Molekularbiologische Untersuchungen zum Einfluss von Entzündungsmediatoren und elektromagnetischen Feldern auf tight junction Komponenten der Blut-Hirn-Schranke Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum angefertigt im Lehrstuhl für Neuroanatomie und Molekulare Hirnforschung vorgelegt von Kerstin Ladage aus Essen Bochum November, 2006 1. Gutachter: Prof. Dr. R. Dermietzel 2. Gutachter: Prof. Dr. H. Lübbert
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Molekularbiologische Untersuchungen zum Einfluss von Entzündungsmediatoren und
elektromagnetischen Feldern auf tight junction Komponenten der Blut-Hirn-Schranke
Dissertation zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie
an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt im
Lehrstuhl für Neuroanatomie und
Molekulare Hirnforschung
vorgelegt von
Kerstin Ladage
aus
Essen
Bochum
November, 2006
1. Gutachter: Prof. Dr. R. Dermietzel 2. Gutachter: Prof. Dr. H. Lübbert
1.1.1 Die Endothelzellen.............................................................................2 1.1.2 Die Perizyten .....................................................................................5 1.1.3 Astrozyten..........................................................................................7 1.1.4 Aufbau der tight junction ....................................................................8
1.2 Die Blut-Hirn-Schranke unter pathophysiologischen Bedingungen........10 1.2.1 Die Wirkung von Zytokinen auf die Blut-Hirn-Schranke ...................11 1.2.2 Die Leukozyten-Endothel-Adhäsions-Kaskade................................12
1.3 Die Wirkung von elektromagnetischen Feldern auf die BHS .................13 1.4 Zielsetzung ............................................................................................16
2. Material und Methoden ................................................................................17 2.1 Material ..................................................................................................17
2.2 Methoden...............................................................................................21 2.2.1 Arbeitsmethoden der Zellkultur (in vitro–Versuche) .........................21 2.2.2 Gefäßisolation mittels Nylonsieben (Ex vivo-Versuche) ..................23 2.2.3 In–vivo-Versuche: Lokale Exposition des Rattengehirns mit .............. elektromagnetischen Feldern (UMTS) in vivo..................................28 2.2.4 Molekularbiologische Arbeitsmethoden ...........................................35 2.2.5 Histochemische Arbeitsmethoden ...................................................44 2.2.6 Proteinbiochemische Arbeitsmethoden ...........................................46
3. Ergebnisse ....................................................................................................49 3.1 Die Wirkung von Entzündungsmediatoren auf Endothelzellen der BHS 49
3.1.1 Wirkung von Interleukin-1β (IL-1β) auf die Proteine der zerebralen Endothelzellen in vitro......................................................................49 3.1.2 Wirkung von Lipopolysaccharid auf Proteine der zerebralen .............. Endothelzellen in vitro......................................................................55
3.2 Darstellung der Proteinexpressionen.....................................................60 3.2.1 Western-Blots und Immunzytochemie zerebraler ............................... Endothelzellkulturen ........................................................................60
3.3 Die Wirkung von Entzündungsmediatoren auf die Genexpression von tight-junction-Komponenten isolierter BHS-Mikrogefäße (ex vivo).........66
3.3.1 Wirkung von Interleukin-1β (IL-1β) auf die Proteine der isolierter ....... BHS-Mikrogefäße (ex vivo)..............................................................66 3.3.2 Wirkung von Lipopolysaccharid auf Proteine isolierter Mikrogefäße (ex vivo) ...........................................................................................72
3.4 Ergebnisse zur lokalen Exposition von Rattengehirnen mit UMTS ........... Mikrowellen............................................................................................77
3.4.1 Ergebnisse der Vorversuche............................................................77 3.4.2 Ergebnisse der Hauptversuche........................................................85
Inhaltsverzeichnis
III
3.5 Expression von tight junction Genen in isolierten Gehirngefäße im elektromagnetischen Feld......................................................................91
3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse .......................................................97
4. Diskussion ....................................................................................................99 4.1 Expressionen von tight junction-Komponenten in Endothelzellkulturen
und BHS-Mikrogefäßen unter inflammatorischen Bedingungen ............99 4.2 Expressionsänderungen von tight junction-Genen isolierter BHS-
Mikrogefäße unter elektromagnetischer Befeldung .............................105 4.3 Der Einfluss von UMTS-Mikrowellen auf die Expression von tight
junction-Komponenten der BHS in vivo ...............................................107 4.3.1 Diskussion der Vorversuche (in vivo).............................................107 4.3.2 Diskussion der Hauptversuche ......................................................112
(0,075g Kollagenase: Worthinton CLS II in 10 ml DMEM). Das Gemisch wurde
kräftig geschüttelt und im 37°C Wasserbad für 1 h enzymatisch angedaut. Wäh-
rend der Inkubation wurde der Ansatz alle 10 min kräftig geschüttelt. Danach
wurde zur Separation des Myelins das verdaute Gewebe auf einen 25%igen
BSA-Gradienten (7,5g BSA in 30ml PBS) geschichtet (je 8 ml Verdau + 7,5 ml
Gradientenlösung pro Falcontube).
Die Proben wurden bei 1.000 xg in der Sigma Laborzentrifuge für 20 min. bei
RT zentrifugiert. Das in der oberen Phase angereicherte Myelin wurde vorsich-
tig durch Drehen des Falcon Tubes vom Rand gelöst und mit dem restlichen
Überstand in ein neues Falcon Tube gegossen. Die Überstände von jeweils 2
Tubes wurden in einem frischen Tube gesammelt und nochmals zentrifugiert
(1000 xg, 20 min., RT).
Die dunkelbraunen Pellets (sowohl nach dem ersten, als auch nach dem zwei-
ten Zentrifugationsschritt) wurden pro Tube in 2 ml Waschmedium aufgenom-
men, resuspendiert und in einem Falcon Tube gesammelt. Dieser Schritt diente
zum Waschen der Zellen. Die Proben wurden nun bei 1600 xg in der Sigma La-
2. Material und Methoden 22
borzentrifuge für 15 min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen
und anschließend erfolgte bei 37 °C für 30 min. ein zweiter Verdau mit 0,1%
Kollagenase (0,1g Kollagenase in 10 ml Waschmedium). Zwischenzeitlich wur-
de in sterilen Corex- Röhrchen (30 ml, Nalge Company) ein kontinuierlicher
50%-iger Percoll-Gradient geschichtet. Dafür wurden 7,33 ml Percoll (Pharma-
cia, Freiburg), 0,53 ml DMEM (10-fach konz.) und 14,33 ml PBS gemischt und
in der Kühlzentrifuge (Biofuge Stratos, Heraeus) zum Aufbau des Gradienten,
bei 27.000 xg für 1 h bei 8°C im Festwinkelrotor (8x 50ml, Nr. 3335) zentrifu-
giert.
Nach dem zweiten Kollagenase-Verdau wurde das verdaute Gewebe zum Wa-
schen mit Waschmedium auf 30 ml aufgefüllt und in der Sigma Zentrifuge bei
1600 xg für 20 min. bei RT zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und es
erfolgte ein DNase-Verdau mit 100 µg/ml DNase I (1ml DNase (Serva) + 4 ml
Waschmedium) für 2 min.. Danach wurde der Verdau mit Waschmedium auf 30
ml aufgefüllt und bei 400 xg in der Sigma Laborzentrifuge für 10 min bei RT
zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen das Pellet in 4 ml Waschmedium resuspendiert
und jeweils 2 ml der Suspension auf den vorbereiteten Percoll-Gradienten ge-
schichtet. Die Gradientenzentrifugation erfolgte in der Kühlzentrifuge (Sigma)
bei 2500 x g für 10 min. bei 4°C.
Nach der Zentrifugation zeigten sich in dem Gradienten drei unterschiedliche
Banden (siehe Abb. 3)
Zelldebris
Mikrovaskuläre Zellen (Endothelzellen)
Erythrozyten
Abb. 3: Percollgradient nach Auftrennung der Zellbestandteile aus der Gehirnpräpara-
tion.
2. Material und Methoden 23
Die Endothelzellen wurden vorsichtig abgesaugt (ca. 10ml Endothelzellsuspen-
sion pro Gradient), in Falcon Tubes gesammelt, mit Waschmedium auf 50 ml
Gesamtvolumen aufgefüllt und bei 1000 xg für 10 min. bei RT in der Sigma
Zentrifuge zentrifugiert. Das resultierende weiße Pellet wurde in 5 ml RBE+ (rat
brain endothelial)-Medium aufgenommen und resuspendiert. Die Zellsuspensi-
on wurde unter dem Phasenkontrast-Mikroskop kontrolliert und die Zellen wur-
den mit Hilfe der Zählkammer (Neubauer-Kammer) ausgezählt. Danach wurden
die Zellen auf Petrischalen (Ø 3 cm, Falcon) ausgesät, welche zuvor für 5–6
Std. bei 37 °C mit Kollagen (Biochrom AG, Berlin) beschichtet waren. Die aus-
gesäte Zelldichte betrug 1 - 1,5 Mio. Zellen pro ml Medium.
2.2.1.2 Reine Perizyten-Kultur Perizytenkulturen können mit derselben Isolationsmethode, wie für Endothelzel-
len beschrieben, gewonnen werden.
Dazu wurden Endothelzellkulturen, die immer mit einer geringen Anzahl Perizy-
ten kontaminiert sind für mindestens 7 Tage bei 37°C (5%CO2) kultiviert (Ram-
sauer, 1999). Dabei wurde alle zwei Tage das Kulturmedium (RBE-
Medium/4,5% Glucose) gewechselt. In den ersten fünf Tagen der Kultur prolife-
rierten unter diesen Kulturbedingungen die Endothelzellen. Nach ca. sieben Ta-
gen starben die Endothelzellen ab, und die ebenfalls in dem Kulturansatz vor-
handenen Perizyten begannen sich zu vermehren. Aus dieser Kultur konnten
nach 12 Tagen reine Perizytenkulturen gewonnen werden.
2.2.2 Gefäßisolation mittels Nylonsieben (Ex vivo-Versuche) Adulte Ratten (zwischen 12 Wochen und 5 Monaten alt) wurden dekapitiert und
die Gehirne wurden aus dem Schädel herauspräpariert. Es wurde nur das
Großhirn und das Zwischenhirn benutzt, das Kleinhirn und der Hirnstamm wur-
den abgetrennt und verworfen. Die Gehirne wurden sorgfältig von den Menin-
gen und vom Plexus choroideus befreit, danach erfolgte die Homogenisierung
der Gehirne. Dazu wurde jeweils 1 Gehirn in 4 ml kalter PBS (Phosphat gepuf-
2. Material und Methoden 24
ferte Saline) 1% BSA- (Bovine Serum Albumin) Lösung mit ca. 50 „strokes“ im
großen Glashomogenisator (50 ml Homogenisator mit L-Pistill, Braun- Melsung)
homogenisiert. Danach wurde das Gehirnhomogenat in einen 15 ml Glashomo-
genisator (Homogenisator mit L-Pistill, Schütt Labortechnik) umgefüllt und mit
25 „strokes“ weiter homogenisiert. Die homogenisierte Gehirnmasse wurde in
einem 10 ml Falcon-Tube gesammelt, wobei der kleine Homogenisator mit ca. 3
ml PBS+1% BSA-Lösung nachgespült wurde. Das Homogenat wurde für ca. 4
sec. gevortext und danach mit Ultraschall (12 Ultraschallstöße: Duty cycle 30,
output control: 2,5) behandelt, um die Gehirngefäße von Geweberesten zu rei-
nigen. Das homogenisierte Gehirngewebe wurde mit Hilfe eines Nylonnetzes
(100 µm Maschenweite) gesiebt. Die auf dem Netz verbliebenen Blutgefäße
wurden mit ca. 10 ml PBS abgespült, Die Gefäßsuspension wurde ein weiteres
Mal in 10 ml Falcon-Tubes gefüllt, 4 sec. gevortext und mit 10 Ultraschallstößen
(duty cycle: 20, output control: 2) behandelt und über ein 100 µm Nylonsieb von
Zellresten gereinigt. Die gereinigten Gefäße wurden je nach weiterer Aufarbei-
tung in PBS bzw. ACSF (artifizielle Cerebrospinal-Flüssigkeit) aufgenommen.
