoppeltem aber
vollständigem EIIMtl sollten Mutationen an anderer Stelle im mtlA gesucht werden, die
entkoppelte Mutanten wieder in den Mtl+-Phänotyp umwandeln. Die entkoppelnden
Mutationen E218A und E218V (pGJT9-1 und pGJT9-2) zeigten in dem vollständigen
MtlA keine Beeinträchtigung des Wachstums auf D-Mannitol (siehe Teil III.1.5.1.),
können also nicht zur Suppressor-Selektion eingesetzt werden. Dagegen verursachten
die Mutationen H256P, E218A/L229Q/H256P und E218V/H256P im Stamm LGS322
einen Mtl--Phänotyp. Mit den Stämmen LGS322 /pGJT9-3 /pGJT9-4 und /pGJT9-5
konnte so eine Selektion auf Supressormutanten durchgeführt werden. Eine ÜK des
jeweiligen Stammes wurde auf MM Mtl-Cam-Platten ausgestrichen und bei 30°C bzw.
37°C inkubiert. Erhaltene Kolonien wurden gereinigt, getestet, Zellen der
entsprechenden Kolonien mit dem Plasmid transformiert, das HindIII-SnaB1-Fragment
neu kloniert und anschließend sequenziert.
III.1.4.1. Suppressormutanten aus den Stämmen LGS322 /pGJT9-3 (H256P),
/pGJT9-4 (E218A/H256P) und /pGJT9-5 (E218V/H256P)
Nach vier Tagen Inkubation waren bei den Selektionen mit LGS322 /pGJT9-3
unabhängig von der Inkubationstemperatur 8-16 Kolonien pro Platte zu sehen. Es
wurden jeweils sechs bzw. fünf (30°C/37°C) Kolonien untersucht und die Mutationen
identifiziert (siehe Tab. III.1.14.). Die Selektionen von Suppressormutationen aus
LGS322 /pGJT9-4 ergaben 3 Kolonien pro Platte, wobei die Kolonien erst nach sieben
Tagen Inkubation unabhängig von der Inkubationstemperatur zu sehen waren. Zwei
Kolonien aus der 30°C- und eine Kolonie aus der 37°C-Selektion wurden untersucht.
Die folgenden Tabellen III.1.14a. und III.1.14b. fassen die erhaltenen Mutationen
zusammen.
74 III. Ergebnisse
Tab. III.1.14. Mutationen aus LGS322 /pGJT9-3 und LGS322 /pGJT9-4
LGS322 /pGJT9-3
Anzahl der Mutationen bei Genotyp der Mutation Phänotyp der Mutation 30°C 37°C
C766CA Pro256
T766CA Ser256
3 0
CC767A Pro256
CA767A Gln256
3 5
LGS322 /pGJT9-4
C766CA Pro256
G766CA Ala256
1 0
CC767A Pro256
CA767A Gln256
1 1
Die Tabelle gibt Ort, Art und Anzahl der Mutationen bei 30°C und 37°C wieder. Die mutierten Basen und resultierenden AS der betroffenen Tripletts sind nach Abb. III.1.4. nummeriert.
Mit dem Ansatz LGS322-/pGJT9-5 wurden keine Mutanten gefunden. Die
neuen Plasmide wurden folgendermaßen benannt:
pDSM1 = pGJT9-3 P256Q
pDSM2 = pGJT9-3 P256S
pDSM3 = pGJT9-4 E218A/L229Q/P256A
pDSM4 = pGJT9-4 E218A/L229Q/P256Q
III.1.5. Charakterisierung der Mutanten
Anhand der Selektion in den jeweiligen Stämmen wurde lediglich die Fähigkeit
des Wachstums auf D-Mannitol ohne DalD festgestellt. Die entkoppelten Mutanten
waren darauf angewiesen, freies, das heißt unphosphoryliertes D-Mannitol zu
transportieren und zu verstoffwechseln. Bei den „Supressormutanten“ dagegen
erforderte die Selektion in Abwesenheit des DalD eine Wiederherstellung des Transports
und der Phosphorylierung. Dabei war nicht auszuschließen, dass Anteile des
D-Mannitols unphosphoryliert in die Suppressor-Zelle gelangen. Um einen Vergleich
des Wachstums aller Mutanten und des WT auf D-Mannitol zu erstellen, wurden weitere
III. Ergebnisse 75
Untersuchungen mit den Mutanten in unterschiedlichen Stamm/Plasmid-Kombinationen
durchgeführt. Dabei wurden der Transport und einzelne Komponenten des Transports
wie Phosphorylierung und Substratbindung untersucht. Weil die relevanten Phänotypen
der Mutanten aus der ortspezifischen Mutagenese und den Selektionen keine
ersichtlichen Unterschiede zeigten, wurde, wenn nicht anders beschrieben, bei allen
Tests mit Plasmiden aus der gerichteten Mutagenese gearbeitet.
III.1.5.1. Phänotypen der verschiedenen Mutanten
Der von den Mutationen vermittelte Phänotyp wurde zunächst mit Hilfe von
Plattentests und Wuchskurven untersucht. Dabei war es für die Feststellung der Ursache
und des Grades der Entkopplung erforderlich, in unterschiedlichen Stammhintergründen
und mit unterschiedlichen Plasmidkonstruktionen zu arbeiten. Vor allem der Einfluss des
F’dalD auf das Wachstum sollte Hinweise auf freies D-Mannitol in der Zelle geben. In
der Darstellung der Markertests wurde versucht, die Ergebnisse so gut wie möglich zu
gliedern bzw. zu bündeln, um den Vergleich der verschiedenen Mutanten untereinander
zu erleichtern.
Markertests und Wachstumskurven entkoppelter Mutanten in den Stämmen
LGS322 und LGS322-1
Im folgenden wurden in den Stämmen LGS322 und LGS322-1 (F’lac::dalD+) nur
Plasmide aus der gerichteten Mutagenese verwendet, womit weitere unerkannte
Mutationen ausgeschlossen werden konnten.
Unterschiede in der Fähigkeit, D-Mannitol in Abhängigkeit des Vorhandenseins
von dem F’lac::dalD zu verstoffwechseln, fielen bereits bei diesem, in der Tab. III.1.15.
dargestellten, qualitativen Test auf. Im Allgemeinen verbessert DalD das Wachstum der
Mutanten auf D-Mannitol. Eine Ausnahme stellten die Mutationskombinationen
E218A/L229Q/H256P und E218V/H256P sowie das deletierte WT-Protein dar, welche
kein Wachstum auf D-Mtl ermöglichten. Zellen mit dem WT-Plasmid pGJ9 zeigten auf
McC Mtl mit und ohne DalD einen 3+-Phänotyp. Eventuelle Wachstums-Unterschiede
sind in diesem Fall auf McC-Platten nicht ersichtlich. Auf D-Arabinitol unterdrückte DalD
bei allen Stämmen die Sensitivität und ermöglichte die Verstoffwechslung des
Zuckeralkohols.
76 III. Ergebnisse
Tab. III.1.15. Markertest entkoppelnder Mutanten in LGS322 und LGS322-1
Markerplatten1,2 Stamm Plasmid relevante Austausche McC Mtl MM Mtl McCAtl
LGS322 /pGJ9∆137 w - S
LGS322-1 ” w - 2+
LGS322 /pGJ9 3+ + S
LGS322-1 ”
3+ + 2+
LGS322 /pGJT9-1∆ w - S
LGS322-1 ” + + 2+
LGS322 /pGJT9-1 2+ + S
LGS322-1 ”
E218A
3+ + 2+
LGS322 /pGJT9-2∆ w - S
LGS322-1 ” + + 2+
LGS322 /pGJT9-2 + + S
LGS322-1 ”
E218V
3+ + 2+
LGS322 /pGJT9-3∆ w - S
LGS322-1 ” + + 2+
LGS322 /pGJT9-3 w - S
LGS322-1 ”
H256P
2+ + 2+
LGS322 /pGJT9-4∆ w - S
LGS322-1 ” w - 2+
LGS322 /pGJT9-4 w - S
LGS322-1 ”
E218A/ L229Q/ H256P
w - 2+
LGS322 /pGJT9-5∆ w - S
LGS322-1 ” w - 2+
LGS322 /pGJT9-5 w - S
LGS322-1 ”
E218V/ H256P
w - 2+ 1 Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1. 2Phänotyp aller Stämme auf McC Glc = 3+, McC Gut = w, LB0Str = +, LB0Cam = +.
Die AS-Austausche E218A, E218V und H256P ermöglichten im verkürzten EIIMtl
(LGS322-1 /pGJT9-1∆, /pGJT9-2∆, pGJT9-3∆) nur mit DalD Wachstum auf D-Mtl. In
diesen Mutanten fand entkoppelter Transport statt. In einem vollständigen EIIMtl ohne
DalD konnten nur die Mutanten mit den Austauschen E218A und E218V auf D-Mtl
wachsen (LGS322 /pGJT9-1, /pGJT9-2). Das Wachstum war in beiden Fällen
III. Ergebnisse 77
schwächer als beim WT. Mit DalD zeigen die Mutanten wieder WT-Aktivität. In einem
vollständigen EIIMtl wurde das Substrat durch die Mutationen E218A und E218V nur
teilweise phosphoryliert und somit ein unterschiedlich großer Anteil an D-Mtl
unphosphoryliert transportiert. Die Mutation H256P verhinderte in einem vollständigen
EIIMtl ohne DalD das Wachstum der Zellen auf D-Mtl vollständig (LGS322 /pGJT9-3),
während mit DalD ein Mtl+-Phänotyp erreicht wurde (LGS322-1 /pGJT9-3). Mit dem
AS-Austausch H256P war der gekoppelte Transport für ein Wachstum auf MM Mtl nicht
ausreichend, es fand hauptsächlich oder nur entkoppelter Transport statt. Die
Mutations-Kombinationen E218A/L229Q/H256P und E218V/H256P verhinderten mit
und ohne DalD Wachstum auf D-Mtl. Diese Kombinationen hatten entweder eine große
Einwirkung auf Bindung und/oder Transport, oder eine funktionelle Faltung der
Translokationsdomäne wurde beeinträchtigt.
Markertest der „Suppressormutanten“ in LGS322 (∆mtlA), LGS322-1 (∆mtlA
DalD+) und LTK31-2 (∆mtlA ∆(ptsH ptsI crr)::kan DalD+ ScrK+)
In der folgenden Tabelle (Tab. III.1.16.) sind die relevanten
Markertesteigenschaften der Suppressormutanten in dem Stamm LGS322 und
LGS322-1 dargestellt. Um festzustellen, ob diese Aminosäureaustausche auch zu einer
Entkopplung führen können, wurden die Mutationen zusätzlich in einem Stamm ohne
allgemeine PTS-Komponenten getestet. Hierfür wurde der Stamm LTK31-2 eingesetzt.
Als Referenz wurden die Stämmen LTK31-2, LGS322 bzw. LGS322-1 mit den
Plasmiden pGJ9 und pGJT9-1 angeführt.
In den Stämmen LGS322 und LGS322-1 vermittelten die Plasmide pDSM1
(P256Q) und pDSM2 (P256S) wieder eine WT-Aktivität auf McC Mtl-Platten. In
LTK31-2 war mit diesen Plasmiden keine Entkoppelung mehr zu erkennen. Dagegen
zeigten die Plasmide pDSM3 (E218A/L229Q/P256A) und pDSM4
(E218A/L229Q/P256Q) in LTK31-2 entkoppelten Transport sowie einen schwächeren
Phänotyp in dem Stamm LGS322, was auf die noch vorhandene entkoppelnde
Mutation E218A zurückgeführt werden kann. Die bessere Verstoffwechselung von D-
Mannitol in dem Stamm LGS322-1 zeigte, dass auch bei diesen Mutanten entkoppelter
und gekoppelter Transport stattfindet. Allerdings führten beide Plasmide in den
Stämmen LGS322 und LGS322-1 zu schwächeren Phänotypen auf D-Mannitol als das
78 III. Ergebnisse
Plasmid pGJT9-1 mit der einfachen E218A-Mutation. Dadurch wird ein weiterer Einfluss
der Mutationen L229Q und/oder P256A bzw. P256Q beim Wachstum auf D-Mannitol
deutlich. Besonders im Hinblick auf die scheinbaren WT-Aktivitäten der einfachen
Mutationen P256Q und P256S sind weitere Untersuchungen erforderlich. Grundsätzlich
fielen bei entkoppelten Mutanten die Phänotypen der D-Mannitol-Verstoffwechselung in
dem Stamm LTK31-2 schwächer aus als in dem Stamm LGS322-1. Die Ursache hierfür
ist aber eher im grundsätzlich abweichenden Stammhintergrund als in funktionellen
Unterschieden in dem Transportmechanismus zu suchen.
Tab. III.1.16. Plattentest der Stämme LGS322, LGS322-1 und LTK31-2
mit den „Suppressor-Mutationen“
Markerplatten1,2 Stamm Plasmid relevante Austausche McC Mtl MM Mtl Mc Atl
LTK31-2 /pGJ9 w - 2+
LGS322 /pGJT9-1 2+ + S
LGS322-1 ” 3+ + 2+
LTK31-2 ”
E218A
+ + 2+
LGS322 /pDSM1 3+ + S
LGS322-1 “ 3+ + 2+
LTK31-2 ”
P256Q
w - 2+
LGS322 /pDSM2 3+ + S
LGS322-1 “ 3+ + 2+
LTK31-2 ”
P256S
w - 2+
LGS322 /pDSM3 (+) (+) S
LGS322-1 “ 2+ + 2+
LTK31-2 ”
E218A/ L229Q/ P256A
+ + 2+
LGS322 /pDSM4 (+) (+) S
LGS322-1 “ 2+ + 2+
LTK31-2 ”
E218A/ L229Q/ P256Q
+ + 2+ 1,2 siehe Tabelle III.1.15.
Zellerträge und Generationszeiten mit verschiedenen mtlA-Plasmiden
Über Wuchskurven können die Wachstums-Vergleiche der unterschiedlichen
Mutanten auf D-Mannitol in quantitativer Weise bestimmt werden. Da die Ergebnisse
der Plattentests schon zeigten, dass es nach dem Transport über die veränderten
III. Ergebnisse 79
IIC*BA-Domänen zu einer Freisetzung von teilweise und nicht phosphoryliertem D-
Mannitol kommen kann, wurden das Wachstum von Zellen mit und ohne DalD in
einem vollständigem EIIMtlC*BA verglichen.
Tab. III.1.17. Zellerträge und Generationszeiten der Stämme LGS322 und LGS322-1 mit verschiedenen mtlA-Plasmiden
Stamm
LGS322 LGS322-1 (F’lac::dalD+)
/Plasmid relevante Austausche
Gt1 [min] Zellertrag2 [∗108 B/ml]
Gt1 [min] Zellertrag2 [∗108 B/ml]
/pGJ9 83 - 88 8 - 8,5 81 - 87 7,5 - 8
/pGJ9∆HindIII k.W. k.W. k.W. k.W.
/pGJT9-1 E218A
180 - 200 4 - 4,4 110 - 125 6 – 8
/pGJT9-2 E218V
230 - 380 2,5 - 3 105 - 115 6 - 7,5
/pGJT9-3 H256P k.W. k.W. 220 - 345 3,5 – 4,3
/pGJT9-4 E218A/L229Q/H256P k.W. k.W. k.W. k.W.
