Molekulare Analyse eines synthetischen Tetracyclin-abhängigen RNA-Regulators Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Michael Müller aus Passau
Molekulare Analyse eines synthetischen
Tetracyclin-abhängigen RNA-Regulators
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Michael Müller
aus Passau
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 27.01.2006
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder
Erstberichterstatter: Prof. Dr. W. Hillen
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. P. Dietrich
meiner Familie
Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. Wolfgang Hillen, an dessen Lehrstuhl diese Arbeit durchgeführt
wurde, für die ausgezeichneten Arbeitsbedingungen.
Besonders bedanke ich mich bei Dr. Beatrix Süß für die Möglichkeit an einem sehr
interessanten Thema frei arbeiten zu können, für ihren fachlichen Rat und die permanente
Unterstützung.
Bei Frau Prof. Dr. Petra Dietrich möchte ich mich für die Übernahme des Koreferats
bedanken.
Herzlich bedanken möchte ich mich bei Dr. Oliver Weichenrieder (NKI Amsterdam), der mir
mit allerlei praktischen Kniffen und hilfreichen Diskussionen das Arbeiten mit RNA näher
gebracht hat und für den freundlichen Empfang in Amsterdam.
Bei unserer Labor-Fee Barbara bedanke ich mich für die Hilfe bei der Lösung von allerlei
labortechnischen Problemchen.
Auch bei allen ehemaligen und derzeitigen Mitgliedern des Trixi-Labs (Shane, Gesine, Anke,
Bernd, Stefi, Sabrina, Linda, Martin, Ewald, Johannes, der Labor-Julia und all denen die ich
jetzt vergessen habe) bedanke ich mich für die stets lustige und freundliche Atmosphäre und
die permanente Hilfsbereitschaft. Insbesondere bei allen Kuchen- und Süßigkeitenlieferanten
dafür, dass immer was in der Schublade war.
Bei Dr. Chris Berens für die zahlreichen interessanten Anregungen und Diskussionen und bei
Dr. Matthias Görlach und Sabine Häfner (IMB Jena) bedanke ich mich dafür, dass sie mir
auch nach meiner Diplomarbeit mit Rat und Tat zur Seite standen.
Ein ganz großes Dankeschön gebührt auch unserem Werkstatt Düsentrieb Markus Müller, der
mit seiner Bastelei alle auftretenden technischen Probleme gelöst hat.
Vielen Dank auch an alle anderen Mitglieder des Lehrstuhls für die gute Zeit und die stete
Hilfsbereitschaft. Besonders möchte ich mich bei meinen Eltern und Großeltern für die
finanzielle Unterstützung bedanken, für den ständigen Nachschub im Kühlschrank und vieles
mehr. Ohne euch wäre das nicht möglich gewesen. Bei meiner Julia bedanke ich mich für die
Unterstützung in allen Lebenslagen, beim Kampf mit Word und dem Finden von
Rechtschreibfehlern.
Mein Dank gilt auch Herrn Dr. Rösch, Frau Cimander, Frau Hanuschik, Frau Storck, Frau
Ingram, Frau Prell, Frau Oliva und Frau Wehr die mit ihrer im Hintergrund geleisteten Arbeit
eine solide Basis für (meist) sorgenfreies Forschen an diesem Lehrstuhl bilden und gebildet
haben.
Inhaltsverzeichnis 1
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung............................................................................................................ 4
2 Einleitung .......................................................................................................................... 6
2.1 RNA-Faltung.............................................................................................................. 6
2.2 RNA-Aptamere .......................................................................................................... 9
2.3 Selektion von Aptameren mittels SELEX.................................................................. 9
2.4 Spezifität und Affinität von RNA-Aptameren ......................................................... 10
2.5 Anwendung von Aptameren..................................................................................... 10
2.5.1 Aptamere als Werkzeuge in der Diagnostik..................................................... 10
2.5.2 Aptamere als Bestandteil von hochempfindlichen Biosensoren für Toxine .... 11
2.5.3 Aptamere in der medizinisch-therapeutischen Anwendung............................. 11
2.5.4 Chemische Modifikation von Aptamer-RNA zum Schutz vor Degradation ... 12
2.6 Genexpression in Eukaryoten................................................................................... 13
2.6.1 Transkription und Prozessierung der prä-mRNA............................................. 13
2.6.2 Aufbau der eukaryotischen mRNA.................................................................. 14
2.6.3 Initiation der Translation von eukaryotischer mRNA...................................... 15
2.6.4 Alternative Möglichkeiten zur Initiation der Translation ................................ 15
2.7 Regulation der Translation ....................................................................................... 16
2.7.1 Regulation der Translation durch Riboswitche................................................ 16
2.7.2 Regulation der Translation durch konditionelle Systeme ................................ 18
2.8 Tetracyclin................................................................................................................ 21
2.9 Zielstellung der Arbeit ............................................................................................. 23
3 Material und Methoden ................................................................................................. 24
3.1 Bakterien- und Hefestämme, Plasmide und Oligonukleotide .................................. 24
3.1.1 Bakterien- und Hefestämme............................................................................. 24
3.1.2 Plasmide ........................................................................................................... 25
3.1.3 Oligonukleotide................................................................................................ 26
3.2 Puffer, Lösungen und Medien.................................................................................. 29
3.2.1 Bakterien- und Hefenährmedien ...................................................................... 29
3.2.2 Puffer und Lösungen ........................................................................................ 30
3.2.3 Enzymlösungen ................................................................................................ 37
3.3 Methoden.................................................................................................................. 37
3.3.1 Allgemeine Methoden ...................................................................................... 37
Inhaltsverzeichnis 2
3.3.2 Anzucht von Bakterien..................................................................................... 37
3.3.3 Transformation von E. coli............................................................................... 38
3.3.4 Anzucht von S. cerevisiae ................................................................................ 38
3.3.5 Anzucht und Transformation von kompetenten S. cerevisiae.......................... 38
3.3.6 Nachweis und Präparation von DNA............................................................... 39
3.3.7 Nachweis und Präparation von RNA ............................................................... 41
3.3.8 Fluoreszenz Messungen ................................................................................... 47
3.3.9 Isothermale Titrationskalorimetrie................................................................... 48
3.3.10 Analytische Gelfiltration am SMART System................................................. 49
3.4 Aufreinigung der T7-RNA-Polymerase ................................................................... 49
3.5 Präparation eines Hefe Zellextrakts ......................................................................... 51
3.6 in vitro Spleißexperimente ....................................................................................... 24
4 Ergebnisse ....................................................................................................................... 54
4.1 in vitro Synthese von Aptamer-RNA....................................................................... 54
4.1.1 Das Hammerhead-Ribozym ............................................................................. 55
4.1.2 Der Klonierungsvektor pSP64 ......................................................................... 55
4.1.3 Konstruktion der Transkriptionsvektoren ........................................................ 56
4.2 Synthese und Aufreinigung der RNA ...................................................................... 57
4.3 Konformation und Stöchiometrie des RNA-Tc Komplexes .................................... 58
4.3.1 Analyse des molaren Verhältnisses im Tc-RNA Komplex über analytische
Gelfiltration ...................................................................................................................... 58
4.3.2 Visualisierung des Tc-Aptamer Komplexes .................................................... 61
4.4 Thermodynamische Charakterisierung des RNA-Tc Komplexes ............................ 63
4.4.1 Titrationsfluoreszenzspektroskopie.................................................................. 63
4.4.2 Isothermale Titrationskalorimetrie................................................................... 72
4.5 Regulation der gfp-Expression in vivo durch verschiedene Tc-Derivate................. 76
4.6 Das zweigeteilte Tc-Aptamer................................................................................... 77
4.7 Das CAA- Aptamer.................................................................................................. 80
4.8 Kontrollierte Regulation des Spleißens durch das Tc-Aptamer............................... 82
4.8.1 Integration von 5´-SS und bp in das Tc-Aptamer und Test auf Tc-Bindung.. 82
4.8.2 Integration der Spleißstellen-Aptamer Hybride in das Intron von Aktin......... 85
4.8.3 In vitro Spleißen der Aktin RNA ..................................................................... 86
4.8.4 In vitro Spleißen der Aptamer enthaltenden Aktin Konstrukte........................ 88
5 Diskussion ....................................................................................................................... 89
Inhaltsverzeichnis 3
5.1 Der Tc-Aptamer-RNA Komplex.............................................................................. 89
5.1.1 Komplexaufbau ................................................................................................ 89
5.1.2 Affinität des Tc-Aptamers zum Liganden Tc .................................................. 89
5.1.3 Aufbau der Tc-Bindetasche.............................................................................. 90
5.2 Spleißregulation in S. cerevisiae durch das Tc-Aptamer ......................................... 54
6 Literaturverzeichnis....................................................................................................... 95
7 Abkürzungsverzeichnis................................................................................................ 101
8 Anhang .......................................................................................................................... 104
8.1 Materialien und Geräte........................................................................................... 104
8.2 Fluoreszenzmessungen an Mutanten von Tc-Aptamer RNA................................. 110
8.3 Fluoreszenz-Messungen mit verschiedenen Tc-Derivaten .................................... 113
8.4 „Double mutant cycle“ Analyse nach Fersht ......................................................... 116
8.5 Integration der Spleißstellen-Aptamer Hybride in das Intron von Aktin............... 118
9 Publikationen................................................................................................................ 120
10 Lebenslauf ................................................................................................................. 121
Zusammenfassung 4
1 Zusammenfassung
Das über in vitro Selektion gefundene Tc-bindende RNA-Aptamer kann zur Tc-abhängigen Regulation der Translation in Hefe eingesetzt werden. Dazu muß das Aptamer in den 5´-UTR eines Reporters inseriert werden. Zugabe von Tc führt dann zur Inhibierung der Translation, indem der Tc-Aptamer Komplex das Ribosom entweder an der Erkennung der cap-Struktur oder am scanning hindert. In dieser Arbeit wurde das Bindungsverhalten von Tc an Aptamer-RNA biochemisch und thermodynamisch charakterisiert. Anhand von analytischen Gelfiltrationsexperimenten konnten die äquimolare Stöchiometrie des Komplexes und die konformationelle Homogenität der Aptamer-RNA gezeigt werden. Der Tc-RNA Komplex wurde durch native PAA-Gelelektrophorese visualisiert. Dazu wurde ausgenutzt, dass die Fluoreszenzintensität von Tc bei Anregung mit 370 nM UV-Licht beim Übergang in eine hydrophobe Umgebung stark ansteigt. Dieses intrinsische Verhalten von Tc ermöglichte es, die Dissoziationskonstante des Komplexes auf 0,73 nM zu bestimmen. Hierbei handelt es sich um eine außergewöhnlich starke Bindung. Vertiefende Analysen durch isothermale Titrations-Kalorimetrie (ITC) zeigen ein ungewöhnliches Bindungsverhalten mit einem starken enthalpischen Beitrag und hoher negativer Entropie. Die hohe Bindungsenthalpie weißt auf die Ausbildung zahlreicher neuer Bindungen hin. Die ungünstige Entropie zeigt eine Versteifung des Komplexes sowie die Fixierung kleinere Moleküle wie Tc und Mg2+. Diese Schaffung von Ordnung überwiegt die bei Bindungsreaktionen normalerweise auftretende Entropieerhöhung, die durch das Freisetzen von H2O bedingt ist. Die Analyse der Punktmutanten A09G, A13U und A50U zeigte einen drastischen Affinitätsverlust. Diese Positionen befinden sich in zwei voneinander unabhängigen Bereichen des Aptamers, welche die Tc-Bindetasche formen. Einer der beiden Bereiche allein ist dazu nicht in der Lage. ITC-Experimente ergaben für A13U und A50U, dass der hohe Affinitätsverlust von einer reduzierten Bindungsenthalpie begleitet wird, was auf den Verlust von mehreren Tc-RNA Kontakten hinweist. Im Falle von A50U zeigt der komplette Verlust des entropischen Terms, dass der Komplex deutlich weniger stark strukturiert ist. Dies weist auf eine „stacking interaction“ dieses Nukleotids mit den benachbarten Purinen hin, die bei der Mutante gestört ist. Der von der Mutation A09G erzeugte entropische Einbruch zeigt, dass hier mehr Bindungsenergie für die RNA-Faltung aufgewendet werden muss. Die Position A09 ist somit für die Vorstrukturierung der RNA von großer Bedeutung. Die Analyse des Bindungsverhaltens von mehreren RNA-Tc-Derivat-Paaren mittels der „double mutant cycle“ Methode ergab, dass die R6β OH-Gruppe von Tc mit dem Adenin an Position 13 in direkten Kontakt steht. Desweiteren bildet auch die R2 Amid-Gruppe am Tc einen direkten Kontakt zum Aptamer aus. In einem zweiten Projekt wurde versucht, das Tc-Aptamer zur Tc-abhängigen Spleißregulation einzusetzten. Dazu wurden 5´-Spleißstelle (SS) und Verzweigungspunkt in das Aptamer inseriert und in das Hefe Aktin-Intron integriert. In vitro Spleißexperimente zeigten jedoch, dass die Maskierung von 5´-SS bzw. Verzweigungspunkt bereits in Abwesenheit von Tc zur völligen Inhibierung der Spleißreaktion führen.
Zusammenfassung 5
Summary The tetracycline (tc)-binding RNA-aptamer was originally discovered by in vitro selection and can be employed for tc-dependent regulation of translation in yeast. Therefor the aptamer has to be inserted into the 5´-UTR of a reporter. Addition of tc leads to inhibition of translation by interference of the tc-aptamer complex with the formation of the 80S ribosom either by prevention of binding of the small ribosomal subunit to the cap-structure or by blocking the scanning process. The mode of tc-binding to the aptamer-RNA has been characterised in a biochemic and thermodynamic way. In analytical gelfiltration experiments the equimolar stoichiometry of the complex and the conformational homogeneity of the aptamer-RNA could be shown. The visualization of the tc-RNA complex was performed by native PAA gelelectrophoresis. For this purpose the intrinsic behaviour of tc to exhibit an increase in fluorescence upon transition into a hydrophobic environement was employed. This allowed the determination of the dissociation constant of 0.73 nM which indicates a remarkably strong binding. In-depht analysis was performd via isothermal titration calorimetry (ITC) and revealed a extraordinary binding behaviour with both a strong enthalpic and a negativ entropic contribution. The strong binding enthalpy points toward the formation of many new bonds. The unfavourable entropic contribution reflects a stiffening of the complex and the fixation of small molecules like Mg2+ and tc. This creation of order outnumbers the entropic increase which is usually caused by the release of H2O during binding reactions. Analysis of the point mutations A09G, A13U and A50U revealed a great loss in affinity. These positions are localized in two separate parts of the aptamer which are responsible for the formation of the tc-binding pocket. One single half is not able to bind tc. ITC experiments showed that the loss of affinity in the case of A13U and A50U is accompanied by a reduced binding enthalpy, indicating the loss of several tc-RNA contacts. In the case of A50U the complete disappearence of the unfavourable entropic term shows that the complex is much less structured. This points toward a stacking interaction of A50 with the adjacent purines, which is disturbed in the A50U mutant. In the case of A09G the entropic term is much more unfavourable than in the wildtype, showing the increased need of binding energy for RNA-folding. Double mutant cycle analysis revealed a direct contact between the tc R6β OH-group and the adenine at position 13. A further direct contact to the aptamer is formed by the R2 amide group of tc. In a second project we tried to utilise the aptamer for tc-dependent regulation of splicing. To do so, 5´-splice site and branchpoint, respectively, were integrated into the aptamer sequence and inserted in the yeast actin intron. In vitro splicing experiments showed that the masking of 5´-splice site or branchpoint cause the complete inhibition of the splicing reaction even in the absence of tc.
Einleitung 6
2 Einleitung
Die ersten biologischen Makromoleküle entstanden bei der Umsetzung von H2O und Gasen,
wie z.B. CH4, CO2, N2 und NH3 durch thermale Energie und Strahlung (Miller, 1953). Aus
biochemischen Bausteinen wie Zucker, Aminosäuren, Purinen und Pyrimidinen,
verschiedenen Nukleotiden, Thioestern und Fettsäuren entwickelten sich unter präbiotischen
Bedingungen erste Polypeptide und –nukleotide. Ein entscheidender Punkt in der Definition
von „Leben“ ist die Vermehrung. Diese Forderung kann bereits von der RNA erfüllt werden.
Viele RNA-Moleküle besitzen katalytische Funktion, womit die Existenz einer urzeitlichen
RNA-Welt, in der das erste Leben aus sich selbst replizierender RNA bestand, durchaus im
Bereich des Möglichen ist. Heute ist bekannt, dass die katalytische Funktion von RNA-
Molekülen auf ihrer hochkomplexen dreidimensionalen Struktur beruht.
2.1 RNA-Faltung
RNA kann vielfältige Sekundär- und Tertiärstrukturen annehmen, was die Grundlage für die
katalytische und regulatorische Funktion vieler RNAs bildet. Obwohl RNA Moleküle nur aus
vier verschiedenen Basen (den Purinen Adenin und Guanin und den Pyrimidinen Cytosin und
Uracil), einer Ribose und einer Phosphatgruppe aufgebaut sind, gibt es eine nahezu unendlich
große strukturelle Vielfalt, die auf intramolekularen Wechselwirkungen beruht. Basen
interagieren mittels Wasserstoffbrücken und Basenstapelungen und ergeben eine große
Bandbreite an Basenpaarungen: Watson-Crick-AU und –GC, das GU-Wobble-Basenpaar und
eine Vielzahl unüblicher Paarungen, z. B. GA, UU und GG Paare. Sie alle tragen zur
strukturellen und funktionellen Vielfalt gefalteter RNA bei.
Bei RNA-Faltungsvorgängen sind die aufgewendeten Energiebeiträge bei der
Sekundärstrukturausbildung höher als bei der Tertiärstrukturausbildung. RNA-Faltung ist also
ein Vorgang, bei dem die Sekundärstruktur die Tertiärstruktur wesentlich beeinflusst. Dies
ermöglicht auch, Algorithmen zur Strukturvorhersage zu entwickeln. Typische
Sekundärstrukturelemente in RNA (Abbildung 2.1) sind doppelsträngige Bereiche, Stamm-
Schleifen, Ausbuchtungen und Verzweigungen (Tinoco et al., 1999).
Eine RNA-Helix ist ein doppelsträngiger Bereich, bestehend aus Watson-Crick-AU, -GC und
GU-Wobble-Basenpaaren (Gesteland, 1999). RNA-Doppelstränge liegen in einer A-Form
vor, weil die 2´-OH-Gruppe der Ribose die Ausbildung einer B-Form aus sterischen Gründen
nicht zulässt. Die Bezeichnungen A-Form und B-Form stammen aus der DNA-Genetik und
Einleitung 7
Fehlpaarung symmetrischer und asymetrischer drei- und vierfach
interner Loop verzweigende Loops
interne Loops Junction (Verzweigung)
Ausbuchtung Ein-Basen
Ausbuchtung
Hairpin Loop (Schleife) Hairpin Stem (Stamm)
Hairpin (Haarnadel) Bulges (Ausbuchtungen)
Duplex Einzelstrang-Bereiche
RNA-Pseudoknoten
Abbildung 2.1
Sekundärstrukturelemente in RNA (Gesteland, 1999).
Einleitung 8
beziehen sich auf die geometrischen Strukturmerkmale von Doppelstrang-DNA bei
verschiedenen Bedingungen. Der Hauptunterschied zwischen A-Form und B-Form liegt im
Winkel zwischen der Helixachse und den Basenpaaren. Bei der A-Form beträgt dieser 71-77°,
bei der Standard-DNA-Form oder der B-Form ca. 90° (Blackburn, 1996; Knippers, 1997).
Haarnadel-Schleifen bilden sich bei der Rückfaltung von palindromischen RNA-Sequenzen
mit sich selbst. Die palindromen RNA-Sequenzen falten sich zu einem Stamm und schließen
so den offenen Loop-Bereich ab. Sie sind weit verbreitet und stehen oft in einem
regulatorischen Kontext. Die Stabilität einer Haarnadel-Schleife ist von der Schleifen-Größe,
der Schleifen-Sequenz und dem abschließenden kanonischen Basenpaar abhängig. Die 5´-
CUUCGG-3´ Tetranukleotid-Schleife (ungepaarte Nukleotide sind unterstrichen) besitzt eine
ausgesprochen hohe thermische Stabilität (Tuerk et al., 1988).
Als Ausbuchtungen werden Schleifen bezeichnet, die nur in einem Strang ein oder mehrere
ungepaarte Nukleotide enthalten. Diese sind oft für Proteinbindung (mit-) verantwortlich und
tragen zur Tertiärstrukturausbildung bei (Bloomfield, 2000).
Interne Schleifen entstehen, wenn die RNA-Helix durch das Fehlen von Basenpaarungen
unterbrochen wird. Je größer die Schleife, desto stärker wird die gefaltete RNA destabilisiert
(Weeks et al., 1993). Ursprünglich wurden alle Bereiche als „interne Schleife“ bezeichnet und
als ungepaart eingestuft, die bei Sekundärstruktur-Vorhersagen nicht-Watson-Crick-
Basenpaare ergaben. Mittlerweile sind viele nicht-Watson-Crick-Basenpaarungen
nachgewiesen.
Kreuzen drei oder mehrere Helices, so entstehen sich mehrfach verzweigende Schleifen oder
Verzweigungen. Der Begriff Schleife ist an dieser Stelle etwas irreführend, da diese
Strukturen auch ohne ungepaarte Nukleotide existieren können (Bloomfield, 2000).
Der RNA-Pseudoknoten ist trotz seines einfachen Aufbaus komplexer gestaltet als die oben
genannten Sekundärstrukturelemente und läßt sich als Übergang zur Tertiärstruktur sehen. Er
ist ein weit verbreitetes und funktionell wichtiges Motiv in viraler, zellulärer, ribosomaler und
nuklearer RNA. Die einfachste Form ist der Haarnadel-Typ. Hier bilden Nukleotide innerhalb
einer Schleife Basenpaarungen mit einer benachbarten, komplementären Region außerhalb
der Stamm-Schleifen Struktur aus. Ein Pseudoknoten besteht immer aus mindestens zwei
Stammregionen und zwei Schleifen (Deiman et al., 1997).
Die genannten Sekundärstruktur-Elemente sind sehr einfach aufgebaut, reichen aber für sich
alleine nicht aus, damit die RNA ihre katalytische Funktion erfüllen kann. Erst aus der
Kombination dieser Elemente entstehen die hochkomplexen und biologisch aktiven
Tertiärstrukturen. Beim Übergang von der Sekundär- zur Tertiärstruktur kommt es zu neuen
Einleitung 9
intramolekularen Verknüpfungen und Wechselwirkungen zwischen oftmals weit voneinander
entfernten doppelsträngigen und hochkomplexen nicht-helicalen Bereichen. Daran sind
Basenstapelungs- und Baseninterkalationseffekte, sowie sekundäre und tertiäre H-
Brückenbindungen beteiligt. Nicht-Watson-Crick-Basenpaarungen können Verwindungen in
der Nukleotidkette erzeugen und damit den Zugriff auf blockierte Positionen freigeben und
auch den Zugang zur großen und kleinen Furche doppelsträngiger RNA modifizieren. Mg2+-
Ionen erzeugen essentielle elektrostatische Wechselwirkungen mit dem Ribose-Phosphat
Rückgrat der RNA und bewirken dadurch eine strukturelle Stabilisierung der RNA.
2.2 RNA-Aptamere
Aptamere sind Nukleinsäuremoleküle, die mit hoher Affinität und Spezifität niedermolekulare
Liganden binden. Diese können Antibiotika, Peptide, Proteine, Metabolite oder organische
Moleküle sein (Burgstaller et al., 1995; Ellington et al., 1990; Geiger et al., 1996; Schurer et
al., 2001; Wallace et al., 1998). Ein Aptamer ist typischerweise eine 15-60 Nukleotide lange
Sequenz, welche eine Bindetasche ausformt, die es ermöglicht, den Liganden fest zu
umschließen.
2.3 Selektion von Aptameren mittels SELEX
Aptamere werden in einem SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential
enrichment) genannten Verfahren gezielt hergestellt, um einen gewünschten Liganden zu
binden (Ellington & Szostak, 1990; Tuerk et al., 1990). Ausgehend von einer Sammlung
randomisierter Doppelstrang-DNA von 1014 – 1015 unterschiedlichen Sequenzen wird durch
in vitro Transkription RNA von der gleichen Variabilität synthetisiert. Anschließend erfolgt
eine gezielte Selektion auf diese Kandidaten mittels Affinitätschromatografie. Die an den
Liganden gebundene RNA wird von der Affinitätschromatografie-Säule eluiert und mittels
reverser Transkription und anschließender PCR-Amplifikation angereichert. Dieser Zyklus
wird 5 – 15 mal wiederholt. Auf diese Weise erhält man hochaffine RNA-Moleküle, welche
beinahe jeden gewünschten Liganden binden. Mittlerweile wird dieses Verfahren
kommerziell und automatisiert angewendet. Die online Datenbank „Aptamer Database“ (Lee
et al., 2004) enthält ca 3500 veröffentlichte Aptamere. Das Ligandenspektrum reicht dabei
von niedermolekularen Effektoren wie ATP (Sassanfar et al., 1993), Tryptohan (Famulok et
al., 1992), Theophyllin (Jenison et al., 1994), Arginin (Geiger et al., 1996) und Farbstoffen
(Werstuck et al., 1998) bis hin zu Makromolekülen, wie Proteinen (Tuerk & Gold, 1990),
Viren (Pan et al., 1995) und Einzellern (Homann et al., 1999).
Einleitung 10
2.4 Spezifität und Affinität von RNA-Aptameren
Künstlich selektionierte RNA-Aptamere können ihren Liganden mit hoher Spezifität und
Affinität binden. Die hohe Spezifität zeigt sich u. a. darin, dass Aptamere zwischen
Effektormolekülen diskriminieren können, die sich nur minimal voneinander unterscheiden.
Das Arginin-bindende RNA-Aptamer z.B. ist hoch enantioselektiv (Geiger et al., 1996). Es
bindet mit einer Gleichgewichts-Dissoziationskonstante von 330 nM das L-Enantiomer 12000
mal besser als D-Arginin.
Das Theophyllin-bindende Aptamer mit einer Länge von 38 Nukleotiden trägt ein 15
Nukleotide großes Bindemotiv, welches von einem Stamm und einer Stamm-Schleifen
Struktur eingerahmt wird (Jenison et al., 1994). Der Ligand Theophyllin wird mit einem KD
von 0,32 µM gebunden. Dem Theophyllin strukturell sehr ähnliche Stoffe zeigen ein bis zu
10000 fach schlechteres Bindungsverhalten. Koffein z.B. unterscheidet sich nur in einer
funktionellen Gruppe (N7- Methyl in Koffein und N7- H in Theophyllin) vom Theophyllin,
wird aber um den Faktor 10000 schlechter gebunden. NMR Untersuchungen am Komplex
ergaben, dass der Ligand Theophyllin in einer Bindetasche sitzt und sowohl über
Wasserstoffbrückenbindungen als auch mittels elektrostatischer Wechselwirkung fixiert wird.
Die Bindung von Theophyllin an das Aptamer verursacht deutliche strukturelle Änderungen
an der RNA. Entweder werden zusätzliche, in der freien RNA nicht vorhandene
Basenpaarungen ausgebildet, oder das Aptamer besitzt in Abwesenheit des Liganden eine
gewisse Dynamik, so dass durch das Theophyllin die für die Komplexbildung günstige
Konformation erst selektioniert wird (Jenison et al., 1994).
Zusätzlich wurde gezeigt, dass Koffein nicht im Kern des Aptamers (in der Theophyllin
Bindetasche) gebunden wird, sondern aufgrund von Basenstapelungseffekten mit der
terminalen Helix wechselwirkt (Zimmermann et al., 2000). Dies demonstriert deutlich die
hohe Ligandspezifität eines RNA-Aptamers.
2.5 Anwendung von Aptameren
Die Fähigkeit einen Liganden hochaffin und –selektiv zu binden, eröffnet für diese
molekularen Werkzeuge viele Anwendungsmöglichkeiten in der Diagnostik, in der Medizin
und der Forschung.
2.5.1 Aptamere als Werkzeuge in der Diagnostik
Aptamere treten immer stärker in Konkurrenz zu den klassischen Antikörpern, da sie einige
herausragende Eigenschaften besitzen, welche sie zu einer echten Alternative machen.
Einleitung 11
Aufgrund ihrer Größe und Oberflächenbeschaffenheit können Aptamere viel mehr Bindungen
mit ihrer Zielsubstanz eingehen als beispielsweise ein kleineres (bio-) chemisches Molekül.
Viele Aptamere erreichen KD Werte, die denen der Antigen-bindenden Fragmente von
Antikörpern ähneln (Gold et al., 1995).
In einem ultrasensitiven Detektionssystem für das Proteinhomodimer PDGF-BB wurden zwei
DNA-Aptamere eingesetzt, welche einen 5´- bzw. einen 3´-Überhang aus je 40 Nukleotiden
tragen (Fredriksson et al., 2002). Wenn diese Aptamere an ihr Zielprotein binden, nähern sich
die freien Nukleotidüberhänge einander an und können nach Anlagerung eines
Verbindungsoligonukleotids miteinander ligiert werden. Dieser Verbund kann anschließend
quantifiziert werden, wodurch der Nachweis von zeptomolaren Proteinmengen möglich ist.
Zum Methodenspektrum der in vivo Diagnostik zählen auch bildgebende Verfahren, bei
denen Radionuklid beladene Antikörper z.B. gegen Krebszellen eingesetzt werden. Während
die Antikörper mehrere Tage benötigen, um ein brauchbares Verhältnis von Signal zu
Rauschen zu erzeugen, wird dies von Tumor spezifischen Aptameren innerhalb mehrerer
Stunden erreicht (Hicke et al., 2000).
2.5.2 Aptamere als Bestandteil von hochempfindlichen Biosensoren für Toxine
Aptamere sind auch für den Einsatz in hochempfindlichen Biosensoren geeignet, da sie in der
Lage sind, eine große Bandbreite von Zielmolekülen, wie Proteine, Metabolite, Aminosäuren
und Nukleotide spezifisch zu erkennen. Im Gegensatz zu auf Antikörper basierenden
Biosensoren können Aptamere auch schwer zugängliche Moleküle wie Gifte oder nicht
immunogene Stoffe binden und somit nachweisen. Ein weiterer Vorteil von Aptameren ist die
Tatsache, dass ein bereits selektioniertes Aptamer beliebig oft und in gleich bleibender
Qualität neu synthetisiert werden kann. Dies ist bei der Herstellung von Antikörpern nicht
immer möglich. Mittlerweile existieren auf Aptameren basierende Biosensoren für Stoffe wie
das Choleratoxin und das Entereotoxin B aus Staphylokokken (Bruno et al., 2002).
2.5.3 Aptamere in der medizinisch-therapeutischen Anwendung
Ein Ansatz zur Bekämpfung viraler Infektionen ist die Inhibierung der viralen Vermehrung.
Da ein Virus zur Selbstreplikation auf den proteinbiochemischen Apparat des Wirtes
angewiesen ist, kann diese durch die gezielte Hemmung von essentiellen Protein-RNA
Interaktionen unterdrückt werden. Viele Viren, darunter auch das HI-Virus, rekrutieren über
die TAR (Trans-Acting Responsive element) und RRE (Rev Responsive Element) RNA-
Sequenzen die für die virale Vermehrung essentiellen Proteine Tat und Rev. Zur
Unterdrückung der viralen Replikation wurde erfolgreich Aptamer-RNA eingesetzt, die mit
Einleitung 12
der viralen TAR-RNA um den Liganden Tat konkurriert und dieser somit nicht rekrutiert
werden kann. Auf diese Weise wird die Transkription von HIV-RNA verhindert und die
Vermehrung des Virus reduziert (Kohn et al., 1999).
In einem gentherapeutischen Ansatz zur Bekämpfung von Krebs und Infektionskrankheiten
wie HIV wird mit auf Ribozymen basierenden Aptameren gearbeitet. In klinischen Studien
der Phasen I und II werden trans-aktive Aptamerribozyme eingesetzt, welche pathogene
mRNA erkennen und durch Restriktion zerstören. In klinischen Studien wurden diese RNA-
Medikamente den Patienten direkt als synthetisches Ribozym verabreicht. Alternativ wurden
retrovirale Vektoren verwendet, um entsprechende Expressionskassetten für anti-HIV
Aptamerribozyme ex vivo in Lymphozyten oder an der Blutbildung beteiligten Zellen zu
integrieren. Diese transduzierten Zellen wurden den Patienten anschließend reinjiziert. Diese
Methode wird von den Patienten gut toleriert und die veränderten Zellen sind etwa ein Jahr
lang im Körper nachweisbar (Amado et al., 1999; Bauer et al., 1997; Wong-Staal et al.,
1998).