Die Mikrogefäße, die nicht weiter inkubiert werden sollten und zur Kontrolle
dienten, wurden in PBS (pro Gehirn ca. 1ml) aufgenommen, in Eppendorf-Cups
gesammelt und in der Tischzentrifuge (Biofuge Pico, Heraeus Instruments) bei
8000 xg für 7 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und verwor-
fen und das Pellet mit den Blutgefäßen wurde in 1 ml Trizol (Ultra Pur, GIBCO
BRL) resuspendiert und bis zur weiteren Aufarbeitung bei –20 °C eingefroren.
2.2.2.1 Inkubation der isolierten Gehirngefäße und der zerebralen Endo-thelzellen mit Entzündungsmediatoren Bei dieser Versuchsdurchführung wurden die isolierten Gehirngefäße (siehe
2.2.2) in ACSF (pro Gehirn 1,0 ml) aufgenommen und in 6-well Kulturplatten
(Falcon, NJ USA) für 4h bzw. 24h mit Entzündungsmediatoren (siehe Tabelle 2)
im Zellkulturschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach der Inkubation er-
folgte die Zentrifugation der isolierten Gehirngefäße bei 8000 xg für 7 min und
die Aufnahme des Gefäßsediments in 1 ml Trizol zur weiteren Aufarbeitung für
2. Material und Methoden 25
die Real-time PCR bzw. in 1 x Laemmli-Puffer zur weiteren Aufarbeitung für die
Western Blots.
Die primären zerebralen Endothelzellen wurden für drei bzw. vier Tage kultiviert
und dann für 24h bzw. 4h mit den Entzündungsmediatoren (siehe Tabelle 2)
inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen mit 37°C warmen PBS
gewaschen und in Trizol bzw. In 1x Laemmli-Puffer aufgenommen.
Tabelle 1: Entzündungsmediatoren
Substanz Anbieter Konzentrationen
LPS (Liposaccharide, Serotyp: 026 : B6; E.coli)
Sigma - Aldrich
100 ng/ml bzw. 1 µg/ml
IL-1β (human Interleukin-1 beta) PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ
500 U/ml bzw. 5000 U/ml
2.2.2.2 Behandlung von isolierten Mikrogefäßen mit UMTS-Strahlung.(ex vivo) Bei diesem Versuch konnte eine Anlage am Universitätsklinikum Münster (Prof.
Dr. med. F. Stögbauer) genutzt werden, in der isolierte Mikrogefäße mit elek-
tromagnetischer Strahlung im UMTS- (Universal Mobile Telecommunications
System) Bereich (siehe Kapitel 2.2.3) exponiert wurden.
Die Mikrogefäße wurden aus den Gehirnen von Wistar-Ratten isoliert (siehe
Kapitel 2.2.2), in ACSF aufgenommen und über Nacht bei 4°C gelagert. Am
nächsten Tag wurden die Mikrogefäße auf Eis nach Münster transportiert.
Die Expositionsanlage befand sich in einem Zellkulturschrank (Inkubator) der
auf 37°C erwärmt und mit 5% CO2 begast wurde. Die Anlage bestand aus zwei
runden Hohlleitern (Abb. 4), in der jeweils 28 Einzelproben exponiert werden
konnten. Die Hohlleiter waren an einen Signalgenerator angeschlossen und die
jeweiligen Proben wurden innerhalb ihrer Behältnisse mit einem SAR-Wert von
1,8 W/kg (UMTS 1,966 GHz) exponiert. Der Versuch wird als Blindversuch
durchgeführt, d.h. ein computergestütztes Zufallsprogramm wählte aus, welcher
der beiden Hohleiter mit dem elektrischen Feld exponiert wurde.
2. Material und Methoden 26
Abb. 4: Die Expositionsanlage mit zwei Hohlleitern im CO2-Inkubator
Ursprünglich war die Anlage für die Bestrahlung von Endothelzellkulturen auf
Filtereinsätzen konzipiert worden. In die vorhandenen Filtereinsätze (Abb. 5 (a)
(4)) konnten die isolierten Mikrogefäße, welche sich in ACSF befanden, einge-
bracht werden. Da nur am Boden dieser Filtereinsätze ein homogenes elektro-
magnetisches Feld gewährleistet war, wurden die Gefäße mit einem feinen Sieb
abgedeckt um einen Auftrieb zu verhindern. Isolierte Mikrogefäße von 3 Rat-
tengehirnen wurden in 3 ml ACSF gesammelt, davon wurden je 1,5 ml auf die
Filtereinsätze in Hohleiter 1 und 2 verteilt. So war gewährleistet, dass das glei-
che Ausgangsmaterial exponiert bzw. nicht-exponiert wurde. Die Behälter (Abb.
5 (a 5)) in denen sich die Filtereinsätze mit den isolierten Gehirngefäßen befan-
den wurden mit ACSF auf 3,5 ml aufgefüllt. Zur Exposition wurden die Einzel-
komponenten (Abb.5 a) zusammengefügt (Abb. 5 b) und in die beiden Hohllei-
ter im CO2-Inkubator eingesetzt.
2. Material und Methoden 27
Abb. 5: Einzelkomponenten (a) der Behältnisse die zusammengebaut (b) in einen der
Hohlleiter der Expositionsanlage für die ex-vivo Versuche eingesetzt wurden.
Die freien Plätze in der Expositionsanlage wurden mit H2O befüllt (Dummies),
da nur bei vollständig bestückten Hohleitern ein homogenes Feld innerhalb ei-
nes jeden Expostionsgefäßes gewährleistet war. Die isolierten Gehirngefäße
wurden für 24h exponiert bzw. „sham“-exponiert.
Nach der Expositionszeit wurden die Mikrogefäße vorsichtig aus den Behältnis-
sen abgesaugt, in Eppendorf-Gefäßen gesammelt und bei 8000 xg für 8 min.
abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment mit den Ge-
fäßen in 1 ml Trizol aufgenommen und auf Eis nach Bochum transportiert. Bis
zur Isolation der RNA aus den Gehirngefäßen wurden diese bei -20°C gelagert.
(a)
(b)
(1) (2) (3) (4) (5)
2. Material und Methoden 28
2.2.3 In–vivo-Versuche: Lokale Exposition des Rattengehirns mit elektromagnetischen Feldern (UMTS) in vivo
2.2.3.1 Die Expositionsanlage In diesem Versuchsvorhaben wurde die Wirkung von elektromagnetischen Fel-
dern wie sie im Mobilfunk genutzt werden, auf die Ausbildung und Zusammen-
setzung der interzellulären Kontakte (tight junctions) an der Blut-Hirn-Schranke
untersucht.
Hierzu wurde das im Mikrowellenbereich zwischen 1,90 und 2,17 GHz arbei-
tende neue System der Mobilfunktechnik (UMTS (Universal Mobile Telecom-
munications System), das auch als Mobilfunksystem der 3.Generation bezeich-
net wird und seit 2004 auf dem deutschen Markt ist, verwendet. Sein Einfluss
auf die m-RNA Expression von verschiedenen Komponenten der tight junction
Strukturen sowie einige andere Parameter der BHS wurden überprüft.
In diesem Versuch sollte die Strahlenbelastung der BHS bei Handynutzung si-
muliert werden. Deshalb musste darauf geachtet werden, dass nur der Kopf
bzw. das Gehirn der Ratten kontinuierlich über einen bestimmten Zeitraum mit
der gleichen Strahlendosis in vivo exponiert wird. Für dieses Versuchsvorhaben
war eine besondere Expositionsanlage erforderlich, die in Zusammenarbeit mit
dem Lehrstuhl für Theoretische Elektrotechnik der Bergischen Universität Wup-
pertal (Prof. Hansen) nach neuesten Erkenntnissen als Prototyp entwickelt und
gebaut wurde.
Die Wuppertaler Partner konstruierten eine sphärische TEM-Wellenleitung, die
aus einem Doppelkegel aus Metall bestand (Abb. 6 a).
2. Material und Methoden 29
Abb. 6: Vom Institut für Elektrotechnik und Informationstechnik in Wuppertal entwickel-
ter doppelwandiger Hohlleiter (a) mit innerer Holmstruktur (b) für die Exposition der
Versuchstiere mit UMTS-Feldern.
Der Doppelkegel weist eine sechseckige Form auf und hat eine innere Holm-
struktur. Jedes der sechs Segmente enthält ein Paar Metallholme (siehe Abb. 6
(a)). Zwischen diesen Holmenpaaren (Abstand 6 mm) wird das elektromagneti-
sche Feld konzentriert bis zum unteren Ende des Doppelkegels geführt (siehe
Abb. 6 (b). Die Ratten konnten in der Expositionsanlage so unter den Enden der
Metallholme fixiert werden, dass gezielt ihr Kopf bzw. das Gehirn exponiert wur-
de.
(a)
(b)
Metallholme
2. Material und Methoden 30
Abb. 7: Aufbau der gesamten Expositionsanlage
Abb. 7 zeigt die komplette Expositionsanlage sowie die Hochfrequenz-
Einspeisung an der Spitze des Doppelkegels. Eine gleichmäßige Verteilung des
elektromagnetischen Feldes auf die sechs Segmente war durch die Symmetrie
der Anlage gewährleistet. Zwischen den Bereichen für die Versuchstiere befan-
den sich Metallwände, um gegenseitige Beeinflussungen durch Überkopplung
von Störfeldern zu vermeiden.
In dieser Anlage konnten sechs Ratten gleichzeitig mit derselben Feldstärke in
einem Versuchsdurchlauf unter identischen Bedingungen exponiert werden.
Die Ratten wurden dazu in Plastikröhren fixiert (siehe Abb. 7), wobei der
Schwanz, für die Ratte ein wichtiger Körperbestandteil zur Temperaturregulati-
on, aus der Röhre herausragte. Im vorderen Teil der Fixierröhren befanden sich
Lüftungsschlitze, die einen Wärmestau verhinderten.
Die Schnauzen der Ratten ragten vorne aus den Fixierröhren heraus. In diesem
Bereich wurde durch eine Lüftungsanlage ein leichter Luftstrom erzeugt, sodass
die Ratten animiert wurden, nach vorn zu schnüffeln und so die Beibehaltung
2. Material und Methoden 31
der Position des Kopfes unter dem Expositionsbereich der Anlage gewährleistet
war.
Zum Zeitpunkt der Exposition befanden sich die Ratten nach dem vorgegebe-
nen Tag-Nachtrhythmus in ihrer Ruhephase, d.h. der Hellphase. Um diesen
Rhythmus der Tiere nicht zu unterbrechen war in jedem Segment der Anlage
eine LED-Lampe installiert.
Für die Versuche wurden männliche Ratten (Stamm: Wistar) im Alter von 12 bis
15 Wochen verwendet, die in der zentralen Versuchstierhaltung der Medizini-
schen Fakultät gezüchtet und mit Futter und Wasser ad libium gehalten wurden.
Schon nach dem Absetzen vom Muttertier wurden die für die Versuche vorge-
sehenen Tiere an die Röhren der Versuchsanlage gewöhnt, indem ihnen die
Plastikröhren als Versteck in den Käfig gelegt wurden.