/pGJT9-5 E218V/H256P
k.W. k.W. k.W. k.W.
/pDSM1 P256Q
82 - 87 7,5 - 8 86 - 88 7
/pDSM2 P256S
84 - 87 7 - 8 84 - 86 7
/pDSM3 E218A/L229Q/P256A
580 - 900 0,3 - 1 140 - 150 5,5 - 6
/pDSM4 E218A/L229Q/P256Q
330 - 360 2 - 2,5 145 - 155 5 - 5,5
Die Stämme wurden in MM Mtl/Glc Cam angeimpft und über Nacht bei 37°C in einem Roller inkubiert. Die ÜK wurden in MM+ gewaschen und in vorgewärmtes Medium (MM Mtl [0,2%] Cam) zu einer Zellzahl von 5x107 B/ml überimpft. Alle Wuchskurven wurden im Schüttelwasserbad bei 37°C mindestens dreimal unabhängig voneinander aufgenommen. 1Generationszeiten (Gt) wurden aus der Steigung der Wuchskurven in der exponentiellen Wachstumsphase berechnet. 2Zellerträge wurden aus der Differenz der anfänglichen (t0) und der maximal gemessenen OD420 in einem Zeitraum von 24h ermittelt. k.W. = kein Wachstum.
Als Kontrolle für das Wachstum unter WT-Bedingungen wurden die Messungen
mit den Stämmen LGS322/pGJ9, LGS322-1/pGJ9 durchgeführt. Die
80 III. Ergebnisse
Generationszeiten für Zellen mit dem WT-MtlA (pGJ9) in einem Stamm mit und ohne
DalD (LGS322-1 bzw. LGS322) lagen bei den Messungen in beiden Fällen
reproduzierbar in einem Bereich zwischen 80 und 90 Minuten. Ein etwas geringerer
Zellertrag wurde lediglich bei den Stämmen mit dem F’-Plasmid beobachtet (ca.
0,5∗108 B/ml weniger Zellen).
Um einen pleiotropen Effekt der Mutationen auf das Wachstum ausschließen zu
können, wurden Wachstumsmessungen in MMGlc [0,2%] mit den entsprechenden
Antibiotika und Aminosäuren durchgeführt. Dadurch sollte der Einfluss des F’-Plasmids,
eines zusätzlichen Plasmids und des Chloramphenicols berücksichtigt werden. Die
Messungen wurden jeweils dreimal durchgeführt.
Der Stamm LGS322 zeigte dabei eine Generationszeit von 66.±3 min., LGS322-
1 wuchs mit 70.±3 min. etwas langsamer. Auch der Zellertrag war beim LGS322-1
etwas schwächer (9.±0,5 ∗108 B/ml) als beim LGS322 (9,5.±0,5 ∗108 B/ml). Beide
Effekte könnten auf das zusätzliche F’-Plasmid in dem Stamm LGS322-1 zurückgeführt
werden. Wuchsen die beiden Stämme mit dem Plasmid pGJ9∆HindIII, welches um den
Großteil von mtlA deletiert ist, auf Chloramphenicol, verlangsamte sich das Wachstum
in beiden Fällen um etwa 7min. (LGS322: 73.±3 min.) bzw. 5 min. (LGS322-1: 75.±3
min.) und auch der Zellertrag reduzierte sich (LGS322: 9.±0,5 ∗108 B/ml; LGS322-1:
7,5.±0,5 ∗108 B/ml). Im Vergleich zu diesen Ergebnissen wurde bei allen anderen in
der Tab. III.1.17. aufgeführten Plasmiden in dem Stamm LGS322 eine Generationszeit
von 75.±3 min (Zellertrag 7,5 ±0,5 ∗108 B/ml) und in dem Stamm LGS322-1 eine
Generationszeit von 80.±3 min (Zellertrag 7 ±0,5 ∗108 B/ml) gemessen. Lediglich bei
Stämmen mit dem Plasmid pGJT9-2 (E218V) wurde eine verlängerte Anlaufphase im
Wachstum festgestellt, die sich allerdings nicht in der Generationszeit bemerkbar
machte. Aufgrund der lediglich geringfügigen Abweichungen im Wachstum der Stämme
mit den verschiedenen mtlA-Plasmiden wurde ein pleiotroper Effekt der Mutationen in
mtlA ausgeschlossen.
Bei der Betrachtung des Wachstums von Zellen mit den unterschiedlichen MtlA-
Varianten auf D-Mannitol lassen sich die Phänotypen in einer ersten Betrachtung in vier
Gruppen unterteilen.
Dabei wird die erste Gruppe aus Mutanten mit den Mutationen P256Q, und
P256S gebildet, die mit und ohne DalD eine Generationszeit und einen Zellertrag im
Bereich des Wildtyps zeigten. Die Messungen deuten darauf hin, dass die Mutationen
III. Ergebnisse 81
bei der untersuchten D-Mtl-Konzentration keinen großen Einfluss auf das Wachstum
haben. Ferner scheint der Anteil an freiem D-Mannitol in der Zelle in allen Fällen so
gering zu sein, dass ein Vorteil eines Wachstums mit DalD nicht zu erkennen ist.
Bei der zweiten Gruppe von Mutationen (E218A, E218V,
E218A/L229Q/P256Q) war das Wachstum auf D-Mannitol in dem Stamm LGS322
deutlich langsamer als das Wachstum des Wildtyps. Der Zellertrag reduzierte sich in
diesen Fällen entsprechend der sich verlängernden Generationszeit. Das Vorhandensein
von DalD führte dagegen zu einer deutlichen Verbesserung des Zellertrags und der
Generationszeiten. Der Zellertrag steigerte sich in allen Fällen um etwa 100%. Eine
Sonderstellung nimmt in dieser Gruppe die Mutation in dem Plasmid pDSM3
(E218A/L229Q/P256A) ein. Diese Mutation ermöglichte auch Wachstum in LGS322,
dieses war jedoch drastisch verlangsamt und auch der Zellertrag war reduziert. In dem
Stamm LGS322-1 kam es wiederum zu einer Verbesserung des Wachstums, wie es
schon bei den anderen Mutationen dieser Gruppe beobachtet wurde. Der Ertrag
steigerte sich von 0,3-1 auf 5,5-6 [∗108 B/ml]. Dies deutet auf einen sehr hohen Anteil
unphosphorylierten, dass bedeutet entkoppelt transportierten D-Mannitols hin.
Die dritte Gruppe wird durch das Plasmid pGJT9-3 (H256P) gebildet. In dem
Stamm LGS322 ermöglichte es kein Wachstum auf D-Mannitol, wogegen mit DalD
Wachstum zu sehen war. Die Mutation H256P ermöglichte lediglich Wachstum auf
freiem D-Mannitol durch entkoppelten Transport.
Die Mutationen der vierten Gruppe (E218A/H256P, E218V/P256A) schalteten
jeden Transport aus. Es war weder Wachstum im Stamm LGS322 noch im Stamm
LGS322-1 möglich.
III.1.5.2. Bindekinetik der Mutanten
Alle Daten zu den Bindekinetiken wurden Dank der freundlichen Unterstützung
von G.T. Robillard und seinen Mitarbeitern (E. Vos, J. Broos, R.H. Duurkens, G.K.
Schuurman-Wolters) in deren Laboratorien an der Reichsuniversität Groningen
selbstständig ermittelt.
Ortsspezifische Mutagenese in dem Plasmid pMaHisMtlAPr
Um eine Überexpression von mtlA mit Hilfe der Hitzeinduktion durchzuführen,
mussten die bekannten Mutationen in das über Hitze induzierbare Plasmid
82 III. Ergebnisse
pMaHisMtlAPr eingeführt werden. Die Mutagenesen wurden mit dem „QuikChange™
Site-Directed Mutagenesis Kit“ der Firma Stratagene und den im Ergebnisteil erwähnten
H256Q(+/-), H256S(+/-.)) durchgeführt. Die daraus resultierenden Derivate des
Plasmides pMaHisMtlAPr (WT) sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
Tab. III.1.18. Mutanten aus dem Plasmid pMaHisMtlAPr
Plasmid Phänotyp (AS-Austausch in MtlA)
pRUG1 pMaHisMtlAPr mtlA E218A
pRUG2 pMaHisMtlAPr mtlA E218V
pRUG3 pMaHisMtlAPr mtlA H256P
pRUG4 pMaHisMtlAPr mtlA E218A/H256P
pRUG5 pMaHisMtlAPr mtlA E218V/H256P
pRUG6 pMaHisMtlAPr mtlA H256A
pRUG7 pMaHisMtlAPr mtlA H256Q
pRUG8 pMaHisMtlAPr mtlA H256S
Bei der weiterführenden Untersuchung der „Supressormutanten“ wurden
lediglich die Auswirkungen der AS-Austausche in dem His256 untersucht. Das bedeutet,
dass der zusätzliche Austausch E218A (sowie der unspezifische Austausch L229Q), wie
er in pDSM3 und pDSM4 kodiert vorkommt, nicht eingefügt wurde. Die Phänotypen der
Mutationen mit den neuen Konstrukten entsprachen den Phänotypen der zuvor
beschrieben pGJ9-Reihe. Dabei zeigte der Stamm LGS322./pRUG4 (E218A/H256P)
den gleichen Phänotyp auf D-Mtl wie LGS322./pGJT9-4 (E218A/L229Q/H256P). Bei
der Untersuchung der einfachen AS-Austausche H256A, H256Q und H256S mit dem
Stamm LTK31-2 wurde keine Entkopplung festgestellt.
Herstellung der Vesikel
Die Phosphorylierungstests und Bindestudien wurden mit Vesikeln durchgeführt.
Als Teststamm wurde LGS322 verwendet, der mit den oben beschriebenen Plasmiden
der Reihe pRUGx transformiert wurde. Die eingesetzten Vesikel wurden mit der „French
Press“ wie in dem Teil II.5.1. der Arbeit beschrieben hergestellt. Die Abb.III.1.6. zeigt
III. Ergebnisse 83
ein Coomassie-gefärbtes SDS-Gel, dass mit den Vesikeln nach der Überexpression
beladen wurde.
1 2 3 4 5 6 7 8 9116 kDa
80 kDa
52,5 kDa
34,9 kDa
MtlA(His)6
Abb. III.1.6. SDS-Gel der Vesikel nach der Überexpression 10µl der Vesikel wurden in einer 1:10 Verdünnung auf ein 12,5%iges Acryl-Amid-Gel aufgetragen. Auf das Gel wurden die Vesikel der jeweiligen Mutanten aufgetragen (LGS322/pRUGx). Bahn 1= E218A (13,6); 2= E218V; 3= H256P; 4= E218A/H256P; 5= E218V/H256P; 6= LGS322; 7= H256Q; 8= H256A; 9= H256S; letzte Bahn= „BIO-RAD SDS-PAGE Standard, Low Range“. Die Größen der Standard-Banden sind neben dem Bild angegeben. Mit einem Pfeil ist die Laufhöhe des MtlA(His)6 angegeben (~60 kDa. Montfort et al., 2001).
In Bahn 6 ist das Gesamtmembranprotein aus dem Stamm LGS322 ohne
Plasmid aufgetragen und zeigt daher keine Expression von MtlA.
Die Gesamtproteinkonzentrationen der Vesikel wurden wie in Teil II.8.1.
beschrieben gemessen. Bei der Messung wurden jeweils 10µl und 30µl einer 1:50
Verdünnung der Vesikel eingesetzt. Die folgende Tabelle III.1.19. gibt die
durchschnittlich gemessenen Werte wieder.
Tab. III.1.19. Gesamtproteinkonzentrationen der Vesikel
Gesamtproteinkonzentration der Vesikel [mg/ml]
E218A E218V H256P E218A H256P
E218V H256P
H256S H256Q H256A LGS322 WT
13,6 20,5 13,7 12,5 14,1 18,4 16,7 15,7 5,1 21,9
84 III. Ergebnisse
Phosphorylierungstests mit den Vesikeln
Mit den Vesikeln wurden Tests der PTS-abhängigen in vitro Phosphorylierung
durchgeführt um festzustellen, ob und wie viel aktives Protein isoliert werden konnte.
Eine Testreihe untersuchte die Phosphorylierungsaktivität bei einer D-Mtl Konzentration
von 1mM nach 220sec, 440sec, 660sec und 880sec. Jeder Ansatz von 100µl enthielt
ca. 33000cpm. Die Vesikel wurden abhängig von den eingesetzten Mutanten in
unterschiedlichen Verdünnungen eingesetzt. Als Kontrollen wurde ein Ansatz mit
Vesikeln aus dem ∆mtlA-Stamm LGS322 und ein Ansatz mit H2O getestet. Die
Kontrollen überschritten unabhängig von der Vesikelverdünnung (bei LGS322) nie den
Wert von 200cpm. Die folgende Abb. III.1.7. zeigt typische Phosphorylierungsaktivitäten
der verschiedenen MtlA-Derivate in Vesikeln nach rechnerischem Abgleich der
unterschiedlichen Verdünnungen.
0
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
140.000
0 200 400 600 800 1000
t [sec]
cpm
E218A
E218V
H256P
H256Q
H256A
H256S
WT
Abb. III.1.7. Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel mit 1mM [14C]-D-Mtl Die ursprünglichen Verdünnungen (1:4000 bei dem WT; 1:1000 bei E218A, E218V, H256Q, H256S und H256A; 1:250 bei H256P, E218A/H256P und E218V/H256P) sind rechnerisch auf 1:250 angeglichen worden. Die Kontrollen durch den ∆mtlA-Stamm LGS322 und dem Ansatz mit Wasser sind nicht dargestellt.
III. Ergebnisse 85
Um die scheinbar nicht vorhandene Phosphorylierungsaktivität der Mutante
H256P näher zu untersuchen, wurden Phosphorylierungstests bei geringerer
Verdünnung der Vesikel (1:10) und einer Konzentration von 500µM [14C]-D-Mtl
durchgeführt. Jeder Ansatz von 100µl enthielt ca. 120000cpm. In diesem Test wurden
auch die Doppelmutanten E218A/H256P und E218V/H256P untersucht. Die folgende
Abb. III.1.8. zeigt einen beispielhaften Verlauf der Phosphorylierung.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 5 10 15 20 25 30
t [min]
cpm
H256P
EA/HP
EV/HP
H2O
Abb. III.1.8. Phos.-Aktivitäten von H256P-Mutanten mit 500µM [14C]-D-Mtl Die Vesikel sind in dem Test in einem Verhältnis von 1:10 verdünnt worden. Zusätzlich ist der Leerwert (H2O) dargestellt, bei dem statt der Vesikel Wasser eingesetzt wurde.
Anhand der gemessenen Phosphorylierungsaktivitäten wurden die spezifischen
Aktivitäten der Mutanten bei einer Konzentration von 1mM bzw. 500µM D-Mtl
berechnet. Die spezifischen Aktivitäten beziehen sich hierbei auf die gemessenen
Gesamtproteinkonzentrationen. Die nur minimal über dem Leerwert liegenden
Aktivitäten der Doppelmutanten E218A/H256P und E218V/H256P wurden nicht als
Phosphorylierungsaktivität gewertet.
