Mol Bio Homojenizasyon

8/12/2019 Mol Bio Homojenizasyon

1/64

MOLEKLER BYOLOJDEKULLANILAN YNTEMLER

II:PROTENLERN ZOLASYONU

VE ANALZ


2/64

MOLEKLER BYOLOJDE ANA KURAL veTEMEL ALIMA ALANLARI

GENOMK

YAPISALLEVSEL

(TRANSKRPTOMK)

DNA RNA PROTENMOLEKLLER

ARASIETKLEM

Nasl?

Neden?

Nasl?

Neden?

Nasl?

Neden?

PROTEOMK

YAPISALLEVSEL

(METABOLOMK)

Gen dizisi transkriptler primer protein rnlerifonksiyonel proteinler

(DNA) (mRNA)

Transkripsiyonelkontrol

Translasyonelkontrol

Translasyon sonrasKontrol (post-translasyonel

modifikasyonlar)

Nkleotid dizisininbelirlenmesi mRNA analizleri Protein yap analizleri Protein fonksiyon analizleri

Nkleik asitlerle ilgili teknikler Proteinlerle ilgili teknikler


3/64

ZETLE:

transkripsiyon translasyon modifikasyon-organizasyon

DNA RNA PROTEN

HCRESEL

LEVLER

ANA HEDEF :

Hcrenin molekler organizasyonunu,dolaysyla canlln molekler temellerini

anlamak !!!


4/64


5/64

NSANDA:

30.000 GEN 250.000500.000 PROTEN

AKTF BR PROTEN OLUURKEN400DEN FAZLA KMYASAL MODFKASYONUN

GEREKLEEBLECE NGRLMEKTEDR.


6/64

SORULAR:

Nerede ve/yahangi proteinler var ?

Ne kadar var?

Yaps nedir?

Ne gibi zellikleri var?

Nasl i grr ?

Hangi molekllerle etkileir?


7/64

Bir proteinin nasl izole edileceine,hangi yntemle ve ne derece

saflatrlacana karar verirkengz nnde bulundurulan kriterler:

AMA;

MATERYALN VE ALIILACAK

PROTENN TP VE MKTARI; LEMLERN SRES VE MALYET;

ELDEK OLANAKLAR


8/64

LABORATUVAR ORTAMI


9/64

LABORATUVARDAKULLANDIIMIZ KMYASALLAR

Dnyada en az 65 milyon eit kimyasal bileik retiliyorve deiik saflk derecelerinde piyasaya srlyor....

Kalitesine ve miktarna gre farkl fiatlara satlyor.


10/64

Kimyasallarn bazlar (zellikle ENZMLER)soutucularda (+4oC ve -20 veya -80oC derin

dondurucularda) saklanmaldr.


11/64

LABORATUVARARA-GERELER


12/64

balonjoje

l kab pipet


13/64

Mikropipetler


14/64

Hamilton rngalar
http://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/GC/images/syrlarge.jpg


15/64

TERAZ pH-metre


16/64

HAVAN


17/64

KARITIRICILIHOMOJENZATR(Waring Blender)


18/64

MLLHOMOJENZATR(ultra turrax)


19/64

PSTONLU

HOMOJENZATR


20/64

BASINHCRES


21/64

BALSTK

HOMOJENZATR


22/64

ULTRASONKATR


23/64

FLTRASYON DZENEKLER


24/64

MEMBRANLI FLTRASYON


25/64

SANTRFJLER

P t i d t d


26/64

Protein denatrasyonundan veinaktivasyondan korunmak iin

almann her aamasndapH ve SICAKLIK kontrol altnda

tutulmaldr!Scakln olumsuz etkisi, ilemlerin SOUKTA(genelde 4oCda) gerekletirilmesiyle nlenir.

pH ise bu molekllerin fizikokimyasal gereksinimleridorultusunda hazrlanm tampon zeltilerin kullanm

ile istenen deerde tutulur.


27/64

Ortam pHsnn 7 ve 7ye yakn

deerlerde olduu koulda engeni apta kullanlan tamponlartris ve fosfattamponlardr.


28/64

YONK KUVVET

Bir tamponda yer alan iyonlarn deriimi veyk de protein almalarnda nem tar.

ci= iyonun molar konsantrasyonu

zi= iyonun yk (iareti dikkate alnmaz)


29/64

TAMPON SEMNDE DKKATEDLMES GEREKENLER:

alma pHs, Tamponun anyonik veya katyonik karakterde olmas, yonik kuvvet ve scaklk etkisiyle pH deiimi, Kimyasal etkinlik, Biyolojik etkinlik, Dier bileenlerle etkileim, Biyolojik membranlarn geirgenlii, Toksisite, 280 nm ve altndaki dalga boylarnda absorbsiyon, Maliyet, znrlk