2.2.3.2 Durchführung der Vorversuche In den Vorversuchen sollten 6 Ratten mit den geplanten Hochfrequenzfeldern
im UMTS-Bereich exponiert werden, um die „spezifische Absorptionsrate“
(SAR) zu bestimmen, gemessen in Watt pro Kilogramm Gewebemasse (W/kg).
Dieser Wert gibt den Anteil der Strahlungsleistung an, der vom Körpergewebe
während der Exposition mit elektromagnetischen Wellen aufgenommen wird
und zur Erwärmung des Gewebes führt. In den Vorversuchen musste der SAR-
Wert für die neue Anlage ermittelt werden bei dem die Temperatur im Schädel
nicht mehr als 0,1 °C anstieg, so war sichergestellt, dass während der Versuche
kein thermischer Effekt auftrat.
Um erste Näherungswerte über die Einstellung des Signalgenerators zu erhal-
ten, der die eingespeiste Leistung und damit die Feldstärke bestimmt, wurden
Versuche an Rattenkadavern durchgeführt. Hierzu wurden Ratten durch eine
Überdosis CO2 getötet und ca. zwei Stunden auskühlen gelassen, damit ihre
Körpertemperatur der Raumtemperatur entsprach. Danach wurde mit einem
Skalpell ein Hautschnitt (ca. 0,7cm) in der Mitte des Schädels gesetzt und der
Schädelknochen in einem Bereich von ca. 0,5 cm2 freipräpariert. Im Weiteren
wurde mit einem Präzisionselektrobohrer ein etwa 2 mm großes Loch in den
Knochen gebohrt.
2. Material und Methoden 32
Für die Vorversuche wurde auch eine Plastikröhre im vorderen Drittel der Röhre
mit einem 5 cm langen und 3 mm breiten Spalt versehen.
Durch diesen Spalt musste die Temperatursonde (FISO Technologies, Quebec,
Kanada, siehe Abb. 8) in das Rattengehirn eingeführt werden.
Abb. 8: Schematischer Bau der Temperatursonde zur Messung der Kerntemperatur
des Gehirns
Innerhalb der ersten 10 mm der Sonde befindet sich die thermosensible Zone
(sensitive zone). Während der Messung musste gewährleistet sein, dass sich
dieser Bereich vollständig im Gehirn befand. Nach der Temperaturmessung
wurde daher überprüft, in welchem Teil des Gehirns und vor allem wie tief sich
die Sonde im Gehirn befunden hat (siehe hierzu Abb. 9 (a) und (b)).
Abb. 9: Bereich der Temperatursonde der sich während der Messung im Gehirn
befand (a), Verlauf der Temperatursonde im Großhirn der Ratte (b).
(a) (b)
2. Material und Methoden 33
Abb. 9 (a) zeigt die Länge des Teils der Sonde, der sich im Gehirn der Ratte
befand. Wie auf dem Bild ersichtlich befand sich die Temperatursonde ca. 1,6
cm tief im Schädel, daraus lässt sich schließen, das die thermosensible Zone
vollständig von Gehirngewebe umschlossen war. Bild 7(b) zeigt die ungefähre
Lage der Sonde im Gehirn rekonstruiert nach der Einstichstelle, welche durch
die Temperatursonde im Gehirn entstanden ist.
Nach den Temperaturmessungen am Kadaver, bei denen die Temperaturmes-
sungen für zwei verschiedene in die Wellenleitung eingespeiste Leistungen von
1,4 W und 0,7 W aufgezeichnet wurden, mussten die Vorversuche der Tempe-
raturmessung an sechs narkotisierten Ratten durchgeführt werden. Da die Tier-
kadaver keine Blutzirkulation mehr aufweisen und somit der Wärmeaustausch
im Gehirngewebe verlangsamt stattfindet, war zu erwarten, dass in den Kada-
vern eine größere Temperaturerhöhung bei gleicher Feldstärke zu verzeichnen
war, als in narkotisierten Tieren mit intakter Mikrozirkulation. Zur Narkose der
Ratten wurde ein Gemisch aus Ketamin 10% (100mg/kg) und Xylazin 2% (5
mg/kg) intraperitoneal injiziert. Anhand des Lidschlußreflexes wurde die Narko-
setiefe der Tiere überprüft und erst bei Ausfall des Lidschlußreflexes wurde der
operative Eingriff zur Temperaturmessung vorgenommen. In einzelnen Fällen
musste das Narkosemittel nachdosiert werden. Das Einbringen der Tempera-
tursonde und die Temperaturmessung erfolgten wie oben für die Tierkadaver
beschrieben.
2.2.3.3 Durchführung des Hauptversuches Nachdem in den Vorversuchen die Temperaturverläufe im Gehirn (siehe 3.3.1)
bei SAR-Werten von ca. 2 W/kg und 8 W/kg überprüft wurden, konnten die Ex-
positionsfeldstärken der Hauptversuche errechnet werden, siehe hierzu das
Expositionsschema Tabelle 1.
2. Material und Methoden 34
Tabelle 2 : Schema zur Exposition der Ratten im UMTS-Feld
Anzahl der Tiere Stärke der Exposition Länge der Exposition
18 Ratten 0 W/kg 2 Stunden / Kontrolle
18 Ratten 2 W/kg 2 Stunden
18 Ratten 10 W/kg 2 Stunden
18 Ratten 0 W/kg 0 Stunden / Käfigkontrolle
Insgesamt wurden 9 Messungen mit jeweils 6 Tieren pro Messung durchge-
führt. Die Messungen erfolgten mit einem computergestützten Zufalls-Protokoll
zur Wahrung der Objektivität als Blindversuche.
Vor den Messungen wurden die Ratten kurz zur Überführung in die Plastikröhre
mit CO2 narkotisiert und die Röhren wurden in der Expositionsanlage befestigt
(Abb. 10).
Abb. 10: Aufsicht auf die mit Ratten bestückte Expostionsanlage.
Die Ratten wachten nach einigen Sekunden in den Röhren wieder auf und wa-
ren während der zweistündigen Exposition voll bei Bewusstsein. Nach der Ex-
position wurden die Tiere aus den Röhren genommen, sofort mit CO2 narkoti-
siert und dekapitiert. Die Schädel wurden eröffnet und die Gehirne herausprä-
2. Material und Methoden 35
pariert. Nach Abpräparieren der Meningen und Entfernen der choroidalen Ple-
xen wurden die Gehirne in Eppendorf-Cups bzw. 10 ml Falcon-Tubes gesam-
melt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Bearbeitung für die
Real-time PCR bzw. die Immunfluoreszenz bei -80°C gelagert.
2.2.4 Molekularbiologische Arbeitsmethoden
2.2.4.1 RNA- Isolation mit Trizol Zur Isolation der RNA aus den verschiedenen Gewebeproben wurden die Zel-
len mit Trizol (Ultra Pur, GIBCO BRL) aufgeschlossen. Das Gewebe wurde in 1
ml Trizol homogenisiert bzw. aufgeschlossen. Die Mikrogefäße waren so ro-
bust, dass sie nicht in einem 1 ml Glashomogenisator zerkleinert werden konn-
ten, daher erfolgte die Homogenisierung der Gefäße mit Hilfe eines Ultraschall-
gerätes (Branson Sonifier 250, Mikrotip). Das Gewebe wurde dazu mit 15 Ultra-
schallstößen beschallt (duty cycle: 35% und output control: 3).
Die leichter aufschließbaren Zellkulturen (siehe Kapitel 2.2.1) wurden in Trizol
durch 8x-iges Suspendieren mit einer 1 ml Pipette und Abspülen des Kultur-
schalenbodens homogenisiert. Das homogenisierte Gewebe wurde in 1 ml Tri-
zol für 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser Schritt diente der komplet-
ten Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe.
Danach wurden dem Homogenat 200 µl Chloroform zugefügt und die Proben
wurden für 15 sec. geschüttelt. Zur Phasenseparation wurden die Ansätze 2-3
min. bei Raumtemperatur stehen gelassen und danach in einer Laborzentrifuge
(Sigma 1K-15, Rotor-Nr.12024-H) bei 12.000 x g für 15 min. bei 4 °C zentrifu-
giert.
Die obere (wässrige) Phase wurde vorsichtig abgenommen und in ein neues
Eppendorf-Cup überführt. In der wässrigen Phase befand sich die RNA, wäh-
rend DNA und Proteine in der Interphase bzw. in der Phenol-Phase angerei-
chert waren.
Zum Fällen der RNA wurden 500 µl Isopropanol zu der Probe gegeben. Zum
besseren Erkennen und Absetzen der gefällten RNA wurden noch 2 µl Glyko-
2. Material und Methoden 36
gen (10mg/ml) zu dem Gemisch hinzugefügt, welches für 10 min. bei Raum-
temperatur inkubiert wurde. Danach erfolgte ein weiterer Zentrifugationsschritt
bei 12.000 g für 10 min bei 4 °C. Der Überstand wurde abgenommen und ver-
worfen und das Pellet, welches die RNA enthielt, wurde mit 1 ml 75% EtOH
gewaschen. Nach erneutem Zentrifugieren (5 min., bei 4°C, 7.500 g) wurde der
Überstand abgenommen und verworfen und das Pellet ca. 5 min. bei Raum-
temperatur luftgetrocknet. Danach erfolgte die Resuspension des Pellets in 10
µl Ultra-Pur-H2O (Gibco, Invitrogen). Die so isolierte RNA konnte im -80°C Ge-
frierschrank gelagert werden. Bei dieser Temperatur sind die RNasen inaktiv.
2.2.4.2 Konzentrationsbestimmung des RNA-Gehalts Die Konzentration der isolierten RNA wurde mit Hilfe des Photospektrometers
(Ultraspec 3000, Pharmacia Biotech) bestimmt. Es wurde dazu 1 µl der in H2O
gelösten RNA zu 80 µl H2O dest. gegeben. Zu einem Ansatz wurde keine RNA
gegeben. Dieser diente als Nullabgleich. Jeder Ansatz wurde gut gemischt und
in eine Quarzküvette gegeben. Die Konzentration der RNA wurde mit Hilfe des
Photospektrometers mit Licht der Wellenlänge λ-260 nm bestimmt. Um die
RNA-Konzentration zu berechnen, mussten der Verdünnungsfaktor (x80) und
der geräteinterne Wert zur RNA-Bestimmung (x40) berücksichtigt werden.
2.2.4.3 DNase-Behandlung und c-DNA-Synthese Die isolierte RNA ist relativ instabil, bzw. sie ist immer dem Verdau von RNasen
ausgesetzt, die im Gegensatz zu DNasen extrem stabil sind und für ihre Arbeit
keine Co-Faktoren wie Mg2+ benötigen. Um dieses Problem zu umgehen, wur-
den die isolierten RNA-Sequenzen mit Hilfe einer Reversen-Transkriptase in
DNA-Sequenzen (c-DNA) umgeschrieben.