86 III. Ergebnisse
Tab. III.1.20. Spezifische Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel
Spezifische Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel
⋅ einGesamtprot mg min
nmol
WT LGS322 E218A E218V H256P E218A/H256P
E218V/H256P
H256S H256Q H256A
278 0 307 32 2 0 0 339 303 253
Die Ergebnisse lassen die Mutanten hinsichtlich der Phosphorylierungsaktivität in
drei Klassen einteilen. Die Mutationen E218A, H256S, H256Q und H256A lagen in
einem Aktivitätsbereich, die dem WT-Protein entsprechen. Keine Aktivität zeigten die
Doppelmutanten E218A/H256P und E218V/H256P. Eine nur geringe Aktivität zeigten
die Mutanten E218V und H256P. Während der AS-Austausch E218V eine ca. 10%ige
WT-Aktivität zeigte, lag der AS-Austausch H256P mit <1% Aktivität nahe der Inaktivität.
Allerdings konnte in einem direkten Vergleich mit den Doppelmutanten und den
Leerwerten diese Minimalaktivität bestätigt werden. Für die weiteren Bindestudien
konnte allgemein gezeigt werden, dass mit der Methode aktives Protein in den Vesikeln
isoliert wurde. Die nicht vorhandene oder schwache Aktivität bei einzelnen Mutanten
(E218V, H256P, E218A/H256P, E218V/H256P) deckte sich mit den vorherigen
Beobachtungen (Tab. III.1.15. - III.1.17.) und ist nicht auf die Art der Vesikel-
Präparation zurückzuführen.
Bindestudien der MtlA-Derivate in Vesikeln
Bei diesen Bindestudien wurde die Bindung von D-Mtl an das jeweilige EIIMtl in
einem Konzentrationsbereich von 26nM - 524nM untersucht. Für die Vesikel mit WT-
MtlA wurde ein Kd-Wert von ~40nM ermittelt. In mehrfachen Versuchen konnte für alle
(E218A/H256P) oder pGJT9-5 (E218V/H256P) konnte keine Transportaktivität
gemessen werden. Die anderen aus den folgenden „Lineweaver-Burk“-Diagrammen
ermittelten Werte sind im Anschluss in der Tabelle III.1.21. zusammengefasst.
88 III. Ergebnisse
LGS322/pGJ9
-0.1
0.0
0.1
0.1
0.2
0.2
-0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.51/S [µM]
1/V
[nm
ol]*
WT IWT IIWT III
Abb. III.1.9. KM
app-Wert Messungen des WT-Stamms LGS322/pGJ9 für D-Mtl Dargestellt sind drei „Lineweaver-Burk“-Diagramme unabhängiger Messungen. Zu den Messpunkten der D-Mannitol-Konzentrationen wurde eine lineare Regressiongerade ermittelt und dargestellt. Die KM
app-Werte und V wurden anschließend wie in Teil II.8.4. beschrieben berechnet.
LGS322/pGJT9-5 (H256A)
-0.1
-0.1
0.0
0.1
0.1
0.2
0.2
0.3
0.3
0.4
0.4
-0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.51/S [µM]
1/V
[nM
]*
H256A IH256A IIH256A III
Abb. III.1.10. KM
app-Wert Messungen von LGS322/pGJT9-5 für D-Mtl siehe Abb. III.1.7.
III. Ergebnisse 89
LGS322/pDSM1 (P256Q)
-0.1
0.0
0.1
0.1
0.2
0.2
-0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.51/S [µM]
1/V
[nM
]*
P256Q IP256Q IIP256Q III
Abb. III.1.11. KM
app-Wert Messungen von LGS322/pDSM1 für D-Mtl siehe Abb. III.1.7.
LGS322/pDSM2 (P256S)
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
-0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
1/S [µM]
1/V
[nM
]*
P256S IP256S IIP256S III
Abb. III.1.12. KM
app-Wert Messungen von LGS322/pDSM2 für D-Mtl siehe Abb. III.1.7.
90 III. Ergebnisse
Tab. III.1.21. KMapp-Werte und V der MtlA-Mutanten für D-Mtl in LGS322
pDSM2 P256S 5,1 7 7,2 6,4 ±1,2 25 22 28 25 ±3 1 Angegeben sind die jeweiligen Werte der einzelnen Messungen (I-III). 2 Ø = Mittelwerte der drei Messungen mit Angabe der Standardabweichungen (±) wie in II.8.4. beschrieben.
Bei der Betrachtung der Daten fällt auf, dass die Werte für V innerhalb einer
Mutation voneinander abwichen. Dies ist auf verschiedene MtlA-Konzentrationen
innerhalb der Testkulturen zurückzuführen. Da die Expression von mtlA in dem
verwendeten Testsystem konstitutiv erfolgte, liegt eine variierende Plasmidkopienzahl
nahe. Bei Überprüfungen von EK getesteter Kulturen auf McMtl und LB0cam (Daten
nicht angegeben) wurde eine 30-70%ige Kurierung des Plasmides (bzw. des Mtl+-
Phänotyps) festgestellt. Die KMapp-Werte zeigten in der Tendenz, dass alle Mutationen
einen gegenüber dem WT erhöhten KMapp-Wert bewirken. Diese Werte sprechen für eine
geringfügig verringerte Affinität von D-Mtl zu der Bindestelle in MtlA, die allerdings nicht
für die in III.1.5.2. beschriebene fehlende Bindung ausschlaggebend sein kann.
Trotz der eingeschränkten Bewertungsmöglichkeiten der V-Werte, fällt der
konstant bis zu einem Faktor 6 niedrigere V der Variante P256S auf. Mit diesem Protein
wurde bei sieben Messungen immer ein V zwischen 19 und 28 [nM] und eine KMapp-
Wert zwischen 4,9 und 7,2 [µM] gemessen. Bei weiteren sieben Messungen wurden mit
dem Stamm LGS22/pDSM2 nichtlineare Kinetiken erhalten (siehe Abb. III.1.13.). In
verschiedenen Versuchsansätzen konnte nicht festgestellt werden welche Parameter
lineare und nichtlineare Kinetiken verursachen. Variierende MtlA-Konzentrationen bei
den Transportmessungen sind als Ursache auszuschließen, da diese keine Auswirkung
auf den KM-Wert haben.
III. Ergebnisse 91
LGS322/pDSM2 (P256S)
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
-0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.51/S [µM]
1/V
[nM
]*
Abb. III.1.13. Nichtlineare Kinetik der KM
app-Messung von LGS322/pDSM2 Die Abbildung zeigt die Messpunkte einer nichtlinear verlaufenden KM
app-Messung.
Die fehlende Transportaktivität in dem Stamm LGS322 mit den Plasmiden
pGJT9-1 (E218A) (McCMtl = 2+;) und LGS322/ pRUG1 (E218A)
(Phosphorylierungsaktivität [1mM D-Mtl] = 307 [nmol], WT= 278 [nmol]) ist aufgrund
der beschriebenen Ergebnisse unerwartet. Zudem konnte für die gleiche Mutation in
mtlA aus
K. pneumoniae Transport (KM = 2,9µM, V = 59nmol) gemessen werden (Otte, 2000).
Diese Messungen wurde allerdings in dem Stamm LGS324 und mit dem Niedrigkopien-
Vektor pHEX3 als mtlA-Plasmid durchgeführt.
Daraufhin wurde in dieser Arbeit untersucht ob der Stamm- oder
Plasmidhintergrund Auswirkung auf die Messbarkeit der Transportaktivitäten des MtlA
haben könnte. In einem Markertest wurde festgestellt wie sich der Stammhintergrund auf
den Phänotyp auswirkt. Dazu wurden die äquivalenten Plasmide pSOL300 (mtlAKAY2026)
und pSOL313 (mtlAKAY2026 E218A), bzw. pGJ9 und pGJT9-1 (E218A) in den Stämmen
LGS322 und LGS324 auf McCMtl getestet und die spezifische Transportaktivität der
entsprechenden Proteine erneut gemessen.
92 III. Ergebnisse
Tab. III.1.22. Stammabhängige Phänotypen von mtlA-Mutanten
Stamm Plasmid McC Mtl1 spez.
Transportaktivität2
LGS322/ pGJ9 3+ 5,2
pGJT9-1 2+ 0
pSOL300 3+ 2,5
pSOL313 1+ 0
LGS324/ pGJ9 3+ 5,7
pGJT9-1 2+ 0
pSOL300 3+ 3,8
pSOL313 3+ 3,4 1.Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1. 2.Angaben in [nmol∗min-1∗mg Protein-1], gemessen mit 10µM [14C]-D-Mtl. Die Testkulturen wurden in LB0Cam angezogen.
Aus den Tests geht hervor, dass der Stammhintergrund in dem Fall des pSOL313
(mtlAKAY2026 E218A) sowohl einen Einfluss auf den Phänotyp auf Platte (LGS322 1+,
LGS324 3+) als auch auf die messbare Transportaktivität hat. Keine stammabhängigen
Unterschiede wurden bei den beiden Wildtypen (pGJ9, pSOL300) und bei der E218A-
Mutante aus E. coli (pGJT9-1) festgestellt. Daraufhin wurde mit den Primern E218A
(+/-) durch ortspezifische Mutagenese erneut die E218A-mtlA-Mutation in das Plasmid
pMMX5 eingefügt (Um eventuelle Reversionen oder Suppressionen in pSOL313
auszuschließen, wurde zur Kontrolle die E218A auch in pSOL300 eingefügt. Die
Ergebnisse aus der Tab. III.1.22. konnten mit diesem Plasmid bestätigt werden). Das
Plasmid pMMX5 ist ein Niedrigkopieplasmid mit einem mtlA(His)6. Dadurch sollte
festgestellt werden, welchen Einfluss das Plasmid auf die Transportaktivität hat. Das
resultierende Plasmid pMMX5-EA zeigte in dem Stamm LGS324 auf McMtl einen 3+-
Phänotyp und eine spezifische Transportaktivität von 11,3 und 11,8 [nmol]. In dem
Stamm LGS322 war der Phänotyp auf McMtl unverändert 3+, allerdings konnte
wiederum keine Transportaktivität gemessen werden. Weitere Transportmessungen mit
dem Stamm LGS324 /pMMX5-EA erwiesen sich dennoch als schwierig, da die
Transportaktivität nicht regelmäßig zu messen war. Die erfolgreiche Messung einer
Transport-Kinetik ergab einen V von 25 [nmol∗min-1∗mg Protein-1] und einen KMapp von
4,9 [µM] für LGS324./pMMX5-EA. Die Mindestvoraussetzungen für eine erfolgreiche
III. Ergebnisse 93
Transportmessung scheinen in dem beschriebenen Fall der Stamm LGS323 und ein
Niedrigkopienvektor wie der pHEX3/5 zu sein. Was die genauen Gründe für diese
Beobachtungen sein können, war im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr zu bestimmen.
Erschwerend ist dabei der nicht genau bekannte Genotyp des Stammes LGS324 im
Vergleich zu dem Stamm LGS322 (siehe III.1.1.4.). An den Mutationen E218A und
P256S wird ersichtlich, dass sich E. coli MtlA in diesen Fällen in Grenzbereichen der
Messbarkeit bewegt. Inwiefern dies an der Konformation, Dimerisierung, oder der
Expressionsstärke liegt, lässt sich anhand der vorliegenden Daten nicht genau
bestimmen. In der Kinetik scheint die E218A-Mutation gegenüber dem WT
(LGS322/pMMX5: V 83-84 [nmol∗min-1∗mg Protein-1], KMapp 4,8-6,3.[µM]) einen
niedrigeren V (25 [nmol∗min-1∗mg Protein-1]) und einen ähnlichen KMapp (4,9 [µM]) zu
haben. In der Tabelle III.1.23. sind die wesentlichen Ergebnisse der
molekularbiologischen und biochemischen Untersuchungen an den mtlA-Mutanten
zusammengefasst.
Die Messungen zeigten, dass mit einem Selektionsprinzip (Wachstum auf D-
Mannitol mit unterbrochener Phosphorylierungskette) drei entkoppelte Mutationen
(E218A, E218V, H256P) mit unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften isoliert
werden konnten. Alle drei Mutanten zeigten in MtlA’ (EIIC) den gleichen Phänotyp auf
McC Mtl. Die Menge des entkoppelt transportierten D-Mtl scheint gleich zu sein. Die
Mutationen E218A und E218V führten in einem vollständigem MtlA (EIICBA) zu
gleichzeitigem ge- und entkoppelten Transport. Dabei hatte E218V im Vergleich mit
E218A nur 10% Phosphorylierungsaktivität, erreichte aber mit DalD gleiche
Generationszeiten auf D-Mtl. Das weist auf einen höheren Anteil an entkoppeltem
Transport mit der Mutation E218V hin. Mit der Mutation H256P wurde die
Phosphorylierungsaktivität fast vollständig ausgeschaltet, Wachstum mit gekoppeltem
Transport fand nicht mehr statt. Es wart nur noch Wachstum mit DalD möglich, welches
aber schwächer als bei den Mutationen E218A und E218V ausfiel. Die Mutation
H256P entkoppelte den Transport von D-Mtl vollständig. Die Kombination der
Austausche (E218A/H256P und E218V/H256P) führte zu einem vollständigen Ausfall
der Phosphorylierungs- und Transportaktivitäten.
94 III. Ergebnisse
Tab. III.1.23. Zusammengefasste Ergebnisse der EIIMtl-Mutanten im Stamm LGS322
IIMtl AS- Austausch
McC Mtl
Gt [min]
Tp KMapp
[µM] Tp V [nM]*
Pho [nM]*
Kd [nM]* Kopplung
I II III IV V VI VII VIII IX IICBA (WT) 3+ 83-88 4 ±0,1 82 ±26 278 40 + IICBA +DalD 3+ 81-87 + IIC w k.W. k.T. IIC +DalD
Die Tabelle fasst wesentliche Ergebnisse der Mutanten-Untersuchungen zusammen. Die Mutationen wurden in verschiedenen Plasmid-Hintergründen gemessen. Für schattierte Felder liegen keine Messungen vor. [nM]*=[nmol∗min-1∗mg Protein-1]. Spalte I: IICBA=MtlA, IIC=MtlA’. II: AS-Austausche. III: Phänotyp auf McC Mtl (siehe Tab.III.I.15. u.16.). IV: Gt=Generationszeit auf D-Mtl (s. Tab.III.I.17.). V u VI: Tp=Transport (s. Tab.III.I.21.). VII: Pho=spez. Phosphorylierungsaktivität. (s. Tab.III.I.20.). IX: Art des D-Mtl-Transports: +=gekoppelter Tp, -=entkoppelter Tp, +/-=ge- und entkoppelter Tp, k.T.=kein Tp. [ ]1 = Messung im Stamm LGS324.
III. Ergebnisse 95
Bei der Selektion von Supressormutanten wurden nur Mutationen der AS256
gefunden. Die daraus resultierenden Derivate H256A, P256Q und P256S stellten in
den Zellen annähernd den WT-Phänotyp auf D-Mtl wieder her. Eine zusätzliche den
Transport entkoppelnde Mutation E218A, wie sie in den Kombinationen
E218A/L229Q/P256A und E218A/L229Q/P256Q untersucht wurde, bewirkt wie auch
allein ge- und entkoppelten Transport. Das Wachstum auf D-Mtl fiel allerdings in
beiden Fällen schwächer aus als mit der E218A-Mutation.
Die Selektionen und Messungen zeigen, dass die Aminosäuren E218 und H256
maßgeblich am Transport- und Phosphorylierungsprozess beteiligt sein müssen.
