Modyfikacje chemiczne do badań metabolizmu i zastosowań terapeutycznych mRNA Jacek Jemielity LABORATORIUM CHEMII BIOORGANICZNEJ IGIB, Uniwersytet Warszawski Warszawa, 18 stycznia 2019 Centrum Nowych Technologii Zakład Biofizyki, Wydział Fizyki Uniwersytet Warszawski
60
Embed
Modyfikacje chemiczne do badań metabolizmu i zastosowań ...
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Modyfikacje chemiczne do badań metabolizmu i zastosowań terapeutycznych
mRNA
Jacek Jemie l i ty
LABORATORIUM CHEMII BIOORGANICZNEJ
IGIB, Uniwersytet Warszawski
Warszawa, 18 stycznia 2019
Centrum Nowych Technologii Zakład Biofizyki, Wydział Fizyki
Uniwersytet Warszawski
MNOGOŚĆ FUNKCJIMNOGOŚĆ ZASTOSOWAŃ
Temat 1 Reagenty do modyfikacji
RNA – terapia genowa
Nukleotydowe sondy
molekularne i znakowanie
Metody screeningowe
inhibitorów i analiza
metabolitów
Nowe
metody
syntezy
Analogi nukleotydów
modyfikowane w mostku
fosforanowym
Rydzik et al. Nucl. Acids Res. (2017)Wojtczak et al. RSC Adv. (2016) Zytek et al. OBC (2014)Warminski et al. Top. Curr. Chem. (2017)
Biokoniugacja nukleotydów
z makrocząsteczkami i
nanomateriałami
Mamot et al. Angewandte Chem. (2017)Warminski et al. Bioconjugate Chem. (2017)Jemielity et al. OBC (2012)Ziemniak et al. RSC Adv. (2013)Wanat et al. Chem. Comm.
Zochowska et al. Nanomedicine: NBM, (2015)Kijewska et al. Biomacromol. (2013)Szczepaniak et al. RNA (2012)
Baranowski, Nowicka et al. OBC (2016)Strzelecka et al. Sci. Reports (2017)Baranowski et al. JOC (2015)Kasprzyk et al. OBC (2016)
Walczak et al. Chemical Science (2017) Strenkowska et al. Nucl. Acids Res. (2016)Kowalska et al. Nucl. Acids Res. (2014)Nowakowska et al. OBC (2014)Patenty US i inne kraje
Warminski et al. Org. Lett. (2017)Wanat et al. Org. Lett. (2015) Strenkowska et al. Org. Lett. (2012)Warminski et al. EurJOC (2016)
Badania białek metabolizmu
nukleotydów i RNAProjektowanie i
optymalizacja inhibitorów
Ziemniak et al. BMC (2015)Ziemniak et al RNA (2016)Kozarski et al. BMC (2018)Wojtczak et al. JACS (2018)
Mugridge et al. Nature Struct. Mol. Biol. (2016)Mugridge et al. Nature Comm. (2018)Essig et al. Nature Comm. (2018)
Cechy charakterystyczne, niezwykłe dla kwasów nukleinowych, kluczowe dla specyficznego rozpoznania przez białka:
Ujemnie naładowany mostek 5’,5’-trifosforanowy : oddziaływania elektrostatyczne i wiąz. wodorowe
Tet. Lett. 2007Bioorg. Med. Chem. 2009RNA 2008US Patent 2012
J. Org. Chem. 2015Zgłoszenie patentowe 2014
Nucl. Acids Res. 2016
Nucl. Acids Res. 2017
Warminski. et al. Topics in Current Chemistry DOI: 10.1007/s41061-017-0106-y (2017)
Poprawa właściwości biologicznych:• Zwiększone powinowactwo do czynnika inicjującego translację, eIF4E (2-4x)• Odporność na enzym Dcp2 odpowiedzialny za odcinanie kapu z końca 5’
mRNA• Zwiększony czas półtrwania mRNA in vivo (3x)• Zwiększona efektywność translacji w komórkach (5x)= Wysoka wydajność biosyntezy białka in vivo
Kowalska J., et al. RNA 14, 1119-1131 (2008)Grudzień-Nogalska et al. RNA 13, 1745 - 1755 (2007)Jemielity et al. US Patent 2012, Kowalska et al. US Patent 2013 i patenty w innych krajach
RNAβ-S-ARCA (D1 and D2)
*JoannaKOWALSKA
Współpraca: M Nowotny, IIMCB, Warszawa
Warmiński, et al. w przygotowaniu
D1D2
m7GpppG
KAS [µM-1]
43.1 ± 1.419.3 ± 2.2
9.4 ± 0.4Centrum stereogeniczne
*
Lys162 Lys162
Arg 157 Arg 157
(R)-β-S-ARCA D1 (S)-β-S-ARCA D2
Z czego wynika stabilizacja kompleksu eIF4E – β-S-ARCA?
mRNA kodujące lucyferazę –
wstrzyknięcie do węzła chłonnego
9 myszy
b-S-ARCA (D1)
LUC
Kuhn A., et al. Gene Therapy 17, 961-971 (2010).