Als Primer wurden Oligo-dT-Primer verwendet, die sich an den Poly-A+-
Schwanz der RNA binden und am 5´-Ende der mRNA enden. Auf diese Art las-
sen sich komplette c-DNAs synthetisieren, wobei beachtet werden muss, dass
RNAs eine Länge von mehreren Kilobasen (kb) haben können, die Reverse
2. Material und Methoden 37
Transkriptase jedoch nur c-DNAs von ca. 1-2 kb synthetisiert. Somit kann es
vorkommen, dass wichtige, proteinkodierende Teile der mRNA nicht syntheti-
siert werden. Um dies zu umgehen, wurden zusätzlich Hexamerprimer (random
hexamers) eingesetzt, welche an beliebigen Stellen mit der mRNA hybridisieren
und kurze c-DNAs synthetisieren, so dass schließlich die komplette mRNA als
c-DNA abgelesen werden konnte (Sambrook, et al., 1989)
Bevor jedoch mit der reversen Transkription begonnen werden konnte, musste
zuerst eine DNase-Behandlung durchgeführt werden, um noch vorhandene ge-
nomische DNA aus der Probe zu entfernen. Dieser Schritt war wichtig, da im
Weiteren sicher gestellt sein musste, dass es sich bei der synthetisierten DNA
um eine c-DNA, also um transkribierte RNA handelte und nicht um genomische
DNA. Für den DNA-Verdau wurde 1 µg RNA-Probe eingesetzt. Dieser Probe
wurden 1 µl 10x konzentrierter DNase I Reaktionspuffer (Invitrogen) und 1 µl
DNase I (1 U/µl / Invitrogen) zugesetzt. Dieser Ansatz wurde mit Ultra-Pur H2O
auf 10 µl aufgefüllt. Der Verdau erfolgte für 20 min. bei RT. Zur Inaktivierung der
DNase I wurde dann 1 µl des Chelatbildners EDTA (25 mM) zu dem Ansatz ge-
geben und für 10 min. auf 65°C erhitzt.
Im Anschluss an die DNase- Behandlung erfolgte die 1st- Strand- Synthese mit
Superscript II-RNase-H--Reverse Transkriptase (Invitrogen). Dazu wurde die
DNase-behandelte Probe mit Ultra-Pur H2O auf 31,5 µl aufgefüllt, und nach Zu-
gabe von 2 µl random hexamers (Boehringer, Mannheim) und 2,5 µl dNTPs
(Deoxyribonukleosidtriphosphate, MBI Fermentas) für 5 min. auf 65°C erhitzt.
Danach wurden 10 µl 5x konzentrierter 1st-Reaction Buffer und 5 µl 0,1 M DTT
(beides von Invitrogen) dazu gegeben, für 10 min. bei RT inkubiert und an-
schließend für 2 min. auf 42°C erhitzt. Vor Zugabe von Superscript II (Invitro-
gen) im nächsten Schritt, wurde aus dem Ansatz ein Aliquot von 8 µl entnom-
men. Ein Teil dieser Probe wurde später in die PCR eingesetzt und diente zum
Nachweis von genomischer DNA in dem Ansatz. Ergab diese Probe ein positi-
ves Signal bei der PCR, während die H2O-Kontrolle negativ war, konnte davon
ausgegangen werden, dass es sich bei dem amplifizierten Abschnitt um geno-
mische DNA handelte. In dieser Probe hatte nämlich keine Transkription von
mRNA zu c-DNA stattgefunden. In solch einem Fall kann man auch bei dem
Teil des Ansatzes zu dem die Reverse-Transkriptase (Superscript II) gegeben
2. Material und Methoden 38
wurde nicht sicher sein, dass es sich um ein mRNA-Signal handelte und nicht
um eine genomische DNA-Amplifikation. Deshalb mussten Proben, die positiv
auf genomische DNA getestet wurden, verworfen werden.
Nach Zugabe von 0,9 µl Superscript II (Gibco BRL) wurde der Ansatz für 90
min. bei 42°C inkubiert und zum Beenden der Reaktion auf 72°C erhitzt. Alle
durchgeführten Reaktionsschritte erfolgten in dem PCR-Thermocycler (MJ Re-
search PTC-200, Peltier Thermo Cycler). Mit diesem Gerät wurden die Tempe-
raturwechsel ohne große Verzögerungen gewährleistet. Die so synthetisierte
c-DNA konnte nun bei 4°C oder zur längeren Aufbewahrung bei -20°C gelagert
werden.
2.2.4.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) Mit Hilfe der PCR- Methode gelingt der Nachweis kleinster Mengen spezifischer
DNA-Sequenzen. Die Methode der PCR beruht auf der enzymatischen Vermeh-
rung eines definierten DNA- Abschnitts zwischen zwei Oligonucleotid-Primern.
Der PCR-Ansatz betrug 20µl und wurde nach folgendem Schema pipettiert:
x µl c-DNA 2 µl 10x Taq-Puffer 1,6 µl MgCl2 (25 mM) 0,4 µl dNTPs (10 mM von jedem) 0,5 µl Primer Mix (sense und antisense Primer) 0,2 µl Taq auf 20 µl mit H2O auffüllen. Das Volumen der eingesetzten c-DNA war abhängig von der eingesetzten Men-
ge RNA in die c-DNA-Synthese. Normalerweise wurde 1 µg RNA eingesetzt,
dann betrug das eingesetzte c-DNA Volumen für die PCR 1 µl (= 20ng RNA).
Die Durchführung der PCR diente in diesem Versuchsteil der Kontrolle der c-
DNA auf genomische DNA und der Überprüfung der Effizienz der c-DNA Syn-
these. In dieser PCR wurden der GAPDH-Primer (siehe Tabelle 1) und ein wei-
terer Primer der Real-time PCR, ZO-1 oder Occludin (siehe Tabelle 2) verwen-
det.
2. Material und Methoden 39
Die DNA Amplifikation wurde im Thermo-Cycler PTC 200 (MJ Research) nach
folgendem Pogramm durchgeführt:
1. 2 min 95°C 2. 30 sec. 94°C 3. 30 sec. 52°C 4. 1 min. 72°C 5. 10 min. 72°C 6. ∞ 4°C
Die Schritte zwei bis vier werden je 35x wiederholt.
Die nachfolgende Tabelle zeigt die Basensequenzen des in die PCR eingesetz-
ten GAPDH-Primers.
Tabelle 3: Basensequenz des GAPDH-Primers
Name Forward-Primer Reverse-Primer
GAPDH TCC AGT ATG ACT CTA CCC ACG G CAT CAC CCC ATT TGA TGT TAG C
Der Primer wurde von Invitrogen Life Technologies hergestellt.
2.2.4.4.1 Gelelektrophorese der PCR-Produkte Zur Überprüfung der Ergebnisse der PCR wurden die Proben in einem Agaro-
segel aufgetrennt. Da es sich, resultierend aus den gewählten Primern, um rela-
tiv kleine DNA Fragmente handelte, wurden 2%ige Agarosegele benutzt. Hierzu
wurden 1,6 g Seakem LE Agarose (Biozym) in 80 ml TAE-Puffer gelöst. Das
Gemisch wurde für ca. 3 min. in der Mikrowelle aufgekocht, bis keine Schlieren
mehr in der flüssigen Agarose zu erkennen waren. Zu der flüssigen Agarose
wurden nach kurzem Abkühlen 5 µl Ethidiumbromid gegeben. Dieser Farbstoff
wird durch UV-Licht angeregt und interkaliert in doppelsträngige DNA, sodass
die DNA-Banden im Gel sichtbar gemacht werden konnten. Von jeder Probe
wurden 20 µl in eine Tasche des Gels aufgetragen. Als Standard wurde ein 100
bp- Marker der Firma MBI Fermentas benutzt. Der Lauf des Gels erfolgte in 1x
TAE-Puffer bei 100V für 45 min. Die Sichtbarmachung der Banden und die Do-
kumentation des Gels erfolgte unter UV-Licht mit dem „Image Master“ (Phar-
macia Biotech, Sana Francisco, CA).
2. Material und Methoden 40
2.2.4.5 Real-time quantitative PCR Mit Hilfe der Real-time PCR-Methode können verschiedene DNA-Proben quan-
titativ miteinander verglichen werden. Der für diese Methode verwendete Real-
time-Cycler ist mit einer UV-Lampe ausgestattet und besitzt als Detektionsmo-
dul eine CCD-Kamera, die die Produktzunahme anhand der Fluoreszenzzu-
nahme misst. Das verwendete System arbeitet mit dem Fluoreszenzfarbstoff
CYBR-Green I (Eurogentec EGT Group). Dieser Farbstoff hat die Eigenschaft,
dass er unspezifisch in jede Doppelstrang-DNA interkaliert. Erhöht sich nun im
Laufe der PCR-Reaktion die Menge des Produkts, also die Menge der dop-
pelsträngigen DNA, so resultiert daraus auch ein Fluoreszenzanstieg, der vom
Detektionssystem gemessen und aufgezeichnet werden kann. Anhand der Auf-
zeichnungen kann abgelesen werden, ab welchem Zyklus die Proben in den
linearen Amplifikationsbereich, in dem die Amplifikation exponentiell verläuft,
eintreten, und wann sie die Plateauphase erreichen. Je höher die DNA-
Ausgangsmenge ist, desto schneller wird der lineare Bereich und der Plateau-
bereich erreicht.
Der Nachteil bei der Verwendung des CYBR-Green I-Farbstoffs lag darin, dass
alle doppelsträngigen PCR-Produkte sowohl spezifische als auch unspezifische,
wie z.B. Primer-Dimere, detektiert wurden. Dieses Problem wurde nach abge-
schlossener Amplifikation mittels einer Schmelzkurvenanalyse gelöst. Dabei
erfolgte eine Differenzierung zwischen spezifischen und unspezifischen Produk-
ten. Die Produkte wurden über einen bestimmten Temperaturbereich kontinuier-
lich aufgeheizt bis sie ihrem Schmelzpunkt entsprechend nur noch als Einzel-
strang vorlagen. Kleinere Fragmente, wie z.B. Primer-Dimere weisen einen
niedrigeren Schmelzpunkt auf als die gewünschten PCR-Produkte, denen man
einen genauen Schmelzpunkt (zwischen 77°C und 85°C) zuordnen konnte. Die
Fluoreszenzabnahme beim Schmelzen der Produkte wurde aufgezeichnet. In
Verbindung mit den unterschiedlichen Temperaturen der Schmelzpunkte konn-
ten Primer-Dimere und spezifische Produkte unterschieden werden. Tabelle 4a
zeigt die Basensequenzen der für die Real-time PCR verwendeten Primer. Ta-
belle 4b zeigt die Länge und die Schmelztemperatur (Tm) des Amplikons der
jeweiligen Primer. Die Primer wurden mit Hilfe der Primer Express Software
ausgewählt und die Sequenzen beziehen sich alle auf das Rattengenom.
2. Material und Methoden 41
Die Primer für Claudin-1, -5, -11, Occludin und ZO-2 wurden von Invitrogen Life
Technologies hergestellt, die Primer ZO-1, VEGF, MMP-2, -9, pAPN, c-jun und
c-fos von biomers.net GmbH.
Der Real-time-PCR-Ansatz wurde unter der Holten Lamina-Air Bank angesetzt
und bestand aus folgenden Komponenten.
1x–Ansatz : 20 µl
1. 1 µl cDNA 2. 10 µl 2x Real-time Sybr Green I Mix (Eurogentec EGT Group) 3. 0,12 µl Primer–Mix ( sense und antisense Primer) 4. 8,88 µl H2O (Ultra-Pur)
Tabelle 4 a: Nukleinsäuresequenzen der verwendeten Sense und Antisense Primer
Name Forward-Primer Reverse-Primer
Claudin-1 AGA TGT GGA TGG CTG TCA TCG CCT GGC CAA ATT CAT ACC TGG
Claudin-5 TGG ACC ACA ATA TCG TGA CGG CAC TTT GCA TTG CAT GTG CC
Claudin-11 GGT TGG ATT GGC ATC ATC G AGT TCG TCC ATT TTG CGG C
Occludin TTC GGA TCC TGT CTA TGC TCG AAA GAT GCC CGT TCC ATA GGC
ZO-2 TCG AGA AGA TGG ACC ACA AGG TTG GCC GTC TCA TCT TGT ACG
ZO-1 TGCTGA ACA GCA AAA GCA TGT
TCA AC
GAG CAC AGC AAT GGA GGA AAC
AGC
VEGF TCA ACC CCT GAA TCC TGG AA AGC TGC ATG TTT GAT GGT GG
Bei dem Vergleich der Expressionen der unterschiedlichen Gene sind geringe
Änderungen der Werte zu erkennen. Keines der untersuchten Gene zeigt je-
doch eine signifikant erhöhte oder erniedrigte Expressionsrate nach Auswer-
tung mit der REST-Software. Daher muß davon ausgegangen werden, dass es
sich bei den in Abbildung 11 a und b dargestellten Werten um physiologische
Schwankungen der Genexpression handelt und eine vierstündige Behandlung
der Endothelzellkulturen mit 500U bzw. 5000U IL-1β pro ml Medium keine signi-
fikanten Expressionänderungen der untersuchten Gene zeigen.