Mutationen wurden nur an diesen Stellen gefunden und beeinflussten den D-Mtl-
Transport auf unterschiedliche Weise.
III.2. Topologieuntersuchungen am EIIMtl
Die oben gezeigten Ergebnisse haben eine deutliche Beteiligung der
Aminosäuren E218 und H256 am eigentlichen Transportprozess von D-Mtl durch das
EIIMtl gezeigt. In dem bisherigen 2D-Modell von MtlA (Abb. I.3.) sind diese in der
vermuteten zytoplasmatischen Schleife 5 zu finden. Die in dem WT-Transporter
beobachtete Kopplung von Transport und Phosphorylierung setzt eine lokale
Nachbarschaft zwischen den an der Bindung und Phosphorylierung beteiligten
Aminosäuren voraus. Da Mutationen/Austausche der genannten AS eine Entkopplung
bewirken, ist es wahrscheinlich, dass diese in der Nähe oder in der Bindestelle liegen.
Daher war die genauere Kenntnis der Topologie der Schleife 5 des EIIMtl wichtig. Das
bisherige Modell stützt sich überwiegend auf Untersuchungen von Sugiyama et al.
(1991), in denen ausschließlich über φ(mtlA’-phoA)-Fusionen Teile des MtlA dem Zyto-
oder Periplasma zugeordnet wurden. Die Methode beruht darauf, dass PhoA im
Periplasma Aktivität zeigt, nicht aber in dem Zytoplasma. Dabei fehlten jedoch die
notwendigen φ(mtlA’-lacZ), deren Aktivitäten sich hinsichtlich der Lage genau
gegensätzlich verhalten, sowie Versuche mit sogenannten „Sandwich“-Fusionen
(φ(mtlA’-lacZ-mtl’A)) und vollständigen, korrekt gefalteten IICBAMtl-Komplexen. Solche
langen AS-Insertionen können allerdings die Faltung beeinflussen und falsch positive
sowie falsch negative Ergebnisse hervorrufen. Im Gegensatz dazu bietet das „Cystein-
96 III. Ergebnisse
Scanning“ die Möglichkeit, mit einem aktiven Protein zu arbeiten, dass zudem nur in
wenigen Aminosäuren verändert ist.
III.2.1. Konstruktion der erforderlichen Plasmide und Mutanten
Die Voraussetzung für das „Cystein-Scanning“ sind MtlA-Komplexe, welche
jeweils an definierter Stelle nur ein Cystein besitzen. Die erforderliche T7-
Überexpression des Membran-Proteins wurde mit dem Niedrigkopieplasmid pHEX5 als
Klonierungs- und Überexpressionsvektor in dem Stamm JM109(λDE3) durchgeführt. Für
die Trennung der zu untersuchenden Proteine von den restlichen markierten Proteinen in
der Zelle war zudem eine effektive MtlA-Reinigung notwendig. In dieser Arbeit wurden
Proteine mit carboxyterminalem „His-Tag“ aus sechs Histidinen verwendet. Die
Reinigung erfolgte mit Hilfe von Ni-NTA-Säulen.
III.2.1.1. Konstruktion der Plasmide pMMX5 und pMMX5-1 bis
pMMX5-4 Um eventuelle Klonierungen über die HindIII-Erkennungssequenz in mtlA zu
ermöglichen, wurde zuerst die HindIII-Erkennungssequenz in pHEX5 über einen HindIII-
Verdau mit anschließender Klenow-Auffüllung und Ligation entfernt. Das resultierende
Plasmid wurde pHEX5d genannt. Mit einer PCR wurde das vollständige mtlA von dem
Plasmid pGJ9 amplifiziert. Der erste verwendete Primer MtlA-HIS1 (5‘- GGA ATT CCC
GTC GAC TGG ACA GTT AAC CGA TTC AGT G -3‘; in blau: EcoRI, in rot: SalI)
enthielt an seinem 5’-Ende die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI.
Dadurch entstand hinter der natürlich vorkommenden SalI-Schnittstelle eine BamHI-
Schnittstelle. Der Primer lagert sich ca. 135bp stromaufwärts des ATG-Startcodons von
mtlA an und amplifiziert somit auch die Promotorregion von mtlA. Der zweite Primer
MtlA-HIS2 (5‘- TTG GAT CCT TAG TGG TGG TGG TGG TGG TGC TTA CGA CCT
1 zp = zytoplasmatisch, pp = periplasmatisch, IK = Innenkontrolle, AK = Außenkontrolle
III.2.1.3. Untersuchung der Funktionalität der MtlA-Derivate
Da Transportaktivität eine korrekte Faltung der Proteine voraussetzt, wurden zur
Überprüfung die resultierenden Phänotypen der Plasmide im Stamm LGS322 auf McMtl
und die Transportaktivitäten mit 10µM D-Mtl untersucht (Tab. III.2.2.). MtlA-Varianten
mit dem Austausch C384S (pMMX5-4 und seine Derivate) zeigten erwartungsgemäß
keine Aktivität.
Tab. III.2.2. Aktivitäten der „Cys-Scanning“-MtlA-Derivate
Plasmid relevante
Austausche McMtl1 spezifische
Transportaktivität2
pMMX5d WT 3+ 26
pMMX5-4 Cys-frei [SASS] W 0
pMMX5-31 [SACS]+ S3C 3+ 23,6
pMMX5-32 [SACS]+ S110C 3+ 21,3
pMMX5-33 [SACS]+ S158C 3+ 30,5
pMMX5-34 [SACS]+ S199C 3+ 14,2
pMMX5-35 [SACS]+ S212C 3+ 20,6
pMMX5-36 [SACS]+ S242C 3+ 27,2
pMMX5-37 [SACS]+ S299C 3+ 15,2 1.Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1. 2.Werte in [nmol∗min-1∗mg Protein-1], gemessen mit 10µM [14C]-D-Mtl. Die LGS322-Testkulturen wurden in 2xTY Cam angezogen.
III. Ergebnisse 99
Um eine stark abweichende Faltung des cysteinfreien MtlA (pMMX5-4)
auszuschließen, wurde durch ortspezifische Mutagenese mit den Primern H256P (+/-)
der entkoppelnde Austausch H256P eingefügt. Zellen des Stammes LTK31-2 mit dem
daraus resultierenden Plasmid pMMX5-4HP zeigten einen 1+-Phänotyp auf McMtl und
Wachstum auf MM Mtl Cam (Alle anderen Derivate wurden ebenfalls auf Entkopplung
getestet, diese wurde aber in keinem Fall festgestellt). Dies ist ein guter Hinweis darauf,
dass die Faltung im cysteinfreien MtlA Transport erlaubt und vermutlich der des WT
entspricht. Die Transportaktivitäten der „Cys-Scanning“-MtlA-Derivate (Tab. III.2.2.) und
der Nachweis, dass eine MtlA-Mutante mit C384S-Austausch immer noch mit hoher
III.2.2. Markierung der Einzel-Cystein MtlA-Derivate
Die Markierung der Cysteine erfolgte wie unter Material und Methoden
beschrieben. Dazu wurde der mit den jeweiligen „Einzel-Cystein“-Plasmiden
transformierte Stamm JM109(λDE3) in Flüssigkultur angezogen. Nach Induktion der
T7-Polymerase wurde mtlA überexprimiert und das Protein in ganzen Zellen zu einem
Teil mit Stilben und folgend mit Biotinmaleimid sowie nur mit Biotinmaleimid markiert.
Aus den markierten Zellen wurden Membranpräparationen gewonnen, die
anschließend gelöst wurden. Das MtlA(His)6 wurde aus den Lösungen gereinigt und bei
den SDS-Gelen und folgenden immunologischen Nachweisen eingesetzt. Diese beiden
Proben aus den Markierungen mit ganzen Zellen (Probe1: Stilben.+.Biotinmaleimid;
Probe 2: Biotinmaleimid) ergaben die Aussage über die Lokalisation der Cysteine.
Aus dem anderen Teil der ganzen Zellen wurde ebenfalls mittels Ultraschall
Membranpräparationen erstellt, die danach zu einem Teil mit Stilben + Biotinmaleimid
sowie nur mit Biotinmaleimid markiert wurden. Die Präparationen wurden gelöst und
das MtlA(His)6 gereinigt. Diese Proben 3 (Stilben + Biotinmaleimid) und 4
(Biotinmaleimid) überprüften die allgemeine Zugänglichkeit der Cysteine für die
Sulfhydrylreagenzien.
100 III. Ergebnisse
III.2.3. Reinigung und immunologischer Nachweis des MtlA-6His
Da bei der Markierung der Cysteine auch alle anderen cysteinhaltigen Proteine
einer Zelle markiert werden, war eine Reinigung des Zielproteins notwendig. Dazu
wurde das MtlA(His)6 aus der gelösten Gesamtproteinfraktion mit Hilfe von Ni-NTA-
Säulen gereinigt. Die Abbildung III.2.1. zeigt das Coomassie-gefärbte SDS-Gel einer
Reinigung.
116 kDa
1.4 1.3 1.2 1.1 5.1 St St 5.2 5.3 5.4
80 kDa
52,5 kDa
34,9 kDa
MtlA(His)6
Abb. III.2.1. SDS-Gel einer MtlA(His)6-Reinigung Auf dem Gel sind die Proben 1-4 zu sehen wobei jeweils das gelöste Gesamtmembranprotein vor der Beladung der Säulen (Bahn: 1.1-1.4) und nach der Elution (Bahn: 5.1-5.4) aufgetragen worden sind. Bahn St.: „BIO-RAD SDS-PAGE Standard, Low Range“. Die Größen der Standard-Banden sind neben dem Bild angegeben. Mit einem Pfeil ist die Laufhöhe des MtlA(His)6 angegeben (~60 kDa, Montfort et al., 2001).
Die Laufhöhe von ca. 60 kDa des gereinigten Proteins entspricht der
beschriebenen Höhe für MtlA(His)6 in Laemmli (1970)-Gelsystemen (Montfort et al.,
2001). Im weiteren Verlauf des Versuchs wurden die Eluate der Proben 1-4 aus zwei
unterschiedlichen Markierungsansätzen auf ein SDS-Gel aufgetragen. Um die
Wirksamkeit der Bindung des MtlA(His)6 an die Ni-NTA-Säule zu testen, wurde die
Gesamtproteinfraktion nach dem ersten Säulendurchlauf mit auf das Gel aufgetragen.
Zur genauen Identifizierung und ungefähren Quantifizierung des MtlA(His)6 wurden bei
dem ersten Gel in einem Western-Blot die aminoterminalen (His)6 immunologisch
nachgewiesen (Abb.III.2.3.). Die Abb.III.2.2. zeigt das mit Coomassie-Lösung
nachgefärbte Gel im Anschluss an den Proteintransfer.
III. Ergebnisse 101
GP GP
MtlA(His)6
1 2 3 4 1 2 3 4Ansatz 1 Ansatz 2
Abb. III.2.2. SDS-Gel nach dem Proteintransfer auf Membran Abgebildet ist das nachgefärbte SDS-Gel nach dem Proteintransfer auf die Nitrocellulose-Membran. GP: Gesamtprotein nach dem ersten Säulendurchlauf. 1-4: die jeweiligen Proben 1-4 der Markierungsansätze 1 und 2. Mit einem Pfeil ist die Laufhöhe des MtlA(His)6 angegeben (~60 kDa, Montfort et al., 2001).
Die noch deutlich zu erkennenden MtlA(His)6-Banden weisen darauf hin, dass
ein großer Teil des gereinigten Proteins nicht auf die Nitrocellulose-Membran
übertragen wurde. Allerdings ist in Abbildung III.2.3. zu sehen, dass für den Nachweis
im „Western-Blot“ ausreichend Protein auf der Membran vorhanden war.
GP GP
MtlA(His)6
Ansatz 1 Ansatz 2 1 2 3 4 1 2 3 4
Abb. III.2.3. Immunologischer Nachweis des MtlA(His)6 Abgebildet ist ein Film, der die Chemilumineszens-Reaktion nach dem Western-Blot gegen das (His)6 nachweist. GP: Gesamtprotein nach dem ersten Säulendurchlauf. 1-4: die jeweiligen Proben 1-4 der Markierungsansätze 1 und 2. Mit einem Pfeil ist die Laufhöhe des MtlA(His)6 angegeben (~60 kDa, Montfort et al., 2001).
102 III. Ergebnisse
Das gereinigte Protein konnte eindeutig als das MtlA(His)6 identifiziert werden.
Unterhalb der ~60 kDa MtlA-Bande sind drei schwächere scharfe Banden zu erkennen,
die möglicherweise aus dem Abbau der zytoplasmatischen Domänen IIB und IIA
stammen. Die untere Bande entspricht dem 34 kDa-Fragment, die von Stephan und
Jacobson (1986) als carboxyterminaler, zytoplasmatischer Teil des EIIMtl identifiziert
wurde. Da das (His)6 carboxyterminal inseriert wurde, geben diese Abbauprodukte
ebenfalls ein Signal. In der Gesamtproteinfraktion wurde kein MtlA(His)6 nachgewiesen,
was für eine effiziente Bindung an die Säulenmatrix spricht.
III.2.4. Ergebnisse der Biotinmaleimid-Markierungen
Ein zweites Gel, dass die identischen Proben 1-4 des immunologischen
Nachweises von MtlA(His)6 enthielt, wurde parallel ebenfalls einem „Western-Blot“
unterzogen, und eine Biotinmaleimid-Markierung mit „Streptavidin-Meerrettich
Peroxidase Konjugat“ und anschließendem Chemilumineszens-Nachweis detektiert. Das
an die Sulfhydrylgruppe des Cysteins gebundene Biotinmaleimid zeigte so ein Signal,
wobei die Auswertung der Signale qualitativ erfolgte. In Abbildung III.2.4. sind die
Ergebnisse der Markierungen zusammengefasst. Die mehrfach durchgeführten Versuche
ergaben für die jeweiligen MtlA-Derivate vergleichbare Ergebnisse. Die Auswertungen
setzten Membraninpermeabilität des Biotinmaleimids unter den gewählten Bedingungen
voraus. Unabhängig davon wurde in den Membranvesikeln der Kontrollen zur
allgemeinen Zugänglichkeit der Sulfhydrylreagenzien immer ein negatives Signal bei der
Probe 3 und ein positives bei der Probe 4 angenommen. In jedem Fall sollte das Stilben
bei der Probe 3 nach der Vorinkubation ein weiteres Binden des Biotinmaleimids
verhindern. Ebenso sollte das Biotinmaleimid in der Probe 4 ohne Blockierung der
Cysteine durch Stilben eine Bindung und somit ein positives Signal bewirken.
Dementsprechend bedeuten die fehlenden Signale der Proben 1 und 2 bei den
Markierungen in den ganzen Zellen, dass das untersuchte Cystein im Zytoplasma liegen
muss, da das Biotinmaleimid unabhängig von einer Vorinkubation mit Stilben das
Cystein nicht erreichen und somit auch nicht daran binden kann. Kein Signal bei der
Probe 1 und eines bei der Probe 2 deuten darauf hin, dass das Cystein in dem
Periplasma liegt. In dem Fall ist es für beide Sulfhydrylreagenzien zugänglich, so dass
das gleiche Muster wie bei der allgemeinen Zugänglichkeit zu erwarten ist.