Unter Umständen kann es sinnvoll sein, eine defekte mRNA zu reparieren. Die ersten Ansätze
dazu fokussierten auf trans spleissende Gruppe I Ribozyme. Das Ribozym lagert sich mit der
Aptamerdomäne an die mutierte/defekte mRNA an und positioniert eine korrekte
Exonsequenz an der Mutation. Durch die autokatalytisch ablaufende in trans Spleissreaktion
wird das defekte mRNA Fragment ersetzt. Damit konnten in Bakterien und Säugetierzellen
erfolgreich defekte lacZ Transkripte repariert werden (Jones et al., 1996; Sullenger et al.,
1994).
2.5.4 Chemische Modifikation von Aptamer-RNA zum Schutz vor Degradation
Da die Halbwertszeit von RNA im Blut nur wenige Sekunden beträgt, wurde mit Hilfe von
chemischen Modifikationen die Resistenz von RNA gegenüber Nukleasen erhöht. 5´-
Phosphothioatnukleotide bilden die erste Generation chemisch modifizierter Nukleotide. Sie
erhöhen die Halbwertszeit von RNA gegen Nukleasen im Serum auf über 48 h und sind nicht
giftig. Eine Weiterentwicklung stellt die 2´-Ortho-Alkyl-Phosphothioat RNA dar, die sehr
erfolgreich als Grundstruktur von Antisense RNA eingesetzt wird. Weitere Modifikationen,
die das RNA-Rückgrat betreffen, sind die Peptid-Nukleinsäure (Peptide Nucleic Acid: PNA)
von Peter Nielsen, die 2´-Ortho-Methoxyeythyl RNA, die Morpholino Nukleinsäure (Gene
Tools Inc.) und die geschlossenen Nukleinsäuren (Locked Nucleic Acid: LNA). Im Falle von
PNA sind die Nukleobasen über ein δ-Aminosäurenrückgrat verknüpft, bei den Morpholino
Nukleinsäuren besteht das RNA Rückgrat aus Phosphoramiden. Bei den LNA Nukleinsäuren
wird die Ribose über eine 2'-O-4'-C Methylbrücke in der C3-Endo Form arretiert, wodurch
Einleitung 13
sich neben der besseren Stabilität eine erhöhte Bereitschaft zur Hybridisierung mit
komplementärer RNA ergibt. Alle Modifikationen vermitteln Resistenz gegen endogene
Enzyme wie RNAse H und eignen sich daher zur Herstellung von Werkzeugverbindungen aus
Nukleinsäuren. Weitere bekannte Substituenten für die 2´-OH Gruppe in der Ribose sind z.B.
die 2´-Amino und 2´-Fluoro Gruppen, sowie das 2´-C-Allyl (Beigelman et al., 1995;
Darfeuille et al., 2002; King, 2002; Pieken et al., 1991). Befindet sich am 3´-Terminus der
RNA ein 3´-3´verbundenes Nukleotid, so erhöht dies ebenfalls die Halbwertsdauer von RNA
im Blut (Beigelman et al., 1995).
2.6 Genexpression in Eukaryoten
Die in der DNA-Sequenz gespeicherten Informationen zur Synthese von Proteinen werden
von einem lebenden Organismus zu unterschiedlichen Zeiten in verschiedenen Mengen
benötigt. Bei Eukaryoten verläuft die Genexpression in zwei Stufen ab, die nicht nur zeitlich
sondern auch räumlich getrennt sind. Die Transkription der RNA findet im Zellkern statt,
wohingegen die Translationsmaschinerie für die Proteinbiosynthese im Zytoplasma lokalisiert
ist. Transkription und Translation ist jedoch gemeinsam, dass sie an unterschiedlichen
Punkten im Ablauf regulierbar sind.
2.6.1 Transkription und Prozessierung der prä-mRNA
Die Kontrolle über die Expression eines bestimmten Genabschnitts beginnt bereits auf DNA-
Ebene. Nur wenn der entsprechende chromosomale DNA-Abschnitt für die Transkriptions-
maschinerie zugänglich, das heisst entpackt ist, kann über kontrollierte Initiation der
Transkription die RNA-Synthese beginnen. Der unmittelbare Bereich um die Startstelle der
Transkription wird als Promotor bezeichnet und ist durch die TATA-Box determiniert, die
sich etwa 30 Nukleotide stromaufwärts befindet. Das RNA-Polymerase II (RNAP II)
Holoenzym besteht aus mindestens 12 Untereinheiten plus den generellen Transkriptions-
faktoren. Für eine erfolgreiche Transkription ist es essentiell, dass das Holoenzym an den
Promotor herangeführt und stabil gebunden wird. Dieser Prozess wird durch die
Wechselwirkung mit dem TATA-Box bindenden Protein und dem Transkriptionsfaktor (TF)
TFIIB ermöglicht. Eukaryotische Gene können der Kontrolle von mehreren distalen und
proximalen regulatorischen Elementen wie den „enhancern“ und „silencern“ unterliegen
welche letztendlich die Menge an neu synthetisierter RNA regulieren. An diese Elemente
binden die sogenannten trans-Faktoren, welche die Prozessifität der RNAP II und damit auch
die Transkription Zelltyp- und Zellzyklus spezifisch regulieren. Intra- und extrazelluläre
Signale werden über Signalkaskaden weitergeleitet und steuern auf diese Weise die Aktivität
Einleitung 14
der TF. Die Beendigung der Transkription wird durch Terminationsregionen vermittelt. Diese
befinden sich häufig bis zu 1000 Nukleotide unterhalb der Erkennungsregion für die
Polyadenylierung von neusynthetisierter RNA.
Noch während der Transkription beginnt die Prozessierung der RNA (Proudfoot et al., 2002).
An das 5´-Ende wird eine 7-Methyl-Guanosin Kappe angeheftet, die zusätzlich durch
Methylierung modifiziert werden kann. Die unterschiedlichen 7-Methyl-Guanosin Kappen
spielen beim Spleissen, beim Export aus dem Zellkern und bei der Translation eine wichtige
Rolle und schützen die RNA vor Abbau (Sachs et al., 1997). Durch den Spleissvorgang
werden die nichtkodierenden Introns entfernt. An diesem nukleären Prozess sind Proteine und
kleine RNA-Moleküle beteiligt, die die hochkonservierten Sequenzen (5´-Spleissstelle,
Verzweigungspunkt und 3´-Spleissstelle) an den Exon-Intron Grenzen erkennen, spalten und
die Exongrenzen miteinander neu verbinden. Das 3´-Ende der RNA wird bei Eukaryoten
ebenfalls prozessiert. Vor der Polyadenylierung des 3´-Endes wird durch eine Nuklease ein
geeignetes 3´-Ende erzeugt. Durch das Enzym Poly(A)-Polymerase wird dann unter ATP-
Verbrauch eine ca. 100 – 200 Nukleotide lange Polyadenylsäure angeheftet, wodurch die
Stabilität der RNA erhöht wird. Nachdem die fertige mRNA aus dem Zellkern ausgeschleust
wurde, steht sie zur Translation am Ribosom zur Verfügung.
2.6.2 Aufbau der eukaryotischen mRNA
Nach Prozessierung der prä-mRNA und deren Ausschleusung aus dem Zellkern steht die reife
mRNA (Abbildung 2.2) zur Translation am Ribosom bereit. Die reife mRNA wird von einer
5´-m7G-Kappe und dem Poly(A)-Schwanz begrenzt. Die nichttranslatierten Bereiche
stromauf- und –abwärts des offenen Leserahmens (ORF) werden als 5´- und 3´-
untranslatierte Region (UTR) bezeichnet. Diese Regionen spielen eine wichtige Rolle bei der
5´- m7G AUG STOP Poly(A)
5´- UTR offener Leserahmen 3´-UTR
Abbildung 2.2
7-Methyl-Guanosin-Kappe (m7G-cap) am 5´-Ende und Poly(A)-Sequenz am 3´-Ende begrenzen die eukaryotische mRNA. In der 5´ und 3´untranslatierten Region (UTR) befinden sich nichtkodierende Sequenzen. Der offene Leserahmen (ORF) enthält die Protein kodierende Information und beginnt mit dem Startkodon AUG und endet an einem STOP Kodon.
Einleitung 15
Translation und deren Regulation, da sie Bindestellen für Regulatorproteine, wie das HuR-
Protein zur Regulation der Translation der Typ I Insulin ähnlichen Wachstumsfaktor Rezeptor
(IGF-IR) mRNA enthalten können (Meng et al., 2005).
In den UTRs können auch destabilisierende Elemente wie die AUUUA Sequenz, die die
Lebensdauer der mRNA beeinflussen, lokalisiert sein (Aharon et al., 1993). Die
Selenocystein Insertionssequenz (SECIS) z.B. ist bei Eukaryoten im 3´-UTR lokalisiert. Sie
ermöglicht die Translation der UGA Kodons im Leseraster eines Selenoproteins als
Selenocystein.
2.6.3 Initiation der Translation von eukaryotischer mRNA
Initiation, Elongation und Termination sind die drei Hauptschritte der Translation. Für
gewöhnlich ist die Gesamtsyntheserate eines Proteins von der Initiation der Translation
abhängig (Marcus, 1970). Meistens erfolgt die Initiation an der 5´-m7G-Kappe. Die 40S-
Untereinheit des Ribosoms verbindet sich mit den eukaryotischen Initiationsfaktoren (eIF) 3
und 4C und bildet den 43S-Komplex. Weitere eIF bereiten die mRNA auf die Bindung des
43S-Komplexes an die 5´-m7G-Kappe vor. Dieser sucht anschließend die mRNA in 5´-3´
Richtung nach dem ersten AUG-Kodon ab (scanning). Das initiale AUG wird vom 43S-
Ribosom mit Hilfe des ternären Komplexes (eIF2, GTP, Methionin und Methionin-tRNA)
durch Basenpaarung erkannt, worauf sich der ribosomale 48S-Komplex ausbildet. Die
Faktoren eIF5 und eIF5B bewirken die Hydrolyse von GTP, worauf der eIF2-GDP Komplex
und alle anderen gebundenen Faktoren das 48S-Ribosom verlassen. Die 60S-Untereinheit
kann sich nun mit dem 48S-Komplex zum vollständigen 80S-Ribosom verbinden und die
Synthese der Peptidkette beginnt.
2.6.4 Alternative Möglichkeiten zur Initiation der Translation
Bei Eukaryoten beginnt die Translation für gewöhnlich am ersten AUG Start-Kodon. Wenn
sich jedoch das erste AUG-Kodon in einem suboptimalen Kontext befindet, kann das
Ribosom auch an einem alternativen Start-Kodon mit der Translation beginnen. Dieser
Vorgang wird als lückenhafte Abtastung (leaky scanning) bezeichnet (Kozak, 1999).
Ein weiterer alternativer Mechanismus ist die Reinitiation der Translation. Wenn dem
initialen Start-Kodon nach wenigen Nukleotiden ein Stop-Kodon folgt, kann das
posttranslationale Ribosom die mRNA weiter in 3´-Richtung abtasten, bis es an einem
nachfolgenden Start-Kodon reinitiiern kann. Zuvor muss das abtastende Ribosom jedoch
wieder von eIF2 mit Met-tRNA beladen werden. Die Reinitiationsrate steigt mit der
Einleitung 16
Entfernung zum 5´-ORF (uORF: upstream ORF) und nimmt mit zunehmender Größe des
uORFS ab (Kozak, 1987; Kozak, 2001).
Nach Termination der Translation kann das Ribosom große Teile der mRNA überspringen
und an einem nachfolgenden AUG-Kodon neu initiieren. Dieses Überpringen (engl. shunting)
von Sequenzbereichen auf der mRNA wurde für die Translation verschiedener viraler RNA
wie z.B. von Cauliflower Mosaic Virus RNA beschrieben (Futterer et al., 1993).
Interne Ribosomen Eintrittsstellen (IRES) ermöglichen dem Ribosom, cap-unabhängig mit
der Translation zu beginnen. Die IRES Sequenzen sind 300 bis 800 Nukleotide lang und
wurden im 5´-UTR von viraler RNA gefunden. Es existieren unterschiedliche Typen von
IRES-Elementen, die sich in ihrem Bedarf an Initiationsfaktoren unterscheiden. Das Hepatitis
A Virus IRES benötigt zur internen Initiation intaktes eIF4G und eIF4E, wohingegen das in
Cricket Paralysis Virus RNA vorkommende IRES zur Initiation der Translation keine
weiteren Faktoren oder Met-tRNA benötigt (Borman et al., 2001; Wilson et al., 2000).
2.7 Regulation der Translation
Von etwa 10% aller eukaryotischen Gene wird die Expression translationell reguliert
(Mathews et al., 2000). Die Regulation der Translation erlaubt es dem Organismus, sehr
schnell auf äußere Einflüsse zu reagieren und die Proteinexpression anzupassen. Dies
geschieht bei Eukaryoten fast ausschließlich durch Regulation des Initiationsereignisses. Die
benötigten Initiationsfaktoren können durch gezielte Phosphorylierung inaktiviert werden,
wodurch die Proteinbiosynthese zum Erliegen kommt. Dieser Weg der Regulation benötigt
jedoch das Mitwirken von ein oder mehreren Proteinfaktoren und ist daher für konditionelle
Regulationssysteme weniger geeignet.
2.7.1 Regulation der Translation durch Riboswitche
Riboswitche sind komplex gefaltete RNA-Domänen, die sich im nicht kodierenden Bereich
von zahlreichen mRNAs befinden. Sie dienen als Rezeptor für Metabolite und kontrollieren
die Genexpression. Die meisten Riboswitche bestehen aus einer Aptamer-Domäne, die für die
Liganden-Bindung verantwortlich ist und aus einer Expressionsplattform, anhand derer die
Expression des Strukturgens kontrolliert wird (Ellington & Szostak, 1990; Lee et al., 2004).
Die Bindung des jeweiligen Liganden verursacht eine strukturelle Veränderung am
Riboswitch, welche letztendlich die Expression des Strukturgens beeinflusst. Die am
häufigsten durch Riboswitche kontrollierten Gene kodieren für Proteine, welche an der
Biosynthese oder dem Transport des jeweiligen Metaboliten beteiligt sind, der von der
Aptamer-Domäne gebunden wird (Mandal et al., 2004a). Meistens arbeitet der Riboswitch als
Einleitung 17
eine Art Rückkopplungsinhibitor, da die Bindung des Metaboliten an den Riboswitch die
Expression des Genproduktes reprimiert, welches zur Herstellung des Metaboliten benötigt
wird. In den meisten Fällen wird die Repression entweder durch Termination der
Transkription oder durch Unterbindung der Translations-Initiation erreicht (Gusarov et al.,
1999; Nudler et al., 2003; Winkler et al., 2002a; Winkler et al., 2002b). Abbildung 2.3 zeigt
die beiden beschriebenen Möglichkeiten.
Abbildung 2.3
Mechanismen der Genkontrolle durch Riboswitche. Kontrolle der Transkription durch Bindung eines Metaboliten worauf es zur Umfaltung der Aptamer-Domäne und damit zur Ausbildung einer Terminator-Struktur kommt. Im Gegensatz dazu erfolgt die Regulation der Translation durch eine Metabolit-induzierte strukturelle Änderung, aufgrund deren die Ribosomenbindestelle (RBS) maskiert wird (Tucker et al., 2005).
In Prokaryoten wurden zahlreiche Riboswitche gefunden. Das ribD Gen in Bacillus subtilis
steht unter Kontrolle des RFN Elements, welches einen FMN-abhängigen Riboswitch darstellt
(Gelfand et al., 1999; Vitreschak et al., 2002). In Abwesenheit von FMN bildet sich der
Antiterminator aus und die Transkription von ribD findet statt. Kommt es aber zur
Komplexbildung aus Riboswitch und FMN, so wird eine Terminatorstruktur ausgebildet,
worauf die Transkription von ribD abbricht (Winkler et al., 2003). In Escherichia coli ist der
TPP-Riboswitch des thiM Gens dafür verantworlich, dass es in Anwesenheit des Liganden zu
einer alternativen Basenpaarung kommt, wodurch die Shine-Dalgarno Sequenz blockiert wird
(Winkler et al., 2002a).
Eine sehr seltene Form von Riboswitchen sind die sogenannten „An“-Schalter. Der erste
beschriebene Riboswitch dieser Art ist ein Adenin-bindender Riboswitch und strukturell dem
Guanin-bindenden Riboswitch sehr ähnlich (Johansen et al., 2003; Mandal et al., 2003;
Mandal et al., 2004b). In Abwesenheit des Liganden Adenin wird die Genexpression durch
Ausbildung einer Terminator-Struktur unterbunden. Erst wenn Adenin an das Aptamer
Einleitung 18
gebunden hat und die Konformationsänderung des Riboswitches die Ausbildung des
Antiterminatores ermöglicht, kommt es zur Transkription einer vollständigen mRNA (Mandal
und Breaker, 2004).
Ein weiterer Riboswitch, der als „An“ -Schalter fungiert, ist der Glycin-abhängige Riboswitch
(Mandal et al., 2004c). Das Bemerkenswerte an diesem Riboswitch ist zum einen sein Aufbau
aus zwei in Tandem geschalteten Aptmer-Domänen, die jeweils ein Molekül Ligand binden.
Zum anderen erfolgt die Glycin-Bindung durch die zwei Aptamere kooperativ. Die Bindung
von Glycin an die eine Aptamer-Domäne erhöht die Affinität der zweiten Bindestelle um den
Faktor 1000. Glycin-Riboswitche reagieren somit hochsensitiv und sehr schnell auf kleinste
Konzentrationsänderungen des Liganden.
Bei der Familie der Glucosamin-6-Phosphat (GlcN6p) Riboswitche erfolgt die Kontrolle von
glmS durch induzierte autokatalytische Hydrolyse des Transkripts in Anwesenheit des
Liganden GlcN6p. Es wird vermutet, dass die Verkürzung des Transkripts aufgrund der
Autohydrolyse zu einer beschleunigten Degradation der mRNA durch RNasen führt (Tucker
& Breaker, 2005).
2.7.2 Regulation der Translation durch konditionelle Systeme
Um den Einfluss eines Genprodukts auf einen lebenden Organsismus zu untersuchen, war
man anfangs auf die Konstruktion einer Deletionsmutante (knock out Mutante) angewiesen.
Dies ist ein langwieriger und nicht immer erfolgreicher Prozess, insbesondere wenn die
Gendeletion einen lethalen Phänotyp verursacht. Andererseits kann die konstitutive
Expression eines zytotoxischen Proteins den Organismus ebenfalls schädigen. Zusätzlich ist
bei diploiden Organismen die Identifizierung eines rezessiven Phänotyps oft nur in der F2
Generation möglich. Daher wurden Methoden entwickelt, mit deren Hilfe es möglich ist, die
Expression eines Zielgens kontrolliert zu steuern.
Regulation durch Antisense RNA
Antisense RNA (asRNA) ist eine Möglichkeit zur Regulation der Proteinbiosynthese. Sie ist
einzelsträngig und bindet an die komplementäre Sequenz auf der Ziel mRNA. Der
entstandene doppelsträngige Bereich verhindert ein Ablesen durch das Ribosom und bewirkt
den Abbau der mRNA durch den RNA Interferenz (RNAi) Mechanismus. Bei der „Flavr
Savr“ Tomate wurde ein künstliches Gen eingebracht, welches bei Transkription asRNA
liefert, wodurch die Expression von am Reifungsprozess beteiligter Gene reduziert wird.
Einleitung 19
Regulation durch RNA Interferenz
RNAi ist ebenfalls ein Mechanismus, der zur Unterdrückung der Translation führt. RNAi
wurde erstmals in Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998) entdeckt und findet seither weit
verbreitet Anwendung bei der gezielten Inhibierung der Genexpression (Plasterk, 2002). Die
21 bis 23 Nukleotid langen RNAi Moleküle binden an die komplementären Bereiche der
mRNA. Der Proteinkomplex RISC (RNAi induced silencing complex) erkennt diese
doppelsträngigen Regionen und baut die RNA ab. Somit steht keine oder nur noch sehr wenig
mRNA zur Translation zur Verfügung (Elbashir et al., 2001; Fire et al., 1998; Tuschl, 2001).
Regulation durch Ribozyme/Aptazyme
Ribozyme oder RNA Enzyme haben katalytische Funktion. Sie sind in der Lage, entweder
sich selbst oder eine andere RNA zu spalten. Die Kombination eines Ribozyms mit einem
Aptamer ergibt ein sogenanntes Aptazym, welches durch die Bindung eines Liganden in den
aktiven oder inaktiven Zustand versetzt wird (Robertson et al., 1999; Silverman, 2003). Ein
Flavin Mononukleotid (FMN) sensitives Ribozym wurde aus der Verbindung der FMN-
Aptamerdomäne und dem Hammerhead-Ribozym durch ein Kommunikationsmodul erzeugt
(Soukup et al., 1999). Je nachdem welches Kommunikationsmodul gewählt wurde, kommt es
bei Bindung des Liganden zur Aktivierung oder Deaktivierung der Ribozymdomäne. Befindet
sich ein solches Aptazym auf der mRNA, so kann diese jederzeit durch Zugabe oder
Reduzierung des Liganden zerstört und damit die Translation beendet werden. Diese System
findet jedoch momentan nur in vitro Anwendung.
Einleitung 20
Regulation durch Aptamere / künstliche Riboswitche
In Saccharomyces cerevisiae wurde ein System zur post-transkriptionellen Genregulation
entwickelt, das auf dem Tetracyclin (Tc) -bindenden RNA-Aptamer cb32 (Abbildung 2.4)
basiert (Berens et al., 2001; Hanson et al., 2003; Suess et al., 2003).
UAGACC
CGC
GCG
U
AA
A A
AU
C
C
UU
UC
UU
A
CC
CCA
A
A
GGG
GGCC
CGG
A AA
A
AA
C C
A CCC
G
G
UU
A
A
691
10
40
50
60
20
30
UG C
A G GG UB1-2 L3
Abbildung 2.4
Sekundärstruktur des Tc-bindenden RNA Aptamers. Die Nummerierung beginnt bei 0 um die ursprüngliche Zählweise der Nukleotide beizubehalten, da ein zusätzliches GC Basenpaar zur in vitro Transkription eingefügt wurde.
Das Aptamer wurde in den 5´-UTR des Reportergens GFP (Grün fluoreszierendes Protein)
oder Luciferase inseriert und die Fluoreszenz in An- und Abwesenheit des Liganden
Tetracyclin gemessen. Abbildung 2.5 zeigt ein Modell des Regulationssystems (Berens et al.,
2001; Hanson et al., 2003; Suess et al., 2003). Ausführliche Untersuchungen ergaben
positions- und strukturabhängige Änderungen der Fluoreszenz und somit der regulatorischen
Eigenschaften des Tc-Aptamers. Erfolgt die Insertion cap-proximal, kommt es zu einer
Inhibierung der Bindung des 43S-Präinitiationskomplexes an die cap-Struktur. Erfolgt die
Aptamer Insertion cap-distal nahe dem Startkodon, so wird der 43S-Präinitiationskomplex
am „scanning“ gehindert und das 80S Ribosom kann sich nicht ausbilden, was ebenfalls zur
Inhibierung der Translation führt. Im Falle der cap-proximalen Insertion wird eine 3-fache
und im Falle der cap-distalen Insertion eine 9-fache Repression des Reportergens erreicht. In
HeLa-Zellen konnte dieses System nicht zur Anwendung gebracht werden. Dies liegt
vermutlich daran, dass es bei der Translationsinitiation bei höheren und niedrigeren
Eukaryoten Unterschiede gibt. Bei in vitro Translationsversuchen mit Zellextrakt aus
Weizenkeimen wurde eine 3-fache Repression erreicht, womit bewiesen war, dass es
prinzipiell auch in höheren Eukaryoten funktioniert.
Einleitung 21
C)
B)
A)
Abbildung 2.5
System zur konditionalen Genexpression in Hefe basierend auf dem Tc-bindenden RNA Aptamer. Schematische Ansicht der mRNA des GFP-Gens. Der 5’-UTR ist durch eine schwarze Linie dargestellt, die „Cap site“ als schwarzer Kreis, die Fünfecke stellen den Liganden Tc dar, und das graue Rechteck den codierenden Bereich des GFP-Gens. (A) zeigt die Translation in Abwesenheit des Liganden. (B) zeigt, wie die Bindung des Liganden an ein cap-proximales Aptamer die Bindung der 43S-Ribosomen-Untereinheit verhindert. (C) zeigt, wie die Bindung des Liganden an ein cap-distales Aptamer das Scanning des Präinitiationskomplexes unterbricht.
2.8 Tetracyclin
Tetracyclin (Abbildung 2.6 (A)) ist der namensgebende Vertreter einer Antibiotika Familie,
welche seit den 1940er Jahren gegen ein breites Spektrum von Gram-negativen und Gram-
positiven Bakterien eingesetzt wird (Chopra et al., 2001; Chopra, 2002). Es ist ein flaches,
polycyclisches Molekül und ist aus vier C6-Ringen aufgebaut. Die antibiotische Funktion
beruht auf der Hemmung der Proteinbiosynthese.
Tc bindet an die ribosomale RNA der kleinen Untereinheit des Ribosoms.
Kristallisationsstudien zeigen mehrere Bindestellen für Tc an der 30S Untereinheit. Die
primäre Bindestelle (Abbildung 2.6 (B)) liegt zwischen Helix H31 und H34 der 16S rRNA,
nahe an der Aminoacyl-tRNA–Bindestelle (A-Site) des Ribosoms (Brodersen et al., 2000;
Pioletti et al., 2001). In Gegenwart von Tc erfolgt keine Stabilisierung der Bindung von
Einleitung 22
Aminoacyl-tRNA in der A-Site der 30S Untereinheit, womit die Proteinbiosynthese gehemmt
wird. Bisher sind sechs Tc-Bindestellen (Tet-1 bis Tet-6) bekannt, von denen sich fünf auf der
16S rRNA befinden. Alle Bindestellen sind strukturell unterschiedlich. Es ist bis heute nicht
bekannt, welche und wie viele Bindestellen für die Vermittlung der antibiotischen Funktion
von Tc benötigt werden und welche auf unspezifischer Bindung beruhen (Pioletti et al.,
2001). Untersuchungen von ribosomalen Schutzproteinen, welche Tc-Resistenz vermitteln,
legen jedoch nahe, dass zumindest die primäre Bindestelle Tet-1 eine wesentliche Rolle spielt
(Connell et al., 2003). Dies steht in Einklang mit Bindestudien, nach denen die Equilibrium-
Bindekonstante KD für Tet-1 im Bereich 1-20 µM liegt. Für die niedrigaffinen Bindestellen
wurden KD Werte im hohen µM bis hin zum niedrigen mM Bereich beschrieben (Nelson et
al., 2001).
OH O OH O
OH
OH
H3C OH
O
NH2
C
NH3C CH3A B
Abbildung 2.6
(A) Struktur von Tetracyclin; (B) Mögliche Wechselwirkungen zwischen Tc und der Tet-1 Bindestelle an der 16S RNA (Brodersen et al., 2000). Die Positionen der mit Tc wechselwirkenden 16S RNA Nukleotide sind angegeben. (C) Wechselwirkung von [tc-Mg]+ mit TetR(D); Die mit Tc wechselwirkenden Aminosäuren sind im Einbuchstabenkode und ihrer Aminosäureposition angegeben. Die Kontakte zu den einzelnen TetR(D) Monomeren sind in blau und grün dargestellt. Mg2+ ist als gelbe und die koordinierten Wassermoleküle als rote Kugeln dargestellt. Hydrophobe Wechselwirkungen sind als gestrichelte Balken, hydrophile Wechselwirkungen als gestrichelte Linien dargestellt (Henssler et al., 2004).
Die Tc-Bindetasche Tet-1 in der 16S RNA besteht aus einer irregulären kleinen Furche in
Helix 34 die von den Nukleotiden 1196-1200:1053-1056 gebildet wird, und den Nukleotiden
Einleitung 23
964-967 aus der Stammschleife von H31. Der Großteil der Kontakte besteht aus
Wasserstoffbrücken zwischen dem Ribose-Phosphat Rückgrat der RNA in H34 und der
hydrophilen Seite von Tc. Eine zusätzliche Wasserstoffbrücke besteht zwischen dem O2P von
Nukleotid G966 in H31. Die Bindetasche wird zur einen Seite durch die Basen an Position
1054 und 1196 begrenzt, welche aus der doppelhelikalen Strucktur von H34 ausgebeult sind
und elektrostische Wechselwirkungen mit Tc eingehen. Weitere wichtige Kontakte existieren
zwischen dem Mg2+ an der hydrophilen Seite von Tc und dem Saueratoff in der
Phosphatgruppe der Nukleotide G1197 und G1198.
An der Kristallstruktur von Tc im Komplex mit Tetracyclinrepressor der Klasse D (TetR(D))
ist ebenfalls zu sehen, dass Tc aus einer hydrophoben und einer hydrophilen Region
aufgebaut ist (Abbildung 2.6 (C)). Die hydrophoben Wechselwirkungen mit TetR(D) finden
hauptsächlich an den funktionellen Gruppen der Ringe C und D von Tc statt. Am gedrehten
Ring A kommt es überwiegend zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu TetR(D).
Zusätzliche hydrophile Kontakte werden direkt über das am Tc koordinierte Mg2+ und
indirekt über drei an diesem Mg2+ fixierte Wassermoleküle erzeugt. Das Mg2+ ist an der
selben Stelle lokalisiert wie im Komplex mit der Tet-1 Bindestelle der 16S RNA.
2.9 Zielstellung der Arbeit
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Bindungsverhalten der Aptamer-RNA an Tc zu
charakterisieren. Dazu sollte die Aptamer-RNA durch in vitro Transkription synthetisiert und
aufgereinigt werden und die Komplexbildung thermodynamisch und biochemisch untersucht
werden. Desweiteren sollte versucht werden, wichtige Kontakte zwischen Tc und Aptamer-
RNA zu identifizieren, um die Tc-Bindetasche näher beschreiben zu können. Dazu wurde der
Einfluss von Punktmutationen im Aptamer untersucht. Die Substratspezifität des Tc-
Aptamers wurde durch die Analyse des Bindungsverhaltens an Tc-Derivate getestet.
Der zweite Teilaspekt der Arbeit beinhaltete die gezielte Beeinflussung des Spleißprozesses.
Es sollte versucht werden, durch Maskierung von 5´-Spleißstelle oder Verzweigungspunkt
durch das Tc-Aptamer eine Tc-abhängige Regulation zu erreichen. Dazu wurde ein Protokoll
für das in vitro Spleißen mit Hilfe eines Hefe-Zellextrakts etabliert und Spleißexperimente
durchgeführt.
Material und Methoden 24
3 Material und Methoden
Materialien: Chemikalien, Hilfsmittel, Geräte, Apparaturen, kommerziell erhältliche
Systeme und Programme sind im Anhang aufgeführt.