Genexpressionen von Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in zerebralen Endo-
thelzellen die für 24h mit IL-1β inkubiert wurden
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Kontrolle 500 U IL1β 4h 5000 U IL-1β 4h
Rat
io
Claudin-1
Claudin-5
Claudin-11
*** p=0,001
*** p=0,001
Abb. 12 a: Darstellung der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte von
Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 3), die
für 24h mit zwei verschiedenen Konzentrationen IL-1β (500 und 5000 U/ml) behandelt wurden.
Die Expressionsrate von Claudin-5 ist signifikant um ca. 75% (500 U/ml IL-1β) bzw. um 70 %
(5000 U/ml IL-1β) erniedrigt. Claudin-1 und Claudin-11 weisen keine Veränderungen bzw. ge-
ringe nicht signifikante Erniedrigungen ihrer Genexpressionen auf.
3. Ergebnisse 53
Genexpressionen von Occludin, ZO-1 und ZO-2 in zerebralen Endothelzellen die
für 24h mit IL-1β inkubiert wurden
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Kontrolle 500 U IL1β 4h 5000 U IL-1β 4h
Rat
io
Occludin
ZO-1
ZO-2*** p=0,001
*** p=0,001*** p=0,001 *** p=0,001
n.s. p=0,094
Abb. 12 b: Darstellung der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte von
Occludin, ZO-1 und ZO-2 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 3), die für 24h mit
zwei verschiedenen Konzentrationen IL-1β (500 und 5000 U/ml) behandelt wurden. Die Ex-
pressionsrate von Occludin ist in den mit 500 U/ml IL-1β und in den mit 5000 U/ml IL-1β inku-
bierten Endothelzellkulturen um ca. 70% erniedrigt, während ZO-1 in den mit 500 U/ml IL-1β
behandelten Kulturen ein signifikante Verringerung um 37% und in den mit 5000 U/ml behan-
delten Kulturen eine signifikante Erniedrigung um 42% zeigt. Die gemessenen Verrringerungen
in der Genexpression von ZO-2 sind nicht signifikant.
3. Ergebnisse 54
Tabelle 9: Endwerte der Real-time PCR und p-Werte [ermittelt mit der REST-Software
(siehe 2.2.4.6)] der Endothelzellkulturen, welche für 24h mit IL-1β inkubiert wurden
Endos +
PBS
Endos + 500U Il-1β Endos + 5000U Il-1β
Endwert Endwert p-Wert Endwert p-Wert
Claudin-1 1,00 0,918 0,751 0,990 0,974
Claudin-5 1,00 0,247 0,001 0,308 0,001
Claudin-11 1,00 1,003 0,987 0,967 0,871
Occludin 1,00 0,309 0,001 0,295 0,001
ZO-1 1,00 0,633 0,001 0,585 0,001
ZO-2 1,00 0,779 0,094 0,916 0,590
Die mRNA-Expressionen von Claudin-5, Occludin und ZO-1 zeigen in diesen
Versuchen eine signifikante Abnahme nach 24h für Claudin-5 und Occludin um
60-70% im Vergleich zur Kontrollgruppe, für ZO-1 um 37% bei einer Dosis von
500 U IL-1β/ml bzw. 42% bei einer Dosis von 5000 U IL-1β/ml im Vergleich zur
Kontrollgruppe. Dies lässt auf eine Herabsetzung der Aktivität dieser Gene
schließen.
Zusammenfassend lässt sich für die Versuche der IL-1β Wirkung auf die tight
junction-Formation der zerebralen Endothelzellen feststellen, dass eine 4-
stündige Inkubationszeit keine signifikanten Expressionsänderungen der unter-
suchten Gene zeigt. Eine 24-stündige Inkubation der kultivierten Endothelzellen
bewirkt dosisabhängig bei 500 U IL-1 β/ml bzw. 5000 U IL-1β/ml eine signifikan-
te Erniedrigung der Genexpressionsraten von Claudin-5, Occludin und ZO-1.
Die Variationen innerhalb der mRNA-Expressionen der anderen untersuchten
Gene, sind nicht signifikant und stellen physiologisch auftretende Schwankun-
gen dar.
3. Ergebnisse 55
3.1.2 Wirkung von Lipopolysaccharid auf Proteine der zerebra-len Endothelzellen in vitro
Bei diesen Versuchen wurde ein weiterer Entzündungsmediator eingesetzt um
eine inflammatorische Situation zu simulieren. Dazu wurden, wie für die Inkuba-
tion mit IL-1β beschrieben, drei bzw. vier Tage kultivierte zerebrale Endothelzel-
len für 4h bzw. 24h mit dem exogenen Faktor Lipopolysaccharid inkubiert. LPS
ist eine Komponente der äußeren Zellwand von gram-negativen Bakterien. Das
hier benutzte LPS stammte von E.coli Bakterien. Es stimuliert die Bildung vieler
inflammatorisch wirkender endogener Zytokine, wie TNF-α, Il-1β, Il-6, Il-8 (Guha
und Mackman, 2000)
Auch in diesen Versuchen wurden, wie oben beschrieben (siehe 2.2.3.1), zwei
verschiedene Konzentrationen (100 ng/ml und 1 µg/ml) des Entzündungsmedia-
tors eingesetzt. Die Genexpressionen der mit 100 ng LPS/ml (2. Säulengruppe)
bzw. mit 1 µg LPS/ml (3. Säulengruppe) behandelten primären Endothelzellkul-
turen wurden mit den Kontrollkulturen (1. Säulengruppe) verglichen, welche nur
mit PBS inkubiert wurden.
Im Gegensatz zu den für 4h mit IL-1β behandelten Endothelzellen zeigte sich in
diesem Versuch schon nach 4h eine signifikante Erniedrigung der Genexpres-
sionen von Claudin-5 und Occludin. Dieses Ergebnis lässt sich damit erklären,
dass es sich bei LPS im Gegensatz zu IL-1β um einen sehr potenten Entzün-
dungsmediator handelt. Dabei kann LPS eine Reaktionskaskade auslösen, die
zur Ausschüttung weiterer pro-inflammatorisch wirkender Zytokine führt. Diese
Potenzierung des LPS führt in den durchgeführten Versuchen bereits nach 4h
Inkubationszeit zu einer signifikanten Expressionsänderung der tight junction-
Komponenten. Die Abnahme der mRNA-Expression von Claudin-5 liegt durch-
schnittlich bei 55%, die von Occludin bei 45% (mit p-Werten ≤ 0,001). Die er-
niedrigte Genexpressionsrate von Claudin-5 und Occludin lässt sich mit einer
erhöhten LPS-Dosis von 1 µg/ml noch weiter absenken.Die mRNA-Expression
von ZO-1 zeigt bei 100ng/ml LPS eine Erniedrigung um 30%, bei 1 µg LPS ist
aber nur eine Erniedrigung der Expression um 15% zu messen. Bei diesem
Gen und auch bei den übrigen untersuchten Genen sind die ermittelten Verän-
derungen jedoch nicht signifikant. Es handelt sich hierbei um natürliche
Schwankungen der Genexpressionen
3. Ergebnisse 56
Genexpressionen von Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in zerebralen Endo-
thelzellen die für 4h mit LPS inkubiert wurden
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Kontrolle 100 ng LPS 4h 1 µg LPS 4h
Rat
io
Claudin-1
Claudin-5
Claudin-11*** p=0,001
*** p=0,001
n.s. p=0,209
Abb. 13 a: Darstellung der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte von
Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 4), die für
4h mit zwei verschiedenen Konzentrationen LPS (100 ng und 1 µg/ml) behandelt wurden. Die
Genexpression von Claudin-5 ist signifikant um 51% (100 ng/ml LPS) bzw. um 57% (1 µg/ml
LPS) verringert. In den mit 1 µg/ml LPS inkubierten Endothelzellkulturen weisen die Expressi-
onsraten von Claudin-1 (ca. 28%) und Claudin-11 (ca. 47%) erhöhte Expressionsraten auf, die
jedoch nicht signifikant sind.
3. Ergebnisse 57
Genexpressionen von Occludin, ZO-1 und ZO-2 in zerebralen Endothelzellen die
für 4h mit LPS inkubiert wurden
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Kontrolle 100 ng LPS 4h 1 µg LPS 4h
Rat
io
Occludin
ZO-1
ZO-2
*** p=0,001
*** p=0,001
n.s. p = 0,604
Abb. 13 b: Darstellung der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte von
Occludin, ZO-1 und ZO-2 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 4), die für 4h mit zwei
verschiedenen Konzentrationen LPS (100 ng und 1 µg/ml) behandelt wurden. In den mit 100
ng/ml LPS inkubierten Endothelzellkulturen konnte für Occludin eine signifikante Abnahme der
Expressionsrate um 48% ermittelt werden, die gemessene Abnahme der Expression von ZO-1
um ca. 30% ist dagegen nicht signifikant. Die Genexpression von Occludin ist in den mit 1 µg/ml
LPS inkubierten Endothelzellen signifikant um ca. 47% erniedrigt.
Tabelle 10: Endwerte der mit der Real-time PCR ermittelten Daten und p-Werte [ermit-
telt mit der REST-Software (siehe 2.2.4.6)] von den Endothelzellkulturen, welche für 4h
mit LPS inkubiert wurden.
Endos + PBS Endos + 100ng LPS Endos + 1µg LPS
Endwert Endwert p-Wert Endwert p-Wert
Claudin-1 1,00 1,038 0,785 1,288 0,209
Claudin-5 1,00 0,486 0,001 0,427 0,001
Claudin-11 1,00 0,783 0,511 1,470 0,645
Occludin 1,00 0,580 0,001 0,534 0,001
ZO-1 1,00 0,693 0,604 0,847 0,752
ZO-2 1,00 1,103 0,783 0,870 0,677
3. Ergebnisse 58
Genexpressionen von Claudin-1, Claudin-5 und Claudin-11 in zerebralen Endo-
thelzellen die für 24h mit LPS inkubiert wurden
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Kontrolle 100 ng LPS 24h 1 µg LPS 24h
Rat
io
Claudin-1
Claudin-5
Claudin-11
*** p=0,003
* p=0,039 *** p=0,001
n.s. p=0,696
Abb. 14 a: Darstellung der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte von
Claudin-1, Claudin-5, und Claudin-11 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 4), die für
24h mit zwei verschiedenen Konzentrationen LPS (100 ng und 1 µg/ml) behandelt wurden. Die
Expressionsrate des Claudin-1 Gens ist in den mit 100 ng/ml LPS inkubierten Endothelzellkultu-
ren signifikant um 48% und in den mit 1 µg/ml LPS inkubierten Kulturen signifikant um 56%
erniedrigt. In den mit 100 ng/ml LPS behandelten Kulturen konnte für die Verringerung der
Claudin-5 Expression um 29% und die Steigerung der Claudin-11 Expression um 19% keine
Signifikanz ermittelt werden. Die verringerte Expressionsrate von Claudin-5 um 57% in den mit
1 µg/ml LPS inkubierten Endothelzellkulturen ist jedoch signifikant.