B YOLOJ K MATERYALLER


30/64

B YOLOJ K MATERYALLER:MKROORGANZMALAR


31/64

HAYVANSAL RNEKLER


32/64

HAYVAN DOKU VE HCREKLTRLER


33/64

BTKLER VE BTK DOKU

KLTRLER

HOMOJEN VE HETEROJEN KARIIMLARI


34/64

HOMOJEN VE HETEROJEN KARIIMLARIAYIRMA VE SAFLATIRMA YNTEMLER

TEK FAZLI AYIRMAYNTEMLER

SANTRFJLEME

FLTRASYON

DALZ

K (OK) FAZLI AYIRMAYNTEMLER

Yardmc bir faz oluturarakayrma (EKSTRAKSYON,

KROMATOGARF,ELEKTROFOREZ)

Kimyasal reak. sonucu fazoluturma (KTRME)

Istma veya soutma ile fazoluturma(KRSTALZASYON,DESTLASYON,

SBLMASYON,EVAPORASYON)


35/64

HOMOJENZASYON:

allacak molekl grubunu ierendoku veya hcrelerin eper ve zaryaplarn paralama ilemi

Fiziksel ilemlerMekanik ilemlerUltrasonikasyonOzmotik ok

Dondurma-zme

Kimyasal ilemlerzclerin kullanlmasEnzimlerin kullanlmas


36/64

Mekanik lemler:ALETL HOMOJENZASYON


37/64

Mekanik lemler:OZMOTK OK


38/64

Mekanik lemler:DONDURMA-ZME

Souk-Scak-Souk-Scak.....


39/64

Kimyasal lemler:zclerin Kullanlmas

Organik zclerDeterjanlar,

Bazik zeltilerle...


40/64

BYOLOJK MOLEKLLERNZOLASYONU (EKSTRAKSYON) :

MASERASYON


41/64

PERKOLASYON

SREKL EKSTRAKSYON


42/64

SREKL EKSTRAKSYON(SOXHLET EKS.)


43/64

SIVI-SIVI EKSTRAKSYONU


44/64

Kimyasal lemler:Enzimlerin Kullanlmas

Lizozim,Tripsin,

Proteinaz K,Zimoliyaz gibi enzimlerle...

eitli materyallere uygulanabilecek baz


45/64

eitli materyallere uygulanabilecek bazparalama yntemleri

Teknik Materyal tipi

NazikOzmotik ok EritrositlerEnzim uygulamas Bakteriler, mayalarDeterjan uygulamas Doku kltr hcreleriHavan veya pistonluhomojenizatr Karacier vb yumuak dokularDier aletlerle paralama Kas vb. Dokular

Orta iddetteMilli homojenizatrle par. Hayvansal ve bitkisel dokularKum, alumina vb. ile ezme Bitkisel dokular, bakteriler

SertFransz basn hcresi Bitkisel dokular, bakterilerUltrasonikasyon Hcre sspansiyonlarBalistik paralama Hcre sspansiyonlar


46/64

Paralama (homojenizasyon)

yntemleri uygulanarak dokuveya hcrelerin eper ve zar

yaplar yok edilir.

Ele geen ve allacak

molekl grubunu ierenkarma HOMOJENATdenir.


47/64


48/64

SZME (FLTRASYON)


49/64


50/64


51/64

Molekler biyolojide en okkullanlan filtre edici materyaller:

Mslin (tlbent veya gazl bez) Filtre kad (bkz. MBKY kitab Ek 15, s. 324)

Sinterli cam huni

Membran filtreler (bkz. MBKY kitab Ek 16, s.324)

M b filt l b l l


52/64

Membran filtreler veya membranlar zgl poraplarna sahip polimer filmlerden oluur.Porlardan geemeyecek byklkteki partikller ve

mikroorganizmalar iin fiziksel bir bariyer oluturur vebunlar zarn yzeyinde tutarlar.


53/64

ULTRAFLTRASYON

Molekllerin boyut, biimve/veya yklerine gre

ayrlmasn salar.

Centricon tipi


54/64

Centricon tipiultrafiltrasyon

tp

(vakumdanyararlanlr)

Kapan hcresi

(basntanyararlanlr)

NMWC


55/64

NMWC

Nominal MolecularWeight Cut-off

Membrana zg bir deerdir.Membrandan geemeyen bir

molekln arlna e deerdir.


56/64


57/64

Santrifjleme sonundast faz (svfaz)spernatant

Alt faz (kelti)pellet


58/64

Santrifj kuvveti

F = m x

2

x rm = ken partikln ktlesi

= asal hzr = partikln dnm eksenine uzakl


59/64

Relative Centrifugal ForceSantrifj hz ile ilgili bir ifade (gdeeri)

RCF = 1.119 x 10-5x rpm2x r

rpm = dnm says (devir/dakika)

r = partikln dnm eksenine uzakl (cm)


60/64


61/64


62/64


63/64


64/64

Homojenattaki zar (membran)

paralarn, paralanmamdoku ve hcreleri

uzaklatrmak amacylauygulanan N AYIRMAilemlerinden sonra ele geensvya HAM ZTad verilir.

Mol Bio Homojenizasyon

Documents