3.1 Bakterien- und Hefestämme, Plasmide und Oligonukleotide
3.1.1 Bakterien- und Hefestämme
Tabelle 3.1 Bakterien- und Hefestämme
Stamm relevanter Genotyp Referenz
Escherichia coli
DH5α recA1 endA1 gyrA96 thi hsdR17rK- mK+
relA1 supE44 Φ80∆lacZ∆M15 ∆(lacZYA-
argF)U169
(Sambrook et al., 1989)
BL21(DE3) F- lon ompT rBmB hsdS gal (cIts857 ind1 Sam7
nin5 lacUV5-T7 gene1)
(Sambrook et al., 1989)
Saccharomyces cerevisiae
RS453 MATa ADE2-1 TRP1-1 CAN1-100 LEU2-3
Leu2-112 HIS3-1 URA 3-52
(Sauer et al., 1993)
BJ2168 MATa LEU 2 TRP1 URA3-52 PRB1-1122
PEP4-3 PRCL-407 GAL2
(Ohashi et al., 1994)
Material und Methoden 25
3.1.2 Plasmide
Tabelle 3.2 Plasmide
Plasmid Marker Referenz
pAE1219 AmpR, Überexpressionsvektor für T7-RNA Polymerase in
E. coli BL21(DE3)
Görlach, Jena
pSP6 Actin AmpR, enthält SP6-Promotor zur in vitro Transkription des
Hefe Actin Mini-Intron Konstrukts für in vitro Spleißen
Fabrizzio, Göttingen
pSP64 ApR, 2999 bp, ori pMB1, SP6 Promotor zur in vitro
Transkription; relevante singuläre Schnittstellen HindIII,
EcoRI
Promega, 1992
NCBI Genbank
X65327
pSP64 T7 Aktin basiert auf pSP64, trägt das Hefe Aktin Mini-Intron
Konstrukt aus pSP6 Actin für in vitro Spleißen
diese Arbeit
pSP64 Tc-Aptamer basiert auf pSP64; enthält T7-Promotor zur in vitro
Transkription von Tc-Aptamer RNA als Hammerhead-
Ribozym Fusions-RNA
diese Arbeit
pSP64 Tc-Aptamer X basiert auf pSP64 Tc-Aptamer mit Mut. X im Tc-Aptamer;
(X= A8G, A9G, A13U, A50U, A55G)
diese Arbeit
pSP64 Tc-Minimer basiert auf pSP64; enthält T7-Promotor zur in vitro
Transkription von Tc-Minimer RNA als Hammerhead-
Ribozym Fusions-RNA
diese Arbeit
pSP64 Tc-Minimer
A55U
basiert auf pSP64 Tc-Minimer mit Mutation A55U im Tc-
Minimer
diese Arbeit
pWHE601 AmpR, 2µ-ori, gfp+, URA3, pADH, AflII, NheI (Suess et al., 2003)
pWHE601 AN32 X basiert auf pWHE601 AN32 mit der im Aptamer
integrierten 5´-SS bzw. bp; (X= S1a, S1b, S2, S3, S4, S5,
S6)
diese Arbeit
pWHE601 AN32 ApR, 2µ-ori, gfp+, URA3, pADH, AflII, NheI
enthält cb32 vor gfp
(Suess et al., 2003)
Material und Methoden 26
3.1.3 Oligonukleotide
Die Oligonukleotide wurden von der Firma MWG-Biotech, Ebersberg, bezogen.
Tabelle 3.3 Oligonukleotide
Primer 5´--3´Sequenz
AP1_pSP64 TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA CAA G
AptC1_F AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCC TAA AAC ATA CCA GCT A
AptC1_R AGC TTA GCT GGT ATG TTT TAG GCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA G
AptC2_F AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG CTG GAG AGG TGA AGA ATA CGA
CCA CCT AGG CTC A
AptC2_R AGC TTG AGC CTA GGT GGT CGT ATT CTT CAC CTC TCC AGC CTA TAG TGA
GTC GTA TTA G
b1 CCT CTC CAG ATT AAA GCG CGG GTG GCG ATC TGG TAT GTT TTA GGC CCT
ATA GTG AGT CGT ATT AG
b2 AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCC TAA AAC ATA CCA GAT CGC
CAC CCG CGC TTT AA
C_Xho-Linker_rev TAC GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTA AAA CAT ACT CGA GTG
AAA GCT CGA GAG AGG TGA AGA ATA CGA CCA CC
c1 CCT CTC CAG ACT TTC ATC TGG TAT GTT TTA GGC CCT ATA GTG AGT CGT
ATT AG
c2 AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCC TAA AAC ATA CCA GAT GAA AG
c3 CTA GAG CCT AGG TGG TCG TAT TCT TCA
c3_1 CTA GAG CCT AGG TGG TCG AAT TCT TCA
c4 TCT GGA GAG GTG AAG AAT ACG ACC ACC TAG GCT
c4_1 TCT GGA GAG GTG AAG AAT TCG ACC ACC TAG GCT
d1 CCT CTC CAG AGC ATA GAC TTT CAT CCT TAG CTC TGG TAT GTT TTA GGC
CCT ATA GTG AGT CGT ATT AG
d2 AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCC TAA AAC ATA CCA GAG CTA
AGG ATG AAA GTC TAT GC
GFP-Rev CAA GAA TTG GGA CAA CTC C
hh1 AGC TTC TAG GCT TTC GTC CTC ACG GAC TCA TCA GTA GAG TCA CCT
hh2 CTA GAG GTG ACT CTA CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA AAG CCT AGA
Material und Methoden 27
InsHT7SE_forw AGC TTT AAT ACG ACT CAC TAT AGT CGA CGC TGC CG
InsHT7SE_rev AAT TCG GCA GCG TCG ACT ATA GTG AGT CGT ATT AA
K7F1: TCG AGA GATTTC TCT TTT ACC TTT TTT TAC TAT TTT TCA CTC TCC CAT
AAC CTC CTA TAT TGA CTG ATC
K7F2: TGT AAT AAC CAC GAT ATT ATT GGA ATA AAT AGG GGC TTG AAA TTT
GGA AAA AAA AAA AAA ACT GAA ATA T
K7F3: TTT CGT GAT AAG TGA TAG TGA TAT TCT TCT TTT ATT TGC T AC TGT TAC
TAA GTC TGG CCT ACT AAC ATA C
K7F4: CAG ATC GCC ACC CGC GCT TTA ATC TGG AGA GGT GAA GAA TAC GAC
CAC CTA GGC CAT TGA TAA CGG TTC TG
K7F5: GTA TGT GTA AAG CCG GTT TTG CCG GTG ACG ACG CTC CTC G TG CTG TCT
TCC CAT CTA TCG TCG GTA GAC C
K7F6: AAG ACA CCA AGG TAT CAT GGT CGG TAT GGG TCA AAA AGA CTC CTA
CGT TGG TGA TGA AGG GG
K7R1: TGA AAA ATA GTA AAA AAA GGT AAA AGA GAA ATC TC
K7R2: TCA AGC CCC TAT TTA TTC CAA TAA TAT CGT GGT TAT TAC AGA TCA GTC
AAT ATA GGA GGT TAT GGG AGA G
K7R3: AGC AAA TAA AAG AAG AAT ATC ACT ATC ACT TAT CAC GAA AAT ATT
TCA GTT TTT TTT TTT TTT CCA AAT T
K7R4: TAT TCT TCA CCT CTC CAG ATT AAA GCG CGG GTG GCG ATC TGG TAT GTT
AGT AGG CCA GAC TTA GTA ACA GT
K7R5: CGA GGA GCG TCG TCA CCG GCA AAA CCG GCT TTA CAC ATA CCA GAA
CCG TTA TCA ATG GCC TAG GTG GTC G
K7R6: CCC ATA CCG ACC ATG ATA CCT TGG TGT CTT GGT CTA CCG ACG ATA GAT
GGG AAG ACA GCA
K7R7: AAT TCC CCT TCA TCA CCA ACG TAG GAG TCT TTT TGA
MP_A8_R TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTA AGA CAT ACC AGA TCG CCA CC
MP_G55_F GCC TAG GTG GTC GCA TTC TTC ACC TCT CCA GAT TAA AGC GCG
MP_G9_R TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTA AAG CAT ACC AGA TCG CCA CC
MP_U_13_R TCA CTA TAG GGC CTA AAA CAT TCC AGA TCG CCA CCC GCG
MP_U50_F AGA GCC TAG GTG GTC GTA TTC ATC ACC TCT CCA GAT TAA AGC
Material und Methoden 28
MP_U51_F AGA GCC TAG GTG GTC GTA TTA TTC ACC TCT CCA GAT TAA AGC
P1F: GAT CCC CCT TTT AGA TTT TTC ACG CTT ACT GCT TTT TTC TTC CCA AGA
TCG AAA ATT TAC TGA ATT AAC
P1R: GAA AAA AGC AGT AAG CGT GAA AAA TCT AAA AGG GG
P2F AAT GGA TTC AGG TAT GTA AAA CAT ACC AGA TCG CCA CCC GCG CTT
TAA TCT GGA GAG GTG AAG AAT ACG A
P2R: CGG GTG GCG ATC TGG TAT GTT TTA CAT ACC TGA ATC CAT T GT TAA TTC
AGT AAA TTT TCG ATC TTG GGA A
P3F: CCA CCT ACA TGC TTC TCT TTT ACC TTT TTT TAC TAT TTT TCA CTC TCC
CAT AAC CTC CTA TAT TGA CTG A
P3R: AAA AAT AGTA AAA AAA GGT AAA AGA GAA GCA TGT AGG TGG TCG TAT
TCT TCA CCT CTC CAG ATT AAA GCG
P4F: TCT GTA ATA ACC ACG ATA TTA TTG GAA TAA ATA GGG GCT TGA AAT TTG
GAA AAA AAA AAA AAA CTG AAA T
P4R: AAG CCC CTA TTT ATT CCA ATA ATA TCG TGG TTA TTA CAG ATC AGT CAA
TAT AGG AGG TTA TGG GAG AGT G
P5F: ATT TTC GTG ATA AGT GAT AGT GAT ATT CTT CTT TTA TTT G CT ACT GTT
ACT AAG TCT CAT GTA CTA ACA T
P5R: CAA ATA AAA GAA GAA TAT CAC TATC ACT TAT CAC GAA AAT ATT TCA
GTT TTT TTT TTT TTT CCA AAT TTC
P6F: GAT CCC CCT TTT AGA TTT TTC ACG CTT ACG GCC TAA AAC ATA CCA GAT
CGC CAC CCG CGC TTT AAT CTG
P6R: CGA TGT TAG TAC ATG AGA CTT AGT AAC AGT AG
P7F: GAG AGG TGA AGG TAT GTC GAC CAC CTA GGC CCA TCC CAT TTA ACT
GTA AGA AGA ATT GCA CGG TCC CAA T
P7R: GTT TTA GGC CGT AAG CGT GAA AAA TCT AAA AGG GG
P8F: TGC TCG AGA GAT TTC TCT TTT ACC TTT TTT TAC TAT TTT TCA CTC TCC
CAT AAC CTC CTA TAT TGA CTG A
P8R: AAT GGG ATG GGC CTA GGT GGT CGA CAT ACC TTC ACC TCT C CA GAT
TAA AGC GCG GGT GGC GAT CTG GTA T
P9R: AAA AAT AGT AAA AAA AGG TAA AAG AGA AAT CTC TCG AGC AAT TGG
GAC CGT GCA ATT CTT CTT ACA GTT A
pADH GCA CAA TAT TTC AAG CTA TAC C
Material und Methoden 29
sp GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG G
Splice1_for AGA TCT CTT AAG GCC TAA AAS GTA TGT GAT CGC CAC CCG CGC TTT AAT
CAC GAG AGG TGA AGA ATA C
Splice2_for GCT AGA TCT CTT AAG GTATG TAA AAC ATA CCA G
Splice2_rev CTC CTT TGC TAG CCA TTT TGC ATGT AGG TGG TCG TAT TC
Splice3_rev CTC CTT TGC TAG CCA TTT TGG CCT AGG TGG TCG ACATA CCT TCA CCT
CTC C
Splice4_rev CTC CTT TGC TAG CCA TTT TGG CCT ATG TGG TCG TAT TCT TCA CATAC
CTC CAG ATT AAA GCG
Splice6_rev CTC CTT TGC TAG CCA TTT TGG CCT ATA CCG TCG TAT TGT TAG TAT CTC
CAG ATT AAA GCG
Splice7_for AGA TCT CTT AAG GCC TAC T AAC ATA CCA GAT CGC
T7_forw_AN32K AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG CAA CTC CAA GCT AGA TCT CTT AAG
Xho_sp_F TCG AGC AAC AAC AAC AAC AAC AAC AAC AAC AAC AAC
Xho_sp_R TCG AGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGT TGC
3.2 Puffer, Lösungen und Medien
Puffer, Lösungen und Medien wurden mit Millipore-Wasser oder deionisiertem Wasser
angesetzt und 25 min im Dampfdrucktopf bei 120°C und 2 bar autoklaviert. Thermolabile
Substanzen wurden gelöst und sterilfiltriert. Als Lösungsmittel diente Reinstwasser (MilliQ),
andere Lösungsmittel sind angegeben.
3.2.1 Bakterien- und Hefenährmedien
Flüssigmedien
LB-Medium (1 l) 10 g Trypton
5 g Hefeextrakt
10 g NaCl
Material und Methoden 30
MM-Medium (1 l) 2 g Yeast Nitrogen Base
(Hefe-Minimalmedium 5,5 g (NH4)2SO4
ohne Uracil) 20 g Glukose
20 ml AS-Mix
20 ml Adenin (600 µg/ml)
pH 5,6 mit 2 M NaOH eingestellt
YEPD-Medium (1 l) 10 g Hefeextrakt
(Hefe Vollmedium) 20 g Pepton
20 g Glukose
Plattenmedien
Zur Herstellung von Plattenmedien wurden den Grundmedien 15 g/l Agar zur Verfestigung
zugesetzt.
Antibiotika
Ampicillin wurde als 1000-fach konzentrierte Stammlösung in 70% Ethanol gelöst. Die
Lösung wurde bei -20°C aufbewahrt. Nach Abkühlung der Medien auf ca. 50°C wurde das
Antibiotikum zugegeben. Die Endkonzentration für E. coli betrug bei Ampicillin 100 µg/µl.
Sonstiges
IPTG wurde bei der Präparation der T7-RNA-Polymerase in einer Endkonzentration von 0,5
mM eingesetzt.
3.2.2 Puffer und Lösungen
0,8%-Agarosegel
für DNA-Gelelektrophorese
0,8% (w/v) Agarose
1x TAE
10x TAE-Puffer
für DNA-Gelelektrophorese
0,4 M Tris
0,2 M Na-Acetat
12,5 mM EDTA
pH 8,3 (eingestellt mit Essigsäure)
Material und Methoden 31
DNA-Farbmarker
für DNA-Gelelektrophorese
0,25% Ficoll 400
1% (w/v) SDS
0,25% Bromphenolblau
100 mM EDTA (pH 8,0)
10x Proteinlaufpuffer
für Protein-Gelelektrophorese
1,92 M Glyzin
0,5 M Tris
1% SDS
pH 8,9 (durch exaktes Einwiegen)
5x SDS-Probenpuffer
für Protein-Gelelektrophorese
15% β-Mercaptoethanol
15% SDS
1.5% Bromphenolblau
50% Glyzerin
Färbelösung
für Protein-Gelelektrophorese
0,5% Coomassie Brillant Blue R250
10% Essigsäure
45% Methanol
44,5% H2O
Entfärbelösung
für Protein-Gelelektrophorese
10% Essigsäure
Waschlösung
für Protein-Gelelektrophorese
45% Methanol
10% Essigsäure
45% H2O
Trenngel
für Protein-Gelelektrophorese
7% - 15% Acrylamid (39:1)
375 mM Tris-HCl pH 8,8
800 µl 2% SDS
mit sterilem Millipore-Wasser auf 9,8 ml aufgefüllt
200 µl 10% APS
2,5 µl TEMED
Material und Methoden 32
Sammelgel
für Protein-Gelelektrophorese
4% Acrylamid-Bisacrylamid (39:1)
125 mM Tris-HCl pH 6,8
0,1% SDS
mit sterilem Millipore-Wasser auf 9,95 ml aufgefüllt
50 µl APS
10 µl TEMED
10x PBS 1370 mM NaCl
27 mM KCl
100 mM Na2HPO4
20 mM KH2PO4
pH 7,4 (eingestellt mit HCl )
10x TBE-Puffer
für RNA-Gelelektrophorese
0,89 M Tris
0,89 M Borsäure
10 mM EDTA
pH 8,3 (durch exaktes Einwiegen)
10% PAA-Gel
mit 8 M Harnstoff
für RNA-Gelelektrophorese
20 ml Acrylamid-Bisacrylamid (39:1)
16 ml 10 x TBE
38,4 g Harnstoff; cEnd= 8 M
mit H2O auf 80 ml
800 µl 10% APS
80 µl TEMED
10% PAA-Gel (nativ)
für RNA-Gelelektrophorese
10 ml Acrylamid- Bisacrylamid (39:1)
4 ml 10x nativer Gelpuffer
26 ml H2O
400 µl 10% APS
40 µl TEMED
Material und Methoden 33
Formamid-Probenpuffer
für RNA-Gelektrophorese
99% Formamid
0,1% Bromphenolblau
0,1% Xylen Cyanol FF
5x Transkriptionspuffer 500 mM Tris
pH 8,1 (eingestellt mit Glutaminsäure)
200 mM Spermidin (1 ml)
(Transkription)
32 µl Spermidin
568 µl H2O
400 µl 5x Transkriptionspuffer
500 mM Spermidin (1 ml)
(Spleißen)
80 µl Spermidin
520 µl H2O
400 µl 5x Transkriptionspuffer
DTT 1 M DTT in 10 mM Natriumacetat pH 5,2 lösen
sterilfiltriert
Proteinase K Mix
6 µl 5 mg/ml Proteinase K
3 µl 0,5 M EDTA
3 µl 10 % SDS
18 µl H2O
Stoppuffer 2 (1 ml)
(Spleißen)
167 µl 3M Na-Acetat pH 5,2
0,6 µl 0,5 M EDTA pH 8,0
5 µl 20% SDS
15 µl E. coli tRNA (1µg/µl)
813 µl H2O
Elutionspuffer für RNA (1 ml)
167 µl 3 M Na-Acetat pH 5,2
2 µl 0,5 M EDTA pH 8
25 µl Phenol/Chloroform (1:1)
806 µl H2O
Material und Methoden 34
Zell-Wasch-Puffer
(T7-RNA-Polymerase)
20 mM TrisHCl pH 8,1
20 mM NaCl
2 mM EDTA
Lysispuffer (100 ml)
(T7-RNA-Polymerase)
50 mM Tris-HCl pH 8,1
20 mM NaCl
2 mM EDTA
nach dem Autoklavieren wurden zugegeben:
1 mM DTT (100 µl der 1 Stammlsg.
10 µg/ml Bacitracine (100 µl der 10 mg/ml Stammlsg.
0,1 mM Benzamidine (100 µl der 0,1 M Stammlsg.
20 µg/ml PMSF (100 µl der 20 mg/ml Stammlsg in 70%
EtOH)
0,8% Deoxycholate
(T7-RNA-Polymerase)
0,8% Deoxycholate in H2O
bei RT lagern
10% Ethylenimin Polymer
(T7-RNA-Polymerase)
10% Ethylenimin Polymer in H2O
pH 8 mit HCl eingestellt
bei RT lagern
10x Puffer C-0 (2 l)
(T7-RNA-Polymerase)
200 mM Na-Phosphat pH 7,7 (aus 1 M Stammlsg)
10 mM EDTA
50% Glycerin
nach dem autoklavieren zugegeben:
10 mM DTT
bei 4°C lagern und kurz vor Gebrauch herstellen
Puffer-C-2000 (2 l)
(T7-RNA-Polymerase)
2 M NaCl
auf 2 l mit 1x Puffer C-0
Material und Methoden 35
Puffer-C-10 (1 l)
(T7-RNA-Polymerase)
5 ml Puffer C-2000
auf 1 l mit 1x Puffer C-0
Puffer-C-25 (500 ml)
(T7-RNA-Polymerase)
6,25 ml Puffer C-2000
auf 1 l mit 1x Puffer C-0
Puffer-C-50 (1 l)
(T7-RNA-Polymerase)
25 ml Puffer C-2000
auf 1 l mit 1x Puffer C-0
Puffer-C-100 (1 l)
(T7-RNA-Polymerase)
50 ml Puffer C-2000
auf 1 l mit 1x Puffer C-0
Puffer-C-200 (1 l)
(T7-RNA-Polymerase)
100 ml Puffer C-2000
auf 1 l mit 1x Puffer C-0
Puffer-C-250 (500 ml)
(T7-RNA-Polymerase)
62,5 ml Puffer C-2000
auf 1 l mit 1x Puffer C-0
Puffer-C-100/50 % Glycerin (1 l)
(T7-RNA-Polymerase)
50 ml Puffer C-2000
500 ml Glycerin
auf 1 l mit 1x Puffer C-0
Puffer-D (2 l)
(T7-RNA-Polymerase)
40 ml 1M Hepes-KOH pH 7,9
800 µl 0,5 M EDTA pH 8,0
50 ml 2 M KCl
460 ml Glycerin
auf 2 l mit H2O
bei 4°C lagern und kurz vor Gebrauch zugegeben:
1 ml 1 M DTT
10 ml 0,1 M PMSF
4 ml 1 M Benzamidin
Material und Methoden 36
5x Puffer-T 200 mM Tris-HCl pH 7,5
1 M NaCl
100 mM MgCl2
5x Puffer-K 200 mM K-Phosphat pH 7,5 (aus 1 M Stammlsg)
1 M NaCl
100 mM MgCl2
(Achtung erst Wasser vorlegen!)
10x Nativer Gellaufpuffer 500 mM Tris-Acetat pH 7,5
100 mM Mg-Acetat
AGK Puffer (200 ml) 2 ml 1 M Hepes-KOH pH 7,9 (cEnd= 10 mM)
0,3 ml 1 M MgCl2 (cEnd= 1,5 mM)
20 ml 2 M KCl (cEnd= 200 mM)
20 ml Glycerin (cEnd= 10%)
50 ml 2 M KCl (cEnd= 50 mM)
Puffer D (2 l)
(Dialysepuffer für Hefe Zell-
extrakt)
40 ml 1 M Hepes-KOH pH 7,9 (cEnd= 20 mM)
0,8 ml 0,5 M EDTA pH 8 (cEnd= 0,2 mM)
460 ml Glycerin (cEnd= 20 %)
bei 4°C lagern und kurz vor Dialyse zugegeben:
1 ml 1 M DTT
10 ml 0,1 M PMSF (in 70% Ethanol)
4 ml 1 M Benzamidin
K-PO4-PEG (800 µl) 500 µl 0,5 M K-PO4 pH 7,0
300 µl 50% PEG 8000 in H2O
Alle Puffer zur Verwendung mit Chromatografiegeräten wurden vor dem Autoklavieren mit
einem 0.45 µm Steritop Filter filtriert.
Material und Methoden 37
3.2.3 Enzymlösungen
Alle kommerziellen Enzyme stammen aus dem lehrstuhleigenen Vorrat und wurden mit den
vom Hersteller gelieferten Puffern verwendet.
3.3 Methoden
3.3.1 Allgemeine Methoden
Zusammenfassung der allgemeinen Methoden (Tabelle 3.4.), die in der Literatur beschrieben
sind und in dieser Arbeit angewendet wurden:
Tabelle 3.4 Allgemeine Methoden
Methode Referenz
Absorptionsmessung (Sambrook et al., 1989)
Ethidiumbromidfärbung von DNA/RNA (Sambrook et al., 1989)
Fällung von Nukleinsäuren (Sambrook et al., 1989)
Gelelektrophorese von DNA (Sambrook et al., 1989)
Gelelektrophorese von Proteinen (denaturierend) (Laemmli, 1970)
Ligation von DNA-Fragmenten (Sambrook et al., 1989)
Proteinmengenbestimmung (Bradford, 1976)
Plasmidpräparation aus E. coli (Sambrook et al., 1989)
Transformation von E. coli (Sambrook et al., 1989)
Herstellung kompetenter E. coli Zellen (Sambrook et al., 1989)
Sequenzierung nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1992)
3.3.2 Anzucht von Bakterien
Soweit nicht anders angegeben, wurde E. coli in LB-Medium bei 37°C und 250 U/min in
Reagenzgläsern oder Schikanekolben angezogen. Beimpft wurde von frischen
Vereinzelungsplatten bzw. aus Übernachtkulturen. Das Wachstum wurde durch Messung der
optischen Dichte bei 600 nm verfolgt.
Material und Methoden 38
3.3.3 Transformation von E. coli
Kompetente Zellen wurden auf Eis aufgetaut, dann 200 µl zu 10-100 ng DNA gegeben, der
Ansatz gemischt und für 30 min auf Eis gestellt. Danach wurde das Reaktionsgefäß 1,5 min
auf 42°C erwärmt und nach Zugabe von 800 µl LB-Medium 1 h bei 37°C im Wasserbad
inkubiert. Von den Transformationsansätzen wurden jeweils 50 bzw. 100 µl und der
abzentrifugierte Rest auf Selektionsplatten ausplattiert.
3.3.4 Anzucht von S. cerevisiae
Soweit nicht anders angegeben, wurde S. cerevisiae in YEPD-Medium oder MM-Medium bei
30°C und 250 U/min in Reagenzgläsern oder Schikanekolben angezogen. Beimpft wurde von
frischen Vereinzelungsplatten bzw. aus Übernachtkulturen. Das Wachstum wurde durch
Messung der optischen Dichte bei 600 nm verfolgt.
3.3.5 Anzucht und Transformation von kompetenten S. cerevisiae
Präparation kompetenter Zellen
Für die Präparation kompetenter Hefen wurde der kommerziell erhältliche Kit Frozen-EZ
Yeast Transformation IITM verwendet. Die Lösungen EZ 1 und EZ 2 wurden diesem Kit
entnommen.
Zur Herstellung kompetenter S. cerevisiae wurde zunächst der gewünschte Hefestamm aus
einer Stockkultur auf YEPD-Platten ausgestrichen und bei 28°C inkubiert. 20 ml YPD-
Flüssigmedium wurden mit je einer Kolonie beimpft und weiterhin bei 28°C auf einem
Rundschüttler (250-300 rpm) üN inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurde YPD-
Flüssigmedium mit der üNK auf eine oD600 von 0,2 eingestellt und bei 28°C unter Schütteln
bis zu einer oD600 von 0,8-1,0 wachsen gelassen. Die folgenden Schritte wurden bei
Raumtemperatur durchgeführt. Zunächst wurde die Hefesuspension bei 500 g für 4 min
abzentrifugiert, das Sediment mit 10 ml EZ 1-Lösung gewaschen und unter den bereits
angegebenen Bedingungen nochmals abzentrifugiert. Das Sediment wurde anschließend mit 1
ml EZ 2-Lösung resuspendiert, aliquotiert (100 µl, 50 µl) und bei -70°C gelagert.
Transformation von S. cerevisiae
Die kompetenten Hefezellen wurden bei RT aufgetaut. Für die Transformation wurden ca.
200 ng der zu transformierenden DNA in 3 µl Millipore-Wasser mit 10 µl kompetenter Zellen
versetzt und nach Zugabe von 100 µl EZ 3-Lösung (Kit Frozen-EZ Yeast Transformation
IITM) gevortext. Die Ansätze wurden 45 min bei 28°C inkubiert, wobei alle 15 min gevortext
Material und Methoden 39
wurde, weil sich die Hefen aufgrund ihrer Größe nach einer gewissen Zeit am Boden
absetzen. Nach Abschluss der Transformation wurde der gesamte Ansatz auf MM-Platten
ausplattiert und bei 28°C für 2-3 Tage inkubiert.
3.3.6 Nachweis und Präparation von DNA
Aufreinigung von Plasmid-DNA über modifizierte Alkali/SDS Lyse
Die Plasmidisolierung erfolgte aus 4 ml bis 2 l Übernachtkultur durch alkalische Lyse und
anschließende chromatographische Aufreinigung (Nucleospin; Macherey-Nagel, Düren).
DNA-Gelelektrophorese
Zur Größenbestimmung und zur präparativen Auftrennung von DNA-Restriktionsfragmenten
wurde eine Gelelektrophorese mit 0,8% Agarosegelen durchgeführt. Die Gele hatten eine
Dimension von 8,5 cm Länge, 10 cm Breite und waren 3-5 mm dick. Die Agarosegele wurden
nach dem Gießen (60°C) durch Abkühlen auf RT verfestigt, die Proben mit DNA-Farbmarker
versetzt und auf das Gel aufgetragen. Der Gellauf erfolgte bei 100-120 V, bis der DNA-
Farbmarker das untere Drittel des Gels erreicht hatte. Danach wurden die Gele 10 min in
Ethidiumbromid gefärbt, kurz in H2O entfärbt und anschließend unter UV-Licht (254 nm)
fotografiert. Bei 365 nm konnten DNA-Banden aus präparativen Gelen ausgeschnitten und in
ein Eppendorfgefäß überführt werden. Die Elution der DNA erfolgte mit dem Nucleospin
Extract 2 in 1 nach Anleitung des Herstellers.
Größenstandards für die DNA-Gelelektrophorese
PEQ Gold Leiter-Mix (PEQ-Gold), Fragmentgrößen in kb:
10/8/6/5/4/3,5/3/2,5/2/1,5/1,2/1,031/0,9/0,8/0,7/0,6/0,5/0,4/0,3/0,2/0,1
Sequenzierung von DNA
Der Sequenzierung lag das Prinzip der Kettenabbruchmethode von Sanger (Sanger et al.,
1992) zugrunde, wobei die Terminatoren fluoreszenzmarkiert sind. Die Sequenzierung
erfolgte mit Hilfe des Big Dye Terminator Mix (PE-Biosystem). Die Durchführung der
Sequenzierreaktion erfolgte gemäß den Vorschriften des Herstellers, wobei die
Hybridisierungstemperatur dem jeweiligen Oligonukleotid angepasst wurde. Die Analyse der
Sequenzierreaktion erfolgte mit dem ABI PRISM 310 Genetic Analyser (PE-Biosystem).
Material und Methoden 40
Cycle-Sequencing-Ansatz 400-500 ng Plasmid DNA
5 pmol Primer
3 µl Ready Reaction Mix
mit Millipore-Wasser auf 10 µl auffüllen
Bedingungen 25 Zyklen
96°C 10 sec
45-60°C (jeweils angegeben) 5 sec
60°C 4 min
Fällung des Ansatzes
in Eppendorfgefäß
10 µl Ansatz + 90 µl H2O + 10 µl 3 M NaAc mischen
250 µl 100% Ethanol (RT) zugeben und mischen
15 min bei 13000 U/min (RT) zentrifugieren
Überstand sorgfältig abziehen
Pellet mit 250 µl 70% frischem Ethanol (RT) waschen
5 min bei 13000 U/min (RT) zentrifugieren
Überstand sorgfältig abziehen
Pellet 5 min in SpeedVac trocknen
Probenvorbereitung Pellet in 10 µl Formamid aufnehmen
Ansatz in Geräte-Reaktionsgefäß überführen und mit
Septum verschließen
Restriktion von DNA
Die Restriktionen mit Endonukleasen wurden in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer
durchgeführt. Die Enzymmenge und Inkubationsdauer richteten sich nach der eingesetzten
DNA-Menge und dem Reaktionsvolumen.
Ligation von DNA
Die Ligation von DNA-Fragmenten wurde mit T4-DNA-Ligase unter Verwendung des vom
Hersteller mitgelieferten Puffers durchgeführt. Es wurden 100 ng Vektor-DNA und ein
1-5 facher molarer Überschuss an Fragment eingesetzt. Die Ligationsreaktion erfolgte über
Nacht bei Raumtemperatur.
Material und Methoden 41
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion wurde stets mit zirkulärer Plasmid-DNA als Matrizen-DNA
durchgeführt.
Reaktionsansatz (100 µl) :
3 µl Primer 1 (30 pmol)
3 µl Primer 2 (30 pmol)
3 µl Ziel-DNA (ca. 100 ng)
20 µl 10× Phusion-Polymerase Puffer
1 µl Phusion-Polymerase
2 µl dNTPs
79 µl H2O
Der Ansatz wurde gemischt und die Reaktion im Thermocycler mit folgendem Programm
durchgeführt:
Anzahl der Zyklen Reaktion Temperatur Dauer der Reaktion
1 Vorlauf 98°C 30 sec
30 Denaturierung
Annealing
Primer Extention
94°C
jeweils angegeben
72°C
15 sec
30 - 60 sec
20 – 30 sec
1 Endlauf 72°C 7 min
Nach Abschluss des Programms wurde der Reaktionsansatz auf 4°C abgekühlt.
Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel überprüft und mittels Nucleospin Extract 2
in 1 (Macherey-Nagel, Düren) aufgereinigt.
3.3.7 Nachweis und Präparation von RNA
RNase-freies Arbeiten
RNasen sind überaus stabile Proteine. Sie können innerhalb kürzester Zeit RNA abbauen.
Daher muss die Kontamination mit RNasen unbedingt vermieden werden. Alle Lösungen
wurden mit RNase-freiem Millipore-Wasser angesetzt und autoklaviert. Alle Glasgeräte
wurden über Nacht bei 200°C sterilisiert. Plastikgeräte wurden über Nacht mit 0,1% (v/v)
Diethylpyrocarbonat-Lösung (DEPC) bei 37°C behandelt, autoklaviert, mit RNase-freiem
Wasser gewaschen und bei 80°C getrocknet.
Material und Methoden 42
RNA Gele
Denaturierende RNA Gele mit 8 M Harnstoff in TBE-Puffer wurden im Format 16x18 cm in
einer Dicke von 1 mm oder 2 mm gegossen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei
30 W ohne Kühlung der Platten. Um ein Zerspringen der Platte und den Zerfall des Harnstoffs
zu vermeiden, sollte die Temperatur nicht über 55°C steigen. Als Laufpuffer wurde 2x TBE
verwendet. Proben wurden in Formamid-Auftragepuffer aufgenommen und 3 min bei 95°C
denaturiert.