3. Ergebnisse 59
Genexpressionen von Occludin, ZO-1 und ZO-2 in zerebralen Endothelzellen die
für 24h mit LPS inkubiert wurden
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Kontrolle 100 ng LPS 24h 1 µg LPS 24h
Rat
io
Occludin
ZO-1
ZO-2
*** p=0,001*** p=0,001
n.s. p=0,097
Abb. 14 b: Darstellung der mit Hilfe der Real-time PCR ermittelten Genexpressionswerte von
Occludin, ZO-1 und ZO-2 in primären Endothelzellkulturen der Ratte (n = 4) die für 24h mit zwei
verschiedenen Konzentrationen LPS (100 ng und 1 µg/ml) behandelt wurden. Die Expressions-
raten für Occludin sind in den mit LPS inkubierten Endothelzellkulturen signifikant um 48% (100
ng/ml LPS) bzw. um 72% (1µg/ml LPS) erniedrigt. Die Genexpression von ZO-2 weist nicht
signifikante Verringerungen um 14% (100 ng/ml LPS) bzw. um 35% (1µg/ml) auf.
Tabelle 11: Endwerte der mit der Real-time PCR ermittelten Daten und p-Werte [ermit-
telt mit der REST-Software (siehe 2.2.4.6)] von den Endothelzellkulturen welche für
24h mit LPS inkubiert wurden
Endos + PBS Endos + 100ng LPS Endos + 1µg LPS
Endwert Endwert p-Wert Endwert p-Wert
Claudin-1 1,00 0,521 0,039 0,438 0,003
Claudin-5 1,00 0,711 0,099 0,425 0,001
Claudin-11 1,00 1,193 0,696 0,888 0,758
Occludin 1,00 0,524 0,001 0,281 0,001
ZO-1 1,00 1,035 0,857 1,018 0,927
ZO-2 1,00 0,859 0,409 0,646 0,097
3. Ergebnisse 60
Auch hier zeigte sich eine Verminderung der mRNA Expressionsrate von Clau-
din-5 und Occludin und zusätzlich von Claudin-1. Im Gegensatz zu den 24h mit
hoher Dosis IL-1β behandelten Endothelzellen kann bei den mit LPS behandel-
ten Endothelzellen ein stärkeres Absinken der Genexpression der oben ge-
nannten Gene beobachtet werden, wenn eine höhere Dosis LPS (1µg/ml) ein-
gesetzt wird.
Die statistische Auswertung zeigt, dass die mRNA-Expressionsrate von Clau-
din-5 nach Inkubation mit 100 ng/ml LPS nicht signifikant erniedrigt ist, obwohl
bereits in Diagramm 7 eine erniedrigte Expressionsrate zu erkennen ist. Nach
der Gabe von 1 µg/ml LPS ist die veränderte Expressionsrate signifikant.
Auch Claudin-1 zeigt in diesem Versuchsansatz eine signifikante Erniedrigung
der Genexpression. Dieses Ergebnis war bei einer Inkubation mit IL-1β weder
nach 4– noch nach 24-Stunden zu beobachten. Die mRNA-Expression von
Claudin-1 wird in den durchgeführten Versuchen nur bei 24-stündiger Inkubati-
on der Endothelzellen mit dem Entzündungsmediator LPS beeinflusst.
3.2 Darstellung der Proteinexpressionen
3.2.1 Western-Blots und Immunzytochemie zerebraler Endo-thelzellkulturen
Wie oben beschrieben (siehe 3.1.1) zeigte sich bei den zerebralen Endothel-
zellkulturen die für 4h und 24h mit LPS und für 24h mit IL-1β behandelt wurden
eine Erniedrigung der Expressionsrate der Gene für Occludin und Claudin-5.
Für diese tight junction-Komponenten wurde im Folgenden die Proteinexpressi-
on mit Hilfe der Western Blot-Methode und der Immunzytochemie untersucht.
3.2.1.1 Proteinexpressionen der mit IL-1β behandelten Endothelzellkultu-ren für 24 h Immunoblot Mit Hilfe der beschriebenen Western-Blot Methode (siehe 2.6.3) wurden die
Proteine der mit IL-1β inkubierten Endothelzellen auf eine Nitrozellulosememb-
ran transferiert und die Proteine Claudin-5 und Occludin mittels spezifischer An-
3. Ergebnisse 61
tikörper sichtbar gemacht. Als Kontrolle (K) dienten Endothelzellkulturen, die
unter denselben Versuchsbedingungen gehalten, aber nicht mit IL-1β behandelt
wurden. Für die Untersuchung von der Claudin-5 wurden 6 µg, für Occludin 5
µg Gesamtprotein auf das SDS-Gel geladen.
Proteinexpression in für 24h mit IL-1β inkubierten Endothelzellkulturen
K= Kontollkulturen – mit PBS behandelt, 500 U = Kulturen + 24h 500U/ml IL-1β
5000 U = Kulturen + 24h 5000 U/ml IL-1β
Abb. 15: Darstellung der Proteinexpression von Claudin-5 und Occludin in für 24h mit IL-1 β
inkubierten Endothelzellen (a), (b) zeigt die β-Aktinexpression der untersuchten Kulturen, die
zur Kontrolle der eingesetzten Proteinmenge untersucht wurde. Für Claudin-5 wurde eine Ge-
samtproteinmenge von 8 µg pro Tasche (12,5%iges SDS-Gel) und für Occludin eine Gesamt-
proteinmenge von 5 µg pro Tasche (10%iges SDS-Gel) aufgetragen.
In Abbildung 15 sind die Proteinexpressionen von Claudin-5 und Occludin in
Endothelzellkulturen dargestellt, welche mit 500 U/ml IL-1β und 5000 U/ml IL-1β
für 24h bzw. mit PBS als Kontrollgruppe behandelt wurden. Die Proteinbande
von Claudin-5 verläuft bei 22 kDa, die von Occludin bei 65 kDa. Die Auftren-
nung der Proteine erfolgte für Claudin-5 über ein 12,5%iges SDS-Gel, während
bei Occludin die Auftrennung über ein 10%iges SDS-Gel durchgeführt wurde.
Claudin-5 ist dabei bei einer Dosis von 5000 U/ml IL-1β nicht mehr nachweis-
bar, während bei einer Dosis von 500 U/ml IL-1β keine Veränderung in der Pro-
teinexpression im Vergleich zur Kontrollgruppe sichtbar ist.
K 500U 5000U
(a)
(b)
Claudin-5 kD 22
K 500U 5000U
Occludin kD 65 51
3. Ergebnisse 62
Occludin zeigt im Immunoblot eine konzentrationsabhängige Abnahme der Pro-
teinexpression.
Immunfluoreszenz Mit Hilfe der Immunfluoreszenzmethode an zerebralen Endothelzellkulturen der
Ratte wurde die Proteinexpressionsvon Claudin-5 und Occludin nach Behand-
lung der Kulturen für 24h mit IL-1β untersucht.
Expression von Occludin und Claudin-5 in zerebralen Endothelzellen die für 24h
mit IL-1β inkubiert wurden
Abb. 16: Fluoreszenzmikroskopische Darstellung der tight junction Proteine Claudin-5 und
Occludin in Endothelzellkulturen der Ratte, die für 24h mit IL-1β (5000 U/ml) inkubiert wurden.
Mit Hilfe der Immunfluoreszenz waren keine Unterschiede in der Expression
von Occludin und Claudin-5 im Verhältnis zur Kontrollkultur nachweisbar. Diese
Beobachtung wurde sowohl bei einer Behandlung mit 500 U/ml als auch mit
5000 U/ml IL-1β gemacht.
Occludin
Claudin-5
Kontrolle Il-1β 5000U
3. Ergebnisse 63
3.2.1.2 Proteinexpressionen der mit LPS behandelten Endothelzellkultu-ren für 4h und 24h Immunoblot
Aufgrund der Real-time PCR Ergebnisse der Endothelzellkulturen nach Be-
handlung mit LPS für 4h und 24h wurde mit diesen Proben auch eine Western-
Blot-Analyse durchgeführt.
In der nachfoldenden Abbildung 14 sind die Expressionen der tight junction Pro-
teine Occludin und Claudin-5 in den für 4h mit LPS (100 ng bzw 1µg/ml) inku-
bierten Endothelzellkulturen dargestellt, im Vergleich zu den Kontrollkulturen
(K), die nur mit PBS inkubiert wurden. Zur Untersuchung von Claudin-5 wurden
8 µg, zur Untersuchung von Occludin 5 µg Gesamtprotein auf das SDS Gel ge-
laden.
Claudin-5 zeigt in der Westernblot-Analyse nach Behandlung der Endothelzell-
kulturen mit 100 ng/ml LPS für 4h eine ausgeprägte Proteinbande bei 22 kDa
ähnlich wie die Kontrollgruppe, die nur mit PBS behandelt wurde.
Nach der Behandlung der Endothelzellkulutren mit 1 µg/ml LPS ist dagegen die
Proteinexpression von Claudin-5 nur noch als schwache Bande sichtbar (Abb.
17)
Die Proteinexpression von Occludin zeigt ähnlich wie Claudin-5 in den mit PBS
und den mit 100 ng/ml LPS behandelten Endothelzellkulturen eine starke Aus-
prägung der Proteinbanden. Die für 4h mit 1µg LPS inkubierten Endothelzellkul-
turen zeigen dagegen eine schwächere Proteinbande, d.h. eine verminderte
Proteinexpression ist die Folge der Behandlung der Kulturen mit einer hohen
Dosis an LPS. Die Abnahme der Poteinexpression von Occludin ist aber nicht
so stark ausgeprägt wie die von Claudin-5.
Die unterschiedliche Ausprägung der Proteinbanden für Claudin-5 und Occludin
beruhte auf der unterschiedlichen Sensitivität der Antikörper und auf verschie-
den langen Expositionszeiten während der Belichtung des Röntgenfilms (5-10
min für Claudin-5 und 30 sec.-1 min für Occludin).
3. Ergebnisse 64
Proteinexpression in für 4h mit LPS inkubierten zerebralen Endothelzellen
K= Kontollkulturen – mit PBS behandelt, 100 ng = Kulturen + 4h 100 ng/ml LPS
1 µg = Kulturen + 4h 1 µg/ml LPS
Abb. 17: (a) Darstellung der Proteinexpression von Claudin-5 und Occludin in für 4h mit LPS
inkubierten Endothelzellkulturen der Ratte im Vergleich zur Kontrollkultur (K), (b) zeigt die Akti-
nexpression der untersuchten Kulturen. Die auf das 12,5%ige SDS-Gel aufgetragene Gesamt-
proteinmenge betrug für Claudin-5 8 µg pro Tasche, für Occludin (10%iges SDS-Gel) 4 ug pro
Tasche.
kD 22
kD 65 51
Occludin Claudin-5
K 100 ng 1 µg K 100 ng 1 µg
(a) (b)
3. Ergebnisse 65
Die Proteinexpressionen von Claudin-5 und Occludin wurden auch in für 24h
mit LPS inkubierten Endothelzellkulturen untersucht.
Proteinexpression in für 24h mit LPS inkubierten zerebralen Endothelzellen
K= Kontollkulturen – mit PBS behandelt, 100 ng = Kulturen + 24h 100 ng/ml LPS
1 µg = Kulturen + 24h 1 µg/ml LPS
Abb. 18: (a) Darstellung der Proteinexpression von Claudin-5 und Occludin in für 24h mit LPS
(100 ng/ml und 1 µg/ml) inkubierten Endothelzellkulturen der Ratte im Vergleich zur Kontrollkul-
tur (K), (b) zeigt die Aktinexpression der untersuchten Kulturen. Für Claudin-5 als auch für Occ-
ludin wurde pro Tasche eine Gesamtproteinmenge von 5 µg/ml aufgetragen.