III. Ergebnisse 103
S212CS158C
Cys-frei S110C
S199C
S3C
S242C S299C C384
1
1 1
1 1
1
1 1 1
2
2 2
2 2
2
2 2 2
3
3 3
3 3
3
3 3 3
4
4 4
4 4
4
4 4 4
A)
A)A)
A) A)A)
A)
A)A)
B)
B)B)
B) B)
B)
B) B) B)
Abb. III.2.4. Biotinmaleimid-Markierungen und Nachweise des MtlA(His)6 Die Markierungen sind einmal für die „Einzel-Cysteine“ S110C und S299C, zweimal für die Mutanten S3C, S158C, S199C, S212C und S242C und dreimal für die cysteinfreie Mutante ([SASS]) sowie die Einzel-Cys384-Mutante ([SACS]) durchgeführt worden. Abgebildet sind die Filme zu dem Nachweis der Chemilumineszens-Reaktionen. Die jeweiligen Tests sind nach den relevanten Mutationen betitelt. 1-4: Proben 1-4. Film A) Nachweis der Biotinmaleimid-Bindung. Film B) Nachweis des MtlA(His)6. Weitere Erläuterungen im Text.
104 III. Ergebnisse
Die Ergebnisse aus den Biotinmaleimid-Markierungen sind in der Tabelle III.2.3.
und den folgenden Erläuterungen zusammengefasst.
Tab. III.2.3. Ergebnisse der Biotinmaleimid-Markierungen
Markierung der
ganzen Zellen Membran-
Präparationen
SB B SB B Plasmid
relevante AS (1) (2) (3) (4)
Lokalisation
pMMX5-4 Cys-frei - - - -
pMMX5-41 S3C - - - + Zytoplasma
pMMX5-42 S110C - - - - n. z.
pMMX5-43 S158C - + - + Periplasma
pMMX5-44 S199C - + - + Periplasma
pMMX5-45 S212C - + - + Periplasma
pMMX5-46 S242C - - - + Zytoplasma
pMMX5-47 S299C - - - - n. z.
pMMX5-3 C384 + + - + n. b.
In der Tabelle sind die eingesetzten Plasmide und die relevanten AS-Austausche dargestellt. Die Ergebnisse der Markierungen von ganzen Zellen und Membranpräparationen mit Stilben und Biotinmaleimid (SB) sowie nur mit Biotinmaleimid (B) sind wie die Proben 1-4 in den Versuchen geordnet (Zahlen in Klammern). + = Markierung durch Biotinmaleimid. - = keine Markierung durch Biotinmaleimid. Aus den Markierungen wurden die Lokalisationen der AS oder andere Schlussfolgerungen abgeleitet. n.z. = nicht zugänglich. n.b. = nicht bestimmbar.
1. Cys-frei (pMMX5-4): A) Erwartungsgemäß ist bei keiner Probe ein Signal zu
erkennen. Bei den Proben 3 und 4 sind lediglich sehr schwache Banden zu sehen, die
auf unspezifische Anlagerungen des Biotinmaleimid zurückzuführen sind. B) Der
Nachweis des Proteins über das (His)6 zeigt, dass ausreichend Protein vorhanden war.
Mit den gewählten Versuchsbedingungen waren keine unspezifischen Signale zu
erwarten.
2. S3C (pMMX5-41): A) Bei den Proben 1 und 2 ist kein Signal zu erkennen.
Die schwache Bande bei der Probe 1 ist als unspezifisch anzusehen, zumal bei einer
Vorinkubation mit Stilben eher schwächere Banden zu erwarten sind. Die Proben 3 und
4 zeigen eine allgemeine Zugänglichkeit für beide Reagenzien. B) Bei allen Proben war
III. Ergebnisse 105
eine vergleichbare Menge Protein vorhanden. Das Cys3 wurde dem Modell
entsprechend im Zytoplasma nachgewiesen.
3. S110C (pMMX5-42): A) Keine der Proben gab ein Signal. B) Der Nachweis
des Proteins zeigt, dass ausreichend Protein vorhanden war. Daher ist davon
auszugehen, dass das Cys110 zumindest für Biotinmaleimid nicht zugänglich ist. Die
Ursache kann eine unzugängliche Faltung des Proteins oder eine Lokalisation des
Cys110 in einer transmembranen Helix sein.
4. S158C (pMMX5-43): A) In der ersten Probe ist kein und in der zweiten ist ein
Signal zu sehen. Die allgemeine Zugänglichkeit wird mit den Proben 3 und 4 bestätigt.
B) Bei allen Proben war eine vergleichbare Menge Protein vorhanden. Anhand dieser
Ergebnisse liegt das Cys158 im Periplasma.
5. S199C (pMMX5-44): A) In der ersten Probe ist kein und in der zweiten ist ein
Signal zu sehen. Die allgemeine Zugänglichkeit wird mit den Proben 3 und 4 bestätigt.
B) Bei allen Proben war eine vergleichbare Menge Protein vorhanden. Die Ergebnisse
sprechen dafür, dass das Cys199 in einer periplasmatischen Schleife liegen muss.
6. S212C (pMMX5-45): A) Eine schwache Bande ist bei Probe 1 zu sehen und
eine deutliches Signal bei der Probe 2. Ähnlich verhält es sich bei den Proben 3 und 4.
B) Die Proben 1 und 3 enthielten scheinbar mehr Protein als die Proben 2 und 4.
Dadurch lassen sich die schwachen Banden bei den Proben 1 und 3 erklären. Diese
können eindeutig als negativ bewertet werden, wodurch das Cys212 einer
periplasmatischen Schleife zugeordnet werden muss.
7. S242C (pMMX5-46): A) Die Proben 1 und 2 sind negativ, bei einer in den
Proben 3 und 4 gezeigten allgemeinen Zugänglichkeit für die Sulfhydrylreagenzien. B)
Die Probe 1 hatte deutlich weniger Protein als die anderen Proben, beeinträchtigt in
diesem Fall aber nicht das Ergebnis. Das Cys242 liegt dementsprechend im
Zytoplasma.
8. S299C (pMMX5-47): A) Keine der Proben zeigt ein Signal. B) Der Nachweis
des Proteins zeigt, dass bei allen Proben ausreichend Protein vorhanden war. Folglich
ist davon auszugehen, dass das Cys299 zumindest für Biotinmaleimid nicht zugänglich
ist. Die Ursache kann eine unzugängliche Faltung des Proteins oder eine Lokalisation
des Cys299 in einer transmembranen Helix sein.
106 III. Ergebnisse
9. C384 (pMMX5-3): A) Die Proben 1 und 2 zeigen ein Signal, während die
Proben 3 und 4 die allgemeine Zugänglichkeit für Stilben und Biotinmaleimid
bestätigen. B) Bei allen Proben war eine vergleichbare Menge an Protein vorhanden.
Dieses Ergebnis wäre bei einer Membranpermeabilität von Biotinmaleimid zu erwarten.
Dies konnte jedoch in mehreren Versuchen mit den gewählten Bedingungen nicht
gezeigt werden. Eine Erklärung für diese Abweichung könnte eher in der Sonderstellung
des Cys384 liegen. Es ist Teil der Phosphorylierungskette, die dafür verantwortlich ist,
dass das Phosphat von dem PEP auf das D-Mtl übertragen wird (Pas & Robillard,
1988a und 1988b).
IV. Diskussion 107
IV. Diskussion
Beim substratspezifischen Transport über ein EnzymII werden der Transportschritt
und die darauf folgende Phosphorylierung als voneinander unabhängig ablaufende
Reaktionen betrachtet (Lolkema et al., 1990; Lolkema et al., 1991a; Postma et al.,
1993; Lengeler & Jahreis, 1996). Die erfolgreiche Teilung des EII in eine aktive
membrangebundene EIICMtl-Domäne und zwei aktive Phosphatüberträger EIIAMtl und
EIIBMtl zeigten, dass Transport und Phosphorylierung als zwei aufeinander folgende
Prozesse zu sehen sind, die voneinander getrennt werden können (Grisafi et al., 1989;
Lolkema et al., 1990). Unphosphorylierte EII transportieren ihr Substrat nicht in
Mengen, die Wachstum ermöglichen (Postma & Stock, 1980). Folglich müssen
Transport und Phosphorylierung gekoppelt sein. Das EIICMtl kann als isolierter
Transporter seine Substrate mit normaler Affinität binden (Grisafi et al., 1989; Briggs et
al., 1992) und einen aktiven transmembranen Transporter bilden (Lolkema et al.,
1990), aber das hochaffine D-Mannitol (KMapp 1-2µM) nicht transportieren. Dagegen
wird das niedrigaffine C5-Isomer D-Arabinitol (KMapp ≥ 500µM) in einer für das
Wachstum ausreichenden Menge durch EIICMtl transportiert (Klawitter, 1992; Otte et
al., 2003). Die Stärke der Kopplung von Transport und Phosphorylierung scheint durch
die Affinität der Bindestelle zum Substrat beeinflusst zu werden (Otte, 2000, Otte et al.
2003). In ∆ptsHI-Stämmen von Salmonella enterica serovar typhimurium und
Escherichia coli wurden Mutanten isoliert, die durch erleichterte Diffusion freie Glucose
über das EIIGlc aufnehmen konnten (Postma, 1981; Ruijter et al., 1992). Das Wachstum
konnte in diesen Mutanten mit einer ATP-abhängigen Glukokinase ermöglicht werden.
Transport und Phosphorylierung des Substrats waren demnach entkoppelt. Alle
mutierten EIIGlc zeigten eine stark verringerte Affinität für Glukose (≥100fach). Die
erfolgreiche Isolierung von diversen entkoppelten EIIGlc- und EIIMtl-Mutanten (EIIGlc:
Postma, 1981; Ruijter et al., 1990; Ruijter et al., 1992. EIIMtl: Klawitter, 1992; Scholle,
1993; Heuel, 1997; Otte, 2000; Turgut, diese Arbeit) ist ein weiterer Beweis dafür,
dass diese Kopplung nicht als strikt anzusehen ist. Ein Transport ohne gleichzeitige
Phosphorylierung ist scheinbar immer dann möglich, wenn ein geeignetes niedrigaffines
Substrat durch das EIIC transportiert werden soll, oder Mutationen die Affinität des
108 IV. Diskussion
Transporters für das hochaffine Substrat verringern. Um den Mechanismus der
Entkopplung weiterführend untersuchen zu können, wurden in dieser Arbeit entkoppelte
Mutanten mit verschiedenen Systemen isoliert.
IV.1. Für Transport und Phosphorylierung relevante AS
im EIICMtl
Von 30 untersuchten entkoppelnden Mutationen zeigten 15 den Austausch
E218A, eine den Austausch E218V und 14 den Austausch H256P. Untersuchungen von
Otte (Otte, 2000; Otte et al., 2003) ergaben weitere 40 aus K. pneumoniae, die die
Abb. IV.2. Vergleich der EIICMtl AS-Sequenzen aus E. coli und K. pneumoniae Dargestellt sind die abgeleiteten EIIC-Aminosäuresequenzen der Gene mtlA aus Escherichia coli K12 (Ec) (Lee & Saier, 1983) und Klebsiella pneumoniae (Kp) (Otte, 2000) und die Konsensussequenz (Kon) aus einem Vergleich mit weiteren MtlA-Sequenzen (siehe Abb. IV.3.). Die identischen AS aus der Konsensussequenz sind gelb unterlegt. Vermutete transmembrane Helices (TM) sind eingerahmt und nummeriert. Abweichungen in den beiden Sequenzen sind grau oder orangefarben hervorgehoben, dabei markiert Orange die Austausche, die relevant sein könnten (weiteres siehe Text und Abb. IV.3.).
Im Bereich von EIIC gibt es 16 voneinander abweichende AS. Konservative AS-
Austausche (AS 318, 319, 332) und Austausche in Aminosäuren, die in der
Konsensussequenz verschiedener MtlA (Abb. IV.3.) keine Berücksichtigung finden (AS
156, 160, 170, 320, 353) haben mit geringerer Wahrscheinlichkeit Auswirkungen auf
IV. Diskussion 113
das Transportverhalten. Danach bleiben acht Aminosäuren (109, 113, 116, 153, 288,
334, 342, 343), die am ehesten für veränderte katalytische Merkmale verantwortlich
sein könnten, ohne die übrigen Aminosäuren völlig auszuschließen. Es fällt aber auf,
dass in dem hoch konservierten Bereich zwischen TM4 und TM5 keine Austausche zu
finden sind. Für eine genaue Beurteilung der unterschiedlichen Phänotypen sind weitere
Untersuchungen der Stammhintergründe, Vektoren und der hier benannten AS-
Austausche erforderlich.
IV.1.2. Die AS 218 und 256 im Translokationsmodell
Für die in dieser Arbeit näher untersuchten AS218 und AS256 lässt sich
feststellen, dass unterschiedliche Aminosäuren an diesen Stellen unterschiedliche
Einflüsse auf den gekoppelten Transport, die Phosphorylierung und Bindung haben.
Beide Aminosäuren liegen nach dem aktuellen Strukturmodell in der hochkonservierten
Schleife 5 (Abb.IV.3. und IV.5.) und sind in den MtlA-Sequenzen konserviert. Das H256
liegt zudem in dem GIHE-Motiv, welches aufgrund der sehr starken Konservierung
schon vorher als essentiell angesehen wurde (Lengeler, 1990). In einem Modell für den
katalytischen Mechanismus von EIIMtl (Lolkema et al., 1991a; 1992) wird eine Kopplung
zwischen Transport und Phosphorylierung mit einer Rate <50% festgelegt.
Untersuchungen mit Vesikelpräparationen des EIIMtl zeigten, dass freies und
phosphoryliertes D-Mannitol mit gleicher Wahrscheinlichkeit von der Bindestelle
freigesetzt werden (Lolkema et al., 1991b). Diese in vitro gemachten Beobachtungen
widersprechen den Ergebnissen aus in vivo Untersuchungen. Anhand
dünnschichtchromatographischer Versuche konnte kein freies D-Mannitol nach einem
Transport durch EIIMtl nachgewiesen werden (Otte, 2000). Das geringe Vorkommen von
freiem D-Mtl wurde auf einen schwachen Transport durch das Gut-PTS sowie der
Hydrolyse von Mtl1P zurückgeführt. Untersuchungen mit EIIMtl und EIIMtl+DalD zeigten
dementsprechend keine relevanten Unterschiede im Wachstum von Zellen auf D-Mtl
(Tab. III.1.23.). Allerdings könnte das freie D-Mtl sofort wieder an der
Membraninnenseite gebunden und phosphoryliert werden, was mit den genannten
Methoden nicht nachweisbar wäre. Ist dagegen die interne Phosphorylierung
beeinträchtigt, steigt der Anteil des freien Substrates in der Zelle. Der resultierende
Anteil unphosphorylierten Substrats ist dadurch von der Phosphorylierungsaktivität bzw.
der Affinität der intrazellulären Bindestellen des EIIMtl-Komplexes abhängig. So zeigt sich
114 IV. Diskussion
bei den Mutationen dieser Arbeit, dass die am stärksten entkoppelten MtlA-Varianten
die geringste Phosphorylierungsaktivität zeigten (Tab. III.1.23.). Ähnliche Effekte wurden
auch bei den entkoppelten Derivaten aus EIIGlc beobachtet. Die entkoppelten EIIGlc-
Mutanten zeigten eine Phosphorylierungsaktivität, die 0 bis 100% des Wildtyps
entsprach (Ruijter et al., 1992). Eine direkte Beziehung zu den KM-Werten der
verschiedenen Proteine zeigte sich hier jedoch nicht.