Native RNA Gele enthielten keinen Harnstoff. Die Gelelektrophorese erfolgte bei
Raumtemperatur und einer konstanten Spannung von 100 V. Als Laufpuffer wurde 50 mM
Tris-Acetat, pH 7,5 mit 10 mM Mg-Acetat verwendet. Die Proben wurden mit 10% Glyzerin
versetzt und aufgetragen.
RNA-Synthese und Aufreinigung
Die für die in vitro-Transkription benötigte T7-RNA-Polymerase wurde von Dr. Oliver
Weichenrieder (NKI-Amsterdam, Niederlande) zur Verfügung gestellt oder selbst
aufgereinigt. Die benötigte SP6-RNA-Polymerase wurde mit einer Konzentration von 50 U/µl
von Roche bezogen
Nukleotid-Triphosphate für in vitro Transkription
Die benötigten Nukleotid-Triphosphate (NTPs) wurden in Pulverform von Sigma bezogen.
Jedes NTP wurde als 100 mM Stammlösung in Milliporewasser hergestellt und mit 5 M
NaOH auf pH 7,0 eingestellt. Die Lösung der Nukleotide erfolgte in der Originalflasche.
Jedes neutralisierte NTP wurde portioniert und bei –20°C gelagert. Die exakte Konzentration
wurde per oD 260 nm ermittelt. Der Quotient aus der gemessenen oD260 und dem jeweiligen
ε260 Wert gibt die Nukleotidkonzentration in mol/l. Tabelle 3.5 enthält die Lösungsvolumina
und die Extinktionskoeffizienten (ε260) zur Konzentrationsmessung (Weichenrieder,
persönliche Mitteilung). Der Quotient aus der gemessenen oD260 und dem jeweiligen ε260
Wert gibt die Nukleotidkonzentration in mol/l.
Material und Methoden 43
Tabelle 3.5 Lösungsvolumina zur Herstellung von 100 mM NTP Lösungen aus Feststoff.
NTP Lösungsvolumena
für 100 mM
H2O 5 M NaOH
(max. zugegeben)
ε260
(l M-1 cm-1)
ATP 9,07 ml / 0,5 g 8 ml 0,325 ml 15,4 x 103
UTP 9,09 ml / 0,5 g 8 ml 0,175 ml 9,9 x 103
CTP 10,35 ml / 0,5 g 9,5 ml 0,305 ml 7,4 x 103
GTP 4,78 ml / 0,25 g 4 ml 0,075 ml 11,7 x 103
a Die angegebenen Volumina basieren auf Erfahrungswerten bei der Neutralisierung von vollständig gefüllten Fläschchen und sind somit als Anhaltspunkt zu verstehen, da es durchaus Schwankungen in der Füllmenge gibt.
DNA-Matrize
Die bei der enzymatischen RNA-Synthese durch in vitro-Transkription verwendete T7-RNA-
Polymerase benötigt eine DNA-Matrize, in der mindestens die Promotorregion doppelsträngig
ist, während der für die RNA kodierende Bereich einzel- oder doppelsträngig sein darf. Im
Fall der SP6-Polymerase ist eine komplett doppelsträngige DNA-Matrize notwendig. Die
Sequenz der verwendeten Promotoren sind in Abbildung 3.1 gezeigt. Als Signal für den
Transkriptionsabbruch dient das Ende der Matrize. In dieser Arbeit wurden linearisiertes
pSP64 und pSP6 als DNA-Matrize verwendet
-17 -10 -1 +1 +2
5´- T A A T A C G A C T C A C T A T A G G -3´
3´- A T T A T G C T G A G T G A T A T C C -5´
-17 -10 -1 +1 +2
5´-A T T T A G G T G A C A C T A T A G G -3´
3´-T A A A T C C A C T G T G A T A T C C -5´
Abbildung 3.1
oben: Konsensussequenz des T7-RNA-Polymerase-Promotors. Die Positionen +1 und +2 wurden beibehalten, um eine effiziente in-vitro Transkription zu ermöglichen. unten: Konsensussequenz des SP6-RNA-Polymerase-Promotors. Die Positionen +1 und +2 wurden beibehalten, um eine effiziente in-vitro Transkription zu ermöglichen.
Material und Methoden 44
In vitro-Transkription mit T7-RNA-Polymerase
Für analytische und semipräparative Zwecke wurden Transkriptionsreaktionen in einem
Maßstab von 100 µl durchgeführt, wobei die folgenden Parameter variiert wurden:
Magnesiumkonzentration (für jede Polymerasepräparation anpassen, da Mg2+ bereits in der
Enzymlösung vorhanden ist), Templatekonzentration, T7-RNA-Polymerasekonzentration und
Reaktionsdauer (je nach Enzymaktivität erhöhen) (Tabelle 3.6.).
Tabelle 3.6 Reaktionsbedingungen bei der in vitro Transkription mit T7-RNA-Polymerase
Tris-Glutamat, pH 8,1 200 mM
DTT 20 mM
Spermidin 2 mM
Mg(Ac)2 20 - 35 mM
rNTP, gesamt 16 mM
Plasmid 10 - 20 µg / 100 µl Ansatz
T7-RNA Polymerase 7 - 10 µg / 100 µl Ansatz
Reaktion bei 37°C
Der Reaktionsverlauf wurde durch analytische PAGE verfolgt. Dabei wurden je 5 µl Probe
mit 20 µl Formamid-Auftragepuffer versetzt und für 3 min bei 95°C denaturiert. Für die
PAGE wurden 8-12%ige denaturierende Acrylamid-Gele verwendet. Die Auftrennung
erfolgte bei konstanter Leistung von 30 W. Anschließend wurde das analytische Gel analog
zu DNA-Gelen in Ethidiumbromid gefärbt und unter UV Licht photografiert.
Die präparative Transkriptionsreaktion wurde in einem Maßstab von 2-10 ml bei den
Bedingungen durchgeführt, die in den analytischen Ansätzen die größtmögliche Ausbeute
geliefert haben. Die Reaktion erfolgte bei 37°C für 7 h oder über Nacht. Der
Transkriptionsansatz wurde anschließend mit dem 5 fachen Volumen einer 25 mM MgCl2
Lösung verdünnt. Um die autokatalytische Hydrolyse des Hammerhead-Ribozyms zu erhöhen
wurde der Ansatz zwei Hitze-Kälte Zyklen von jeweils 10 min bei 60°C, 10 min auf Eis und
anschließend 30 min bei 20°C ausgesetzt. Zur Beendigung der Reaktion wurde 0,5 M EDTA
pH 8 bis zum vollständigen Aufklaren der Lösung zugegeben.
Material und Methoden 45
RNA-Aufreinigung durch chromatographische Verfahren
Die weitere Aufreinigung der RNA erfolgte durch säulenchromatographische Verfahren.
Zunächst wurden aus dem Reaktionsgemisch die T7-RNA-Polymerase und nicht eingebaute
Nukleotide entfernt. Zu diesem Zweck wurde eine DEAE-Sepharose FF-
Anionenaustauschersäule verwendet. Die Säule (∅ 0,8 cm, 10 cm lang) wurde mit 1 ml
DEAE-Sepharose befüllt und mit 10 ml H2O gewaschen. Die Säule wurde mit 10 ml einer 0,3
M NaAc Lösung pH 5,5 äquilibriert, mit 5 ml 3 M NaAc, pH 5,5 gewaschen und
abschließend wieder mit 10 ml einer 0,3 M NaAc pH 5,5 Lösung re-äquilibriert. Im
Anschluss daran konnte die Säule mit dem abgestoppten Transkriptionsansatz beladen
werden. Sämtliche Durchflüsse der Säule wurden gesammelt. Die beladene Säule wurde mit
10 ml einer 0,3 M NaAc Lösung pH 5,5 gewaschen. Die Elution erfolgte mit 5 ml einer 2 M
NaAc Lösung pH 5,5. Mittels denaturierender Gelelektrophorese wurden alle Fraktionen auf
ihren RNA-gehalt hin analysiert. Die RNA wurde dann durch Zugabe des 2,5–4 fachen
Volumens an kaltem EtOH üN bei –20°C präzipitiert. Das RNA-Pellet wurde abzentrifugiert
(10000 g, 4°C, 2 h) und dann in Wasser gelöst.
RNA-Aufreinigung durch präparative PAGE
Die weitere Aufreinigung erfolgte über präparative denaturierende PAGE. Zu diesem Zweck
wurden ein oder zwei (bei 10 ml Transkriptionen) PAA-Gele mit 8 M Harnstoff in einer
Dicke von 2 mm verwendet. Die Gelplatten wurden so angeordnet, dass sich die jeweilige
fluoreszierende Seite innen befand (unter 254 nm UV-Licht-Bestrahlung gelblich
fluoreszierend; beide Seiten der Platte auf dunklem Untergrund im Photolabor vergleichen
und die fluoreszierende Seite markieren!). Die in Wasser gelöste RNA wurde mit einem
Volumen 8 M Harnstoff mit Bromphenolblau und Xylencyanol versetzt. Die
elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 30 W bis die Bromphenolblau-Bande im unteren
Drittel angekommen ist. Nach der Entfernung einer der beiden Glasplatten wurde die RNA-
enthaltende Bande per „UV-shadowing“ sichtbar gemacht. Dazu wurde das geöffnete Gel auf
der Glasplatte über einem dunklen Untergrund mit einer 254 nm UV-Handlampe bestrahlt.
Nukleinsäurehaltige Banden erscheinen als dunkler Schatten, da hier das UV-Licht absorbiert
wird. Der restliche Bereich fluoresziert. Die gewünschte Bande wurde mit einem sterilen
Skalpell ausgeschnitten und in ein bis drei sterile 50 ml Plastikgefäße überführt.
Material und Methoden 46
Elution der RNA aus dem PAA-Gel
Um die RNA aus dem Gel eluieren zu können, wurden die Gelstücke mit einem RNase freien
Glasstab zerkleinert und mit 50–150 ml 0,3 M Na-Ac pH 5,5 überschichtet. Die Elution
erfolgte über Nacht bei RT unter Schütteln. Anschließend wurde das Eluat mit Hilfe eines
Steritopfilters (Porengröße 0,45 µm) von den Feststoffen befreit. Das Filtrat wurde
abschließend wie oben beschrieben per DEAE-Säulenchromatografie aufgereinigt.
In vitro-Transkription und Aufreinigung von radioaktiv markierter RNA
SP6-Polymerase und T7-Polymerase wurden zur in vitro Synthese von radioaktiv markierter
RNA verwendet. α-32P UTP (3000 Ci/mmol) wurde ab dem Kalibrierungsdatum für maximal
7 Tage verwendet. Tabelle 3.7 gibt die Reaktionsbedingungen wieder. Die Transkription
wurde im 20 µl Maßstab bei 37°C für 2 h durchgeführt (Tabelle 3.7) und wie oben
beschrieben über denaturierende PAGE aufgereinigt.
Tabelle 3.7 Reaktionsbedingungen bei der radioaktiven in vitro Transkription
Die Elution der RNA erfolgte für 6 h bis über Nacht bei 4°C in 400 µl Elutionspuffer für
RNA. Anschließend wurde der Überstand vorsichtig abgezogen und mit 2,5 Volumen Ethanol
für 5 min in flüssigen Stickstoff gefällt und 10 min bei 13k rpm (RT) abzentrifugiert. Das
Pellet wurde mit 500 µl 70% Ethanol gewaschen und wie oben abzentrifugiert. Das
getrocknete Pellet wurde in 20 – 50 µl H2O resuspendiert und die Aktivität im
10x Polymerasepuffer (Roche) 2 µl
Plasmid Template 2–5 µg
10x rNTP-Mix
(5 mM A, C, G, 1 mM U)
2 µl
α-32P UTP (3000 Ci/mmol) 4 µl
RNA guard 1 µl
SP6-RNA Polymerase (50 U/µl)
oder
T7-RNA Polymerase (1:50)
2 µl
oder
0,5–1 µl
H2O auf 20 µl
Reaktion bei 37°C
Material und Methoden 47
Szintillationszähler bestimmt. Dazu wurden 2 µl RNA mit 3 ml Szintillationsflüssigkeit
gemischt und vermessen. Die aufgereinigte RNA wurde portioniert und bei –20°C gelagert.
3.3.8 Fluoreszenz Messungen
Bestimmen der Bindekonstanten über Tetracyclin Titrationsspektroskopie
Alle Messungen wurden bei 25°C an einem Fluorolog FL3-22 durchgeführt. Die Anregung
erfolgte für alle Tc-Derivate bei 370 nm. Die einzige Ausnahme stellte Anhydrotetracyclin
mit einer Anregungswellenlänge von 455 nm dar. Die Emissionsspektren wurden von 450 nm
bis 600 nm in Schritten von 1 nm aufgezeichnet. Die Integrationszeit pro Datenpunkt betrug
0,3 sec, die Spaltbreite betrug 2 mm. Für die Messungen wurden Acryl-Küvetten mit einer
Seitenlänge von 1 cm verwendet. Die verwendeten Rührfische wurden über Nacht in 2 M
NaOH gewaschen, gründlich mit H2O gespült und autoklaviert. Vor Gebrauch wurde der
Rührfisch mit Puffer-K gespült und mit Druckluft getrocknet. Die Tc oder Tc-Derivat Lösung
wurde in einem Volumen von 2 ml in Puffer P vorgelegt. Pro Messreihe wurden maximal 100
µl RNA in Puffer-K zutitriert, da somit die Volumenerhöhung (maximal 5%)
vernachlässigbar ist. Nach jeder Titration wurde der Ansatz gerührt und vor der Messung für
10 min äquilibriert. Der Bereich des Signalmaximums der emittierten Fluoreszenz wurde
gemittelt, normalisiert und gegen die Konzentration der freien RNA aufgetragen. Dazu wurde
die fraktionale Sättigung FS berechnet:
FS = (S – Smin) / (Smax – Smin) = ∆S / ∆Smax
∆S ist der Unterschied zwischen dem Fluoreszenzsignal (S) und der Hintergrundfluoreszenz
(Smin) bei jedem einzelnen Titrationsschritt. ∆Smax ist der Unterschied zwischen dem
Fluoreszenzmaximum bei vollständiger Sättigung (Smax) und Smin. Da das detektierte
Fluoreszenzsignal vom Tc stammt, welches als Akzeptormolekül dient, entspricht FS dem
Grad der Sättigung. Die Konzentration der freien RNA wurde somit als
cfreie-RNA = ctotal-RNA – (FS * c(tc))
berechnet.
Die Berechnung der isothermalen Bindekurve, der Dissoziationskonstante (KD) und der
maximalen Anzahl an Bindestellen (B) erfolgt iterativ anhand der Gleichung
FS = (Bmax * cfreie-RNA / (KD + cfreie-RNA))
mit Hilfe der Software Origin 5.0.
Material und Methoden 48
GFP Messungen
Alle Messungen wurden bei 25°C an einem Fluorolog FL3-22 durchgeführt. Die Anregung
erfolgte bei 484 nm. Die Emissionsspektren wurden von 490 nm bis 530 nm in Schritten von
1 nm aufgezeichnet. Die Integrationszeit pro Datenpunkt betrug 0,3 sec, die Spaltbreite betrug
2 mm. Für die Messungen wurden Acryl-Küvetten mit einer Seitenlänge von 1 cm verwendet.
Für GFP Messungen wurde der Stamm S. cerevisiae RS 453 verwendet. Der mit dem Plasmid
pWHE601 oder pWHE601-AN32 transformierte Hefe-Stamm wurde für 48 h in 10 ml MM-
Medium ± 100 µM Tc-Derivat inkubiert. Die Zellen wurden 10 min bei 8500 rpm
abzentrifugiert, das Zellpellet zweimal mit PBS gewaschen und in 2 ml PBS resuspendiert.
Pro Derivat wurden 3 parallele Ansätze vermessen und an zwei Messtagen wiederholt. Die
Zelldichte wurde anhand der optischen Dichte bei 600 nm bestimmt und wurde zur
Normalisierung der Absorbtionswerte verrechnet.
3.3.9 Isothermale Titrationskalorimetrie
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) Experimente wurden an einem Microcal VP-ITC
Gerät am NKI in Amsterdam durchgeführt. Mittels ITC Messungen kann das
thermodynamische Verhalten einer Bindungsreaktion untersucht werden. Enthalpie (∆H) und
Entropie (-T∆S) sowie die Bindungsstärke und Stöchiometrie einer Reaktion können direkt
bestimmt werden. Die Messzelle (1,44 ml) wurde mit RNA Lösung in Puffer-T gefüllt und
auf 25°C äquilibriert. Die Injektionskanüle enthielt in Puffer-T gelöstes Tc oder ein Tc-
Derivat. Jedes Experiment wurde mit einer 2 µl Injektion gestartet, gefolgt von 10 µl oder 15
µl Injektionen in einem Abstand von 3 min. Jede Injektion erzeugte eine Wärmepulskurve
(µcal/sek vs min). Die bei jedem Titrationsschritt freiwerdende Wärme wurde durch
Integration der Fläche einer jeden Wärmepulskurve ermittelt und bezüglich der
Verdünnungswärme (Injektionen von Tc in Puffer-T) korrigiert. Die integrierten Wärmepulse
wurden gegen das entsprechende molare Verhältnis von Tc und RNA aufgetragen. Die
Prozessierung der Rohdaten und Erstellung der Titrationskurve erfolgte mit Hilfe der vom
Hersteller gelieferten Software Microcal Origin 5.0, da diese ein spezielles Modul zur
Auswertung von ITC-Daten enthält.
Material und Methoden 49
3.3.10 Analytische Gelfiltration am SMART System
Analytische Gelfiltrationen wurden am Pharmacia SMART System anhand einer Superdex
GF75 Säule durchgeführt. Die Säule wurde zuvor mit 20 ml Puffer T äquilibriert. Die
Flussrate betrug 80 µl/min. Das Probenvolumen war 15 µl. Als Laufpuffer wurde Puffer-T
verwendet. Die optische Dichte wurde bei 290 nm und 374 nm verfolgt.
3.4 Aufreinigung der T7-RNA-Polymerase
Überexpression
Zur Überexpression wurde der Stamm E. coli BL21 / pAE1219 verwendet, welcher von Dr.
Matthias Görlach (IMB Jena, Abteilung für Biophysik) zur Verfügung gestellt wurde.
2x 1 l LBAmp 100 Medium wurden mit jeweils 10 ml üNK angeimpft und bei 37°C unter
schütteln inkubiert. Bei einer oD600 von 0,5 wurde die Expression der T7-Polymerase mit 0,5
M IPTG (Endkonzentration) induziert und für 3 h weiter inkubiert. Die Zellen wurden durch
Zentrifugation im JA10 Rotor geerntet (5000 rpm, 10 min, 4°C) und mit 50 ml Zell-
Waschpuffer gewaschen. An dieser Stelle kann das Pellet (ca. 8 g Feuchtgewicht) bei –70°C
gelagert werden.
Zellaufschluss
Folgenden Schritte wurden im Kühlraum bei 4°C durchgeführt. 8 g Zellen (aus 2 l Kultur)
wurden in 24 ml Lysis Puffer (frisch zubereitet) in einem Becherglas resuspendiert. Nach
Zugabe von 6 ml Lysozymlösung (1,5 mg/ml in Lysispuffer) wurde für 20 min auf Eis
inkubiert. Anschließend wurden 2,5 ml einer 0,8% Deoxycholat-Lösung zugegeben und für
20 min auf Eis unter Rühren weiterinkubiert. Der Zellaufschluss erfolgte durch Beschallung
mit der großen Ultraschallsonde für 10 x 5 sec bei 30% Leistung. Die viskose Suspension
wurde mit kalten Lysispuffer auf 50 ml aufgefüllt. Nach Zugabe von 5 ml einer 10%
Ethylenimin Polymer Lösung (pH 8,0) nimmt die Viskosität stark ab. Die Lösung wurde für
weitere 20 min auf Eis gerührt und anschließend für 15 min bei 20000 rpm im Ti60 Rotor bei
4°C abzentrifugiert. Zum Überstand wurde unter Rühren das 0,82-fache Volumen einer
gesättigten Ammoniumsulfat-Lösung tröpfchenweise zugegeben. Es wurde weitere 30 min
unter rühren inkubiert und anschließend bei 8500 rpm und 4°C in der Minifuge
abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 15 ml Puffer C-100 resuspendiert. Anschließend wurde
üN gegen 2x 1 l Puffer C-100 dialysiert (Ausschlussgröße 12 kDa). Das Dialysat wurde für 10
Material und Methoden 50
min bei 8500 rpm und 4°C in der Minifuge abzentrifugiert und durch Zugabe von einem
Volumen Puffer C-0 auf die Pufferbedingung C-50 eingestellt.
SP-Sepharose-FF Kationenaustauscher Chromatografie
Eine Pharmacia XK 26/20 Säule (∅ 26 mm, Höhe 20 cm) wurde mit 50 ml SP-Sepharose-FF
befüllt. Die Säule wurde an einer Äkta prime im Kühlraum bei 4°C betrieben. Die verwendete
Programmierung ist in Tabelle 8.6 aufgelistet. Die Äquilibrierung der Säule erfolgte mit 200
ml Puffer C-50 bei einer Flussrate von 5 ml/min. Das auf Pufferbedingung C-50 eingestellte
Dialysat wurde bei einer Flussrate von 5 ml/min auf die Säule geladen. Anschließend wurde
mit 200 ml Puffer C-50 bei 5 ml/min gewaschen. Die Elution erfolgte mit Puffer C-200. Das
Eluat wurde in 1,2 ml Fraktionen in 1,5 ml Schraubeppis gesammelt. Dazu wurde der
passende Einsatz für den Fraktionen-Sammler montiert. Der Schreiber wurde bei 2 mm/min
und einer Empfindlichkeit von 0,5 V betrieben. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden
auf einem denaturierenden 7% PAA Gel analysiert. Die T7-RNA-Polymerase enthaltenden
Fraktionen wurden vereinigt und 1:2 mit Puffer C-0 verdünnt. Anschließend wurde üN gegen
3 l Puffer C-20 bei 4°C dialysiert (Ausschlussgröße 12 kDa). Das Volumen des Dialysats
wurde bestimmt.
DEAE-Sepharose FF Anionenaustauscher Chromatografie
Eine Pharmacia XK 26/20 Säule (∅ 26 mm, Höhe 20 cm) wurde mit 30 ml DEAE-Sepharose-
FF befüllt. Das entsprichr einer Säulenmaterialhöhe von 6 cm. Die Säule wurde an einer Äkta
prime im Kühlraum bei 4°C betrieben. Die verwendete Programmierung ist in Tabelle 8.7
aufgelistet. Die Äquilibrierung der Säule erfolgte mit 200 ml Puffer C-25 bei einer Flussrate
von 5 ml/min. Die Beladung der Säule erfolgte mit 5 ml/min. Im Anschluß daran wurde mit
200 ml Puffer C-25 gewaschen (Flussrate 5 ml/min). Zur Elution wurde ein linearer Gradient
aus je 200 ml Puffer C-25 und Puffer C-250 bei 5 ml/min verwendet. Es wurden Fraktion zu
je 7 ml gesammelt. Der Schreiber wurde bei 2 mm/min und einer Empfindlichkeit von 0,1 V
betrieben. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden auf einem denaturierenden 7% PAA
Gel analysiert. Alle T7-RNA-Polymerase enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mit
Hilfe von Centriprep 10 Filtereinheiten auf ca. 20% des Ausgangsvolumens eingeengt.
Anschließend wurde üN bei 4°C gegen 1 l Puffer C-10 und nochmals üN gegen 1 l Puffer C-0
dialysiert (Ausschlussgröße 12 kDa). Das Präzipitat enthält die T7-RNA-Polymerase. Dieses
wird durch Zentrifugation (10 min/8000 rpm/4°C) gewonnen und in 10-15 ml Puffer C-100
resuspendiert. Anschließend wurde üN bei 4°C gegen 1 l Puffer C-100 + 50 % Glycerin
Material und Methoden 51
dialysiert. Die T7-RNA-Polymerase kann bei –20°C gelagert werden. Der oxidative Abbau
der Polymerase wird durch monatliche Zugabe von 1 mM DTT verhindert.
Denaturierende Proteingelelektrophorese
Denaturierende Proteingele wurden nach der Methode von (Laemmli, 1970) hergestellt. Die
Gele, bestehend aus Trenn- und Sammelgel, wurden mit einer Dicke von 1 mm gegossen. Die
Proben wurden mit SDS-Probenpuffer versetzt und vor der Auftragung 5 min auf 95°C
erhitzt. Die Gelläufe erfolgten bei 100 V. Danach wurden die Gele 20 min in Waschlösung
fixiert, 15 min mit Färbelösung behandelt und ÜN in 10% Essigsäure entfärbt. Als
Größenstandard wurde der peqGOLD Protein-Marker II verwendet (Fragmentgrößen in kDa:
10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 85, 100, 120, 150, 200).
3.5 Präparation eines Hefe Zellextrakts
Zellanzucht
1 l YEPD-Medium wurden mit 10 ml einer S. cerevisiae BJ2168 üNK angeimpft und unter
schütteln bei 30°C üN bis zu einer oD600 von 3–5 inkubiert. Die Zellen wurden durch
Zentrifugation (JA 10 Rotor, 7000 rpm, 15 min, 4°C) geerntet. Das Pellet wurde je einmal in
50 ml kaltem Milliporewasser und 50 ml kaltem AGK-Puffer (+25 µl 1 M DTT; +100 µl 1 M
Benzamidin) gewaschen und wie oben in der Minifuge abzentrifugiert. Anschließend wurde
das Pellet in 10 ml kaltem AGK-Puffer (+ 5 µl 1 M DTT; + 25 µl 0,2 M PMSF; + 20 µl 1 M
Benzamidin) resuspendiert und das Volumen bestimmt. Anhand der Volumen Erhöhung
wurden die Konzentrationen von KCl, DTT und PMSF berechnet. Die Zellsuspension wurde
anschließend mit 2 M KCl-Stammlösung auf 200 mM KCl, mit 1 M DTT-Stammlösung auf
0,5 mM DTT und mit 0,2 M PMSF-Stammlösung auf 0,5 mM PMSF eingestellt. Die Zellen
wurden im Kühlraum in flüssigen N2 getropft, so dass möglichst kleine Zellkügelchen
entstanden, welche bei –70 °C gelagert wurden. Dazu wurden 50 ml Plastikgefäße mit
flüssigen N2 gefüllt. Vor dem Verschließen der Gefäße wurden mit einer sterilen Nadel kleine
Löcher in den Deckel gestochen, um den verdampfenden N2 entweichen zu lassen.
Zellaufschluss mit Mörser und Pistill
Um die Zellen möglichst schonend aufzuschließen, wurden diese mechanisch zerkleinert.
Dazu wurde ein auf –20 °C vorgekühlter Mörser im Kühlraum auf Eis mit flüssigen N2 weiter
heruntergekühlt. Die Zellkügelchen wurden darin unter ständiger Zufuhr von flüssigen N2 zu
Material und Methoden 52
einem sehr feinen Puder zermahlen. Anschließend wurde das Zellpuder unter ständigen
Rühren bei 4°C aufgetaut. Das Homogenat wurde abzentrifugiert (JA 20 Rotor, 17k rpm, 4°C,
30 min). Der Überstand wurde ultrazentrifugiert (Ti60 Rotor, 37k rpm, 4 °C, 1 h). Das
Ultrazentrifugen-Röhrchen wurde erschütterungsfrei dem Rotor entnommen und geöffnet.
Der klare Überstand zwischen Pellet und Fettschicht wurde zügig mit gläsernen Pasteur-
Pipetten abgezogen. Hierbei wurde vermieden, dass Teile des Pellets oder der Fettschicht
verschleppt wurden. Anschließend wurde 2x für je 90 min gegen 1 l Puffer-D (mit DTT,
PMSF und Benzamidin) bei 4 °C dialysiert (MWCO 6000 – 8000). Der Zellextrakt wurde zu
100 µl aliquotiert und in flüssigen N2 schockgefroren. Die Lagerung erfolgte bei –70 °C.
3.6 in vitro Spleißexperimente
In vitro Spleißexperimente wurden an der Aktin prä mRNA durchgeführt. Die Präparation
von radioaktiv markierter Aktin RNA erfolgt wie in Kapitel 3.3.7 beschrieben. Als DNA-
Matrize für die in vitro Transkription diente EcoRI linearisiertes Plasmid pSP6-Aktin. Die
aufgereinigte RNA wurde im Szintillationszähler auf ihre Aktivität vermessen und auf eine
Konzentration von 40000 Zerfällen pro Minute und µl (cpm/µl) eingestellt.
Für die Spleißreaktion wurde ein Hefezellextrakt aus dem Stamm S. cerevisiae BJ2168
verwendet. Die Präparation ist in Kapitel 3.5 beschrieben.
Für die in vitro Spleißreaktion wurden die in Tabelle 3.8 aufgeführten Lösungen (5x Spleiß
Cocktail, Mix 1 und Mix Aktin) frisch hergestellt und bei RT aufbewahrt.
Tabelle 3.8
5x Spleiß Cocktail Mix 1 Mix Aktin
80 µl K-PO4-PEG
10 µl 0,1 M ATP
5 µl 0,25 M MgCl2 20,4 µl H2O 6,0 µl Aktin (40000 cpm/µl)
2 µl 0,5 M Spermidin 9,6 µl 5x Spleiß Cocktail 4,8 µl 5x Spleiß Cocktail
1,5 µl H2O 24 µl Hefe Zellextrakt 1,2 µl H2O
100 µl 54 µl 12,0 µl
Material und Methoden 53
Für die Spleißreaktion wurden pro Ansatz 4,5 µl Mix 1 und 0,5 µl Mix Aktin gemischt und
bei 23°C inkubiert. Die Inkubationszeit betrug maximal 45 min. Zum Beenden der
Spleißreaktion wurde jeweils 1 µl Proteinase K Mix zugegeben und 15 min bei 37°C
inkubiert. Anschließend wurden 200 µl Stoppuffer 2 zugegeben und gemischt.
Die weitere Aufreinigung erfolgte durch Phenolextraktion. Dazu wurden jeweils 200 µl
Phenol (für RNA) zugegeben, gevortext und 15 min bei 13000 rpm abzentrifugiert. Die
wässrige Phase (ca. 180 µl) wurde vorsichtig abgezogen und in ein frisches Eppendorfgefäß
überführt. Für die anschließende Ethanolfällung wurde das 2,5x Volumen an kaltem Ethanol
zugegeben, gemischt und für 3 min in flüssigen Stickstoff inkubiert. Anschließend wurde die
RNA für 30 min bei 13000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgezogen
und das getrocknete Pellet in 10 µl RNA Auftragepuffer durch kurzes Vortexen resuspendiert.
Die Proben wurden auf ein denaturierendes 6% PAA-Gel aufgetragen. Die Gelelektrophorese
erfolgte bei 25 W bis die Xylen-Cyanol Bande den unteren Gelrand erreicht hat. Eine
Phosphoimager-Platte wurde üN belichtet und anschließend ausgelesen.
Ergebnisse 54
4 Ergebnisse
4.1 in vitro Synthese von Aptamer-RNA
Für in vitro Experimente wurden das 69 Nukleotide (Nt) lange Aptamer cb32 und das 57
Nukleotide lange Minimer cb32_short um ein zusätzliches GC Basenpaar im Stamm P1
verlängert (Berens et al., 2001; Hanson et al., 2005). Dies war erforderlich, um eine
Transkription als Hammerhead-Ribozym Fusions-RNA zu ermöglichen (Abbildung 4.1 (A)).
Die veränderten Aptamere wurden als Tc-Aptamer und Tc-Minimer bezeichnet und sind in
Abbildung 4.1 (B) dargestellt. Im Tc-Minimer wurde der Stamm P2 verkürzt. Dieser wird nun
von der stabilen Tetranukleotidschleife GAAA abgeschlossen. Um die ursprüngliche
Nummerierung beizubehalten, trägt das 5´-terminale Nt die Nummer Null.
A B
A C C A C C U A G G C U U A G A G
G A U C C G A A U C U C
GUG
A
C
AAGCAGG
G A GUCC
CU
GAU
GUG
A
AACUX
3´-
5´- X
RibozymSpaltstelle
1 2 3 4 5 6 7
3´- terminale Sequenzder Aptamer RNA
UAGACC
CGC
GCG
U
AA
A A
AU
C
C
UU
UC
UU
A
CC
CCA
A
A
GGG
GGCC
CGG
A AA
A
AA
C C
A CCC
G
G
U
UA
A
691
10
40
50
60
20
30
UG C
GA
AA
U G
A G GG UB1-2 L3
Abbildung 4.1
(A) Sekundärstruktur des Hammerhead-Ribozyms als Fusions-RNA mit dem Tc-Aptamer. Die eingerahmten Nt entsprechen dem 3´-Terminus der Aptamer-RNA. Die Spaltstelle für das Ribozym ist angegeben. (B) Sekundärstrukturen vom Tc-Aptamer und Tc-Minimer. Für das Tc-Minimer ist nur der Unterschied zum Tc-Aptamer angegeben. Das erste Nt (G) trägt die Nummer Null, um die ursprüngliche Nummerierung beizubehalten (Hanson et al., 2005).