Auf das SDS-Gel wurde eine Gesamtproteinmenge von 5 µg pro Tasche, für
alle verwendeten Proben aufgetragen. Die Proteinbanden von Claudin-5 sind im
Immunoblot schwächer ausgeprägt als die von Occludin, aber auch hier ist die
Proteinexpression von Claudin-5 in den mit 100 ng/ml und 1µg/ml LPS behan-
delten Endothelzellkulturen weiter herunterreguliert, wie an den Banden ersicht-
lich (Abb. 18 (a)).
Die Proteinexpression von Occludin zeigt im Immunoblot eine vom Entzün-
sungen dieser Arbeit im Gehirnparenchym einen viel schnelleren und deutlich
höheren Temperaturanstieg bei den toten Ratten verglichen mit den narkotisier-
ten Tieren (siehe Tabelle 12). Die Unterschiede könnten auf die unterschiedli-
chen Messorte und vor allem auf die unterschiedlichen Expositionsparameter,
hier Teilkörper- versus Ganzkörperexposition, zurückzuführen sein.
4.3.2 Diskussion der Hauptversuche Es wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen Permeabilitätsstudien an der
BHS feldexponierter Ratten durchgeführt, allerdings liegen für die BHS in vivo
bis jetzt noch keine Studien in Bezug auf die Expression von tight junction-
Genen unter Befeldung vor.
In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Genexpressionen der tight junction-
Gene Claudin-1, Claudin-5, Claudin-11, Occludin, ZO-1 und ZO-2 untersucht
und des Weiteren die Gene von MMP-2, MMP-9, VEGF, pAPN, c-jun und c-fos.
Diese Gene wurden ausgewählt, da Änderungen in ihrem Expressionsmuster
Hinweise auf BHS-Störungen unter Einfluss von UMTS-Mikrowellen geben
könnten.
MMPs sind eine Gruppe von extrazellulär aktiven Metalloproteasen. Weite Be-
reiche ihrer Genstruktur weisen Sequenzhomologien auf und sie besitzen alle
eine Zink enthaltende katalytische Domäne (Murphy et al., 1991; Massova et
al., 1998; Nagase und Woessner, 1999; Gröters et al., 2005). Sie sind an vielen
physiologischen und pathologischen Prozessen im Organismus beteiligt. Unter
anderem besteht ihre Funktion im Ab- und Umbau der extrazellulären Matrix.
4. Diskussion 113
Der Wachstumsfaktor VEGF ist ein angiogener Faktor und stimuliert die Teilung
von Endothelzellen. Er ist im Gehirn an den physiologischen Prozessen der An-
gio-und Vaskulogenese (Risau, 1997; Risau und Flamme 1995) als auch an
pathologischen Phänomenen, wie der Hypoxie-induzierten Hyperpermeabilität
und Angiogenese (Bates et al. 2002, Feng et al. 1999) beteiligt.
Die Perizyten der BHS exprimieren eine spezielle Isoform der Aminopeptidase
N (CD 13) (Krause et al., 1988; Kunz et al., 1994), die unter pathophysiologi-
schen Bedingungen, wie z.B. am experimentellen Tiermodell für Multiple Skle-
rose (EAE-Modell) Expressionsänderungen zeigt (Kunz et al. 1995).
C-jun und c-fos gehören wie oben (4.4.4.) schon beschrieben zur Gruppe der
„early-response“-Gene.
Die in vivo und in vitro Ergebnisse zu den Permeabilitätsstudien an der BHS
unter Exposition mit elektromagnetischen Feldern werden in der Fachliteratur
kontrovers diskutiert. Bisher wurden jedoch keine reproduzierbaren experimen-
tellen Beweise für eine physiologische Veränderung der BHS aufgrund nicht-
thermischer Einwirkung elektromagnetischer Felder geliefert. (Stögbauer und
Franke, 2004).
Hardell et al. (2002) haben allerdings eine epidemiologische Studie veröffent-
licht, in der die Benutzer von Analog-, GSM- und Schnurlos-Telefonen bezüglich
des Auftretens von Hirntumoren untersucht wurden. In der Gruppe der Lang-
zeitbenutzer (mehr als 10 Jahre) analoger Mobilfunktelefone haben die Autoren
ein signifikant erhöhtes Risiko für das Auftreten von Hirntumoren entdeckt. Be-
sonders auffällig (odds ratio 3,5, die Chance ist um das 3,5-fache erhöht zu er-
kranken) war in dieser Gruppe das Auftreten des „Akustikus Neurinoms“, eines
Tumors im Bereich des Hörnervs.
Erklärbar könnte dieser Befund damit sein, dass der Hörnerv in dem Bereich
des Kopfes liegt, in dem beim Telefonieren die höchsten SAR-Werte erwartet
werden (Meyer, 2003).
In einer in vivo Studie von Lai und Singh (1995) wurde gezeigt, dass es in Ge-
hirnzellen von Ratten, die für zwei Stunden mit einem 2450 MHz Feld bei Ganz-
körper-SAR-Werten von 0,6 bzw. 1,2 W/kg exponiert wurden, zu vermehrten
DNA-Einzelstrangbrüchen kam. Ratten, die erst 4h nach der Exposition getötet
wurden, zeigten verglichen mit den sofort getöteten Tieren noch ausgeprägtere
4. Diskussion 114
DNA-Brüche. Malyapa et al. (1998) konnten die von Lai und Singh gefundenen
Ergebnisse jedoch nicht bestätigen. In der Studie von Malyapa et al. wurden
Ratten auch für 2h einem 2450 MHz-Feld bei einem SAR-Wert von 1,2 W/kg
ausgesetzt. Danach wurden Zellen aus dem Cortex und Hippocampus auf
DNA-Einzelstrangbrüche untersucht, es wurden keine Veränderungen in Bezug
zu nicht-exponierten Ratten gefunden.
Die meisten in vivo Studien beschreiben aber Permeabilitätsuntersuchungen an
der BHS oder die Entstehung von Tumoren im Gehirn der exponierten Tiere,
ohne Berücksichtigung der zellulären und molekularen Parameter.
In der vorliegenden Arbeit konnte unter Exposition mit UMTS-Feldern eine sig-
nifikante Änderung der Genexpression von Claudin-1 gezeigt werden. Aller-
dings zeigte sich die erhöhte Genexpression auch in den sham-exponierten Tie-
ren im Vergleich zur Käfigkontrolle. Claudin-1 ist eines der ersten Claudine,
welches in Endothelzellen von Säugetieren identifiziert wurde. In einem Trans-
fektionsmodell, bei dem tight junction freie Fibroblasten mit Claudin-1 bzw.
Claudin-5 transfiziert wurden, konnte im Gefrierbruch gezeigt werden, dass
Claudin-1 P-face assozierte tight junction und Claudin-5 E-face assozierte tight
junction ausbildeten (Morrita et al., 1999 a, b).
Da die Expression von Claudin-1 schon in den sham-exponierten Tieren eine
erhöhte Expressionsrate zeigt, kann daraus geschlossen werden, dass diese
Erhöhung eine Reaktion auf den Stress darstellt, dem die Ratten bei der Röh-
renfixierung ausgesetzt sind. Die signifikant um das Doppelte erhöhte Expressi-
onsrate von Claudin-1 in den mit 10 W/kg exponierten Ratten, im Vergleich zu
den sham-Kontrollen, und mit 2 W/kg exponierten Tieren kann wiederum auf
einen additiven Effekt des elektromagnetischen Feldes im Zusammenhang mit
Stress hindeuten. Bis heute ist nichts bekannt über Änderungen der Gen- oder
Proteinexpression von Claudin-1 bei BHS-Defekten.
Witt et al. (2003) konnten am Rattenmodell zeigen, dass Hypoxie/ Reoxygenie-
rungs-Stress zu einer erhöhten Permeabilität der BHS und zu einer verminder-
ten Expression von Occludin in den Endothelzellen der BHS führt. Auch bei ex-
perimentellen Modellen der Multiple Sklerose wurde eine Unterbrechung der
BHS gezeigt, die mit einem Verlust von Occludin und ZO-1 (Bolton et al., 1998;
4. Diskussion 115
McQuaid et al., 2002; Kirk et al., 2003) an den Mikrogefäßen des Gehirns asso-
ziiert ist.
Expressionsänderungen von Claudin-1 an tight junction wurden bis heute allein
an Darmepithelzellen bei kolorektalen Tumoren nachgewiesen. Miwa et al.
(2001) und Resnick et al. (2005) konnten zeigen, dass Claudin-1 in neoplasti-
schem Gewebe, im Gegensatz zur normalen Darmmukosa, hochreguliert ist.
Weiterhin bestand ein deutlicher Zusammenhang zwischen einer reduzierten
Claudin-1 Expression und einer geringeren Differenzierung des Tumorgewebes,
sowie der Wiederkehr der Krankheit und einer geringeren Überlebenschance
der Patienten (Resnick et al. 2005). In krankhaft verändertem Darmgewebe
könnte die vermehrte Expression von Claudin-1 also einen Schutzeffekt für das
gesunde Gewebe darstellen. Es ist jedoch schwierig, Ergebnisse zur Claudin-1
Expression in Darmepithelzellen des Menschen auf BHS-Endothelzellen der
Ratte zu übertragen.
Schlussfolgernd kann zusammengefasst werden, dass nach Exposition von
röhrenfixierten Ratten keine signifikanten Veränderung der Genexpressionen
von Claudin-5, Claudin-11, Occludin, ZO-1, ZO-2, MMP-2, MMP-9, VEGF,
pAPN, c-jun und c-fos gemessen wurden. Allein Claudin-1 zeigt eine signifikant
erhöhte Expression, die jedoch schon für die sham-exponierten Ratten, vergli-
chen mit den Käfigkontrollen, ermittelt wurde. Die signifikante Steigerung der
Genexpression von Claudin-1 in den mit 10 W/kg exponierten Tieren, verglichen
mit den sham-exponierten Tieren könnte auf einen additiven Effekt der Exposi-
tion mit dem elektromagnetischen Feld in Zusammenhang mit der Stresssituati-
on hindeuten. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein 2100 GHz UMTS-Feld bei Teil-
körperexposition des Gehirns mit einem SAR-Wert von 10 W/kg, unter Stress
eine Veränderung der Genexpression von Claudin-hervorruft. Allerdings gibt
dieses Ergebnis keinen Hinweis auf eine Öffnung der BHS. Hierfür muss in wei-
terführenden Versuchen die Proteinexpression untersucht werden um sicherzu-
stellen, dass die Änderung innerhalb der Genexpression auch eine Änderung
der Proteinexpression verursacht.
5. Zusammenfassung 116
5. Zusammenfassung Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine Gefäßbarriere dar, die einen ungehin-
derten Übertritt von Stoffen aus dem Blut ins Gehirnparenchym unterbindet. Ei-
ne funktionell essentielle Struktur der BHS sind die interendothelialen tight junc-
tion der zerebralen Mikrogefäße. Unter pathologischen Bedingungen kommt es
häufig zur Öffnung der BHS, die durch erhöhte Permeabilität der Endothelzellen
gekennzeichnet ist und nicht schrankengängige Stoffe ins Gehirnparenchym
eindringen läßt. Die molekularbiologischen Veränderungen, die zur Öffnung der
BHS führen, sind weitgehend unbekannt und waren Forschungsgegenstand
dieser Arbeit.
Das durchgeführte Forschungsprojekt ist in zwei Teile gegliedert, in denen zwei
verschiedene Parameter untersucht wurden, die zur möglichen Öffnung der
BHS führen:
1. wurden zerebrale Mikrogefäße einer entzündungsähnlichen Situation
ausgesetzt,
2. wurden zerebrale Mikrogefäße im elektromagnetischen Feld exponiert,
das dem Frequenzbereich des Mobilfunks entsprach.