Abb. IV.3. Vergleich der EIICMtl AS-Sequenzen verschiedener Stämme
Abb. IV.3. Vergleich der EIICMtl AS-Sequenzen verschiedener Stämme Dargestellt sind die abgeleiteten EIIC-Aminosäuresequenzen der mtlA-Gene folgender Organismen: K12, Escherichia coli K12 (IICBA; Lee & Saier, 1983); OH157:H7, E. coli OH157:H7 (IICBA; Hayashi et al., 2001); CFT073, E. coli CFT073 (EIICBA; Welch et al., 2002); S.fle, Shigella flexneri (IICBA; Jin et al., 2002); S.ent, Salmonella enterica serovar typhimurium (EIICBA; McClelland et al., 2001); K.pne, Klebsiella pneumoniae (EIICBA; Otte, 2000); Y.pes, Yersinia pestis (EIICBA; Parkhill et al., 2001); V.cho, Vibrio cholerae (EIICBA; Heidelberg et al., 2000); P.mul, Pasteurella multocida (EIICBA; May et al., 2001); C.ace, Clostridium acetobutylicum (EIICB, EIIA; Behrens et al. 2001); S.mut, Streptococcus mutans (EIICB, EIIA; Honeyman & Curtiss III., 2000); L.lac., Lactococcus lactis (Mansour et al., 2001); S.car, Staphylococcus carnosus (IICB, IIA; Reiche et al., 1988; Fischer et al., 1989; Fischer & Hengstenberg, 1992); B.hal, Bacillus halodurans (IICB, IIA; Takami et al., 2000); B.ste, Bacillus stearothermophilus (IICB, IIA; Henstra et al., 1996); B.sub, Bacillus subtilis (IICBA; Akagawa et al., 1995, geändert nach Henstra et al., 1996). Die Konsensussequenz (Kons) wurde mit Hilfe des Programms „VectorNTI Suite“ ermittelt. Mit „X“ wurden Bereiche der Konsensussequenz markiert, in denen keine AS zugeordnet werden konnte. Gruppen ähnlicher AS wurden farblich hervorgehoben. Konservierte Aminosäuren sind gelb unterlegt. AS, die der Konsensussequenz entsprechen, sind in Blau, dazu konservative Austausche in Rot dargestellt. Als konservative Austausche wurden zugelassen: A G, D E, F Y, K R, N Q, S T, und Austausche innerhalb der Gruppe I L V. Bei der Gesamtanalyse wurde nur die E.coli-Sequenz von K12 berücksichtigt, um die Aussage nicht durch drei fast identische E.coli-Sequenzen zu beeinträchtigen.
Ein weiterer Punkt des Modells besagt, dass nur phosphoryliertes EIIMtl eine
erleichterte Diffusion mit hoher Rate katalysiert. Dies bedeutet, dass der Grad der
Phosphorylierung der IIBAMtl-Domänen die Aktivität der Translokator-Domäne EIICMtl
beeinflusst, indem wahrscheinlich der Translokationsvorgang durch eine drastische
Senkung der Aktivierungsenergie erreicht wird. Das entspricht der Tatsache, dass ein
WT-EIIC nicht dazu in der Lage ist, D-Mtl ausreichend für ein Wachstum zu
transportieren. Dagegen sind in den entkoppelten Mutanten weder Phosphorylierung
IV. Diskussion 117
noch das Vorhandensein der EIIAB-Domänen für einen ausreichenden Transport
notwendig. Der Grund hierfür könnte eine der Phosphorylierung analoge Senkung der
Aktivierungsenergie durch die AS-Austausche sein. Es ist schon länger bekannt, dass
das niedrigaffine C5-Isomer D-Arabinitol (KMapp ≥ 500µM) mit einer hohen Rate
unphosphoryliert sowohl durch das WT- als auch das entkoppelte EIICMtl transportiert
wird, unabhängig von dem Phosphorylierungszustand des EIICMtl und dem
Vorhandensein der EIIBAMtl-Domänen (Klawitter, 1992; Scholle, 1993; Otte 2000).
Dies ist vergleichbar mit anderen nicht-PTS-Substraten, welche niedrigaffine Stereo-
Isomere natürlicher PTS-Substrate sind und unphosphoryliert durch EII-Domänen
transportiert werden. Beispiele hierfür ist der Transport von D-Galaktose und Trehalose
durch EIIMan in S. enterica (Postma, 1976; Postma et al., 1986), der Transport von D-
Galaktose, D-Arabinitol, Ribitol und D-Fruktose durch EIIGlc in E. coli (Kornberg &
Riordan, 1976; Kornberg et al., 2000;; Zeppenfeld et al., 2000) und der Transport von
D-Arabinitol und Xylitol durch EIIGat (Lengeler, pers. Mitteilung). Da auch entkoppelnde
Mutationen oft die Affinität des Transporters zu seinen Hauptsubstraten verringern
(Ruijter et al., 1992; Otte, 2000; diese Arbeit), zeigt sich ein großer Einfluss der Stärke
der Substratbindung auf die Kopplung von Transport und Phosphorylierung (Lengeler et
al., 1994).
Man geht davon aus, dass im WT eine hohe Phosphorylierungsaktivität dazu
führt, dass freies intrazelluläres D-Mtl sofort wieder gebunden und phosphoryliert wird.
Effektiv ist in der Zelle nur D-Mtl-Phosphat vorhanden (Otte, 2000). Wie kann es aber
zum Transport von freiem D-Mtl in die Zelle kommen? Für ein EII-Dimer wird das
Vorhandensein zweier hochaffiner, zur periplasmatischen Seite orientierten Bindestellen
postuliert (Pas et al., 1988; Briggs et al., 1992; Lolkema et al., 1992). Durch die
Bindung eines Substrates an diese hochaffine Bindestelle könnte eine
Konformationsänderung induziert werden, die die Bindestelle in einen geschlossenen
Zustand überführt. Danach würde die Umwandlung in eine, dem Zytoplasma
zugewandte, niedrigaffine Bindestelle erfolgen. Bindestudien mit Vesikeln (Lolkema et
al., 1992) und Tryptophan Phosphoreszenz-Studien (Broos et al., 2000) lieferten
Hinweise auf solche substratbindungs- und phosphorylierungsabhängige
Strukturveränderungen im EIIMtl.
Nach dem Modell von Lolkema moduliert der Phosphorylierungszustand der
zytoplasmatischen EIIB-Domäne die Aktivität der Translokationsdomäne EIIC (Lolkema
118 IV. Diskussion
et al., 1991b). In vitro Untersuchungen hatten gezeigt, dass sich die Transportrate in
Anwesenheit von Phospho-IIB drastisch erhöht (Elferink, et al., 1990; Lolkema et al.,
1991a). Demnach bewirke die Phosphorylierung von IIB eine Verringerung der
Aktivierungsenergie für den eigentlichen Translokationsschritt, also die Umlagerung der
geschlossenen in die niedrigaffine Bindestelle. Die Phosphorylierung von IIB würde
damit zu einer signifikanten Steigerung der Isomerisierungsrate der Bindestelle und
somit zum Anstieg der Transportraten führen. Nach diesem Modell wäre entkoppelter
Transport in einem nicht phosphorylierten oder isolierten EIIC nicht denkbar.
Nach dem Modell von Lengeler (Lengeler et al. 1994) gibt es im EIIMtl eine
Bindestelle mit drei Zuständen (hochaffin / geschlossen / niedrigaffin) zwischen denen
umgeschaltet werden kann. Das Substrat wird außen mit hoher Affinität gebunden und
nach einer durch die Substratbindung induzierten Konformationsänderung, die zu einer
Umlagerung der Bindestellen in einen „geschlossenen“ Zustand führt, erfolgt in einem
zweiten Schritt die Phosphorylierung des gebundenen Substrates. Die Affinität der
Bindestelle für das phosphorylierte Substrat ist so gering, dass es nun freigesetzt werden
kann. Somit würde durch die Phosphorylierung nicht die Mobilisierung der Bindestelle,
sondern das Ablösen des hochaffinen Substrates von der Bindestelle beschleunigt. Die
Ergebnisse aus in vitro Untersuchungen in Vesikeln weisen hingegen darauf hin, dass
freies und phosphoryliertes D-Mannitol mit gleicher Wahrscheinlichkeit von der
Bindestelle freigesetzt wird (Lolkema et al., 1991b). Die Durchlässigkeit von Vesikeln für
D-Mtl stellt jedoch ein Problem bei der Auswertung der Ergebnisse dar. In vivo
durchgeführte DC- und Wachstumsuntersuchungen haben gezeigt, dass nach dem
Transport von D-Mtl über EIIMtl das intrazelluläre Verhältnis von Substrat : Substrat-
Phosphat ganz auf der Seite des phosphorylierten Substrates liegt (Otte, 2000; diese
Arbeit). Für eine im Transport entkoppelte Mutante wäre in dem Lengeler-Modell
denkbar, dass die Affinität der Bindestelle durch den AS-Austausch grundsätzlich
herabgesetzt und freies D-Mtl in die Zelle abgegeben wird.
Unterschiedliche Klassen von Mutationen könnten durch zwei Faktoren
entstehen: 1. Die Stärke bzw. Schwäche der Bindestellen-Affinität und 2. Die Stärke der
internen Phosphorylierung des freien D-Mtl. Anhand der in dieser Arbeit ermittelten
Generationszeiten (Tab III.1.23.) wird deutlich, dass das Wachstum von Zellen auf D-
Mtl mit EIIMtlE218A und DalD verbessert wird, was wiederum auf intrazelluläres freies D-
Mtl hinweist. Das Transporttests mit den E218A-Derivatern nicht reproduzierbar waren,
IV. Diskussion 119
ist ein Hinweis darauf, dass der Austausch E218A im vollständigen EIIMtl den WT-
Phänotyp nicht wiederherstellt. Dennoch war eine hohe Phosphorylierungsrate messbar.
Bei diesem Protein ist die Entkopplung durch ein Herabsetzen der Bindestellen-Affinität
entstanden, wobei die Phosphorylierungsaktivität nicht eingeschränkt war. Ähnlich
verhält es sich bei MtlA*E218V, welches Zellen mit DalD fast eine WT-Generationszeit
auf D-Mtl vermittelt, aber nur noch 10% der Phosphorylierungsaktivität. Hier scheinen
beide Faktoren für eine Entkopplung vorzuliegen. In der Mutante H256P scheint die
Affinität der Bindestelle nicht wie bei E218A oder E218V herabgesetzt zu sein. Das
Wachstum von Zellen mit DalD ist im Vergleich mit beiden Mutanten schwächer und
eine Phosphorylierungsaktivität ist kaum mehr vorhanden. Dies weist auf eine stärkere
Entkopplung auf der Ebene der internen Phosphorylierung des freien D-Mtl hin.
In der Arbeit von Otte (2000) wurden entkoppelte Transporter aus
K.vpneumoniae und E. coli, sowie plasmidkodierte entkoppelte EIIGlc-Mutanten, die sich
bezüglich ihrer KM-Werte und der Phosphorylierungsaktivitäten unterscheiden (Ruijter et
IV.2. Untersuchung der Sekundärstruktur des EIICMtl
Für ein umfassendes Verständnis des Translokationsmechanismus im EIIMtl ist ein
genaues Wissen um die Sekundär- bzw. Tertiärstruktur unumgänglich. Aufgrund
zahlreicher Untersuchungen geht man heute von einer dimeren aktiven Konformation
des Proteins aus (Übersicht bei Jacobson, 1992, Boer et al., 1994; Boer et al., 1996;
Koning et al., 1999; Heuberger et al., 2002), die durch nicht-kovalente, hydrophobe
Wechselwirkung der C-Domänen vermittelt wird (Lolkema et al., 1993). Ein weiterer
Einfluss der AS378-465 auf die Dimerisierung ist aber nicht auszuschließen (Briggs et
al., 1992). Die Sekundärstruktur entwickelte sich aus den Erkenntnissen der Arbeiten
von Lee & Saier (1983), Sugiyama et al. (1991), Dijkstra et al. (1996) und Lengeler
(Lengeler et al., 1994; Lengeler & Jahreis, 1996) zu einem Modell aus mindestens
sechs transmembranen Helices, drei kurzen periplasmatischen und zwei großen
zytoplasmatischen Schleifen sowie einem zytoplasmatischen N-Terminus. Für das EIIGlc
wurde mittels PhoA-Fusionsstudien ein Modell mit acht transmembranen Helices
ermittelt (Buhr & Erni, 1993), obwohl die Hydrophobizitätsmuster von EIIGlc und EIIMtl
sehr ähnlich sind. Die Strukturprojektion eines 2D-EIIMtl-Kristalls mit einer Auflösung von
5 Å gibt Hinweise auf das EIIMtl-Modell mit sechs transmembranen Helices und schließt
dabei die Assoziation einer transmembranen Helix mit extramembranen Strukturen nicht
aus (Koning et al., 1999). Bei der Betrachtung des Sekundärstrukturmodells von EIICMtl
unter Berücksichtigung der Untersuchungen entkoppelter Transporter ist dies auch zu
fordern. Wichtige an der Kopplung beteiligte Aminosäuren (H195, E218, H256) liegen
in der zytoplasmatischen Schleife 5, während das Substrat ursprünglich im Periplasma
zu finden ist. Eine Assoziation der Schleife 5 mit transmembranen Elementen, wie es im
Modell von Lengeler (Lengeler 1990; Lengeler et al. 1994) vorgeschlagen wird, ist
daher durchaus denkbar. Unter Berücksichtigung dessen, wurde in dieser Arbeit eine
strukturelle Untersuchung mit dem Schwerpunkt auf der Schleife 5 durchgeführt.
IV.2.1. Mögliche Strukturen des EIICMtl
Mit der Methode der gezielten Biotinmaleimid-Markierung von Cysteinen in dem
Protein wurde die Lokalisation der Aminosäuren S3, C110, S158, S199, S212, S242,
S299 und C384 in EIICMtl untersucht (siehe III.2.4. und Abb. III.2.4.). Als positive
Innenkontrolle wurde anfänglich das Cys384 gewählt, das als essentielle Aminosäure
122 IV. Diskussion
bei der Phosphatgruppenübertragung in der EIIBMtl-Domäne fungiert (Pas & Robillard,
1988a, 1988b). Aus den Kontrollen geht hervor, dass Cys384 allgemein für Stilben
und Biotinmaleimid zugänglich ist. Unter den gewählten Bedingungen erwies sich
Biotinmaleimid jedoch in allen anderen Versuchen als membranimpermeabel und die
Kontrollmarkierungen mit einer cysteinfreien Mutante lassen unspezifische Bindungen
ausschließen. Dabei sollte in der Diskussion die Sonderstellung des Cys384 im EIIMtl
berücksichtigt werden. Man könnte zum einen eine schwächere Bindung für
Sulfhydrylreagenzien erwarten, da bei einem Wachstum in einem Medium ohne D-Mtl
das EIIMtl an der Phosphorylierungsstelle Cys384 größtenteils phosphoryliert ist.