Ergebnisse 55
4.1.1 Das Hammerhead-Ribozym
Bei der in vitro Transkription mit T7-RNA Polymerase dient das 3´- Ende eines linearisierten
Templates (bei pSP64 HindIII) als Stopsignal für die Transkription („run off“ Transkription).
Da die T7-RNA Polymerase an das 3´-Ende der synthetisierten RNA unspezifisch zusätzliche
Nt anhängt, wurde die Aptamer-RNA als Fusionsprodukt mit einer Hammerhead-Ribozym-
RNA-Sequenz transkribiert, dessen intramolekulares Substrat das 3´-Ende der Aptamer-RNA
ist. Die 3´-terminale Sequenz des Aptamers (CUC) stellt die Hammerhead-Ribozym-
Spaltstelle dar. Die Fusions-RNA wird 3´- zum letzten Cytosin hydrolysiert. Dadurch wird ein
RNA-Produkt mit einem homogenen 3´-Ende erhalten. Abbildung 4.1 (A) zeigt die
Sekundärstruktur des Hammerhead-Ribozyms. Die eingerahmten Nt 1–7 (3´-Ende der
Aptamer-RNA) müssen mit dem 3´-Ende der Ribozym-Sequenz Basenpaarungen eingehen,
damit sich ein korrekt gefaltetes und somit aktives Ribozym ausbilden kann.
4.1.2 Der Klonierungsvektor pSP64
Als DNA-Matrize für die in vitro Transkription diente der Vektor pSP64 X, welcher die
Aptamer-Sequenzen (X = Tc-Aptamer, Tc-Minimer) unter Kontrolle des T7-Promotors
enthält. Als Ausgangsvektor für die Klonierung der Transkriptionsvektoren diente das
Plasmid pSP64 von Promega. Der Vektor ist 2999 Nukleotide lang, trägt eine Ampicillin
Resistenzkassette und den E. coli ori pMB1. In Abbildung 4.2 ist die Multiple
Klonierungsstelle (MCS) von pSP64 mit den relevanten singulären Schnittstellen für die
Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII dargestellt. Abbildung 4.3 zeigt diesen
Sequenzausschnitt nach der Klonierung von pSP64 Tc-Aptamer.
Amp R, ori pMB1
Hind III EcoRI
MCS
Abbildung 4.2
Multiple Klonierungsstelle (MCS) in pSP64; die relevanten Schnittstellen EcoRI und HindII sind eingezeichnet
Ergebnisse 56
sp
1 5´-GGAATTGTGA GCGGATAACA ATTTCACACA GGAAACAGCT ATGACCATGA
3´-CCTTAACACT CGCCTATTGT TAAAGTGTGT CCTTTGTCGA TACTGGTACT
EcoRI T7-Promotor
51 TTACGAATTC TAATACGACT CACTATAGGG CCTAAAACAT ACCAGATCGC
AATGCTTAAG ATTATGCTGA GTGATATCCC GGATTTTGTA TGGTCTAGCG
↓
101 CACCCGCGCT TTAATCTGGA GAGGTGAAGA ATACGACCAC CTAGGCTCTA
GTGGGCGCGA AATTAGACCT CTCCACTTCT TATGCTGGTG GATCCGAGAT
HindIII
151 GAGGTGACTC TACTGATGAG TCCGTGAGGA CGAAAGCCTA GAAGCTTGTA
CTCCACTGAG ATGACTACTC AGGCACTCCT GCTTTCGGAT CTTCGAACAT
201 TTCTATAGTG TCACCTAAAT CGTATGTGTA TGATACATAA GGTTATGTAT
AAGATATCAC AGTGGATTTA GCATACACAT ACTATGTATT CCAATACATA
AP1_pSP64
Abbildung 4.3
Für Klonierungen und in vitro Transkription relevanter Sequenzausschnitt von pSP64 Tc-Aptamer. Primersequenzen (sp, AP1_pSP64) und Schnittstellen für die Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII sind unterstrichen. Die T7-Promotor Sequenz ist kursiv dargestellt. Die Tc-Aptamer Sequenz ist in Rot, die Hammerhead-Ribozym Sequenz ist in Grün dargestellt. Der Pfeil markiert die Spaltstelle des Hammerhead-Ribozyms.
4.1.3 Konstruktion der Transkriptionsvektoren
Das Plasmid pSP64 wurde mit den Enzymen HindIII und EcoRI geschnitten und mittels
präparativer Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt. Das jeweilige Insert wurde aus
kommerziell erhältlichen Oligonukleotiden (MWG-Biotech, Ebersberg) erstellt. Dazu wurden
je 10 µl der teilweise komplementären Oligonukleotide (je 10 pM) gemischt und für 10 min
bei 90°C denaturiert. Um eine optimale Hybridisierung der Oligonukleotide zu gewährleisten,
wurde der Ansatz langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschließend wurde der
Oligonukleotidmix enzymatisch phosphoryliert und direkt mit dem HindIII und EcoRI
geschnittenen Vektor pSP64 ligiert. Die jeweils verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle
4.1 aufgelistet.
Ergebnisse 57
Tabelle 4.1 Hybridisierte Oligonukleotide
Plasmid pSP64 Oligonukleotide
Tc-Aptamer hh1, hh2, b1, b2, c3, c4
Tc-Minimer hh1, hh2, c1, c2, c3, c4
Tc-Minimer A55U hh1, hh2, c1, c2, c3_1, c4_1
Alle Punktmutationen von pSP64 Tc-Aptamer wurden über zweistufige PCR-Mutagenese
erstellt. Die Klonierung erfolgte über die singulären Schnittstellen EcoRI und HindIII. Als
äußere Primer dienten sp und AP1_pSP64. Die verwendeten Mutageneseprimer sind in
Tabelle 4.2 aufgeführt.
Tabelle 4.2 Verwendete Mutageneseprimer und äußere Primer
Konstrukt
pSP64 Tc-Aptamer Vorwärts Primer Rückwärts Primer
A8G AP1_pSP64 MP_A8B_R
A9G AP1_pSP64 MP_G9_R
A13U AP1_pSP64 MP_U13_R
A50U sp MP_U50_F
G51U sp MP_U51_F
U54G sp MP_G54_F
A55G sp MP_G55_F
4.2 Synthese und Aufreinigung der RNA
Präparative in vitro Transkriptionsreaktionen im Maßstab 2 – 10 ml wurden wie in Kapitel
3.3.7 beschrieben durchgeführt und mittels denaturierender PAGE analysiert. Abbildung 4.4
zeigt exemplarische eine Probe aus einer 2 ml Transkription von Tc-Aptamer RNA. Die
Transkription der RNA erfolgt als Fusions-RNA mit einem Hammerhead-Ribozym
(Abbildung 4.4). Die autokatalytische Hydrolyse erfolgt während der in vitro Transkription.
Ca. 70% der RNA liegen in Form der beiden Spaltprodukte Tc-Aptamer RNA (71 Nt) und
Hammerhead-RNA (47 Nt) vor.
Ergebnisse 58
1 2 3
DNA
FU
Apt
HH
Abbildung 4.4
In vitro Transkription von Tc-Aptamer RNA. 9% PAA/8 M Harnstoff Gel. In Spur 1 wurden 5 µl Transkriptionsansatz aufgetragen. Spur 2 enthält 2 µg Tc-Aptamer RNA als Größenstandard. In Spur 3 wurden 5 µl einer Nullkontrolle (Transkription ohne DNA Template) aufgetragen. Die Banden in Spur 1 entsprechen dem DNA Template (DNA), der Aptamer-Hammerhead- Ribozym-Fusions-RNA (FU), der Tc-Aptamer RNA (Apt) und dem abgespaltenen Hammerhead-RNA Anteil (HH).
Nach Beendigung der Reaktion erfolgte die weitere Aufreinigung über präparative PAGE wie
in Kapitel 3.3.7 beschrieben. Die Konzentration der RNA-Lösung wurde UV-photometrisch
anhand der optischen Dichte bei 260 nm bestimmt. Pro 1 ml Transkription ergaben sich nach
der Aufreinigung 250 – 400 µg Aptamer RNA.
4.3 Konformation und Stöchiometrie des RNA-Tc Komplexes
4.3.1 Analyse des molaren Verhältnisses im Tc-RNA Komplex über analytische
Gelfiltration
Um strukturelle Änderungen oder Multimerisation an der RNA erfassen zu können, wurden
analytische Gelfiltrationsexperimente durchgeführt. 15 µl einer 40 µM Tc-Minimer RNA-
Lösung in Puffer-T wurden in An- und Abwesenheit von 120 µM Tc einer Gelfiltrations-
Chromatografie unterzogen. Der genaue Ablauf ist in Kapitel 3.3.10 beschrieben. Abbildung
4.5 zeigt das resultierende Chromatogramm der untersuchten Tc-Minimer RNA. Die
schwarze Linie entspricht der optischen Dichte bei 290 nm. Bei dieser Wellenlänge wurde das
Laufverhalten der RNA verfolgt. Die gepunktete rote Linie entspricht der optischen Dichte
bei 374 nm, bei der das Tc detektiert wurde. Die Analyse der freien RNA ergibt ein einziges
scharfes Signal bei 1,2 ml. Das Fehlen von zusätzlichen Signalen spricht für eine homogene
RNA-Population. Die Analyse des RNA-Tc Komplexes resultiert in zwei Signalen für die
oD290. Das stärkere Signal stammt von der RNA, wohingegen das zweite Signal vom Tc
Ergebnisse 59
stammt, welches ebenfalls UV-Licht bei 290 nm absorbiert. Die Detektion bei 374 nm ergab
ebenfalls zwei Signale. Das erste oD374 Signal stimmt mit dem oD290 Signal der freien
RNA überein. Dies zeigt, dass Tc an die RNA gebunden ist. Das zweite Signal von oD374 bei
2,3 ml stammt von überschüssigem Tc, welches aufgrund seines im Vergleich zum Tc-RNA
Komplex geringeren hydrodynamischen Radius stärker verzögert wird. Die strikte
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
optis
che
Dic
hte
Volumen / ml0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
optis
che
Dic
hte
Volumen / ml
A B
Abbildung 4.5
Chromatogramm der freien Tc-Minimer RNA (A) und des Tc-RNA Komplexes (B) in Puffer T. Die schwarze Linie zeigt die oD290 (RNA Absorption), die gepunktete rote Linie die oD374 (Tc Absorption). RNA wird nach 1,2 ml eluiert, freies Tc nach 2,3 ml.
Kolokalisation von gebundenem Tc und Aptamer RNA zeigt, dass es sich um einen kinetisch
und thermodynamisch stabilen Komplex handelt. Aufgrund der Komplexbildung kommt es
somit zu keiner über Größenausschluss-Chromatografie detektierbaren, Tc-bedingten
strukturellen Änderung oder Multimerisation der RNA.
Stöchiometrie des Tc-RNA Komplexes
Die Stöchiometrie wurde anhand der Chromatogramme (Abbildung 4.5) aus den exakten
RNA (R) und Tc Konzentrationen berechnet. Dazu musste berücksichtigt werden, dass Tc
ebenfalls UV-Licht bei 290 nm absorbiert. Die Extinktionskoeffizienten ε290(Tc) und
ε290(R) wurden anhand der oD290(Tc) und oD290(R) von Tc und RNA in Puffer-T ermittelt.
Die exakte Tc Konzentration wurde durch UV Absorptionsspektroskopie bestimmt
(Takahashi et al., 1986). Die RNA Konzentration wurde mit 1 oD260 = 0,035 mg/ml und
einem Molekulargewicht von 320 g/mol pro Nt berechnet.
Ergebnisse 60
Dies ergibt
ε290(tc) = oD290(tc) / ( c(tc) x d ) = 9658 M-1 x cm-1 für Tc und
ε290(R) = oD290(R) / ( c(R) x d ) = 95630 M-1 x cm-1 für die RNA.
Als nächstes wurden die Verhältnisse Q(Tc) und Q(R) der oD374 und oD290 für Tc und die
RNA berechnet.
Q(Tc) = oD374(Tc) / oD290(Tc) = 1.872 und
Q(R) = oD374(R) / oD290(R) = 0.000531.
Die Werte oD374(ges) = 0.06257 und oD290(ges) = 0.377063 wurden anhand der
Gelfiltration bei 1,2 ml ermittelt und geben die jeweilige optische Dichte für den Tc-RNA
Komplex (ges) wieder.
Für freie RNA gilt:
oD374(ges) – Q(R) x oD290(ges) = oD374(R) – Q(R) x oD290(R) = 0
Für freies Tc gilt:
oD374(ges) – Q(tc) x oD290(ges) = oD374(tc) – Q(tc) x oD290(tc) = 0
Um die Konzentration von Tc in einer Tc-RNA Mischung zu berechnen, muss berücksichtigt
werden, dass in der folgenden Gleichung immer gilt, dass (Tc) = (ges), da die RNA keinen
Beitrag leistet:
oD374(ges) – Q(R) x oD290(ges) = oD374(tc) – Q(R) x oD290(tc)
= oD290(tc) x ( Q(tc) – Q(R) )
= c(tc) x d x ε290(tc) x ( Q(tc) – Q(R) )
Die Konzentration von Tc in der Mischung berechnet sich daher zu:
c(Tc) = ( oD374(ges) – Q(R) x oD290(ges) ) / (ε290(Tc) x d x ( Q(Tc) – Q(R) ) )
Ergebnisse 61
Um die Konzentration von RNA in einer Tc-RNA Mischung zu berechnen, muss
berücksichtigt werden, dass in der folgenden Gleichung immer gilt, dass (R) = (ges), da das
Tc keinen Beitrag leistet:
oD374(ges) – Q(Tc) x oD290(ges) = oD374(R) – Q(Tc) x oD290(R)
= oD290(R) x ( Q(R) – Q(Tc) )
= c(R) x d x ε290(R) x ( Q(R) – Q(Tc) )
Die Konzentration von RNA in der Mischung berechnet sich daher zu:
c(R) = ( oD374(ges) – Q(Tc) x oD290(ges) ) / (ε290(R) x d x ( Q(R) – Q(Tc) ) )
Somit konnten die Konzentrationen der Bindungspartner im Komplex zu c(Tc) = 34,5 µM
und c(RNA) = 35,9 µM berechnet werden. Dies ergibt ein molares Verhältnis von Tc / RNA
= 0,96 und zeigt an, dass es sich um einen äquimolaren Tc-RNA Komplex handelt
4.3.2 Visualisierung des Tc-Aptamer Komplexes
Aufgrund der im Gelfiltrationsexperiment beobachteten Stabilität des Tc-Aptamer Komplexes
wurde als nächstes versucht, den Komplex mit Hilfe nativer Polyacrylamid Gelelektrophorese
(PAGE) zu visualisieren. Dieses Verfahren weist für gewöhnlich eine höhere Sensitivität
bezüglich struktureller Änderungen auf. Dazu wurde 20 µM RNA ohne und mit 50 µM Tc in
Puffer-T inkubiert und wie in Kapitel 3.3.7 beschrieben mittels nativer PAGE
elektrophoretisch analysiert. Das Gel für Wildtyp RNA und die A55U Mutante ist in
Abbildung 4.6 (A) gezeigt.
Die Spuren 1 – 2 zeigen das Gel nach Ethidiumbromid-Färbung. Die Spuren 3 – 4 zeigen die
Tc-Fluoreszenz des Gels unter 365 nm UV-Licht. Die Spuren 5 – 6 zeigen eine Überlagerung
der Tc-Fluoreszenz und des Ethidiumbromid gefärbten Gels. Tc war in den Spuren 2 und 4
enthalten. Anhand der Ethidiumbromid-Färbung ist deutlich zu erkennen, dass die Tc-
Minimer RNA eine einzige Konformation annimmt. Das Tc-Fluoreszenz-Signal stimmt exakt
mit der Laufweite der RNA überein. Dies bedeutet, dass die RNA Tc binden kann. Ebenso ist
zu beobachten, dass es durch Tc zu keiner detektierbaren Veränderung der
elektrophoretischen Mobilität der RNA kommt. Dies wäre ein Hinweis auf strukturelle
Veränderungen gewesen, die sich auf den hydrodynamischen Radius der RNA auswirken.
Ergebnisse 62
Solche Veränderungen sind z.B. Multimerisations-Ereignisse, aufgrund derer zusätzliche
RNA-Signale mit geringerer elektrophoretischer Mobilität zu erwarten gewesen wären.
0 10 20 30 40 50
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
c Konzentration (µM)
rela
tive
Fluo
resz
enz
A B
Tc - + - + - + - + - + - +
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tc-Minimer A55U
Abbildung 4.6
(A) Native PAGE zur Analyse der Komplexbildung von Aptamer RNA Minimer RNA, in Spur 7 – 12 die A55U Mutante untersucht. Spuren 1 - 2 ungefärbte Gel, Spuren 3 – 4 und 9 – 10 zeigen die Tc-Fluoreszenz bei BestraSpuren 5 – 6 und 11 – 12 sind die entsprechenden Überlagerungen zKomplexbildung von Tc-Minimer RNA und steigenden Tc-KonzentrationenGelfotos gibt die Tc-Fluoreszenz wieder, der untere Teil zeigt das Ethidiumb Die Spuren 7 - 12 zeigen die A55U Mutante. Von dieser Mut
einer Verschlechterung des Regulationsfaktors in vivo führt
experimentelle Vorgehen war identisch mit dem für die Wild
zeigen das Gel nach Ethidiumbromid-Färbung. Die Spuren 9 –
des Gels unter 365 nm UV-Licht. Die Spuren 11 – 12 zeige
Fluoreszenz und des Ethidiumbromid gefärbten Gels. Tc war in
Im Gegensatz zur Wildtyp-RNA zeigt die A55U Mutante eine
geringerer elektrophoretischer Mobilität. Aufgrund des A55U
Bereich L3 zur palindromen Sequenz 51GAAUUC. Dies er
(Formation eines „kissing loop“ Komplexes), die als z
verzögertem Laufverhalten sichtbar wird. Diese RNA-Spezies
binden, da an dieser Stelle kein für Tc typisches Fluoresz
monomere Form ist in der Lage, Tc zu binden. Dies bestätigt
Komplex aus jeweils einem Molekül monomerer RNA und eine
den vorliegenden Bedingungen liegen ca. 50% der A55U RNA
Dimer vor. Aufgrund der Dimerisierung scheint es im betr
strukturellen Umorientierungen zu kommen, die eine Tc-Bind
Hinweis, dass diese Region an der Tc-Bindung beteiligt ist.
T
und Tc. In Spur 1 – 6 wurde Tc-d 7 – 8 zeigen das Ethidiumbromid
hlung mit 365 nm UV-Licht. In den u sehen. (B) Quantifizierung der . Der obere Teil des eingebundenen romid gefärbte Gel.
ation ist bekannt, dass sie zu
(Hanson et al., 2005). Das
typ-RNA. Die Spuren 7 – 8
10 zeigen die Tc-Fluoreszenz
n eine Überlagerung der Tc-
den Spuren 2 und 4 enthalten.
zusätzliche RNA-Bande mit
Nt-Austausches kommt es im
möglicht eine Dimerbildung
usätzliche RNA-Bande mit
ist nicht in der Lage, Tc zu
enzsignal auftritt. Allein die
die Annahme, dass der aktive
m Molekül Tc besteht. Unter
als Monomer und ca. 50% als
offenen Bereich von L3 zu
ung verhindern. Dies ist ein
Ergebnisse 63
Anschließend wurde die Stöchiometrie der Tc-RNA Komplexbildung anhand eines
Titrationsexperiments untersucht. Dazu wurde 20 µM Tc-Minimer RNA mit 0, 10, 15, 20, 30
und 50 µM Tc in insgesamt 10 µl Puffer-T inkubiert und einer nativen PAGE unterzogen. Die
Tc-Fluoreszenz eines jeden Komplexes wurde densidometrisch quantifiziert und gegen die
Tc-Konzentration aufgetragen. Die resultierende Bindekurve ist in Abbildung 4.6 (B)
dargestellt. Das Ethidiumbromid gefärbte Gel und die zugehörige Tc-Fluoreszenz sind
ebenfalls abgebildet. Die Bindekurve erreicht die Sättigung bei 15 µM Tc. Dies weißt
ebenfalls auf einen äquimolaren Komplex aus Aptamer-RNA und Tc hin.
4.4 Thermodynamische Charakterisierung des RNA-Tc Komplexes
Die Ergebnisse von analytischer Gelfiltration und nativen PAGE Experimenten bestätigten
nicht nur die angenommene 1:1 Stöchiometrie und die Existenz von konformationell
homogenen Populationen von freier und an Tc gebundener RNA, sondern deuten auch auf
eine ausgesprochen hohe thermodynamische Stabilität des Komplexes hin. Daher wurde diese
Komplexbildung mittels zweier unterschiedlicher Verfahren näher charakterisiert.
4.4.1 Titrationsfluoreszenzspektroskopie
Aufgrund seiner chemischen Struktur fluoresziert Tc bei Anregung mit 370 nm UV-Licht im
Bereich von 480 – 520 nm. Beim Übergang aus einer wässrigen (in Lösung) in eine
hydrophobe (im Komplex mit RNA) Umgebung kommt es zu einer starken Zunahme der Tc-
Fluoreszenz, welche quantifiziert werden kann (Takahashi et al., 1986). Dieses intrinsische
Verhalten von Tc wurde bei der Titrationsfluoreszenzspektroskopie ausgenutzt.
Fluoreszenzmessungen am Tc-Aptamer
Zur Quantifizierung der Bindung von Tc an das Aptamer wurden Dissoziationskonstanten
(KD) bestimmt. Dazu wurde in vitro transkribierte Aptamer RNA zu einer Tc-Lösung in
Puffer-K titriert und der entstandene Fluoreszenzanstieg detektiert (Abbildung 4.7 (A)). Das
experimentelle Vorgehen ist in Kapitel 3.3.8 beschrieben. Aus dem Fluoreszenzanstieg wurde
die isothermale Bindekurve berechnet. Abbildung 4.7 (B) zeigt die berechnete Bindekurve.
Für das Tc-Aptamer wurden durch nichtlineare Regression ein KD von 0,73 nM und eine
Stöchiometrie N von 1,05 ermittelt. Alle Experimente wurden mindestens zweimal
wiederholt. Die gewonnenen Daten sind in Tabelle 4.3 enthalten.
Ergebnisse 64
440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200
2000
4000
6000
8000
10000
Puffer 0 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 4 nM RNA 6 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm0 5 10 15 20
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
F S
freie RNA / nM
A B
Abbildung 4.7
(A) Spektrenschar der Titration von Tc-Aptamer RNA zu 0,5 nM Tc. (B) Die ausgefüllten Symbole zeigen die Messwerte, die durchgezogene Linie die berechnete Bindekurve.
Mg2+-Abhängigkeit der Komplexbildung von Aptamer-RNA und Tc
Die Tertiärstruktur und Stabilität einer RNA sind von essentieller Bedeutung für ihre
biologische Funktion (Ohmichi et al., 2002). Für die Struktur und somit auch für die Funktion
katalytischer RNAs sind divalente Kationen wie Mg2+ von größter Bedeutung (Bujalowski et
al., 1986; Koizumi et al., 1991; Sugimoto et al., 1996). Für Tc ist ebenfalls bekannt, dass es
in der Lage ist, Mg2+ Ionen zu binden. Daher wurde die Mg2+-Abhängigkeit der Tc-Bindung
an die Aptamer-RNA fluoreszenzspektroskopisch untersucht. Zu 0,5 nM Tc in 20 mM K-PO4
(pH 7,5), 100 mM NaCl und 1 mM EDTA wurde Tc-Aptamer RNA titriert (bis 15 nM
Endkonzentration). Hierbei war kein Anstieg in der Tc-Fluoreszenz messbar, wie er für die
Komplexbildung typisch ist (siehe Abbildung 4.8). Erst bei Zugabe von Mg2+ Ionen konnte
wieder der typische Fluoreszenzanstieg beobachtet werden.
440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200
2000
4000
6000
8000
10000 1mM EDTA 0 nM RNA 5 nM RNA 15 nM RNA + 1 mM MgCl2 + 2 mM MgCl2 + 10 mM MgCl2 + 15 mM MgCl2
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm
Abbildung 4.8
Mg2+-Titration von 0,5 nM Tc mit 15 nM Tc-Aptamer RNA in 20 mM K-PO4 (pH 7,5), 100 mM NaCl und 1 mM EDTA. Anschließend Zugabe von MgCl2 bis zu einer Endkonzentration von 15 mM.
Ergebnisse 65
Tabelle 4.3 Getestete Aptamer-Mutanten
Tetracyclin Doxycyclin Col 2 Oxytetracyclin
RNA c(Tc) (nM) N KD
(nM) Regulation in vivo a
c(dox) (nM) N KD
(nM) c(Col2)
(nM) N KD (nM)
c(Oxy)(nM) N KD
(nM)
Tc-Aptamer 0,5 1,05 ±0,01
0,73 ±0,05 5,8 10 1,21
±0,02 115 ±4 1,0 1,22
±0,04 9,8 ±0,9 1,0 1,00
±0,01 1,37 ±0,08
A8G
0,5 1,06 ±0,02
0,93 ±0,08 3,1
A9G 40 1,09 ±0,01
149 ±8 1,0 30 1 17700
±4300 10 1,14 ±0,01
2600 ±40 40 1,17
±0,01 450 ±10
A13U 30 1,26 ±0,01
210 ±3 0,9 30 1,50
±0,01 2390 ±40 30 1,39
±0,01 1700 ±30 30 1,26
±0,01 520 ±10
A50U 40 1,26 ±0,02
184 ±6 0,9, 0,9 b 50 1 10500
±2500 10 1,21 ±0,01
2600 ±70 40 1,15
±0,01 605 ±15
G51U 0,5 1,17 ±0,01
2,9 ±0,1 3,0
U54G 0,5 1,01 ±0,02
2,50 ±0,20 3,3
A55G 1,0 1,03 ±0,01
1,50 ±0,06 2,9 c
N Stöchiometrie; Kursiv geschriebene Werte: die Sättigung konnte nicht erreicht werden, daher wurden die Werte aus der Anfangssteigung berechnet a Die angegebenen in vivo Regulationsfaktoren geben das Verhältnis der GFP-Fluoreszenz mit und ohne 100 µM Tc im Medium wieder (Hanson et al., 2005). b A50U und A55G erzeugen ein zusätzliches Startkodon und sind somit nicht direkt messbar, in vivo Regulationsfaktoren für A50G bzw. A50C c Regulationsfaktor wurde als Doppelmutante mit A53C um die Bildung eines zusätzliches Startkodons zu verhindern. A53C zeigt in vivo Regulation wie WT.
Ergebnisse 66
Fluoreszenzmessungen mit verschiedenen Tc-Derivaten
Um die Interaktion von Tc und RNA näher zu charakterisieren, wurde das Bindungsverhalten
verschiedener Tc-Derivate an das Tc-Aptamer fluoreszenzspektroskopisch analysiert. Dies
diente nicht nur zur Analyse der Substratspezifität der Aptamer-RNA in vitro, sondern auch
zur Ermittlung funktioneller Gruppen, welche für die Komplexbildung essentiell sind. Die
untersuchten Tc-Derivate sind in Tabelle 4.4 aufgelistet und unterscheiden sich durch ein oder
mehrere Substitutionen an ihren funktionellen Gruppen von Tc. Diese sind in Abbildung 4.9
dargestellt. Die eingesetzten Konzentrationen wurden dem Bindeverhalten des jeweiligen Tc-
Derivats angepasst. Alle Messungen wurden mindestens zweimal wiederholt. Die
aufgezeichneten Spektren und alle berechneten isothermalen Bindekurven sind im Anhang in
Abbildung 8.4 dargestellt.
OH R11 R12 O
OH
OH
R6α R6βR7
R2
Η HR5α R4α
7
10
6
11
5
12
4
1
Abbildung 4.9
Struktur von Tc; die in dieser Arbeit untersuchten funktionellen Gruppen sind nummeriert. Die entsprechenden Substitutionen sind in Tabelle 4.4 aufgelistet.
Die resultierenden Dissoziationskonstanten und Stöchiometrie-Werte sind in Tabelle 4.4
dargestellt.
Der Austausch der Position R7 durch eine Cl-Gruppe (7-Chlor-Tc: KD 0,57 nM) führt zu
keiner signifikanten Änderung in der Affinität zur Aptamer-RNA. Ebensowenig die
Substitution von R5α mit einer OH-Gruppe (Oxy-Tc: KD 1,37 nM). Der Austausch der
Dimethyl-Amino-Gruppe an Position R4α durch eine OH-Gruppe (Col 6: KD 2,5 nM) oder
durch einen Wasserstoff (Col 1: KD 2,6 nM) verursacht nur einen minimalen Abfall der
Dissoziationskonstante. Der Wechsel von der Keto-Enol-Gruppe an Position R11-R12 zu einer
Pyrazol-Gruppe im Kontext von Col 1 ergibt das Derivat Col 5 (KD 0,62 nM) und führt
ebenfalls zu keiner signifikanten Äffinitätsänderung. Für Col 5 ist anzumerken, dass bei der
Fluoreszenz-Titration mit Aptamer-RNA eine viel höhere Konzentration des Derivates (20
nM) eingesetzt werden musste als bei der Titration von Tc, 7-Chlor-Tc oder Oxy-Tc (0,5 nM
bzw. 1 nM), welche ähnliche Dissoziationskonstanten ergeben wie letztlich Col 5, da das
emittierte Fluoreszenz-Signal ansonsten zu schwach ist. Die Amid-Gruppe an Position R2 ist
Ergebnisse 67
von größerer Bedeutung für die Komplex-Bildung, da die Substitution mit einer CN-Gruppe
(Col 2: KD 9,8 nM) eine Reduktion in der Bindung um den Faktor 14 bewirkt. Doxycyclin
(KD 115 nM) trägt zwei Substitutionen. Zum einen an Position R5α eine OH-Gruppe (wie
Oxy-Tc) und zusätzlich an Position R6β einen Wasserstoff. Somit ist im Vergleich von
Doxycyclin mit Oxy-Tc der Einfluss von R6β messbar. Diese Substitution an R6β erzeugt eine
drastische Reduktion in der Affinität zu Tc-Aptamer RNA um den Faktor 80. Eine Analyse
von Col 8 (KD 570 nM), welches zusätzlich zu den Austauschen in Doxycyclin noch an
Position R4α einen Wasserstoff trägt (wie in Col 1), ergibt für die Position R6β ebenfalls eine
ca. 80 fache Reduzierung der Affinität. Bei Sancyclin (KD 16,5 nM), die Reste R6α und R6β
tragen jeweils einen Wasserstoff, ist dieser Effekt nur in stark abgeschwächter Form zu
beobachten. Hier wird das Fehlen der R6β OH-Gruppe vermutlich durch eine strukturelle
Umorientierung teilweise kompensiert. Im Falle von Anhydro-Tetracyclin (KD 3,5 nM) ist R6β
deletiert und es kommt nur zu einer um den Faktor 5 reduzierten Affinität. In diesem Falle ist
der Kohlenstoff, welcher R6β trägt sp2 hybridisiert, wodurch die R6α Methyl-Gruppe in die
Ringebene wandert und eine größere Fläche für Basen-Stapelungseffekte erzeugt. Dies könnte
den Affinitätsverlust teilweise kompensieren.
Somit sind von den untersuchten funktionellen Gruppen im Tc die Positionen R6β (Faktor 80)
und R2 (Faktor 14) für die Bindung an die Tc-Aptamer RNA von großer Bedeutung.