Für beide Parameter wurde die Expression der charakteristischen tight junction
Komponenten der zerebralen Endothelzellen, Claudin-1, Claudin-5, Claudin-11,
Occludin, ZO-1 und ZO-2 auf molekularbiologischer Ebene untersucht. Als Un-
tersuchungsmethoden wurden die real-time PCR für Aussagen zur Genexpres-
sion und der Westernblot für Aussagen zur Proteinexpression eingesetzt.
Des Weiteren wurden für beide Versuchsparameter verschiedene Ausgangsbe-
dingungen gewählt. Es wurden intakte zerebrale Gehirngefäße (in vivo- bzw. ex
vivo-Versuche) sowie isolierte kultivierte zerebrale Endothelzellen (in vitro-
Versuche) verwendet. Der Einsatz dieser Bedingungen diente dazu, Aussagen
über die funktionelle Notwendigkeit aller für die BHS spezifischen Bestandteile
für die Formation der endothelialen tight junction zu machen.
Im ersten Teil der Arbeit wurden die chemische Substanzen Il-1β und LPS ge-
wählt, von denen eine entzündungsmediierende Wirkung bekannt ist. Sie wur-
den in einem Kurzzeit- (4h) und in einem Langzeitversuch (24h) eingesetzt und
5. Zusammenfassung 117
nach der Inkubation wurden die Genexpression und die Proteinexpression der
verschiedenen tight junction Proteine ermittelt.
Als Ergebnis waren in den isolierten Endothelzellkulturen (in vitro) die tight junc-
tion Komponenten Claudin 5 und Occludin sowohl auf Gen- wie auch auf Prote-
inebene signifikant erniedrigt. Daneben zeigte die Endothelzellkultur erniedrigte
ZO-1 Genexpression nach IL-1β-Behandlung (24h) und erniedrigte Claudin-1
Genexpression nach LPS-Behandlung (24h).
Dagegen wurden für die isolierten Gehirngefäße (ex vivo) nach Inkubation mit
den Entzündungsmediatoren keine signifikanten Expressionsveränderungen der
tight junction Komponenten gefunden. Dieser Befund dient als Indiz für die
Wichtigkeit des Zusammennspiels aller BHS-Bestandteile für die funktionelle
Integrität der BHS. Perizyten, Basalmembran und Astrozytenendfüßchen oblie-
gen auch innerhalb der isolierten Gehirngefäße offensichtlich modulierende
Kontrollfunktionen für den Erhalt der tight junction Struktur.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluß elektromagnetischer Felder auf die
tight junction der BHS in vivo (2,1 GHz UMTS-Feld, 2 W/kg und 10 W/kg für
2h) und ex vivo (1,966 GHz, 1,8 W/kg für 24 h) untersucht.
Die in vivo Versuche, bei denen die Versuchstiere lebend exponiert wurden,
zeigen ausschließlich für die tight junction Komponente Claudin-1 eine signifi-
kante Erhöhung der Genexpression bei Exposition von 10 W/kg. Die mit 2 W/kg
exponierten, aber auch die die sham-exponierten Tiere, die in Versuchsröhren
fixiert wurden, zeigen eine erhöhte Claudin-1 Expression im Vergleich zu den
Käfig-Kontrolltieren. Diese Expressionsänderungen sind auf die Stressbedin-
gungen während des Versuches zurückzuführen und müssen bei der Interpreta-
tion der Werte berücksichtigt werden. So ist die erhöhte Claudin-1 Expression
der mit 10 W/kg exponierten Tiere auf einen additiven Effekt der Stressbedin-
gungen sowie der Wirkung des elektromagnetischen Feldes zu werten.
Andere tight junction Komponenten, wie Claudin-5, Claudin-11, Occludin, ZO-1
und ZO-2, sowie weitere in diesem Versuchsteil untersuchte BHS-spezifische
Komponenten, wie VEGF, MMP-2, MMP-9, pAPN, c-jun und cfos sind nicht sig-
nifikant verändert.
Ex vivo Versuche, in denen isolierte Gehirngefäße im elektromagnetischen Feld
exponiert wurden, zeigten dagegen eine signifikante Erhöhung der Genexpres-
5. Zusammenfassung 118
sionen von Claudin-11 und Occludin. Als Positiv-Kontrollgruppe wurden Gehirn-
gefäße ex vivo für 8h einer Hyperthermie (42°C) ausgesetzt. Von diesen Bedin-
gungen ist bekannt, dass sie zur Öffnung der BHS führen. Hierbei wurden er-
niedrigte Genexpressionsraten für Claudin-5 und ZO-1 gefunden.
Ein Vergleich der unterschiedlichen Expressionsmuster der tight junction Kom-
ponenten nach chemischen und physikalischen Einflüssen auf die BHS lässt
vermuten, dass nicht unter allen Bedingungen die BHS defekt und permeabel
ist, sondern dass sekundäre molekulare Effekte in Gang gesetzt werden, die
modulierenden Einfluß auf die BHS nehmen können.
6. Abkürzungsverzeichnis 119
6. Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung
ACSF artifizielle Cerebrospinal-Flüssigkeit
AK Antikörper
ALP Alkaline-Phosphatase
APS Ammoniumperoxysulfat
ATP Adenosintriphosphat
BBB Blood-Brain Barrier
BCEC Brain Capillary Endothelial Cells
BSA Bovine Serum Albumin
°C Grad Celsius
(c)-DNA (Copy)-Deoxyribonucleic Acid
C-Terminus Carboxy-Terminus
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMEM Dulbecco´s Modified Eagel´s Medium
DNase Desoxyribonuklease
dNTP Desoxy Nucleosidtriphosphat
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiaminetraacetic Acid
EMF Elektromagnetisches Feld
EtOH Ethanol
FCS Fetal Calf Serum
FCS Fötales Kälberserum
g Erdbeschleunigung
GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein
GSM Global System for Mobile Communication
hsp heat shock protein
IL Interleukin
JAM Junctional Adhesion Molecule
Kb Kilobasenpaare
6. Abkürzungsverzeichnis 120
KDa Kilo Dalton
LPC Laser-Pressure Catapulting
LPS Lipopolysaccharid
M Molar
Min. Minuten
Ml Milliliter
mm Millimeter
MMP Matrix Metalloproteinase
(m)RNA (messenger) Ribonucleic Acid
pAPN perizytäre Aminopeptidase N
PBS Phosphate-Buffered Saline
PCR Polymerase-Chain-Reaction
RBE Rat-Brain-Endothelium
RT Raumtemperatur
SAR Spezifische Absorptionsrate
SDS Sodiumdodecylsulfat
Tab. Tabelle
TAE Tris-Acetat EDTA
TEMED Tetramethylethylendiamin
TIGHT JUNCTION Tight junctions
TNF Tumor-Nekrose-Faktor
Tris Trihydroxymethylaminomethan
U Unit
UMTS Universal Mobile Telecommunications System
v/v Verhältnis Volumen/Volumen
VEGF Vascular endothelial growth factor
w/v Verhältnis Volumen/Masse
ZNS zentrales Nervensystem
ZO-1/2 Zonula Occludens Protein 1 / 2
µl Mikroliter
7. Literaturverzeichnis 121
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8. Summary 136
8. Summary The Blood Brain Barrier (BBB) is a physical vessel barrier which limits the
crossing of substances from the blood to the brain parenchyma. Among the
functionally essential structures of the BBB are the interendothelial tight junc-
tions of the cerebral microvessels.
Under pathological conditions the permeability of the BBB can be increased,
thus, allowing the entrance of potentially harmful substances into the brain pa-
renchyma. The molecular changes that lead to this opening are widely unknown
and therefore, subjects of the present study.
The research project consists of two parts investigating two putative noxes that
potentially may lead to the event of BBB opening:
1. inflammatory stimulation of cerebral microvessels under cell culture con-
ditions
2. exposure of cerebral microvessels to electromagnetic fields correspond-
ing to the frequencies used for mobile telephony.
For both situations the expression of the tight junction forming proteins Clau
din-1, Claudin-5, Claudin-11, Occludin, ZO-1 and ZO-2 was examined on the
molecular level. To quantify gene expression Real-time PCR was implied and to
measure protein expression Western Blot Analysis was performed.
Two distinct experimental paradigms were created: For the in vivo and ex vivo
experiments intact cerebral microvessels were used and for the in vitro part iso-
lated cerebral endothelial cells were cultivated. This fractioning of the BBB
components was chosen to provide the possibility to assess the importance of
the specific BBB constituents for its functional integrity.
In the first part of the study, the inflammatory mediators IL-1ß and LPS were
implied to microvessel and endothelial cell culture systems. After short term (4
hours) and long term (24h) incubation with these agents gene and protein ex-
pression levels of the tight junction forming proteins were examined.
As a first result, endothelial cell cultures exhibited significantly reduced gene
and protein expression levels for the tight junction proteins Claudin-5 and Oc-
8. Summary 137
cludin. In the same cultures the gene expression of ZO-1was reduced after 24h
incubation with IL-1ß and that of Claudin-1 after 24h of stimulation with LPS.
However, in the cultivated intact microvessels (ex vivo setup) the incubation
with the inflammatory mediators did not induce any changes in the tight junction
gene expression. This result indicates the importance of the presence and the
concert of all BBB components as a prerequisite for its functional integrity.
Pericytes, the basal membrane and the astrocytic endfeet seem to interact for
and at the same time underlie modulatory control functions for the maintenance
of the tight junction structure even in isolated cerebral microvessels.
In the second part of the study, the influence of electromagnetic fields on BBB
tight junctions was investigated in vivo (2,1 GHz–field, 2 W/kg and 10 W/kg for
2h) and ex vivo (1,966 GHz, 1,8 W/kg for 24h).
During the in vivo experiments isolated microvessels of adult rats that were ex-
posed to 10 W/kg showed a significant upregulation of Claudin-1 mRNA. For
animals exposed to 2 W/kg as well as for sham treated rats an increase in the
Claudin-1 mRNA expression was observed as compared to their control litter-
mates. The latter changes in the expression pattern can be regarded as stress-
induced, but have to be taken into consideration for the interpretation of the
whole test results. Thus, the marked increase of the Claudin-1 gene transcrip-
tion in the 10W/kg group can be attributed to an additive effect of the electro-
magnetic field exposure on the stress-induced changes.
None of the other tight junction forming proteins Claudin-5, Claudin-11, Oc-
cludin, ZO-1 or ZO-2 exhibited significant changes on mRNA level. Other BBB
associated genes and proteins, such as VEGF, MMP-2, MMP-9, pAPN and the
immediate early genes c-jun and c-fos were investigated for changes in expres-
sion patterns, but the analysis did not reveal significant differences, either.
However, ex-vivo experiments that were conducted with isolated cerebral mi-
crovessels under defined culture conditions showed a significant upregulation of
Claudin-11 and Occludin mRNA after the exposure to electromagnetic fields.
Brain microvessels exposed to hyperthermia of 42°C for 8 hours served as posi-
tive controls as these conditions are known to induce BBB opening. Here, hypo-
thermia alone lead to a downregulation of Claudin-5 and ZO-1 mRNA.
8. Summary 138
This detailed comparison of the expression patterns of the different tight junc-
tion proteins after chemical and physical stimulation revealed that the applied
noxes do not lead inescapably to a BBB breakdown. In contrast, the concert of
all components involving secondary molecular mechanism seem to have a
modulating effect on the BBB.
9. Beiträge zu Konferenzen 139
9. Beiträge zu Konferenzen Präsentationen: 5. Blut-Hirn Schranken-Expertentreffen (Bad Herrenalb 26.-28. Mai 2003):
Regulation von tight junction Proteinen der Blut-Hirn-Schranke in vivo und