Abb. IV.4. Bindung eines Phosphats bzw. Maleimids an ein Cystein A) Bindung einer Phosphorylgruppe (grün) an die Sulfhydrylgruppe des Cysteins (blau). B) Bildung des Thioethers durch Bindung des Maleimids (rot) an die Sulfhydrylgruppe des Cysteins (blau).
Eine Blockierung der Bindestelle für Maleimid wäre denkbar (Abb. IV.4.), zeigte
sich jedoch nicht bei den Kontrollen auf allgemeine Zugänglichkeit. Zum anderen sollte
das Cys384 in der Nähe des D-Mtl-Transports durch die Membran sein, da es das
Phosphat auf das Substrat überträgt. Dort wären Membranstrukturen denkbar, die es
Biotinmaleimid, nicht aber Stilben ermöglichen, Cys384 zu erreichen, zumal die
Membranpermeabilität bzw. -impermeabilität von Biotinmaleimid zeitabhängig ist (Loo
und Clarke, 1994). Ein nahe oder in der Membran liegendes Cys384 könnte noch von
Biotinmaleimid erreicht werden, während zytoplasmatische Cysteine innerhalb der
Inkubationszeit unmarkiert bleiben. In jedem Fall ist es als sicher anzusehen, dass
Cys384 vom Zytoplasma erreichbar sein muss. Für eine „positive Innenkontrolle“ wurde
zudem der Austausch S3C gewählt, der nach dem derzeitigen Sekundärstrukturmodell
im Zytoplasma liegen soll (Abb. IV.5.).
IV. Diskussion 123
Abb.IV.5. Ergebnisse aus Sequenz- und Strukturuntersuchungen im Sekundär-strukturmodell des IICMtl-Transporters aus E. coli (nach Sugiyama et al., 1991 und Lengeler et al., 1994; verändert)
Das Modell entspricht der Abb.I.2. erweitert durch den Sequenzvergleich aus Abb. IV.3. Die Aminosäuren sind wie folgt markiert: In dem Sequenzvergleich konservierte AS haben einen schwarzen Kasten, AS mit lediglich konservativen Austauschen einen schwarzen Kreis, AS mit Konsensussequenz einen leeren Kreis und AS ohne Konsensus keine Markierung. AS deren Position im Sekundärstrukturmodell in dieser Arbeit oder durch aktuelle Struktur-Untersuchungen bestätigt worden sind, sind in Grün dargestellt. Abweichende Positionen sind in Rot, unbestimmte Positionen in Blau dargestellt. Die Messungen der PhoA-Aktivitäten einzelner AS (Sugiyama et al., 1991) sind in den Farben Gelb (<20 Einheiten pro OD Einheit (= EpOD)), Orange (20-75 EpOD) und Braun (>75 EpOD) angegeben. Blaue Kreise zeigen Lücken bzw. Insertionen in den verglichenen AS-Sequenzen an. Leere Kreise stellen AS-Sequenzen unbestimmter Länge dar. Weitere Erläuterungen sind im Text zu finden.
124 IV. Diskussion
Für die AS-Austausche S110C und S299C konnte keine allgemeine
Zugänglichkeit für Sulfhydrylreagenzien festgestellt werden. Im Falle des S110C sind
unzugängliche Strukturen denkbar, die durch eine Anlagerung der EIIBMtl-Domäne an
die Schleife 3 entstehen. So konnte gezeigt werden, dass zwischen zwei EIIMtl-Domänen
Disulfidbrücken durch Cys124-Cys124, Cys384-Cys384, Cys124-Cys384 sowie
innerhalb einer Domäne durch Cys124-Cys384 gebildet werden können (van Montfort
et al., 2001). Dadurch ergibt sich ein geringer Abstand der zwei Cys124 und Cys384 in
der B/C-Domäne und der Dimer-Verbindung, der mit maximal 5 Å vorgeschlagen wird.
Die Vielzahl der möglichen Disulfidkombinationen spiegelt hier die dynamischen
Prozesse der einzelnen Domänen in der Substrattranslokation wieder. Die EIIB-Domäne
muss dafür mit dem Cys384 in die Nähe der EIIA-Domäne gelangen, um die
Phosphorylgruppe vom His554 zu übernehmen und dann zur Phosphorylierung des
Substrats mit der EIIC-Domäne in Wechselwirkung treten. Des Weiteren kann die
Phosphatgruppe im Dimer zwischen den jeweiligen Monomeren von der EIIA- zur EIIB-
Domäne bzw. der EIIB-Domäne zum Substrat übertragen werden (van Weghel et al.,
1991a; Weng et al., 1992; Boer et al., 1996; Saraceni-Richards & Jacobson, 1997).
Dadurch wird deutlich, dass das aktive Zentrum der EIIB-Domäne unterschiedliche
Konformationen durchlaufen muss, die verschiedene Disulfidbrücken ermöglichen.
Der Grund für die Unzugänglichkeit des S299C-Austausches könnte eine
Lokalisation in der Membran sein. In diesem Bereich der Schleife 6 gibt es zwar drei
phoA-Fusionen, die für die Lage von I300, G310 und A311 im Periplasma sprechen
(Sugiyama et al., 1991). Hohe phoA-Aktivität kann aber auch erwartet werden, wenn
die drei AS in die Helix 6 gelegt werden würden. Für eine genaue Einordnung fehlen in
diesem Bereich weitere phoA-Fusionen. Grundsätzlich haben Deletionsfusionen den
Nachteil, dass das Protein nicht aktiv ist und carboxyterminale, für eine genaue Insertion
wichtige AS-Sequenzen deletiert sein können (Calamia & Manoil, 1990 und 1992).
Die Markierungs-Ergebnisse für die Austausche S158C, S199C und S212C
weisen deutlich auf periplasmatische Aminosäuren hin. Im Fall des Ser158 stützt dieses
Ergebnis das aktuelle Sekundärstruktur-Modell und die Messungen aus phoA-Fusionen
in diesem Bereich (Sugiyama et al., 1991), die Ser158 in die periplasmatische Schleife
4 legen. Widersprüchlich sind dagegen die Ergebnisse für S199C und S212C. Beide
Aminosäuren (Ser199 und Ser212) liegen in dem EIIMtl-Modell in der zytoplasmatischen
Schleife 5 und die Werte zahlreicher phoA-Fusionen bestätigen dies (Sugiyama et al.,
IV. Diskussion 125
1991). Es ist jedoch schon im ersten Teil der Arbeit auf die Besonderheit der Schleife 5
hingewiesen worden, die sich aus der relativ hohen Konservierung und den vielen
Mutationen, welche den Transport beeinflussen, ergibt. Dynamische Prozesse, die keine
Insertion von Teilen der Schleife 5 in die Membran erfordern, und Strukturen wie der
von Lengeler beschriebene hydrophile Kern vom EIICMtl (Lengeler 1990; Lengeler et al.
1994) könnten unter Umständen mit Deletionsfusionen nicht nachgewiesen werden.
Dies wäre der Fall, wenn die Schleife 5 für eine Faltung in die Membran die
Stabilisierung von weiteren, in dem jeweiligen Protein aber deletierten Strukturen
benötigte. Die nach den Markierungsversuchen periplasmatische Anordnung des
Ser199 und Ser212 ist ein starker Hinweis auf eine Faltung von Teilen der Schleife 5 in
die Membran, da die AS S242 nach Ergebnissen dieser Arbeit wiederum
zytoplasmatisch lokalisiert ist.
Das bisherige Sekundärstrukturmodell stützt sich lediglich auf die phoA-Fusionen
(Sugiyama et al., 1991) und mathematische und empirische Methoden zur Vorhersage
von Membranstrukturen in Proteinen (Kyte & Doolittle, 1982; Engelman et al., 1986;
von Heijne & Gavel, 1988; von Heijne, 1992; Lengeler et al., 1994). Weitere gezielte
Untersuchungen zur Lokalisation einzelner Aminosäuren im Protein gibt es nur wenige.
Als gesichert ist die Bestimmung des Ser124 in unmittelbarer Nähe zum Cys384
anzusehen (van Montfort et al., 2000). Ergebnisse aus Tryptophan-
Phosphoreszensstudien geben starke Hinweise auf das Vorkommen der AS Trp30 und
Trp42 in einer Membran-Helix, was der Helix 1 im Modell entsprechen sollte (Broos et
al., 2000). Die Studie gibt zudem noch gute Hinweise darauf, dass Trp109 und Trp117
im Zytoplasma liegen, so wie es im Modell vorgesehen ist.
Auf Grund der Ähnlichkeiten im Hydropathie-Muster und der Domänenstruktur,
wurden für das EIIMtl und EIIGlc ähnliche Topologien vermutet. Für EIIGlc wird allerdings in
einer Studie mit phoA- und lacZ-Deletionsfusionen ein Modell mit acht transmembranen
Helices vorgeschlagen (Buhr & Erni, 1993). Vergleicht man die Anordnung der
einzelnen Helices zwischen EIIMtl und EIIGlc (Abb. IV.6.), so sieht man annähernde
Übereinstimmungen bei den Schleifen Mtl1-Glc1, Mtl2-Glc2, Mtl3-Glc5, Mtl4-Glc6
und Mtl5-Glc8. Abweichungen gibt es durch die Schleifen Glc3, Glc4, Glc7 und Mtl6.
Glc3 und Glc4 stellen zwei Schleifen dar, die im Sekundärstrukturmodell von EIIMtl nicht
Abb. IV.6. Vergleich der postulierten transmembranen Helices von EIICMtl und EIICGlc Die Abbildung zeigt die relative Lage postulierter Helices aus EIICGlc (Buhr & Erni, 1993) in der AS-Sequenz von EIICMtl (K12; Lee & Saier, 1983). Die Helices aus EIICGlc sind mit einem weißen Kasten versehen (Glc1 - Glc8), die Helices aus EIICMtl mit einem grauen Kasten (Mtl1 - Mtl6). AS-Bereiche im Zytoplasma sind mit grünen Is, die im Periplasma mit roten As gekennzeichnet. Die dargestellte AS-Sequenz ist aus der Abb.IV.3. mit den Markierungen übernommen worden. Transmembrane Bereiche nach der Vorhersage des Programms TMHMM (Sonnhammer et al., 1998; Abb.V.7.) sind mit blauen (EIIMtl) bzw. grünen (EIIGlc) Balken und alphabetisch markiert. Relevante AS sind hervorgehoben und nummeriert. Der Abbildung liegt ein Sequenzvergleich zwischen EIICMtl und EIICGlc zu Grunde (weiteres siehe Text).
IV. Diskussion 127
Die Tryptophan-Phosphoreszensstudien an W109 und W117 (Broos et al.,
2000), sowie die Cystein-Kreuzverbindungsstudien (van Montfort et al., 2000)
schränken das Vorkommen der Schleife Glc4 in EIICMtl stark ein. Damit entfällt aus
topologiesymmetrischen Gründen auch eine mögliche Schleife 3, zumal S158 in dieser
Arbeit im Periplasma lokalisiert wurde. Die Abweichungen der Schleifen Glc7 und Mtl6
erscheinen danach als eine Verschiebung der zwei aufeinander folgenden Helices in
den jeweiligen Proteinen.
Neben den experimentellen Möglichkeiten, die Topologie eines transmembranen
Proteins aufzuklären, gibt es noch zahlreiche Computerprogramme, die entsprechende
Vorhersagen berechnen. Allen Programmen ist gemein, dass die grundsätzlichen Regeln
der Ladungsverteilung und des bevorzugten Vorkommens bestimmter Aminosäuren
berücksichtigt wird (Kyte & Doolittle, 1982; Engelman et al., 1986; von Heijne &
Gavel, 1988; von Heijne, 1992). Das Programm TMHMM („transmembrane hidden
Markov model“) von Sonnhammer et al. (1998) hat in einem Vergleich mehrerer
Vorhersageprogramme am besten abgeschnitten (Möller et al., 2001). Das Prinzip von
TMHMM liegt in der dynamischen Berücksichtigung biologischer Besonderheiten bei der
Entstehung transmembraner Strukturen. So können z.B. Bereiche geringer
Hydrophobizität dennoch als transmembrane Helix beurteilt werden, wenn umliegende
topogene Strukturen dies unterstützen. Solche Helices kommen oft vor, wenn
Dennoch ist bei der Arbeit mit Vorhersage-Programmen immer zu berücksichtigen, dass
mögliche Strukturen nur vorgeschlagen werden und die angegebenen transmembranen
Bereiche variabel anzusehen sind. So wird eine Vorhersage als korrekt beurteilt, wenn
der angegebene Bereich für eine Helix mit dem der realen Helix überlappt. Daher
können die transmembranen Bereiche in variablen Größen angegeben werden.
Die Ergebnisse von TMHMM (Abb. IV.6. und IV.7.) bestätigen das
Sekundärstrukturmodell von EIIGlc in den acht postulierten transmembranen Helices,
insgesamt werden zehn mögliche Bereiche für Helices vorhergesagt. Diese zwei
zusätzlichen Helices würden in der Schleife 5 und hinter der Schleife 8 (Glc8) am Ort
der Schleife 6 (Mtl6) von EIICMtl liegen. Auch die Vorhersage für EIIMtl bestätigt das
entsprechende Sekundärstrukturmodell, obwohl die Helix 4 (Mtl4; hellblauer Balken in
Abb. IV.6.) nur bei der Berechnung für die Konsensussequenz von EIICMtl erkannt wird
(Für die Berechnung wurde die Konsensussequenz ohne Insertionen verwendet).
128 IV. Diskussion
Abb. IV.7. TMHMM-Vorhersage der Topologien von EIICMtl und EIICGlc Die Abbildung zeigt die graphische Darstellung der Wahrscheinlichkeitsberechnungen des Programms TMHMM (Sonnhammer et al., 1998; Abb.V.7.) für EIICGlc und EIICMtl. Den Berechnungen für transmembrane, zytoplasmatische (innen) und periplasmatische (außen) Bereiche liegen die Konsensussequenzen für EIICMtl (Abb. IV.3.), EIICBMtl (Lee & Saier, 1983) und EIICBGlc (Erni & Zanolari, 1986) zu Grunde. Über den jeweiligen transmembranen Bereichen sind die ersten und letzten AS angegeben. Die zugehörigen Helices der aktuellen Topologiemodelle (Sugiyama et al., 1991; Buhr & Erni, 1993) sind mit römischen Ziffern gekennzeichnet. Einander im Sequenzvergleich entsprechende transmembrane Bereiche (Abb. IV.6.) sind alphabetisch gekennzeichnet (Näheres siehe Text).