Fluoreszenzmessungen an Mutanten von Tc-Aptamer RNA
Um zu untersuchen, welche Nt an der Tc-Bindung und in vivo Regulation beteiligt sind,
wurden interessante Positionen in der Aptamer-RNA mutagenisiert und ebenfalls
fluoreszenzspektroskopisch analysiert. Mehrere Positionen im Aptamer weisen einen starken
Tc-abhängigen Schutz bei enzymatischen und chemischen Interferenzstudien auf (A09N7&N1,
U12N3, A13N7>N1, A49N7>N1, A50N7>N1, G51N1&N2, U54N3, A55X, G57N1&N2; (Hanson et al.,
2005)). Aus diesen wurden je drei Positionen ausgewählt, die in Bezug auf Tc-abhängige
Regulation der Translation in vivo Mutationen gegenüber intolerant (A09, A13, A50) bzw.
tolerant (G51, U54, A55) sind. Die beiden letzten Positionen wurden auch wegen ihrer Nähe
zu einem Bereich im RNA-Rückgrat gewählt, welcher in Gegenwart von Tc gegen Hydroxyl-
Radikal-Spaltung hypersensitiv wird (Hanson et al., 2005). Als zusätzliche Kontrolle wurde
A08 mitgeführt, da diese Position nur einen minimalen Tc-abhängigen Schutz bei
Interferenzstudien zeigt und nach saturierender Mutagenese noch in vivo Regulationsfaktoren
von 2,1 (A08U), 2,8 (A08C) und 3,1 (A08G) aufweist (Hanson et al., 2005). Diese Auswahl
Ergebnisse 68
Tabelle 4.4 Getestete Tc-Derivate
Tc-Derivat R R R R R R2 R4α 5α 6α 6β R7 11 12 Konz.(nM)
KD (nM) rel. Fluoreszenza (%) Regulation
in vivo b
Tc CONH2 N(CH3)2 H CH3 OH H O OH 0,73 ±0,05
19,6±0,1 5,1
Oxy-Tc
OH 1 1,37 ±0,08 22,4±0,9 4,5
Col 6 OH 1 2,5 ±0,3 50±2 2,0
Col 1 H 1 2,6 ±0,2 71±20c 1,4c
Anhydro-Tc - 50 3,5 ±0,7 nd nd
Col 2 CN 1 9,8 ±0,9 77±5 1,3
7-Chlor-Tc Cl 1 0,57 ±0,05 26,2±0,6 3,8
Sancycline H H 10 16,5 ±0,7 77±8 1,3
Doxycycline OH H 10 115 ±4 86±3 1,1
Col 8 H OH H 10 570 ±20 nd nd
Col 5 H NNH 20 0,62 ±0,30 50,9±0,9 2,0
0,5
Funktionellen Gruppen aller verwendeten Tetracyclin-Derivate. Es sind jeweils die Unterschiede zu Tc angegeben. Die bei Fluoreszenzmessungen eingesetzten Konzentrationen sind angegeben. a Relative Fluoreszenz der in vivo Regulation. Die durch durch pWHE601-AN32 exprimierte GFP-Fluoreszenz wurde auf 100% gesetzt. b Die Effizienz der Regulation in vivo ist angegeben als das Verhältnis der relativen GFP-Fluoreszenz in Ab- und Anwesenheit von 100 µM Tc im Medium. c In vivo Regulation wurde mit 20 µM Col 1 bestimmt, da höhere Konzentrationen zu Wachstumsinhibierung führen. nd nicht detektierbar, aufgrund von Wachstumsinhibierung, Verursacht durch das entsprechende Tc-Derivat.
Ergebnisse 69
ergab drei Paare benachbarter Nukleotide, welche sich in ihren Eigenschaften bezüglich der
Interferenzstudien und Regulation unterscheiden (A08 und A09), sich nur in der Regulation
unterscheiden (A50 und G51) oder in beiden Belangen ähnlich sind (U54 und A55). Für diese
Mutanten wurde die Dissoziationskonstante über Fluoreszenztitrationsspektroskopie, wie in
Kapitel 3.3.8 beschrieben bestimmt. Alle Experimente wurden mindestens zweimal
wiederholt.
Zunächst wurden diejenigen Positionen untersucht, welche bei Mutation zum Verlust der in
vivo Regulation führen und somit einen großen Beitrag zur Tc-Bindung leisten. In Abbildung
8.1 sind exemplarisch die Spektrenscharen und die berechneten Bindekurven für die Aptamer-
Mutanten A9G, A13U und A50U von jeweils einer Messreihe dargestellt. Die ermittelten
Dissoziationskonstanten sind in Tabelle 4.3 enthalten.
Die eingeführten Mutationen resultieren in einer drastisch reduzierten Affinität zu Tc. Daher
wurden für die Fluoreszenzmessungen höhere Tc Konzentrationen vorgelegt (A9U 40 nM, bei
A13U 30 nM und bei A50U 40 nM), um ein detektierbares Fluoreszenzsignal zu erhalten. Die
berechneten Dissoziationskonstanten betragen für A9G 173 nM, für A13U 210 nM und für
A50U 184 nM. Die Komplexstöchiometrie N wurde bei allen untersuchten RNAs auf 1,1 bis
1,2 berechnet. Die eingeführten Mutationen haben somit keinen Einfluss auf den
Komplexaufbau.
Die Mutationen G51U, U54G und A55G werden in vivo noch weitgehend toleriert und
ergeben Regulationsfaktoren von ca. 3 (Hanson et al., 2005). Diese Nukleotid-Positionen in
der Aptamer-RNA sind somit von untergeordneter Bedeutung für die Tc-Bindung, liegen aber
dennoch im Bereich der postulierten Tc-Bindetasche. In Abbildung 8.2 sind exemplarisch die
Spektrenscharen und die berechneten Bindekurven für die Aptamer-Mutanten G51U, U54G
und A55G von jeweils einer Messreihe dargestellt. Die resultierenden
Dissoziationskonstanten sind in Tabelle 4.3 enthalten. Die eingeführten Mutationen
resultieren in einer geringfügig reduzierten Affinität zu Tc. Die berechneten
Dissoziationskonstanten für G51U, U54G und A55G betragen 2,9 nM, 2,5 nM und 1,5 nM.
Dies entspricht einer 2- bis 4-fach schlechteren Bindung im Vergleich zur Wildtyp-RNA. Die
Komplexstöchiometrie N ergibt einen Wert von ca. 1,1. Die eingeführten Mutationen haben
somit ebenfalls keinen Einfluss auf die Zusammensetzung des Tc-RNA Komplexes.
Die Mutation A8G wird in vivo ebenfalls noch gut toleriert, wenngleich sich der
Regulationsfaktor auf 3,1 reduziert (Hanson et al., 2005). In Abbildung 8.3 sind die
aufgezeichnete Spektrenschar und die berechnete Langmuir Isotherme aus einer Messreihe
dargestellt. Die Mutation führt zu einer minimal schlechteren in vitro Bindung an Tc mit
Ergebnisse 70
einem KD Wert von 0,93 und einer Stöchiometrie N von 1,06. Die Messdaten sind in Tabelle
4.3. enthalten.
Von allen untersuchten Positionen im Tc-Aptamer zeigen die Nukleotide A09, A13 und A50
bei Mutation nach A09G (Faktor 200), A13U (Faktor 290) und A50U (Faktor 250) den
größten Einfluß auf die Affinität des Aptamers zu Tc.
„Double Mutant Cycle“ Analyse nach Fersht zur Bestimmung möglicher
Interaktionspartner
Aus den vorherigen Fluoreszenz-Titrations-Experimenten geht hervor, dass die Nukleotide
A9, A13 und A50 in der Aptamer-RNA und die funktionellen Gruppen R6β und R2 von Tc
maßgeblich an der Tc-Aptamer-RNA Komplexbildung beteiligt sind. Um mögliche
intermolekulare Kontakte zwischen diesen Positionen zu ermitteln, wurden Über-Kreuz-
Messungen von den Tc-Aptamer Mutanten A9G, A13U und A50U mit den Tc-Derivaten
Oxytetracyclin, Col 2 und Doxycyclin durchgeführt.
Die Titration von Oxytetracyclin mit den Aptamer-Mutanten A9G, A13U und A50U ergibt
die stärkste Bindung mit einem KD von 450 nM, 520 nM bzw. 605 nM (Tabelle 4.3). Die
Affinität zwischen der jeweiligen Mutanten-RNA und Oxytetracyclin im Vergleich zu Tc ist
in etwa um das 3-fache reduziert und entspricht der beobachteten 50%igen Reduktion der
Bindungsstärke von Wildtyp-RNA mit Oxytetracyclin im Vergleich zu Tc.
Col 2, welches zum Tc-Aptamer eine 14-fach geringere Affinität aufweist als Tc, führt bei
Titration mit den Mutanten A9G und A50U zu einer Dissoziationskonstanten von jeweils
2600 nM, bei der Mutante A13U zu einem KD von 1700 nM (Tabelle 4.3). Im Falle von Col 2
ergibt sich mit den untersuchten Aptamer-Mutanten somit eine durchschnittliche Erhöhung
des KD-Wertes um den Faktor 13.
Doxycyclin, welches Mutationen an R5α (wie Oxytetracyclin) und an R6β trägt, ergab bei
Titration mit den Mutanten A9G bzw. A50U nur einen minimalen Fluoreszenzanstieg, so dass
es nicht möglich war den Sättigungsbereich zu erreichen. Die Dissoziationskonstanten für
Doxycyclin mit der Mutante A9G (KD=17700 nM) bzw. A50U (KD=10500 nM) wurden daher
aus den gemessenen Fluoreszenzanstiegen extrapoliert.
Um direkte Kontakte zwischen den Nukleotiden A09, A13 und A50 zu den Tc-Positionen R2,
R5α und R6β zu erkennen, wurden die freien Bindungsenergien (∆G und ∆∆G) der
Einzelmutationen und Kombinationsmutationen (im Anhang in Tabelle 8.8 zusammengefasst)
nach der „double mutant cycle“ Methode miteinander verglichen (Carter et al., 1984; Fersht
et al., 1992; Frisch et al., 1995; Horovitz, 1987). In Abbildung 4.10 (A) ist exemplarisch der
Ergebnisse 71
Rechenweg für die Kombination WT-RNA mit Oxy-Tc im Vergleich zu A13U-RNA mit
Doxycyclin aufgeführt.
A B C
∆∆G = 4.41 kcal/mol
TR
∆∆G = 2.6 kcal/molTwtOTc
wtDox
A13UDox
A13UOTc
∆∆G
= 3
.5 k
cal/m
olR
∆∆GT ∆∆GR
∆∆GTR
2
1
3
4
5
6
∆∆GT
R∆∆G+
∆∆GT
R∆∆G+
-
TcOTc
TcOTc
TcOTc
DoxOTc
DoxOTc
DoxOTc
TcCol2
TcCol2
TcCol2
wt-A09G wt-A13U wt-A50U
-2
-1
R5α R6β R6β R6βR2 R2 R2R5α R5α
Abbildung 4.10
(A) Rechenschema zur „double mutant cycle“ Methode zur Bestimmung von Interaktionspartnern im Komplex am Beispiel von WT-RNA mit Oxy-Tc im Vergleich zu A13U-RNA mit Doxycyclin. (B) Balkendiagramm der ∆∆G Werte. (C) Balkendiagramm der berechneten ∆∆Gint Werte der untersuchten Kombinationen aus RNA und Tc-Derivat.
∆∆GT und ∆∆GR stellen jeweils den Unterschied der freien Bindungsenergien dar, der sich bei
Betrachtung von einem Austausch im Tc oder in der RNA ergibt. Diese werden im Diagramm
durch die dunkelblaue bzw. dunkelrote Farbe dargestellt. ∆∆GTR gibt den Unterschied in der
Bindungsenergie wieder, der sich durch den gleichzeitigen Austausch der zuvor einzeln
betrachteten Positionen im Tc (-Derivat) und der RNA ergibt. Dieser Reaktionsweg ist in
schwarz dargestellt. In Abbildung 4.10 (B) sind die Messwerte (dunkelblau, dunkelrot und
schwarz) grafisch dargestellt. Wenn die zwei untersuchten Positionen (in Tc (∆∆GT), die
andere in der RNA (∆∆GR)) im Komplex in direkten Kontakt zueinander stehen, so ergibt
sich ein deutlicher Unterschied zwischen dem direkt gemessenen Wert ∆∆GTR (in schwarz)
und der (theoretischen) Summe von ∆∆GT und ∆∆GR. Dieser Unterschied in der freien
Bindungsenergie (∆∆Gint) ist in grün dargestellt. In Abbildung 4.10 (C) sind diese für alle
untersuchten Kombinationen zusammengefasst. Den größten Effekt zeigt der Vergleich von
WT-RNA mit Oxy-Tc im Vergleich zu A13U-RNA mit Doxycyclin (∆∆Gint=-1,72 kcal/mol),
gefolgt von WT-RNA mit Oxy-Tc im Vergleich zu A50U-RNA mit Doxycyclin (∆∆Gint=-
0,93 kcal/mol). Dies zeigt, dass Nukleotid A13 (und eventuell auch A50) in direkten Kontakt
zur R6β OH-Gruppe von Tc steht. Alle anderen Kombinationen ergeben keinen signifikanten
Wert für ∆∆Gint und somit keinen gemeinsamen Kontakt.
Ergebnisse 72
4.4.2 Isothermale Titrationskalorimetrie
Zur näheren thermodynamischen Charakterisierung des Komplexes und zur Bestätigung der
Daten aus den Fluoreszenzspektroskopieexperimenten wurde isothermale Titrations-
Kalorimetrie (ITC) durchgeführt. Mit Hilfe von ITC-Experimenten können Wärmeströme in
einer Größenordnung von weniger als 1 µcal/sek detektiert und quantitativ erfasst werden.
Dies ermöglicht es, die freigewordene oder aufgenommene Wärmeenergie bei der Umsetzung
der Reaktionspartner exakt zu bestimmen. Aus den gewonnenen Daten können nicht nur die
Dissoziationskonstante, die Stöchiometrie und die Änderung der Enthalpie ∆H sehr genau
bestimmt werden, vielmehr erlaubt der isothermale Aufbau auch die Berechnung der
Entropieänderung -T∆S und der freien Gibbs´schen Reaktionsenergie ∆G (Frisch et al., 1997;
Ladbury et al., 1996). Der enthalpische Beitrag entspricht dem Auf- und Abbau von
molekularen Wechselwirkungen, während der entropische Anteil Auskunft über die Zu- oder
Abnahme der Ordnung im System gibt, welches die beteiligten Makromoleküle und das
Lösungsmittel einschließt. Der Nachteil von ITC ist die etwas geringere Sensitivität (KD bis in
den nanomolaren Bereich) und der enorm hohe Verbrauch an RNA, welcher sich auf mehrere
hundert Mikrogramm pro Titrationsexperiment beläuft.
ITC-Messungen am Tc-Aptamer
Zunächst wurde die thermodynamische Interaktion von Tc-Aptamer RNA mit Tc und
Doxycyclin untersucht. Das experimentelle Vorgehen ist in Kapitel 3.3.9 beschrieben. Die
exakten Konzentrationen an RNA in der Messzelle und Tc bzw. Doxycyclin in der
Injektionsspritze sind in Tabelle 4.5 aufgelistet. Da bei diesem Experiment die
Empfindlichkeitsgrenze des Messgeräts erreicht wurde, konnte nur eine sehr steile
Titrationskurve mit wenigen Datenpunkten im Bereich der Transition aufgezeichnet werden
(Abbildung 4.11 (A)). Für WT RNA titriert mit Tc ergibt sich somit eine
Dissoziationskonstante von 0,6 nM (∆G = -12,51 kcal/mol). Die Bindungsenthalpie ∆H,
welche unter den gegebenen Bedingungen viel verlässlicher bestimmt werden kann (Ladbury
& Chowdhry, 1996), beträgt –20,4 kcal/mol. Der resultierende entropische Beitrag -T∆S
beträgt +8,2 kcal/mol.
Ergebnisse 73
Abbildung 4.11
Zeit / Min
Wär
mee
nerg
ieµc
al /
sek
Wär
mee
nerg
ieµc
al /
sek
Inje
ktio
nsw
ärm
ekc
al /
mol
Inje
ktio
nsw
ärm
ekc
al /
mol
[Tc] / [RNA] [Doxy] / [RNA]
-0,20
-0,15
-0,10
-0,05
0,000 10 20 30 40 50 60 70 80
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
-20
-10
0
-0,2
-0,1
0,0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
-20
-10
0
Zeit / Min A B
Das obere Feld zeigt die aufgezeichnete Wärmepulskurve sequentieller Injektionen von (A) Tc und (B) Doxycyclin zu Tc-Aptamer RNA in Puffer-T. Das untere Feld zeigt die integrierte Injektionswärme nach Korrektur für entsprechende Injektionen von Ligand in Puffer-T. Punkte kennzeichnen die gemessene Injektionswärme, die durchgezogene Linie ist die berechnete Bindekurve.
Um den Effekt der R6β OH-Gruppe von Tc genauer charakterisieren zu können, wurde die
Komplexbildung mit Doxycyclin ebenfalls mittels ITC untersucht. Die ermittelte
Dissoziationskonstante für den Komplex aus Tc-Aptamer RNA und Doxycyclin beträgt 65
nM. Die Transitionskurve ist aufgrund der niedrigeren Affinität deutlich flacher als im Falle
von Tc (Abbildung 4.11 (B)). Die gemessene Bindungsenthalpie ist mit -17,1 kcal/mol
deutlich niedriger als bei Tc. Dies bedeuted, dass zwischen Doxycyclin und dem Tc-Aptamer
weniger neue inter- und intramolekulare Bindungen aufgebaut werden. Der entropische Term
-T∆S ist mit 7,3 kcal/mol nur minimal geringer als bei Tc. Daraus folgt, dass sowohl bei Tc
als auch bei Doxycyclin die bei der Komplexbildung auftretenden Umorientierungen an den
beteiligten Molekülen (RNA, Tc-Derivat, Puffer) nahezu identisch sind. Alle Daten sind in
Tabelle 4.5 enthalten.
ITC-Messungen an Tc-Aptamer Mutanten
Das Bindeverhalten von Tc-Aptamer Mutanten A9G, A13U, A50U und A55G mit Tc wurde
ebenfalls mittels ITC thermodynamisch charakterisiert (Tabelle 4.5). Die hierbei gemessenen
Dissoziationskonstanten von 260 nM, 190 nM, 210 nM und 7,6 nM korrelieren sehr gut mit
den fluorimetrisch ermittelten Werten.
Die A55G Mutation bewirkt nur eine geringfügige Verschlechterung der Bindung und sowohl
der enthalpische (∆H= -19,4) als auch der entropische (-T∆S= 8,3) Beitrag erfahren bei Tc-
Bindung nur eine minimale Änderung im Vergleich zur WT-RNA. Dies verdeutlicht, dass die
Ergebnisse 74
Identität der Base an Position 55 nur von geringer Bedeutung ist und der Kontakt zum Tc
vermutlich über das RNA-Rückgrat zustande kommt.
Bei den anderen Mutanten kommt es neben einem drastischen Rückgang in der
Bindungsstärke (höherer KD) zu sehr unterschiedlichen enthalpischen und entropischen
Beiträgen zu diesem Effekt im Vergleich zur WT-RNA.
Im Falle von A13U wird der Verlust an Tc-Affinität hauptsächlich durch die reduzierte
Bindungsenthalpie ∆H von –8,9 kcal/mol verursacht, wohingegen der entropische Beitrag
(-T∆S= 8,6) nur geringfügig steigt. Diese Mutation eliminiert vermutlich eine wichtige Tc-
RNA Bindung, hat aber gleichzeitig wenig Einfluss auf die RNA-Faltung.
Bei der A09G Mutante liegt die Ursache für die reduzierte Affinität im stark erhöhten
entropischen Term -T∆S von 13,9 kcal/mol, welcher im Vergleich zu WT-RNA sehr viel
ungünstiger ist. Dies legt die Vermutung nahe, dass das Adenin an Position 9 für die (Vor-)
Strukturierung der RNA von großer Bedeutung ist und somit bei der Mutante mehr Energie
für die strukturelle Ordnung des Komplexes aufgewendet werden muss. Die
Bindungsenthalpie von -22,9 kcal/mol ähnelt dem Bindungsverhalten von WT-RNA.
Die Mutation A50U bewirkt einen enormen Verlust an Bindungsenthalpie (∆H= -8,9
kcal/mol), welcher durch den vollständigen Rückgang des ungünstigen entropischen Terms
(-T∆S= -0,2) kompensiert wird. Höchstwarscheinlich verhindert die A50U Mutation, dass
sich große Bereiche von L3 bei Tc-Bindung richtig falten.
Ergebnisse 75
Tabelle 4.5 Resultate der ITC-Experimente
Experimentelle Parameter der ITC-Messungen. Angegeben sind die jeweils verwendeten RNA und Tc Konzentrationen, sowie Anzahl und Volumen der jeweiligen Injektionen von Tc in die RNA-Lösung. Der enthalpische (∆H) und entropische (-T∆S) Term, die freie Bindungsenergie (∆G) sowie Stöchiometrie N und Assoziationskonstante KA wurden anhand der Messdaten mit der Software Microcal Origin Version 5.0 berechnet. KD wurde als 1/KA berechnet.
RNA [RNA]
in Messzelle
(µM )
[Tc]
in Spritze
(µM )
Injektionen ∆G
(kcal/mol)
∆H
(kcal/mol)
-T∆S
(kcal/mol)
N
(tc / RNA )
KA
(M-1)
KD
(nM)
Tc-Aptamer 1.71 22.89 24 * 10 µl -12,52±0,24 -20,4±0,29 7,8 1.15±0.01 (1.68±0.87)x109 0.60±0.20
A9G 5.53 49.23 19 * 15 µl -8,98±0,07
-22,9±0,35 13,9 1.18±0.01 (3.83±0.43)x106 260±30
A13U 4.63 48.40 19 * 15 µl -9,17±0,07 -17,8±0,21 8,6 1.21±0.01 (5.32±0.51)x106 190±20
A50U 3.82 58.00 19 * 15 µl -9,11±0,20 -8,9±0,27 -0,2 1.38±0.03 (5.84±1.07)x106 210±60
A55G 3.28 49.23 19 * 15 µl -11,1±0,10 -19,4±0,16 8,3 1.32±0.01 (1.32±0.26)x108 7.60±1.90
Tc-Aptamer 2.59 Doxy 36.0 24 * 10 µl -9,80±0,07 -17,1±0,22 7,3 1.25±0.01 (1.53±0.19)x107 65±10
Ergebnisse 76
4.5 Regulation der gfp-Expression in vivo durch verschiedene Tc-Derivate
Zur Untersuchung der Substratspezifität des Tc-bindenden Aptamers in vivo wurde ein
System zur konditionalen Genexpression in S. cerevisiae verwendet (Suess et al., 2003). S.
cerevisiae RS453 wurde wie in Kapitel 3.3.8 beschrieben angezogen und die GFP-
Fluoreszenz in Anwesenheit von verschiedenen Tc-Derivaten bestimmt. Die relative GFP-
Fluoreszenz, welche durch den Vektor pWHE601-AN32 in Abwesenheit von Liganden
erzeugt wurde, wird als 100% Wert angesehen. Die Regulationsfaktoren sind in Abbildung
4.12 als das Verhältnis der relativen GFP-Fluoreszenz ohne und mit Tc-Derivat angegeben.
Die relativen Fluoreszenzintensitäten sind in Tabelle 4.4 enthalten. Alle Tc-Derivate wurden
in Konzentrationen von 100 µM eingesetzt; Col 1 konnte nur bei einer Konzentration von 20
µM verwendet, da es bei höheren Konzentrationen das Wachstum von S. cerevisiae inhibiert.
Um den Vergleich mit den anderen Derivaten zu ermöglichen, wurde für die Referenz ohne
Tc die gleiche Zellmenge eingesetzt wie im Falle von Col 1. Anhydro-Tc und Col 8 führen
selbst bei einer Konzentration von 20 µM im Medium zu einer starken
Wachstumsinhibierung. Diese beiden Derivate konnten somit nicht in vivo getestet werden.
0
1
2
3
4
5
6
Reg
ulat
ions
fakt
or
Tc-Derivat
Tc Oxy-Tc Col 6 Col 1 Col 2 7-Chlor-Tc Sancyclin Doxycyclin Col 5
Abbildung 4.12
In vivo Regulationsfaktoren der getesteten Tc-Derivate. Die relative GFP-Fluoreszenz exprimiert durch pWHE601-AN32 ohne Tc wird als 100% Wert betrachtet.
Die in vivo Regulationsfaktoren der Tc-Derivate korrelieren sehr gut mit der in vitro Affinität
zum Tc-Aptamer. Die Derivate Oxy-Tc, 7-Chlor-Tc, Col 6 und Col 5 ergeben neben
Dissoziationskonstanten bis maximal 2,5 nM die besten Regulationsfaktoren.
Ergebnisse 77
4.6 Das zweigeteilte Tc-Aptamer
Da die Tc-Bindetasche aus zwei unabhängigen Bereichen aufgebaut ist, stellte sich die Frage,
ob bereits einer dieser Teile für die Tc-Bindung ausreichend ist. Um dies zu testen, wurden
zuerst Sekundärstrukturberechnungen durchgeführt. Zum einen wurden die
Sekundärstrukturen der in Abbildung 4.13 (A und B) dargestellten 5´- und 3´-Hälften der Tc-
Minimer RNA-Sequenz berechnet. Dies ergab, dass sich nur die 3´-Hälfte wie die
Originalsequenz im Tc-Minimer zu L3 faltet. Die Hybridisierung in silico ergab, dass die
beiden Aptamer Teile zusammen ein RNA-Hybrid (Abbildung 4.13 (D)) ergeben, welches der
Sekundärstruktur von Tc-Minimer entspricht. Um dies experimentell zu bestätigen, wurde die
Tc-Minimer RNA in zwei Hälften transkribiert und die Tc-Bindung sowohl an die einzelnen
Hälften als auch an das Hybrid analysiert.
Klonierung und Transkription der Aptamer-Hälften
Das Plasmid pSP64 Tc-Aptamer wurde mit HindIII und EcoRI restringiert und mit den
hybridisierten Oligonukleotiden AptC1_F und AptC1_R (ergibt Teil 1) bzw. mit AptC2_F
und AptC2_R (ergibt Teil 2) ligiert. Nach Transformation von kompetenten E. coli DH5α
wurden positive Transformanden sequenziert. Die in vitro Transkription erfolgte in diesem
Falle nicht als Fusions-RNA mit einer Hammerhead-Ribozym-Sequenz. Die Präparation der
RNA erfolgte wie in Kapitel 3.3.7 beschrieben, ausgehend von HindIII linearisiertem Plasmid
pSP64 Tc-Minimer Teil 1 und pSP64 Tc-Minimer Teil 2. Die RNA-Sequenzen der Aptamer-
Teile lauten:
RNA Tc-Minimer Teil 1: G GGC CUA AAA CAUA CCA GCU A
RNA Tc-Minimer Teil 2: GG CUG GAG AGG UGA AGA AUA CGA CCA CCU AGG
CUC A
Abbildung 4.13 (A) zeigt ein analytisches denaturierendes RNA-Gel mit der gereinigten RNA
von Tc-Minimer Teil 1 (Spur 2) und Teil 2 (Spur 3). Als Größenstandard ist Tc-Minimer
RNA aufgetragen.
Ergebnisse 78
1 2 3 A B C D
Abbildung 4.13
(A) 15% PAA/8M Harnstoffgel der Aptamer RNA Teil 1 (Spur 2) und Teil 2 (Spur 3). Als Größenvergleich ist Tc-Minimer RNA (Spur 1) aufgetragen. Die Berechnung der theoretischen Sekundärstrukturen von RNA Tc-Minimer Teil 1 (B), Tc-Minimer Teil 2 (C) und dem Hybrid (D) erfolgte mit Hilfe der Software RNA-structure.
Tc-Bindung an das geteilte Aptamer
Anhand nativer PAA-Gelelektrophorese wurde die Tc-Bindung an die beiden Aptamer-
Hälften und deren Hybrid analysiert. Das experimentelle Vorgehen ist in Kapitel 3.3.7
beschrieben. Die RNAs Tc-Minimer Teil 1 (entspricht B1-2) und Teil 2 (entspricht L3)
wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt, so dass pro Ansatz 0,2 nmol RNA enthalten
waren (Tabelle 4.6), für 5 min bei 65°C denaturiert und wieder auf RT abgekühlt.
Anschließend wurde Tc zugegeben und weitere 5 min bei RT inkubiert. Als Kontrolle wurden
in Spur 8 0,2 nmol Tc-Minimer RNA mitgeführt. Nach Beendigung der Gelelektrophorese
wurde an RNA gebundenes Tc unter 366 nm UV-Licht sichtbar gemacht. Anschließend
wurde die RNA mit Ethidiumbromid gefärbt und ebenfalls visualisiert.
Tabelle 4.6 Beladungsplan natives Gel
Spur 1 Spur 2 Spur 3 Spur 4 Spur 5 Spur 6 Spur 7 Spur 8
Tc (1 µM] + + + + + + + +
Teil 1 / nmol 0,2 - 0,05 0,075 0,1 0,125 0,15 -
Teil 2 / nmol - 0,2 0,15 0,125 0,1 0,075 0,05 -
Tc-Minimer / nmol - - - - - - - 0,2
Ergebnisse 79
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 A B
Abbildung 4.14
Natives 15% PAA-Gel. (A) Tc-Fluoreszenz unter 366 nm UV-Licht. (B) Das gleiche Gel nach Ethidiumbromid-Färbung. Der Beladungsplan ist in Tabelle 4.6 enthalten.
In Spur 1 und 2 sind jeweils nur Teil 1 bzw. Teil 2 enthalten. Die charakteristische grünliche
Fluoreszenz von gebundenm Tc ist in beiden Fällen nicht vorhanden. Bei einem
Mischungsverhältnis von 1 Teil Tc-Minimer Teil 1 und 0,6 Teilen Tc-Minimer Teil 2 ist die
Tc-Fluoreszenz maximal. Im Vergleich zur Tc-Fluoreszenz von 0,2 nmol Tc-Minimer in Spur
8 ist die Fluoreszenz des Komplexes aus Heterodimer und Tc deutlich schwächer. Nach
Ethidiumbromid-Färbung der RNA ist zu sehen, dass sich sich die beiden Monomere und das
Heterodimer aufgrund ihrer unterschiedlichen hydrodynamischen Radii in ihren
elektrophoretischen Mobilitäten unterscheiden (Teil 2 > Teil 1 > Tc-Minimer). Dies zeigt,
dass jede Hälfte der Tc-Bindetasche für sich alleine nicht in der Lage ist, Tc zu binden. Erst
wenn sich aus beiden Teilen ein Heterodimer gebildet hat, ist die Tc-Bindetasche wieder
ausgebildet (Spuren 2 – 7).
Bei der Titration von 10 nM Tc in Puffer-K mit RNA Teil 1 oder Teil 2 war der für Tc-
Bindung typische Fluoreszenzanstieg nicht zu verzeichnen. Dies bestätigt das Resultat der
nativen PAGE, wonach eine Aptamerhälfte für die Tc-Bindung nicht ausreicht.
Das Bindungsverhalten des Hybrids wurde ebenfalls fluorimetrisch in einem
Titrationsexperiment quantifiziert. Die beiden Hälften wurden im optimalen
Mischungsverhältnis von 1 Teil Tc-Minimer Teil 1 und 0,6 Teilen Tc-Minimer Teil 2
gemischt und zu 10 nM Tc in Puffer-K titriert. Das weitere experimentelle Vorgehen ist in
Kapitel 3.3.8 beschrieben.
Ergebnisse 80
A B
440 460 480 500 520 540 560 580 600 620
0
50000
100000
150000
200000
250000 0 nM RNA 3 nM RNA 6 nM RNA 9 nM RNA 12 nM RNA 15 nM RNA 18 nM RNA 21 nM RNA 24 nM RNA 27 nM RNA 30 nM RNA 39 nM RNA 48 nM RNA 57 nM RNA 66 nM RNA 75 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm-10 0 10 20 30 40 50 60 70
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
Abbildung 4.15
(A) Spektrenschar der Fluoreszenztitration von 10 nM Tc in Puffer-K mit der Hybrid-RNA aus Tc-Minimer Teil 1 und Teil 2 RNA. (B) Hyperbolische Bindekurve der Titrationsreihe
In Abbildung 4.15 sind die aufgezeichnete Spektrenschar (A) und die berechnete isothermale
Bindekurve (B) dargestellt. Die Auswertung ergab einen KD von 17 nM und eine
Stöchiometrie N von 1,3. Unter der Annahme, dass das Hybrid den gleichen KD wie das Tc-
Aptamer aufweist, kann man folgern, dass etwa 25% der zutitrierten RNA ein aktives Hybrid-
Aptamer gebildet haben.
4.7 Das CAA- Aptamer
Nachdem gezeigt wurde, dass sich ein funktionelles Aptamer aus den zwei RNA-Hälften
formen kann, wurde untersucht, ob sich die beiden Hälften ebenfalls finden, wenn diese in cis
durch eine 30 Nt lange Sequenz aus sich wiederholenden CAA-Nukleotid-Tripletts getrennt
sind.
Klonierung und Transkription des CAA-Aptamers
Über zweistufige PCR-Mutagenese wurden in pSP64 Tc-Minimer zwei XhoI Schnittstellen
mit 6 Nt Abstand eingefügt. dazu wurden der Mutageneseprimer C_Xho-Linker_rev und die
beiden äußeren Primer sp und AP1_pSP64 verwendet. Das resultierende Plasmid pSP64 XhoI
wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI geschnitten und mit der XhoI - (CAA)10 - XhoI
Sequenz (bestehend aus den hybridisierten Oligonukleotiden Xho_sp_F und Xho_sp_R)
ligiert. Das resultierende Plasmid trägt die Bezeichnung pSP64 CAA und erlaubt die in vitro
Transkription der CAA-Aptamer RNA (Abbildung 4.16) als Fusions-RNA mit einer
Ergebnisse 81
Hammerhead-Ribozym-Sequenz. Transkription und Aufreinigung erfolgten wie für Tc-
Aptamer RNA beschrieben.
Die Sequenz des CAA-Aptames lautet:
5´-GGG CCU AAA ACA UAC UCG AG CAA CAA CAA CAA CAA CAA CAA CAA
CAA CAA C UCG AG AGA GGU GAA GAA UAC GAC CAC CUA GGC UC
Die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym XhoI ist in rot, die 10x CAA Sequenz ist
in blau dargestellt.
Abbildung 4.16
Die Berechnung der theoretische Sekundärstruktur des CAA-Aptamers erfolgte mit Hilfe der Software RNA-structure.
Tc-Bindung an das CAA-Aptamer
Die Quantifizierung der Bindung erfolgte durch Fluoreszenz-Titrations-Spektroskopie. Für
die Komplexbildung wurde eine Dissoziationskonstante von 4 nM und eine Stöchiometrie N
von 1,1 ermittelt.
Ergebnisse 82
440 460 480 500 520 540 560 580 600 620
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000 0 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 15 nM RNA 20 nM RNA 25 nM RNA 30 nM RNA 35 nM RNA 40 nM RNA 45 nM RNA 50 nM RNA 55 nM RNA 60 nM RNA 65 nM RNA 70 nM RNA 75 nM RNA 80 nM RNA 85 nM RNA 90 nM RNA 95 nM RNA 100 nM RNA 115 nM RNA
Wellenlänge / nm-10 0 10 20 30 40 50 60 70
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
A B
nz /
cps
resz
e
Fluo
Abbildung 4.17
(A) Spektrenschar der Titration von RNA CAA-Aptamer zu 50 nM Tc. (B) Die ausgefüllten Symbole zeigen die Messwerte, die durchgezogene Linie die berechnete Bindkurve.
Dies zeigt, dass sich die zusammengesetzte Tc-Bindetasche unabhängig vom Kopfbereich des
Tc-Aptamers ausbilden kann.
4.8 Kontrollierte Regulation des Spleißens durch das Tc-Aptamer
Alternatives Spleißen ist bei höheren Eukaryoten ein Weg, um die Kodiervariabilität eines
Gens zu erhöhen. In Hefe enthalten ca. 4% aller Gene ein Intron. Die in silico Suche nach
Konsensussequenzen der Metabolit-Bindedomäne des TPP (Thiaminpyrophosphat) -
Riboswitches in Eukaryoten ergab, dass sich diese u.a. in Introns im 5’-UTR von Genen der
Thiaminbiosynthese von vier Pilzarten befindet (Sudarsan et al., 2003). Daraufhin wurde
postuliert, dass das Spleissen durch Riboswitche reguliert werden kann. Einen
experimentellen Nachweis gab es jedoch nicht. Mit Hilfe des Tc-Aptamers sollte versucht
werden, das Spleissen eines Mini-Intron Konstruktes in vitro zu beeinflussen, indem
wahlweise die 5´- Spleißsttelle (5´-SS; AC/G GUAUGU ) oder der Verzweigungspunkt
(branchpoint; bp; UACUAAC) maskiert wird.
4.8.1 Integration von 5´-SS und bp in das Tc-Aptamer und Test auf Tc-Bindung
Um eine möglichst effiziente Tc-abhängige Maskierung von 5´-SS oder bp zu erreichen,
wurden diese Motive direkt in das Tc-Aptamer integriert. Die Motive wurden so eingeführt,
dass sich möglichst wenig Nukleotidaustausche ergeben, so dass die Originalsequenz des Tc-
Aptamers und dessen Ligandenbindefähigkeit weitestgehend erhalten bleibt. Das Plasmid
pWHE601-AN32 enthält das Tc-Aptamer im 5´-UTR von gfp (Kapitel 4.5). In dieses wurden
mittels PCR-Mutagenese die Spleißmotive inseriert, um zu überprüfen, welchen Einfluss die
Ergebnisse 83
Mutationen auf die regulatorische Aktivität des Aptamers haben. Die Klonierungen erfolgten
über die singulären Schnittstellen AflII und NheI. In Tabelle 4.7 sind die verwendeten
Oligonukleotid Primer sowie das jeweils in das Tc-Aptamer integrierte Sequenz-Motiv
angegeben. Die Kontrolle der Konstrukte erfolgte durch Sequenzierung mit den Primern
pADH und GFP_rev.
Tabelle 4.7 Klonierung der modifizierten Tc-Aptamere
Konstrukt Ausgangsplasmid Vorwärts Primer Rückwärts Primer integriertes Motiv
S1 a und b pWHE601-AN32 Splice1_for
GFPrev 5´-SS
a: AC GUAUGU
b: AG GUAUGU
S2 pWHE601-AN32 Splice2_for Splice2_rev 5´-SS
AG GUAUGU
S3 pWHE601-AN32 pADH Splice3_rev 5´-SS
AG GUAUGU S4 pWHE601-AN32 pADH Splice4_rev 5´-SS
AG GUAUGU
S5 pWHE601-AN32 pADH Splice6_rev Verzweigungspunkt
UACUAAC
S6 pWHE601-AN32 Splice7_for GFPrev Verzweigungspunkt
UACUAAC
In Tabelle 4.8 sind die Sequenzen der modifizierten Tc-Aptamere angegeben. Das eingeführte
Motiv (5´-SS; bp) ist in rot, kompensatorische Mutationen zur Aufrechterhaltung der
Aptamerstruktur sind in blau dargestellt.
Ergebnisse 84
Tabelle 4.8 Sequenzen der modifizierten Tc-Aptamere
Konst. Tc-Aptamer-Sequenz
WT GGCCUAAAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGAGGUGAAGAAUACGACCACCUAGGCC S1a GGCCUAAAACGUAUGUGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCACGAGAGGUGAAGAAUACGACCACCUAGGCC
S1b GGCCUAAAAGGUAUGUGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCACGAGAGGUGAAGAAUACGACCACCUAGGCC
S2 AGGUAUGUAAAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGAGGUGAAGAAUACGACCACCUACUGCS3 GGCCUAAAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGAGGUGAAGGUAUGUCGACCACCUAGGCC
S4 GGCCUAAAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGGUAUGUGAAGAAUACGACCACAUAAGGCCS5 GGCCUAAAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGAUACUAACAAUACGACGGUAUAGGCC
S6 GGCCUACUAACAUACCAGAUCGCCACCCGCGCUUUAAUCUGGAGAGGUGAAGAAUACGACCACCUAGGCC
Die Konstrukte S1 bis S7 wurden auf ihre regulatorische Aktivität in vivo untersucht. Das
experimentelle Vorgehen ist in Kapitel 3.3.8 beschrieben. Alle Konstrukte führen zum Verlust
der in vivo Regulation. In den Konstrukten S1a bis S4 wurde mit dem integrierten
Sequenzmotiv ein alternatives Startkodon eingeführt. Darunter verursacht nur das zusätzliche
AUG im Konstrukt S4 eine Verschiebung des Leserasters von gfp, wodurch kein funktionales
Protein mehr translatiert wird. Bei den übrigen Konstrukten könnte das eingeführte Motiv die
für in vivo Regulation benötigte Struktur bzw. Strukturänderung am Aptamer negativ
beeinflusst sein. Da jedoch hier für die Insertion in ein Intron nur die Tc-Bindefähigkeit von
Bedeutung ist, wurden die veränderten Tc-Aptamere anschließend darauf getestet, ob sie noch
in der Lage sind Tc zu binden. Die benötigte DNA Matrize zur in vitro Transkription wurde
durch PCR hergestellt. Dazu wurden die Primer T7_forw_AN32K (trägt den T7-Promotor am
5´-Ende) und GFP_rev verwendet. Als PCR-Matrize dienten die Plasmide pWHE601-AN32
S1 bis S6. Die in vitro Transkriptionsreaktionen wurden im 100 µl Maßstab wie in Kapitel
3.3.7 beschrieben durchgeführt. Die Matrizen-DNA (PCR-Produkt) wurde durch Behandlung
mit DNAse entfernt. Die RNA wurde nach Ethanolfällung in Puffer-K resuspendiert und auf
eine Konzentration von 100 µM eingestellt. Der Test auf Tc-Bindung erfolgte fluorimetrisch.
Das genaue Vorgehen ist in Kapitel 3.3.8 beschrieben. 200 nM Tc wurde in 2 ml Puffer-K
vorgelegt und die Fluoreszenzintensität bestimmt. Anschließend wurde 750 nM RNA
zutitriert und die Fluoreszenz erneut bestimmt. Als Positivontrolle (+K) wurde Tc-Aptamer
RNA mitgeführt und die gemessene Fluoreszenz als 100% Wert festgesetzt. Die
Basalfluoreszenz von 200 nM Tc wurde ebenfalls gemessen. In Abbildung 4.18 sind die
realtiven Fluoreszenzintensitäten dargestellt.
Ergebnisse 85
1
0,5
0
rela
tive
Flu
ore
sze
nz
Abbildung 4.18
Test der Spleißkonstrukte auf Tc-Bindung. Die relativen Fluoreszenzintensitäten bei 520 nM sind angegeben. Die relative Fluoreszenz von Tc ohne Aptamer RNA (Tc) ist ebenfalls dargestellt. Die Fluoreszenz der Positivkontrolle (+K) wurde als 100% Wert verwendet.
Nur die Konstrukte S2, S3 und S6 zeigen den für die Tc-Bindung charakteristischen
Fluoreszenzanstieg. Dieser erreicht in allen drei Fällen ca. 50% des Maximalwerts der durch
die Positivkontrolle vorgegeben wurde. Bei den übrigen Konstrukten ist davon auszugehen,
dass durch das eingeführte Sequenzmotiv (5´-SS; bp) die Tc-Bindefähigkeit des Aptamers
zerstört wurde.
4.8.2 Integration der Spleißstellen-Aptamer Hybride in das Intron von Aktin
Die Aptamer-Konstrukte S2, S3 und S6 wurden nun so in das Intron von Aktin aus S.
cerevisiae integriert, dass sich die Lage des maskierten Motivs bezüglich des WT Aktins nicht
verändert. Das Plasmid pSP6-Aktin trägt das von zwei Mini-Exons flankierte Intron von
Aktin. Da das Plasmid pSP6-Aktin über keine geeigneten singulären Schnittstellen verfügt,
wurde die Exon-Intron-Exon Sequenz über die Schnittstellen SalI und EcoRI ausgeschnitten.
Für die Umklonierung musste in das Plasmid pSP64 Tc-Aptamer die Schnittstelle SalI im
Anschluss an den T7-Promotor eingefügt werden. Um dies zu erreichen, wurde das Plasmid
mit den Enzymen HindIII und EcoRI verdaut und mit einem Insert, bestehend aus den zwei
synthetischen Oligonukleotiden InsHT7SE_forw und InsHT7SE_rev, ligiert. Das entstandene
Plasmid pSP64 HT7SE wurde mit SalI und EcoRI verdaut und mit der aus pSP6-Aktin
entnommenen Exon-Intron-Exon Sequenz ligiert. Das entstandene Plasmid pSP64-T7-Aktin
wurde durch Sequenzierung mit den Primern sp und AP1_pSP64 überprüft. Der relevante
Ergebnisse 86
Sequenzausschnitt ist im Anhang in Abbildung 8.5 (A) dargestellt. Nun konnten die
Konstrukte S2, S3 und S6 in pSP64-T7-Aktin eingefügt werden. Die Inserts wurden wie in
Kapitel 4.1.3 beschrieben, aus synthetischen Oligonukleotiden hergestellt. Diese sind in
Tabelle 4.9 für das jeweilige Konstrukt aufgelistet. Die Klonierung von S2 und S3 erfolgte
über die Schnittstellen BamHI und ClaI. Für die Klonierung von S6 wurden die Schnittstellen
AvaI und EcoRI verwendet.
Tabelle 4.9 Konstruktion der Spleißstellen-Aptamer Hybride
Konstrukt verwendete Oligonukleotide
pSP64-T7-Aktin-S2 P1F, P2F, P3F, P4F, P5F, P1R, P2R,P3R, P4R, P5R, P6R
pSP64-T7-Aktin-S3 P4F, P5F, P6F, P7F, P8F, P4R, P5R, P6R, P7R, P8R, P9R
pSP64-T7-Aktin-S6 K7F1, K7F2, K7F3, K7F4, K7F5, K7F6, K7R1, K7R2, K7R3, K7R4,
K7R5, K7R6, K7R7
Die relevanten Sequenzausschnitte von pSP64-T7-Aktin-S2, S3 und S6 sind im Anhang in
Abbildung 8.5 (B-D) dargestellt.
4.8.3 In vitro Spleißen der Aktin RNA
Erste in vitro Spleißexperimente wurden an WT Aktin prä-mRNA durchgeführt, um den
präparierten Hefe-Zellextrakt auf seine Aktivität zu testen. Als Template für die radioaktive in
vitro Transkription diente EcoRI linearisiertes Plasmid pSP6 Aktin. Die Präparation der
verwendeten RNA ist in Kapitel 3.3.7 beschrieben. Das experimentelle Vorgehen bei in vitro
Spleißexperimenten ist in Kapitel 3 beschrieben.
Das Resultat eines in vitro Spleißexperiments von Aktin prä-mRNA nach 0, 20 und 45
minütiger Inkubation ist in Abbildung 4.19 (A) dargestellt. Die gespleißte RNA (Exons 1 und
2; 257 Nt) zeigt aufgrund ihrer reduzierten Größe eine höhere elektrophoretische Mobilität.
Das Spleißzwischenprodukt (Intron mit Exon 2; 478 Nt) zeigt die niedrigste
elektrophoretische Mobilität. Das herausgespleißte Intron (309 Nt) bewegt sich ebenfalls
langsamer als die ungespleißte RNA. Die reduzierte elektrophoretische Mobilität kommt
durch die Ringstruktur des gespleißten Introns (Lariat) zustande.
Ergebnisse 87
1 2 3
2
1 2
1 2
478 Nt
309 Nt
566 Nt
257 Nt
88 Nt 169 Nt
1 2 3A B
Abbildung 4.19
Autoradiogramme von 6% PAA / 8 M Harnstoffgelen von in vitro Spleißexperimenten von Aktin prä mRNA. Die Exons 1 und 2 sind als Kasten, das Intron als Linie dargestellt. Die Größe der jeweiligen RNA Spezies ist angegeben. (A) Spur 1, 2 und 3 zeigen das Resultat nach 0 min, 20 min und 45 min Inkubation. (B) In vitro Spleißexperiment in Gegenwart von 8 µM Tc (Spur 1), 16 µM Tc (Spur 2) und 40 µM Tc (Spur 3).
Um zu testen, ob Tc den in vitro Spleißvorgang behindert, wurden vor der Spleißreaktion 8,
16 und 40 µM Tc zum Mix Aktin zugegeben. Nach 5 min Inkubation von 0,5 µl Mix Aktin +
Tc bei RT wurde die Reaktion durch Zugabe von 4,5 µl Mix 1 gestartet. Die Dauer der
Spleißreaktion betrug 20 min. Das experimentelle Vorgehen wurde ansonsten nicht verändert.
Das Resultat ist in Abbildung 4.19 (B) dargestellt. Das Autoradiogramm zeigt, dass Tc in den
eingesetzten Konzentrationen keinen sichtbaren Einfluss auf die Spleißreaktion hat.
Ergebnisse 88
4.8.4 In vitro Spleißen der Aptamer enthaltenden Aktin Konstrukte
Um zu testen, ob die Aktin prä-mRNA nach der Maskierung von der 5´-SS (Konstrukte S2
und S3) bzw. des Verzweigungspunktes (Konstrukt S6) durch das Tc-Aptamer noch gespleißt
werden kann, wurden auch an diesen Konstrukten in vitro Spleißexperimente durchgeführt.
Das experimentelle Vorgehen entsprach dem für WT Aktin prä mRNA und ist in Kapitel 3
beschrieben. Die Inkubationszeiten betrugen 0, 20, 40 und 60 min. Die Autoradiogramme
sind in Abbildung 4.20 dargestellt.
A B C
0 20 40 60 0 20 40 60 0 20 40 60
Abbildung 4.20
Autoradiogramme von 6% PAA / 8 M Harnstoffgelen von in vitro Spleißexperimenten an den Konstrukten (A) S2, (B) S3 und (C) S6. Die jeweilige Reaktionsdauer von 0, 20, 40 oder 60 min ist angegeben.
Alle drei Konstrukte werden in vitro nicht mehr gespleißt. Dies ist daran zu erkennen, dass
die typischen Spleißzwischenprodukte mit geringerer elektrophoretischen Mobilität (Intron
mit Exon 2; Intron) nicht vorhanden sind.
Diskussion 89
5 Diskussion
5.1 Der Tc-Aptamer-RNA Komplex
Im Rahmen dieser Arbeit ist das Tc-bindende RNA Aptamer und dessen Komplexbildung mit
Tc biochemisch und thermodynamisch charakterisiert worden. Dazu wurde das
Bindungsverhalten von Tc und verschiedenen Tc-Derivaten an WT und RNA-Mutanten über
analytische Gelfiltration, native PAA-Gelelektrophorese, Fluoreszenztitrations-Spektroskopie
und isothermale Titrationskalorimetrie untersucht.
Der Komplex aus Tc und Aptamer konnte erstmals visualisiert und die bisher nur
angenommene 1:1 Stöchiometrie bestätigt werden. Das Tc-Aptamer ist in der Lage den
Liganden Tc hochaffin mit einem KD von 0,73 nM zu binden, was den bisher angenommenen
KD im µM-Bereich deutlich übertrifft (Berens et al., 2001). Für die Komplexbildung wichtige
Nukleotide bzw. funktionelle Gruppen am Tc konnten mit den angewendeten Methoden
identifiziert werden. Die aus in vitro Experimenten gewonnenen Erkenntnisse über die
Ligandenbindefähigkeit korrellieren mit der regulatorischen Aktivität des Tc-Aptamers. Trotz
einer noch fehlenden dreidimensionalen Struktur des Aptamers, konnte das bestehende
Arbeitsmodell der zweigeteilten Tc-Bindetasche bestätigt und verfeinert werden.
5.1.1 Komplexaufbau
Anhand der analytischen Gelfiltrationsexperimente konnte die Komplexstöchiometrie auf ein
Tc/RNA Verhältnis von 0,96 berechnet werden. Somit ist von einem äquimolaren Komplex
aus Tc und Aptamer-RNA auszugehen, der bisher nur angenommen, experimentell aber noch
nicht belegt wurde (Hanson et al., 2005). Durch native PAGE-Experimente konnte dies
bestätigt werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Aptamer-RNA in einer
homogenen Form vorliegt und sich keine alternativen Konformationen ausbilden. Diese
Informationen sind sehr wichtig für die Interpretation der Daten von chemischen und
enzymatischen Interferenzstudien. Würden mehrere Moleküle Tc gleichzeitig an die Aptamer-
RNA binden, so könnte das resultierende Interferenzmuster einen falschen Aufbau der Tc-
Bindetasche suggerieren. Den gleichen Effekt würde die parallele Existenz verschiedener
Aptamer-Strukturen erzeugen.
5.1.2 Affinität des Tc-Aptamers zum Liganden Tc
Für die Bindung von Tc an das Tc-Aptamer wurde die Dissoziationskonstante auf 0,73 nM
bestimmt. Weitere RNA-Aptamere, die in vivo regulatorisch aktiv sind, wie das
Diskussion 90
Malachitgrün-bindende Aptamer (KD= 40 nM; (Grate et al., 1999)), das Theophyllin-Aptamer
(KD= 200 nM; (Jenison et al., 1994)) oder das Biotin-Aptamer (KD= 6 µM; (Wilson et al.,
1998)) erreichen keine derart hohe Affinitäten. Unter den niedermolekularen Liganden-
bindenden Aptameren weist das hier untersuchte Tc-Aptamer die stärkste Bindung auf. Zwar
wurden Aptamere mit noch besseren Bindefähigkeiten selektioniert, jedoch handelt es sich bei
diesen um Protein-bindende Aptamere. Proteine sind deutlich größer als Tc und bieten damit
auf ihrer Oberfläche deutlich mehr funktionelle Gruppen für multiple Bindungen an. Somit
könnte das Aptamer im Idealfall mit seiner ganzen Oberfläche an den Liganden binden,
wodurch sich die Affinität natürlich deutlich steigert. Das KGF- (Keratinocyten
Wachstumsfaktor) bindende Aptamer z.B. übertrifft das Tc-Aptamer mit einer
Dissoziationskonstante von 3 pM um das 250-fache (Pagratis et al., 1997).
Bei der in vivo Anwendung des Tc-Aptamers als Riboregulator müssen trotz der
außerordentlich hohen in vitro Affinität zu Tc 100-1000 fach höhere Konzentrationen an
Ligand eingesetzt werden, als die Dissoziationskonstante vermuten lässt. Diese Diskrepanz
wurde auch bei anderen in vivo Systemen zur Translationsregulation beobachtet und ist
gegenwärtig das wohl größte Hindernis in der Entwicklung von hochsensitiven
Riboregulatoren in höheren Eukaryoten (Desai et al., 2004). Mögliche Ursachen dafür sind
alternative Sekundärstrukturen in der Zelle, um den Liganden konkurrierende Proteine und
RNAs und natürlich auch die Dynamik der Bindungsreaktion selbst.
5.1.3 Aufbau der Tc-Bindetasche
Bereits zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass zwei unabhängige Bereiche im Tc-Aptamer
(B1-2 und L3) an der Tc-Bindung beteiligt sind. Diese Bereiche weisen Tc-abhängige
Änderungen in der Zugänglichkeit bei enzymatischen und chemischen Interferenzstudien auf,
woraus sich erste Hinweise auf Kontakte zwischen Tc und dem Aptamer ergaben, ohne
jedoch die Bedeutung der einzelnen Nukleotide genauer definieren zu können (Hanson et al.,
2005). In Abbildung 5.1 ist die Sekundärstruktur des Tc-Aptamers dargestellt. Die Positionen,
welche in vitro bei Mutation den stärksten Effekt auf die Tc-Bindung aufweisen, sind rot
markiert. Orange markierte Positionen bewirken bei Mutation nur eine geringfügige
Verschlechterung, während die grün markierte Position A8 nach Mutation zu G fast dem WT
entspricht.
Der Bereich L3 im Tc-Aptamer beginnt mit einer Nukleotidfolge aus 6 Purinen (G48-A53).
Die Nukleobasen dieser Purinkette können durch Basenstapelungseffekte miteinander
wechselwirken und somit die strukturelle Voraussetzung für die Tc-Bindung an das Aptamer
schaffen. Für das Nukleotid G51 wurde gezeigt, dass es eine UV-induzierte kovalente
Diskussion 91
Verknüpfung mit Tc eingeht (Berens et al., 2001), aber dessen Mutation nach U nur eine
minimale Reduzierung der Tc-Affinität verursacht. Demzufolge ist die Identität der
Nukleobase an Position 51 für die Tc-Bindung nur von sekundärer Bedeutung.
Das für Tc-Bindung essentielle Nukleotid A50 befindet sich in direkter Nachbarschaft. Somit
ist es durchaus möglich, dass der aromatische Teil von Tc im Purinstapel G48-A53 durch
elektrostatische Wechselwirkungen (Basenstapelungseffekte) von A50 gebunden wird und die
UV-induzierte Verknüpfung von Tc an G51 nur aufgrund von sterischen Effekten an dieser
Position zustande kommt. Dies wird durch die Beobachtung, dass Tc nur mit Guanin eine
UV-induzierte Verknüpfung eingeht (Barta, persönliche Mitteilung) und der Tatsache, dass
G51 das nächstliegende Guanin ist, bestätigt. Dem Adenin an Position 50 kommt zudem eine
große strukturelle Bedeutung für das Aptamer bei. Dies wird aus der Analyse der
Komplexbildung mit der A50U Mutante bei ITC-Experimenten deutlich. Die A50U Mutation
verursacht den kompletten Wegfall des entropischen Terms aufgrund fehlender inter- und
intramolekularer Wechselwirkungen zwischen den Bindungspartnern. Für die WT-RNA
bedeutet das, dass A50 für die Strukturierung von L3 im Aptamer essentiell ist.
Direkt im Anschluss an den Purinstapel befinden sich die Nukleotide U54 und A55, welche
bei Mutation nach G nur einen geringfügigen Tc-Affinitätsverlust zeigen. Der Bereich um die
Position 55 ist für die Tc-Bindung von großer Bedeutung, da diese Position eine Tc-
abhängige Hypersensitivität gegenüber der Spaltung durch OH-Radikale (Fenton-Reaktion)
aufweist und somit mit Mg2+ in Kontakt steht. Mg2+ ist für die Komplexbildung essentiell und
wird durch das Tc positioniert. Dieses bildet über R11 und R12 mit Mg2+ einen
Chelatkomplex und kann durch Kontakte zum RNA-Rückgrat den Komplex stabilisieren.
Die A55U Mutante kann Tc noch binden, erzeugt jedoch das Palindrom 51GAAUUC.
Dadurch kommt es zur Homodimerisierung von zwei RNA Molekülen. Anders als die
monomere Form ist das Homodimer nicht mehr in der Lage, Tc zu binden. Dies liegt
vermutlich daran, dass aufgrund der Doppelstrangbildung L3 nicht mehr korrekt gefaltet ist.
Chemische und enzymatische Interferenzstudien zeigen zusätzlich, dass die A55U Mutation
auch eine Änderung des Spaltmusters im Bereich B1-2 bewirkt. Während die Nukleotide A9,
U12 und A13 im WT-Aptamer einen starken Tc-abhängigen Rückgang in der Signalintensität
zeigen, kommt es in der A55U Mutante bei A9 zu einer Intensitätserhöhung und bei U12 und
A13 nur noch zu einer geringfügigen Reduktion der Signalstärke (Hanson et al., 2005). Dies
zeigt ebenfalls, dass die Bereiche B1-2 und L3 miteinander in Kontakt stehen.
Die Position A09 scheint für die Vorstrukturierung des Aptamers von großer Bedeutung zu
sein. Die Mutante A09G zeigt eine drastisch reduzierte Affinität zu Tc. Dieser Effekt ist
Diskussion 92
jedoch ausschliesslich entropisch bedingt und zeigt, dass die RNA ungeordneter bzw. weniger
vorstrukturiert ist. Daher muss für die Komplexbildung mehr Faltungsenergie aufgewendet
werden. Für das rationale Design eines artifiziellen Riboregulators ist diese Mutation ein
Schritt in die Richtung, das freie Aptamer für das Ribosom durchlässiger zu machen. Jedoch
ist der hier erzielte Effekt so stark, dass es dabei zum kompletten Verlust der in vivo Aktivität
kommt.
Für das Adenin an Position 13 konnte gezeigt werden, dass es in direkten Kontakt zur R6β
OH-Gruppe im Tc steht. Dies gelang mit der „double mutant cycle“ Methode bei der das
Bindungsverhalten von mehreren Aptamer-Mutanten mit unterschiedlichen Tc-Derivaten
verglichen wurde. Aus chemischen Interferenzstudien ist zusätzlich bekannt, dass der
Stickstoff N7 des Adenins in Gegenwart von Tc vor der Modifizierung durch DMS geschützt
wird. Daher ist es vermutlich dieser Stickstoff N7 im Adenin an Position 13, der mit der R6β
OH-Gruppe von Tc in Kontakt steht. In der A13U Mutante ist dieser direkte Tc-Adenin
Kontakt unterbrochen, was von einer reduzierten Bindungsenthalpie begleitet wird, ohne
jedoch einen großen Einfluss auf die RNA Struktur auszuüben.
Für die Tc-Bindung müssen sich B1-2 und L3 räumlich nahe sein und sich in der richtigen
strukturellen Orientierung befinden. Einer der beiden Bereiche allein reicht für die
Komplexierung von Tc nicht aus. Somit ergibt sich ein Bild, in dem der aromatische Teil von
Tc durch elektrostatische Wechselwirkungen, ausgelöst durch Basenstapelungseffekte
zwischen den Nukleotiden G48-A53 von A50 fixiert wird. Über das an der Ketoenol-Gruppe
komplexierte Mg2+ entsteht wahrscheinlich ein weiterer Kontakt zum Zucker-Phosphat
Rückgrat an Position A55 in L3. Das Nukleotid A13 steht in direkten Kontakt mit der R6β
OH-Gruppe und kann das in L3 fixierte Tc wie eine Klammer in Position halten. Weitere
Kontakte des Tc bilden die R2 Amidgruppe und eventuell der nicht getestete Kohlenstoff C1.
Der Kopfbereich des Tc-Aptamers ist an der Komplexbildung nicht beteiligt. Im
komplexierten Zustand ähnelt die RNA somit einem Pseudoknoten, der durch das Tc
vermittelt wird.
Diskussion 93
UAGACC
CGC
GCG
U
AA
A A
AU
C
C
UU
UC
UU
A
CC
CCA
A
A
GGG
GGCC
CGG
A AA
A
A
AA
C C
A CCC
G
*G
U
UA
A
691
10
40
50
60
20
30
UG C
wichtig für die RNA-Struktur
direkter Kontakt von N7
zur R6β OH-Gruppe im Tc
Kontakt zu Tc durch elektrostatische Wechselwirkung mit dem aromatischen Teil von Tc
wichtig für die RNA-Struktur
G GG UB1-2 L3
Mg2+ vermittelter Kontakt
von Tc zum RNA-Rückgrat
Abbildung 5.1
Sekundärstruktur des Tc-Aptames. Eingekreiste Nukleotide zeigen einen sehr geringen (grün), mittleren (gelb) und sehr starken (rot) Effekt auf die Tc-Bindung in vitro. Der G48-A53 Pyrimidintrakt ist in hellblau, die OH-Radikal hypersensitive Position A55 ist in violett dargestellt. Der * markiert die UV-induzierte Verknüpfung mit Tc. Bekannte Funktionen einzelner Nukleotide sind eingetragen.
In den Bereichen B1-2 und L3 des Tc-Aptamers gibt es Sequenzähnlichkeiten zu den Tc-
Bindestellen in der 16S rRNA von E. coli. Die Nukleotidfolgen AAG (49-51; 50-48; 53-51)
und UAC (12-10; 12-14; 54-56) im Tc-Aptamer finden sich in der Sequenz der ribosomalen
Tc-Bindestellen Tet-1 (AAG: 1196-1198; UAC: 1056-1054) und Tet-2 (AA: 894-895; UAC:
891-893) wieder (Brodersen et al., 2000; Hanson et al., 2005; Pioletti et al., 2001). Sowohl
die ribosomalen Tc-Bindetaschen als auch diejenige im Aptamer sind modular aufgebaut und
fixieren das Tc wie in einer Klammer über muliple Kontakte.
Dieses Strukturmodel der Tc-Bindetasche liefert eine mögliche Erklärung für die
regulatorische Aktivität des Tc-Aptamers in vivo. Das Ribosom ist in der Lage, Stamm-
Schleifen Strukturen in der mRNA aufzulösen. Es ist jedoch nicht in der Lage, einen
Pseudoknoten zu überwinden. Dieser stellt eine zu stabile Barriere dar. Ebenso verhält es sich
mit dem Tc-Aptamer. Das Ribosom kann die Stammschleifen in der Apo-Struktur wie einen
Reißverschluss öffnen. Wenn sich jedoch aus dem Aptamer durch Tc-Bindung eine
pseudoknotenähnliche Struktur ausgebildet hat, stellt dieser ein kaum zu überwindendes
Hindernis für das Ribosom dar.