IV. Diskussion 129
Die Ergebnisse für EIIMtl enthalten ebenfalls mehr Helices als das Modell
beinhaltet. Eine davon liegt in der Schleife 3 und zwei in der Schleife 5 des
Sekundärstrukturmodells von EIICMtl. Im Vergleich zwischen EIICGlc und EIICMtl fällt auf,
dass bei der Vorhersage, beiden Modellen entsprechend, mehr transmembrane
Bereiche für EIIGlc vorgeschlagen werden. Vieles weist darauf hin, dass EIIGlc und EIIMtl
Transporter gleichen Ursprungs sind, deren Funktion und Hydropathie-Muster ähnlicher
sind als die Topologie. Der Bereich für eine mögliche Helix in der Schleife 3 von EIIMtl
liegt dabei in einem Bereich, der im Sequenzvergleich eine Deletion bzw. Insertion
aufweist. Das kann auf eine Deletion im Bereich zweier transmembraner Helices in der
Schleife 3 von EIIMtl hinweisen. Mögliche transmembrane Bereiche in Schleife 5 von
EIICMtl weisen auf eine Membranassoziation der Schleife 5 hin. Sowohl in EIICMtl als
auch in EIICGlc gibt es auf die Schleife 5 folgend drei Bereiche für transmembrane
Helices in denen jeweils zwei Helices aus den Modellen eingeordnet werden. Die
Ergebnisse aus den zugehörigen phoA- bzw. phoA- und lacZ-Untersuchungen sprechen
für die Zuordnung wie sie in den Modellen erfolgt. Es sind allerdings bei dem Modell
für EIIMtl auf Grund weniger Daten in diesem Bereich Verschiebungen der
transmembranen Bereiche möglich. Anhand der in dieser Arbeit durchgeführten und
vorgestellten Untersuchungen sind verschiede Strukturen in EIICMtl denkbar (Abb. IV.8.).
Dabei wurden folgende Punkte gesondert berücksichtigt.
Die Maleimid-Markierungen des Ser3 bestätigt den zytoplasmatischen
Aminoterminus von EIIMtl. Die Helix 1 wird durch Tryptophan Phosphoreszensstudien
(Broos et al., 2000) gestützt. Die AS W109 und W117 in der Schleife 3 werden durch
am S124 weisen auf eine unmittelbare Nähe zum C384 hin (van Montfort et al., 2000).
Die Maleimid-Markierungen des C110 zeigten eine Unzugänglichkeit der Aminosäure.
Ein Vergleich der postulierten Helices in EIIMtl und EIIGlc sowie die phoA-Untersuchungen
an den AS G91, A92 und D93 geben Hinweise auf deletierte Membran-Helices. Die
Helices 2 und 3 resultieren aus den vorangegangenen Ergebnissen sowie der
periplasmatische Zuordnung des Ser158 in der Schleife 4. Die Helix 4 fällt in der
TMHMM-Vorhersage schwach aus und die Bestimmung von Ser199 und Ser212 im
Periplasma spricht für eine Helix nach den AS 199 und 212. Allerdings sind die Werte
der phoA-Studien in diesem Bereich sehr gut, womit die Helix 4 beibehalten wird. Die
Daten aus den Mutantenselektionen und die Bestimmung von Ser199 und Ser212
130 IV. Diskussion
sprechen für eine Faltung der Schleife 5 „in die Membran“, wie sie von Lengeler
(Lengeler 1990; Lengeler et al. 1994) vorgeschlagen wurde. Dabei sind die
dargestellten hellblauen Strukturen nicht zwingend als Helix anzusehen. Die in dieser
Arbeit nachgewiesene Relevanz von Glu218 für die Kopplung bestärkt die Verlegung
der AS in die Membran. Gleiches gilt für die AS His195 und Umgebung. Dabei wurde
die von TMHMM in der Schleife 5 vorgeschlagene Helix (AS212-234) eingebaut. Das
Ser242 liegt danach den Markierungen entsprechend im Zytoplasma. Das GIHE-Motiv
wird „nahe“ der Membran angeordnet, da seine zentrale Bedeutung in der Kopplung
von Transport und Phosphorylierung gezeigt werden konnte. Die Helices 5 und 6
werden dem ursprünglichen Modell entsprechend beibehalten.
Abb.IV.8. Mögliche 2D-Strukturen des IICMtl-Transporters aus E. coli
Die Darstellung entspricht der Abb. IV.5. Abweichend sind AS, die relevant am Transportprozess beteiligt sind rot markiert. Mögliche Membran-Strukturen sind entsprechend der Abb. IV.7. alphabetisch gekennzeichnet. Der hellblaue Bereich in der Membran stellt eine hydrophile Struktur dar, in der nicht zwingend Helices liegen.
IV. Diskussion 131
Auf Grund der neuen Struktur, die eine Zurückfaltung der Schleife 5 nur im
kompletten Protein ermöglicht, lassen sich auch die PhoA-Aktivitäten der
Deletionsfusion L209 erklären, da in diesen Konstrukten die Faltung in die Membran
nicht erfolgt. Letztlich wurde in der Abbildung die nachgewiesene Nachbarschaft der AS
Ser124 aus der Schleife 3 und dem Cys384 aus EIIBMtl dargestellt.
Das abgebildete Modell (Abb. IV.8.) stellt nur mögliche Strukturen im EIICMtl dar.
Außerdem ist zu berücksichtigen, dass es sich dabei um eine von vielen möglichen
Konformationen handeln kann. Es sei aber darauf hingewiesen, dass das Modell alle
bisherigen Erkenntnisse über das EIIMtl vereinigt. Eine mögliche dreidimensionale
Anordnung der einzelnen Elemente zeigt die Abb.xIV.9. Dabei soll die Formung eines
hydrophilen Kerns wie in Abb.xI.3. dargestellt werden.
Abb.IV.9. Mögliche 3D-Strukturen des IICMtl-Transporters aus E. coli
Die Nummerierung der begrenzenden AS einer Struktur entspricht der Abb. IV.8. In rot sind wichtige am Transportprozess beteiligte AS sowie das dem C384 benachbarte S124 hervorgehoben. Das C384 wurde in der phosphorylierten Form dargestellt (C384~P).
132 IV. Diskussion
Ein Dimer aus zwei solchen Anordnungen würde einen Ring aus stabilisierenden
transmembranen Helices formen, deren hydrophiler Kern das reaktive Zentrum bilden
würde. Dieses reaktive Zentrum entspricht dabei dem hochkonservierten Bereich
zwischen den AS L174 und P267 und würde nicht in der Membran, sondern in einem
Ring von transmembranen Helices liegen. In diesem Bereich befinden sich alle
Aminosäuren, die anhand der Mutantenselektion einen Einfluss auf den gekoppelten
Transport haben.
Weiterführende Untersuchungen sind erforderlich, um die vorgeschlagenen
Strukturen in dem Modell genauer bestimmen zu können. In dieser Arbeit konnte die
Methode der Biotinmaleimid Markierung in geeigneter Weise etabliert werden. Bei
folgenden Untersuchungen ist zu berücksichtigen, dass in dem aktiven Zentrum
dynamische Strukturen zu erwarten sind. Markierungen an einem phosphoryliertem EIIMtl
könnten diese aufzeigen.
V. Zusammenfassung 133
V. Zusammenfassung
Die Konstruktion des Plasmids F’lac::dalD ermöglichte die Entwicklung stabiler
Systeme zur Selektion entkoppelter EIIMtl-Mutanten. Semisynthetische Stoffwechselwege
für den D-Mtl-Abbau wurden durch die Stämme LGS322-1/pGJ9∆137 und
LTK31-2/pGJ9 etabliert und erfolgreich zur Selektion von Mutanten eingesetzt. Von 30
untersuchten entkoppelnden Mutationen zeigten 15 den Austausch E218A, eine den
Austausch E218V und 14 den Austausch H256P. Die Phänotypen der Mutanten wurden
nach ortsspezifischer Mutagenese bestätigt und in unterschiedlichen
Stammhintergründen untersucht. Alle Mutationen ermöglichten im EIICMtl nur noch
entkoppelten Transport. Im vollständigen MtlA (EIICBAMtl) wurde bei dem Austausch
E218A gekoppelter und entkoppelter Transport gemessen. Mit DalD lag die
Generationszeit bei ~118min, ohne DalD bei ~190min (WT-Gt = ~85min mit und
ohne DalD). Kinetische Transportmessungen waren bei der Mutation E218A nicht
reproduzierbar und zeigten eine starke Abhängigkeit vom Plasmid- und
Stammhintergrund. Die Phosphorylierungsaktivität lag mit 307 [nM]1 im Bereich des WT
(278 [nM]1). Die Mutation E218V zeigte stärkere Auswirkungen auf den Phänotyp. Im
EIICBAMtl wurde auch gekoppelter und entkoppelter Transport festgestellt. Mit DalD lag
die Generationszeit bei ~110min, ohne bei ~305min. Transportmessungen waren
nicht möglich, die Phosphorylierungsaktivität lag bei 32 [nM]1. Mit der Mutation H256P
war im EIICBAMtl nur noch entkoppelter Transport möglich (Gt mit DalD = 283min /
ohne DalD = k.W.). Transport war nicht mehr messbar, die Phosphorylierungsaktivität
lag bei 2 [nM]1. Die Ergebnisse geben Hinweise darauf, dass die Kopplung von
Transport und Phosphorylierung durch die Affinität des EIICMtl zum Substrat beeinflusst
wird. Durch ortsspezifische Mutagenese konstruierte Doppelmutationen E218A/H256P
und E218V/H256P konnten D-Mtl in keinem Stammhintergrund verstoffwechseln. Die
Proteine mit den Doppelmutationen wurden in der Membran nachgewiesen, nicht aber
deren korrekte Faltung.
1[nM]= [nmol∗min-1∗mg Protein-1]
134 V. Zusammenfassung
Die Selektion von Suppressormutanten ergab lediglich Aminosäureaustausche in
der AS256. Die Mutationen H256A, P256Q und P256S zeigten in Generationszeit,
Transport- und Phosphorylierungsmessungen annähernd WT-Werte. Besonderheiten bei
den Messungen von P256S lassen jedoch eine Beeinflussung der Dimerisierung durch
Mutationen in H256 vermuten. Aufgrund des ausschließlichen Auftretens von
entkoppelten Mutanten in E218 und H256 und des starken Selektionsdrucks, der keine
Suppressormutationen in anderen AS ermöglichte, ergibt sich eine essentielle Funktion
dieser AS in der Kopplung von Transport und Phosphorylierung.
Zur Analyse der Sekundärstruktur des EIIMtl mittels „Cystein-Scanning“ wurde ein
MtlA(His)6 in einem Überexpressionsvektor konstruiert. Nach ortsspezifischer
Mutagenese konnte die Aktivität des EIIMtl mit den Austauschen S3C, S110C, S158C,
S199C, S212C, S242C oder S299C gezeigt werden. Aus den Biotinmaleimid-
Markierungen ergab sich die Lokalisation von C3 und C242 im Zytoplasma sowie von
C158, C199 und C212 im Periplasma. Keine oder unbestimmbare Zugänglichkeiten
für Sulfhydrylreagenzien zeigten die AS C110, C299 und C384. Aus diesen
Ergebnissen ergibt sich eine Anordnung von Teilen der ursprünglichen Schleife 5 in der
Membran. Diese Schleife 5 bildet das aktive Zentrum, in der sich alle AS befinden,
deren direkte Beteiligung an Transport und Phosphorylierung nachgewiesen wurden. Es
ist nahe liegend, dass solche Strukturen in der Nähe der Substratbindung und des
Transports liegen sollten. Ein Modell, das diesen Anforderungen und den bisherigen
Ergebnissen entspricht, wurde vorgeschlagen. Es stellt aber lediglich eine Anregung für
weitere Untersuchungen dar.
VI. Literaturverzeichnis 135
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VII. Anhang 151
LEBENSLAUF UND AUSBILDUNGSGANG
Persönliche Daten
Şevket Turgut geb. 16.03.1968 in Zürich ledig seit 07.1999 deutsche Staatsangehörigkeit, davor türkische
von - bis Schulbildung
1974 - 1978 Grundschule in Bad Pyrmont
1978 - 1988 Humboldt-Gymnasium in Bad Pyrmont Abschluss: allgemeine Hochschulreife am 27.05.1988
von - bis Hochschulstudien
10.1988 - 09.1989 Studium der Chemie an der Universität Paderborn, FB Chemie
10.1989 - 07.1995
Studium der Biologie an der Universität Osnabrück, FB Biologie / Chemie Abschluss: Dipl. biol. Titel der Diplomarbeitarbeit in der AG Genetik bei Herrn Professor J.W. Lengeler: „Molekulargenetische Untersuchungen des rbt-Operons für den Ribitol-Transport und -Stoffwechsel aus dem Bakterium Klebsiella pneumoniae KAY2026“
10.1995 - 2003
Promotionsstudium in der AG Genetik an der Universität Osnabrück. Thema der Arbeit: „Molekulargenetische und biochemische Untersuchungen zur Funktion und Struktur des Enzym IIMtl aus Escherichia coli K-12“
Veröffentlichungen
1997
Heuel, H., Turgut, S., Schmid, K., and Lengeler, J.W. Substrate Recognition Domains As Revealed by Active Hybrids between the D-Arabinitol and Ribitol Transporters from Klebsiella pneumoniae. J. Bacteriol. 179: 6014-6019.
1998 Heuel, H., Shakeri-Garakani, A., Turgut, S., and Lengeler, J.W. Genes for D-arabinitol and ribitol catabolism from Klebsiella pneumoniae. Microbiology 144: 1631-1639.
2003
Otte, S., Scholle, A., Turgut, S., and Lengeler, J.W. Mutations Which Uncouple Transport and Phosphorylation in the D-Mannitol Phosphotransferase System of Escherichia coli K-12 and Klebsiella pneumoniae 1033-5P14. J. Bacteriol. 185(7): 2267-2276.
152 VII. Anhang
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Joseph W. Lengeler für die Bereitstellung der Promotionsmöglichkeit an seinem Lehrstuhl. Ohne seine überdurchschnittliche Unterstützung bei der Fertigstellung und die vielen anregenden und informativen Gespräche wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Nicht zu vergessen ist die Schulung der persönlichen Kritikfähigkeit, die sich auch außerhalb der Universität als sehr hilfreich erweist. Herrn Dr. Kurt Schmid danke ich ebenfalls für die Unterstützung während dieser Arbeit und die vielen praktischen Tipps sowie unterhaltsamen und hilfreichen Gespräche. Bei Herrn Prof. Dr. Karlheinz Altendorf bedanke ich mich für die freundliche Übernahme des Koreferats. Herrn Prof. Dr. George T. Robillard danke ich für Ermöglichung der Versuche an seinem Lehrstuhl der Reichsuniversität Groningen unter der freundlichen Mithilfe von Erwin Vos. Herrn Dr. Heinrich Jung danke ich für die informativen und sehr hilfreichen Gespräche rund um das „Cystein-Scanning“ sowie seinen Einsatz in der Prüfungskomission. Allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe danke ich für die hilfreichen Gespräche und das sehr angenehme Arbeitsklima, insbesondere der Besatzung des Nordseite Angi, Dana, Hedwig, Jens, Jörg und Knut. Bei Georg Zimmermann möchte ich mich auch im Namen der Arbeitsgruppe bedanken, da er mich jederzeit bei meiner Arbeit als Computerbeauftragter unterstützt hat und die Systeme trotz Mr. Gates am Laufen gehalten wurden. Nancy Tholema danke ich für die „Starthilfe“ beim Cystein-Scanning und das sehr gewisenhafte Korrekturlesn dre Arbeit. Ganz besonderer Dank gilt Dette, die nicht nur durch ihre Hilfe bei den Markierungsversuchen zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.
VII. Anhang 153
Eidesstattliche Erklärung
Ich versichere, dass die vorliegende Arbeit mein erster Promotionsversuch ist und ich die
beschriebenen Arbeiten selbst durchgeführt und keine anderen als die beschriebenen
Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Osnabrück, März 2003 ............................................. (Şevket Turgut)