Diskussion 94
5.2 Spleißregulation in S. cerevisiae durch das Tc-Aptamer
In diesem Projekt sollte versucht werden, das Tc-Aptamer zur Spleißregulation in S.
cerevisiae einzusetzen. Bisher wurde es zur Translationsregulation in Hefe in den 5´-UTR
eines Reporters inseriert. Daher sollte getestet werden, ob mit Hilfe des Tc-Aptamers die für
das Spleißen wichtigen Sequenzen 5´-SS und Verzweigungspunkt Tc-abhängig maskiert
werden können. Anders als im 5´-UTR interferiert das Aptamer dabei nicht mit dem
Ribosom, sondern mit dem Spleißosom bzw. dessen Formierung. In allen getesteten
Konstrukten wurden 5´-SS bzw. Verzweigungspunkt in der Aktin prä-mRNA direkt in die
Aptamersequenz integriert, wobei darauf geachtet wurde, dass die Tc-Bindefähigkeit erhalten
bleibt.
In vitro Spleißexperimente haben jedoch gezeigt, dass diese Art der Maskierung bereits ohne
Tc zu einer kompletten Inhibierung der Spleißreaktion führt.
Literaturverzeichnis 95
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Abkürzungsverzeichnis 101
7 Abkürzungsverzeichnis
% (v/v) % (volume/volume) (Volumenprozent)
% (w/v) % (weight/volume) (Massenprozent)
1D, 2D, 3D ein-, zwei-, dreidimensional
A Adenin
Abb. Abbildung
Amp Ampicillin
APS Ammoniumperoxodisulfat
AS Amminosäure
bp Basenpaare; Verzweigungspunkt („branch point“)
C Cytosin
c(X) Konzentration der Substanz X
Da Dalton
DEAE Diethylaminoethyl-Sepharose, Anionenaustauschermatrix
DEPC Diethylpyrocarbonat
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Desoxyribonukleotidtriphosphat
ds Doppelstrang („double strand“)
DTT Dithiothreitol
E. Escherichia
EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure
eIF eukaryotischer Initiationsfaktor
EtOH Ethanol
g Erdbeschleunigung oder Gramm
G Guanin oder Gibb´s freie Energie
H Enthalpie
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
ITC Isothermale Titrations-Kalorimetrie
KA Assoziationskonstante
kb Kilobasenpaare
KD Dissoziationskonstante
kDa Kilodalton
Abkürzungsverzeichnis 102
MCS Multiple Klonierungsstelle („multiple cloning site“)
MWCO Molekulargewichts-Ausschlussgrenze für die Passage durch
Membranen („molecular weight cut of“)
N Nukleotid, A, G, C oder U oder Stöchiometrie
NaAc Natrium Acetat
Nt Nukleotide
NTP Nukleotidtriphosphat
ODx optische Dichte, gemessen bei Wellenlänge λ=x nm
orf offener Leserahmen („open reading frame“)
PAA Polyacrylamid
PAGE PAA Gelelektrophorese
PCR Polymerasekettenreaktion
pH „pondus hydrogenii“
PMSF Phenylmethylsulphonylfluorid
RBD RNA-bindende Domäne
RBS Ribosomenbindestelle
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
rRNA ribosomale RNA
RT Raumtemperatur
S. Saccharomyces
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
ss Einzelstrang („single strand“)
T Thymin
Tab. Tabelle
Tc Tetracyclin
TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin
Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan
tRNA „transfer“-RNA
U Uracil oder „unit“
üNK über-Nacht-Kultur
UTR nicht translatierter Bereich „untranslated region“
WT Wildtyp
Abkürzungsverzeichnis 103
Einheiten: Vorsätze:
A Ampere k kilo 103
bp Basenpaar m milli 10-3
°C Grad Celsius µ mikro 10-6
g Gramm n nano 10-9
h Stunde
l Liter Nukleotide:
m Meter A Adenin
M molar (mol/l) C Cytosin
min Minute(n) G Guanin
sec Sekunde(n) T Thymin
Upm Umdrehungen pro Minute U Uracil
V Volt
W Watt
Anhang 104
8 Anhang
8.1 Materialien und Geräte
Häufig verwendete Chemikalien sind in Tabelle 8.1 aufgeführt. Weitere Chemikalien wurden
in per analysis Qualität von Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) und Sigma (München)
bezogen, und Oligonukleotide ausschließlich von MWG Biotech AG (Ebersberg). In den
folgenden Tabellen sind verwendete Hilfsmittel (Tabelle 8.2), Geräte (Tabelle 8.3),
verwendete Programme (Tabelle 8.4) kommerziell erhältliche Systeme (Tabelle 8.5)
aufgelistet. Die an der Äkta prime verwendeten Programme sind in Tabelle 8.6 und Tabelle
8.7 aufgelistet.
Tabelle 8.1 Chemikalien
Chemikalie Bezugsquelle 7-Cl-Tetracyclin
α-[32P] UTP (3000 mCi/mmol)
β-Mercaptoethanol
Anhydroteracyclin
APS (Ammonium-Peroxodisulfat)
Acrylamid: Bisacrylamid (40:1), 40 %
Adenin
AS-Mix (ohne L-Glutamin)
Adenosin-5´-triphosphat (ATP)
Agar
Agarose
Ammoniumsulfat
Ampicillin
Benzamidin
Borsäure
Bromphenolblau
Calciumchlorid
Col 1-8
DEAE-Sepharose FF
Deoxycholat
Desoxyribonukleintriphosphate
DMS (Dimethylsulfat)
Doxycyclin
Acros Organics, Belgien
Amersham Biosciences, Freiburg
Merck, Darmstadt
Acros Organics, Belgien
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Sigma, Steinheim
Gibco, Paisley (Schottland)
Roche Diagnostics, Mannheim
Merck, Darmstadt
peqLab, Erlangen
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Sigma, Steinheim
Merck, Darmstadt
Serva, Heidelberg
Merck, Darmstadt
Collagenex Pharmaceuticals, USA
Amersham Biosciences, Freiburg
Fluka AG, Schweiz
Boehringer, Mannheim
Fluka AG, Schweiz
Hovione, Schweiz
Anhang 105
dNTPs
DTT (Dithiothreitol)
EDTA
Essigsäure
Ethanol
Ethidiumbromid
Formamid
Glucose
Glyzerin
Hefeextrakt
Isoamylalkohol
Isopropanol
Magnesiumchlorid
Magnesiumsulfat
Natruimacetat
Natriumcacodylat
Natriumchlorid
Natriumhydroxid
Neomycin Sulfat
Oxyteracyclin
PMSF
Polyehylenimin Polymer
Phenol (TE-gesättigt)
rNTPs
SDS (Sodiumdodecylsulfat)
SP-Sepharose FF
Stickstoffquelle für Hefe
Temed
Tetracyclin
Trypton
Xylencyanol
Yeast nitrogen base
Roche Diagnotics, Mannheim
Sigma, München
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Fluka AG, Schweiz
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Oxoid, Heidelberg
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Sigma, München
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Sigma, USA
Acros Organics, Belgien
Sigma, USA
Fluka AG, Schweiz
Roth, Karlsruhe
Amersham Biosciences, Freiburg und Sigma, München
Roth, Karlsruhe
Amersham Biosciences, Freiburg
Becton-Dickinson, Dublin (Irland)
Merck, Darmstaft
Sigma, USA
Oxoid, Heidelberg
Roth, Karlsruhe
Difco
Tabelle 8.2 Hilfsmittel
Hilfsmittel Bezugsquelle
Einmalspritzen
Eppendorfgefäße (1,5 / 2,0 ml)
Glaspipetten
Kunststoffpetrischalen
Becton-Dickinson, Dublin (Irland)
Greiner, Nürtingen
Brand, Wertheim
Greiner, Nürtingen
Anhang 106
Imager Platte BAS-IIIS
Mikroliterpipetten (einfach)
Mikroliterpipetten (8-Kanal)
PCR-Reaktionsgefäße (0,2 ml)
Pipettenspitzen, Kunststoff
Polyethylenröhrchen (12 / 50 ml)
Küvetten (10x10x48 mm)
Küvetten (Halb-Mikro)
Reagenzgläser (10 ml)
XK-Säule
Zentrifugenbecher
Fuji Photo Film, Japan
Gilson, Düsseldorf
Eppendorf, Hamburg
peqLab, Erlangen
Greiner, Nürtingen
Greiner, Nürtingen
Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Greiner, Nürtingen
Sarstedt, Nürnbrecht
Amersham Biosciences, Freiburg
Beckmann, München
Tabelle 8.3 Geräte
Gerät Bezugsquelle
ABI Prism 310 Genetic Analyser
Äkta prime
Autoklav
BiofugeA, fresco und primoR
Brutschrank
Elektrophoreseapparaturen für Agarose- und
PAA-Gele
Feinwaage Sartorius
Fluorolog-3
Thermomixer comfort
Horizontalschüttler 3006
Kühlzentrifuge Avanti J-25
Kulturschüttler G 25
Long/Short Wave Light UVLS-26
Magnet-Heizrührer
Microcal VP-ITC
pH-Meter Calimatic
Phosphoimager Fuji BAS-1500
Scintillator LS 5000 TD
Spannungsquelle TN 300–120
Speed-Vac-Konzentrator
Spektralphotometer Ultraspec 3000
Thermocycler Gene Amp PCR-system 2400
Umlaufkühler FC 360
UV-Schirm 254 nm und 366 nm
Perkin Elmer, Weiterstadt
Amersham Biosciences, Piscateway (USA)
Deutsch und Neumann, Berlin
Heraeus Christ, Osterode
Heraeus Christ, Osterode
B. Macht, Universität Erlangen-Nürnberg
Sartorius, Göttingen
Instruments S.A., Inc., New Jersey
Eppendorf, Hamburg
GFL, Burgwedel
Beckmann, München
New Brunswick, Neuisenburg
Upland, CA USA
JAK Werk, Staufen
MicroCal Inc, Northampton
Knick, Berlin
Raytest Isotopenmessgeräte, Straubenhardt
Beckman, München
Heinzinger, Rosenheim
Bachofer, Reutlingen
Pharmacia Biotech, Freiburg
Pharmacia Biotech, Freiburg
JULABO Labortechnik GmbH, Seelbach
JKA-Labortechnik, Staufen
Anhang 107
Vortexer VF2
Waage Sartorius Universal
Wasserbad
Wasservollentsalzungsanlage
Vetter, Wiesloch
Sartorius, Göttingen
Braun, Melsungen
Millipore, Frankreich
Tabelle 8.4 Programme
Programm Bezugsquelle
Mfold
RNAstructure 3.7
TINA 2.08c
Origin 5.0
http://mfold.burnet.edu.au/
http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/
raytest Isotopenmessgeräte GmbH
Microcal Inc.
Tabelle 8.5 Kommerziell erhältliche Systeme (Kits)
Reagenziensatz Bezugsquelle Anwendung
Frozen-EZ Yeast Transformation II
Nucleobond AX
Nucleospin Plasmid
NucleoSpin Extract 2 in 1
GFX
Ready To Go PCR-Beads
Terminationsmix
Zymo Research, Orange (USA)
Macherey-Nagel, Düren
Macherey-Nagel, Düren
Macherey-Nagel, Düren
Amersham Biosciences,
Piscateway (USA)
Amersham Pharmacia, Freiburg
PE-Biosystems, USA
Plasmidtransformation in Hefe
Plasmidpräparation
DNA-Elution aus Agarose
Aufreinigung von PCR-Produkten
DNA-Elution aus Agarose,
Aufreinigung von PCR-Produkten
PCR, Kolonie-PCR
Sequenzierung von DNA
Sequenzierung von DNA
Anhang 108
Tabelle 8.6 Programmierung der Äkta prime für SP-Sepharose Säule
breakpoint bei
ml 0.00 50 250 251 369
conc %B 0 0 0 100 100
flow rate
ml/min.
5
4
4
3 3
fraction size ml 0.0 0 0 1.2 1.2
buffer valve
pos 2 1 1 1 1
inject valve pos load Load load load load
peak collect no no no no no
autozero no no no no no
event mark no no no no no
time volume
ml 0.00 50 250 251 369
Puffer/Vorgang Probenbeladung Waschen Elution
Anhang 109
Tabelle 8.7 Programmierung der Äkta prime für DEAE-Sepharose Säule
breakpoint bei
ml 0 30 100 200 600 630 650 655 755
conc %B 0 0 0 0 100 60 60 0 0
flow rate
ml/min. 5 5 5 5 5 5 5 5 5
fraction size ml 0.0 10 10 6.0 6.0 10.0 0.0 0.0 0.0
buffer valve pos 1 2 1 1 1 1 1 1 1
inject valve pos load load load load load load load load load
peak collect no no no no no no no no no
autozero no yes no no no no no no no
event mark no no no no no no no no no
time volume
ml 0 30 100 200 600 630 650 655 755
Puffer/Vorgang Baseline Proben-
beladung Waschen Gradient/Elution Hochsalzpuffer/Stoßelution Waschen
Anhang 110
8.2 Fluoreszenzmessungen an Mutanten von Tc-Aptamer RNA
A
440 460 480 500 520 540 560 580 600 620
020000400006000080000
1000001200001400001600001800002000002200002400002600
0 nM RNA 20 nM RNA 40 nM RNA 80 nM RNA 120 nM RNA 160 nM RNA 200 nM RNA 280 nM RNA 360 nM RNA 440 nM RNA 520 nM RNA 600 nM RNA 800 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
Puffer 0 nM RNA 15 nM RNA 30 nM RNA 45 nM RNA 60 nM RNA 90 nM RNA 120 nM RNA 180 nM RNA 240 nM RNA 300 nM RNA 360 nM RNA 480 nM RNA 600 nM RNA 720 nM RNA 840 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm0 200 400 600 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200
20000400006000080000
100000120000140000160000180000200000220000240000260000280000
Puffer 0 nM RNA 40 nM RNA 80 nM RNA 120 nM RNA 200 nM RNA 320 nM RNA 480 nM RNA 720 nM RNA 1080 nM RNA 1480 nM RNA 1960 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm0 500 1000 1500 2000
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fsfreie RNA / nM
B
00C
Abbildung 8.1
Titration von Tc mit RNA Tc-Aptamer A9G (A), A13U (B) und A50U (C). Die Spektrenschar ist jeweils links, die berechnete hyperbolische Bindekurve ist jeweils rechts dargestellt. Für die Titration wurden bei A9G 40 nM, bei A13U 30 nM und bei A50U 40 nM Tc in Puffer-K vorgelegt
Anhang 111
440 460 480 500 520 540 560 580 600 620
100015002000250030003500400045005000550060006500700075008000850090009500
Puffer 0 nM RNA 0,5 nM RNA 1 nM RNA 3 nM RNA 5 nM RNA 9 nM RNA 14 nM RNA 19 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm0 5 10 15 20
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
440 460 480 500 520 540 560 580 600 620500
10001500200025003000350040004500500055006000650070007500
Puffer 0 nM tc 1 nM tc 2 nM tc 4 nM tc 8 nM tc 16 nM tc 32 nM tc 48 nM tc 60 nM tc
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm0 10 20 30 40 50 60
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
440 460 480 500 520 540 560 580 600 620
2000
4000
6000
8000
10000
12000 Puffer 0 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 4 nM RNA 8 nM RNA 15 nM RNA 30 nM RNA 60 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm0 10 20 30 40 50 60
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nm
C
B
A
Abbildung 8.2
Titration von Tc mit RNA Tc-Aptamer G51U (A), U54G (B) und A55G (C). Die Spektrenschar ist jeweils links, die berechnete hyperbolische Bindekurve ist jeweils rechts dargestellt. Für die Titration wurden bei G51U und U54G 0,5 nM und bei A55G 1 nM Tc in Puffer-K vorgelegt.
Anhang 112
cps
uore
szen
z /
Fl
440 460 480 500 520 540 560 580 600 62010001500200025003000350040004500500055006000650070007500 Puffer
0 nM RNA 0,5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 4 nM RNA 8 nM RNA 13 nM RNA
Wellenlänge / nm-2 0 2 4 6 8 10 12 14
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
Abbildung 8.3
Titration von Tc mit Tc-Aptamer A8G RNA. Die Spektrenschar ist links, die berechnete hyperbolische Bindekurve ist rechts dargestellt. Für die Titration wurden 0,5 nM Tc in Puffer-K vorgelegt.
Anhang 113
8.3 Fluoreszenz-Messungen mit verschiedenen Tc-Derivaten
600
800
400
200
2
1
1 1
5000
440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200
0
0
0
0
10000
12000
14000
16000
18000
Puffer 0 nM RNA 0.5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA 30 nM RNA 50 nM RNA 100 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm0 20 40 60 80 100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
440 460 480 500 520 540 560 580 600 620
2000
4000
6000
8000
10000
2000
4000
16000
8000
0 Puffer 0 nM RNA 0,5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 4 nM RNA 7 nM RNA 10 nM RNA 15 nM RNA 20 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm0 5 10 15 20
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
440 460 480 500 520 540 560 580 600 620
100015002000250030003500400045005000550060006500700075008000850090009500
1 Puffer 0 nM RNA 0.5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 15 nM RNA 25 nM RNA 50 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm0 10 20 30 40 50
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA /nM
475 500 525 550 575 600
0
10000
15000
20000
Puffer 0 nM RNA 30 nM RNA 60 nM RNA 90 nM RNA 120 nM RNA 150 nM RNA 300 nM RNA 450 nM RNA 600 nM RNA 900 nM RNA 1200 nM RNAko
rrig
ierte
Flu
ores
zenz
/ cp
s
Wellenlänge / nm0 200 400 600 800 1000 1200
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
D
A
0000C
000B
Anhang 114
zenz
/ cp
s
uore
s
Fl
cps
resz
enz
/
Flu
enz
/ cps
esz
Fluo
r
440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Puffer 0 nM RNA 0,5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA 30 nM RNA 40 nM RNA 50 nM RNA
Wellenlänge / nm0 10 20 30 40 50
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Puffer 0 nM RNA 0.5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA 30 nM RNA 40 nM RNA
o
Wellenlänge / nm0 5 10 15 20
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
1 K-PO4 Puffer 0 nM RNA 1 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 15 nM RNA 20 nM RNA 30 nM RNA 40 nM RNA 50 nM RNA 60 nM RNA 70 nM RNA 80 nM RNA 90 nM RNA
Wellenlänge / nm0 20 40 60 80
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
440 460 480 500 520 540 560 580 600 6200
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
22000
24000 Puffer 0 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA 30 nM RNA 40 nM RNA 60 nM RNA 80 nM RNA 120 nM RNA 160 nM RNA 200 nM RNA 250 nM RNA 300 nM RNA 400 nM RNA 500 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm0 100 200 300 400 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
H
F
E
8000G
Anhang 115
440 460 480 500 520 540 560 580 600 620
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000 Puffer 0 nM RNA 0,5 nM RNA 1 nM RNA 2 nM RNA 3 nM RNA 4 nM RNA 7 nM RNA 10 nM RNA 15 nM RNA 20 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
440 460 480 500 520 540 560 580 600 620
100020003000400050006000700080009000
100001100012000130001400015000160001700018000
0 nM RNA 5 nM RNA 10 nM RNA 20 nM RNA 50 nM RNA 100 nM RNA 200 nM RNA 300 nM RNA
Fluo
resz
enz
/ cps
Wellenlänge / nm0 50 100 150 200 250 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fs
freie RNA / nM
K
J
Abbildung 8.4
Titration von Tc-Derivat mit Tc-Aptamer RNA. Die Spektrenschar ist links, die berechnete hyperbolische Bindekurve ist rechts dargestellt. Es wurden (A) Oxytetracyclin, (B) Col 6, (C) Col 1, (D) Anhydrotetracyclin, (E) Col2, (F) 7-Cl-Tetracyclin, (G) Sancyclin, (H) Doxycyclin, (I) Col 8 und (J) Col 5 analysiert. Im Falle von (A), (B), (C), (E) und (F) wurde 1 nM Tc-Derivat vorgelegt, bei (G), (H) und (I) wurden 10 nM vorgelegt, bei (J) 20 nM und bei (D) 50 nM.
Anhang 116
8.4 „Double mutant cycle“ Analyse nach Fersht
Tabelle 8.8 ∆G und ∆∆G Werte für die „double mutant cycle“ Analyse
Tc Oxy-Tc Col 2 Doxy
∆G
(kcal/mol)
∆∆G
(kcal/mol)
∆G
(kcal/mol)
∆∆G
(kcal/mol)
∆G
(kcal/mol)
∆∆G
(kcal/mol)
∆G
(kcal/mol)
∆∆G
(kcal/mol)
WT -12.46 ± 0.04 -12.09 ± 0.04 -0.37 ± 0.08 -10.92 ± 0.06 -1.54 ± 0.09 -9.47 ± 0.02 -2.99 ± 0.06
A09G -9.31 ± 0.03 -3.15 ± 0.07 -8.66 ± 0.01 -3.43 ± 0.05 -7.62 ± 0.01 -3.30 ± 0.06 -6.48 ± 0.16 -2.98 ± 0.18
A13U -9.11 ± 0.01 -3.35 ± 0.05 -8.57 ± 0.01 -3.52 ± 0.05 -7.87 ± 0.01 -3.05 ± 0.07 -7.67 ± 0.01 -4.79 ± 0.03
A50U -9.19 ± 0.02 -3.28 ± 0.06 -8.48 ± 0.01 -3.61 ± 0.05 -7.62 ± 0.02 -3.31 ± 0.07 -6.79 ± 0.16 -5.67 ± 0.18
∆G Werte wurden aus den entsprechenden KD Werte mit der Formel ∆G=-RT ln(KD-1) berechnet.
∆∆G Werte wurden als ∆G(WT / Tc) - ∆G(RNA / Tc-Derivat) berechnet.
Anhang 117
Tabelle 8.9 Berechnung von ∆∆Gint
∆∆GT (kcal/mol) ∆∆GR (kcal/mol) ∆∆GTR (kcal/mol) ∆∆Gint (kcal/mol)a
WT – A09G Tc / Oxy-Tc 0.37 ± 0.08 3.15 ± 0.07 3.81 ± 0.06 0.28 ± 0.21
Tc / Col 2 1.54 ± 0.10 3.15 ± 0.07 4.85 ± 0.04 0.16 ± 0.22
Oxy-Tc / Doxy 2.62 ± 0.06 3.43 ± 0.05 5.61 ± 0.20 - 0.45 ± 0.31
Oxy-Tc / Col 2 1.17 ± 0.09 3.43 ± 0.05 4.47 ± 0.04 - 0.13 ± 0.19
Tc /Doxy 3.00 ± 0.06 3.15 ± 0.07 5.98 ± 0.22 - 0.17 ± 0.36
Col 2 /Doxy 1.46 ± 0.08 3.31 ± 0.07 4.44 ± 0.22 - 0.32 ± 0.37
WT– A13U Tc / Oxy-Tc 0.37 ± 0.08 3.35 ± 0.05 3.89 ± 0.05 0.16 ± 0.18
Tc / Col 2 1.54 ± 0.09 3.35 ± 0.05 4.59 ± 0.05 - 0.30 ± 0.20
Oxy-Tc / Doxy 2.62 ± 0.06 3.52 ± 0.05 4.42 ± 0.05 - 1.72 ± 0.15
Oxy-Tc / Col 2 1.17 ± 0.09 3.52 ± 0.05 4.22 ± 0.05 - 0.46 ± 0.19
Tc /Doxy 3.00 ± 0.06 3.35 ± 0.05 4.80 ± 0.07 - 1.56 ± 0.18
Col 2 /Doxy 1.46 ± 0.08 3.05 ± 0.07 3.26 ± 0.07 - 1.26 ± 0.21
WT – A50U Tc / Oxy-Tc 0.37 ± 0.08 3.28 ± 0.06 3.98 ± 0.06 0.33 ± 0.20
Tc / Col 2 1.54 ± 0.10 3.28 ± 0.06 4.85 ± 0.05 0.03 ± 0.21
Oxy-Tc / Doxy 2.62 ± 0.06 3.61 ± 0.05 5.30 ± 0.20 - 0.93 ± 0.30
Oxy-Tc / Col 2 1.17 ± 0.09 3.61 ± 0.05 4.47 ± 0.05 - 0.30 ± 0.20
Tc /Doxy 3.00 ± 0.06 3.28 ± 0.06 5.67 ± 0.22 - 0.60 ± 0.34
Col 2 /Doxy 1.46 ± 0.08 3.31 ± 0.07 4.13 ± 0.22 - 0.63 ± 0.37
∆∆Gint wurde als ∆∆GTR – (∆∆GT + ∆∆GR) berechnet
Anhang 118
8.5 Integration der Spleißstellen-Aptamer Hybride in das Intron von
Aktin
A T7-Promotor SalI BamHI 1 AGAATACAAG CTTTAATACG ACTCACTATA GTCGACGGAT CCCCCTTTTA 51 GATTTTTCAC GCTTACTGCT TTTTTCTTCC CAAGATCGAA AATTTACTGA 5´-SS 101 ATTAACAATG GATTCTGGTA TGTTCTAGCG CTTGCACCAT CCCATTTAAC AvaI 151 TGTAAGAAGA ATTGCACGGT CCCAATTGCT CGAGAGATTT CTCTTTTACC 201 TTTTTTTACT ATTTTTCACT CTCCCATAAC CTCCTATATT GACTGATCTG 251 TAATAACCAC GATATTATTG GAATAAATAG GGGCTTGAAA TTTGGAAAAA 301 AAAAAAAAAC TGAAATATTT TCGTGATAAG TGATAGTGAT ATTCTTCTTT bp ClaI 351 TATTTGCTAC TGTTACTAAG TCTCATGTAC TAACATCGAT TGCTTCATTC 3´-SS 401 TTTTTGTTGC TATATTATAT GTTTAGAGGT TGCTGCTTTG GTTATTGATA 451 ACGGTTCTGG TATGTGTAAA GCCGGTTTTG CCGGTGACGA CGCTCCTCGT 501 GCTGTCTTCC CATCTATCGT CGGTAGACCA AGACACCAAG GTATCATGGT EcoRI 551 CGGTATGGGT CAAAAAGACT CCTACGTTGG TGATGAAGGG GAATTCGTAA
B T7-Promotor BamHI 1 AGAATACAAG CTTTAATACG ACTCACTATA GTCGACGGAT CCCCCTTTTA 51 GATTTTTCAC GCTTACTGCT TTTTTCTTCC CAAGATCGAA AATTTACTGA 5´-SS 101 ATTAACAATG GATTCAGGTA TGTAAAACAT ACCAGATCGC CACCCGCGCT 151 TTAATCTGGA GAGGTGAAGA ATACGACCAC CTACATGCTT CTCTTTTACC 201 TTTTTTTACT ATTTTTCACT CTCCCATAAC CTCCTATATT GACTGATCTG 251 TAATAACCAC GATATTATTG GAATAAATAG GGGCTTGAAA TTTGGAAAAA 301 AAAAAAAAAC TGAAATATTT TCGTGATAAG TGATAGTGAT ATTCTTCTTT bp ClaI 351 TATTTGCTAC TGTTACTAAG TCTCATGTAC TAACATCGAT TGCTTCATTC 3´-SS 401 TTTTTGTTGC TATATTATAT GTTTAGAGGT TGCTGCTTTG GTTATTGATA 451 ACGGTTCTGG TATGTGTAAA GCCGGTTTTG CCGGTGACGA CGCTCCTCGT 501 GCTGTCTTCC CATCTATCGT CGGTAGACCA AGACACCAAG GTATCATGGT EcoRI 551 CGGTATGGGT CAAAAAGACT CCTACGTTGG TGATGAAGGG GAATTCGTAA
Anhang 119
C T7-Promotor BamHI 1 AGAATACAAG CTTTAATACG ACTCACTATA GTCGACGGAT CCCCCTTTTA 51 GATTTTTCAC GCTTACGGCC TAAAACATAC CAGATCGCCA CCCGCGCTTT 5´-SS 101 AATCTGGAGA GGTGAAGGTA TGTCGACCAC CTAGGCCCAT CCCATTTAAC 151 TGTAAGAAGA ATTGCACGGT CCCAATTGCT CGAGAGATTT CTCTTTTACC 201 TTTTTTTACT ATTTTTCACT CTCCCATAAC CTCCTATATT GACTGATCTG 251 TAATAACCAC GATATTATTG GAATAAATAG GGGCTTGAAA TTTGGAAAAA 301 AAAAAAAAAC TGAAATATTT TCGTGATAAG TGATAGTGAT ATTCTTCTTT bp ClaI 351 TATTTGCTAC TGTTACTAAG TCTCATGTAC TAACATCGAT TGCTTCATTC 3´-SS 401 TTTTTGTTGC TATATTATAT GTTTAGAGGT TGCTGCTTTG GTTATTGATA 451 ACGGTTCTGG TATGTGTAAA GCCGGTTTTG CCGGTGACGA CGCTCCTCGT 501 GCTGTCTTCC CATCTATCGT CGGTAGACCA AGACACCAAG GTATCATGGT EcoRI 551 CGGTATGGGT CAAAAAGACT CCTACGTTGG TGATGAAGGG GAATTCGTAA D T7-Promotor 1 AGAATACAAG CTTTAATACG ACTCACTATA GTCGACGGAT CCCCCTTTTA 51 GATTTTTCAC GCTTACTGCT TTTTTCTTCC CAAGATCGAA AATTTACTGA 5´-SS 101 ATTAACAATG GATTCTGGTA TGTTCTAGCG CTTGCACCAT CCCATTTAAC AvaI 151 TGTAAGAAGA ATTGCACGGT CCCAATTGCT CGAGAGATTT CTCTTTTACC 201 TTTTTTTACT ATTTTTCACT CTCCCATAAC CTCCTATATT GACTGATCTG 251 TAATAACCAC GATATTATTG GAATAAATAG GGGCTTGAAA TTTGGAAAAA 301 AAAAAAAAAC TGAAATATTT TCGTGATAAG TGATAGTGAT ATTCTTCTTT bp 351 TATTTGCTAC TGTTACTAAG TCTGGCCTAC TAACATACCA GATCGCCACC 3´-SS 401 CGCGCTTTAA TCTGGAGAGG TGAAGAAACG ACCACCTAGG CCATTGATAA 451 CGGTTCTGGT ATGTGTAAAG CCGGTTTTGC CGGTGACGAC GCTCCTCGTG 501 CTGTCTTCCC ATCTATCGTC GGTAGACCAA GACACCAAGG TATCATGGTC EcoRI 551 GGTATGGGTC AAAAAGACTC CTACGTTGGT GATGAAGGGG AATTCGTAAT
Abbildung 8.5
Relevante Sequenzausschnitte von (A) pSP64 T7 Aktin, (B) pSP64 T7 Aktin S2, (C) pSP64 T7 Aktin S3 und (D) pSP64 T7 Aktin S6. Die T7-Promotorsequenz ist kursiv, 5´-SS, bp und 3´-SS sind in blau und die Aptamersequenz ist in rot dargestellt. Schnittstellen für verwendete Restriktionsenzyme sind unterstrichen.
Publikationen 120
9 Publikationen
Michael Müller, Julia Weigand, Oliver Weichenrieder and Beatrix Suess. (2006).
Thermodynamic characterization of an engineered tetracycline-binding riboswitch. J Biol
Chem (eingereicht)
Schilling, O., Langbein, I., Müller, M., Schmalisch, M. H. & Stulke, J. (2004). A protein-
dependent riboswitch controlling ptsGHI operon expression in Bacillus subtilis: RNA
structure rather than sequence provides interaction specifity. Nucleic Acids res 32, 2853-2864.
Lebenslauf 121
10 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name Michael Müller
Geburtsdatum 08.05.1975
Geburtsort Passau
Familienstand verheiratet
Schulausbildung
1981 – 1986 Grund- und Hauptschule Thyrnau
1986 – 1995 Gymnasium Untergriesbach
Grundwehrdienst
1995 – 1996 Grundausbildung in der Marinewaffenschule in Eckernförde
Mannschaftsdienstgrad auf dem Minenjagdboot Homburg 1.MSG
Hochschulausbildung
1996 – 2001 Studium der Biologie an der Friedrich-Alexander Universität
Erlangen-Nürnberg
Diplomarbeit am Lehrstuhl für Mikrobiologie, Friedrich-Alexander
Universität Erlangen-Nürnberg bei PD Dr. Jörg Stülke zum Thema:
„NMR-Untersuchungen an einer gefalteten RNA“; davon 6 Monate am
Institut für molekulare Biotechnologie, Abteilung für Biophysik in Jena
Abschluss: Diplom-Biologe Univ.
2002 – 2005 Promotion am Lehrstuhl für Mikrobiologie, Friedrich-Alexander
Universität Erlangen-Nürnberg bei Prof. Dr. Wolfgang Hillen in der
AG Dr. Beatrix Süß;
Thema: „Molekulare Analyse eines synthetischen Tetracyclin-
abhängigen RNA-Regulators“
Erlangen, den 07.12.2005