ARCA b-S-ARCA (D1)
ARCA b-S-ARCA (D1)ARCAb-S-ARCA (D1)
krew
krew
śledziona
śledziona
SIINFEKL-specyficzne komórki T CD8+
Immunizacja: dzień 0 i 3wyznaczanie liczby limfocytów T: dzień 8 5 myszy
SIINFEKL
Efekt w niedojrzałych komórkach dendrytycznych:
3-krotny wzrost specyficznej aktywacji limfocytów T u myszy – po dowęzłowym wstrzyknięciu mRNA kodującego antygen (β-S-ARCA D1 vs ARCA)
Kuhn A., et al. Gene Therapy 17, 961-971 (2010).
Zmiana 1 z 80 tysięcy atomów w mRNA…
…zbliża nas do terapii genowej opartej na mRNA
*
Jeśli mRNA jest zrobione z a kap reprezentuje i zawiera jeden atom siarki to:
2012-2017: Cztery badania kliniczne nad szczepionką przeciw czerniakowi złośliwemu i rakowi piersi, szczepionki przeciw innym nowotworom w trakcie przygotowań (BioNTech, Mainz, Germany)
XI 2015: Porozumienie o współpracy BioNTech –SANOFI (sublicencja β-S-ARCA). 60 M$ 300M$
IX 2016: Porozumienie o współpracy BioNTech –Genentech/Roche (sublicencja β-S-ARCA). 310M$
XII 2017: Genentech/Roche we współpracy z BioNTechrozpoczynają badania kliniczne nad spersonalizowanymi szczepionkami przeciwnowotworowymi
PCV – Personalized Cancer Vaccine, antygen ustalany na podstawie badań genetycznych komórek zdrowych i nowotworowych danego pacjenta.
572 pacjentów w 38 ośrodkach w Stanach Zjednoczonych, Kanadzie oraz Europie:USA – 18, Kanada – 2, Belgia – 3, Niemcy – 5, Holandia – 3, Hiszpania – 2, Wielka Brytania –3, Szwecja - 2
Melanoma (czerniak złośliwy)
Renal Cancer (rak nerki)
Non-Small Cell Lung Cancer (niedrobnokomórkowy rak płuc)
Bladder Cancer (rak pęcherza moczowego)
Colorectal Cancer (rak jelita grubego)
Triple Negative Breast Cancer (potrójnie ujemny rak piersi)
Head and Neck Cancer (nowotwory głowy i szyi)
Other Solid Cancers (inne nowotwory lite)
Choroby nowotworowe: immunoterapie oparte na komórkach dendrytycznych
Suplementacja białek i peptydów
Dostarczanie antygenów
Choroby genetyczne, zaburzenia metaboliczne
Medycyna regeneracyjna-dostarczanie czynników wzrostu (m.in. w chorobach sercowo naczyniowych)-generowanie i modyfikacje komórek macierzystychSzczepionki przeciw
chorobom zakaźnym
Dostarczanie nukleaz
Edycja genów metodą CRISPR/Cas9
„Messenger RNA Therapeutics™ can be developed and tested in just a few weeks, enabling an expedited process from concept to first-in-man studies on the order of less than one year. All messenger RNA Therapeutics™ are made using the same reagents in the same cell-free production process, enabling rapid, cost-effective GMP manufacturing. This is possible given the chemical similarities between all messenger RNAs, which vary only in their RNA sequence.”
Czy coś można ulepszyć?
Z w i ę k s z y ć ko n k u r e n c y j n o ś ć v s n a t u r a l n e m R N A b e z u t r a t y o d p o r n o ś c i n a e n z y m D c p 2 ( n o w e m o d y f i k a c j e o r a z p o z n a w a n i e s t r u k t u r ko m p l e k s ó w b i a ł ko - k a p ) .
J e s z c z e b a r d z i e j z w i ę k s z y ć t r w a ł o ś ć k a p u ( n o w e m o d y f i k a c j e o r a z p o z n a w a n i e s t r u k t u r ko m p l e k s ó w b i a ł ko -k a p ) .
Z w i ę k s z y ć t r w a ł o ś ć ko ń c a 3 ’ m R N A
W p ł y w a ć n a i m m u n o g e n n o ś ć m R N A
P o p r a w i e n i e i u p r o s z c z e n i e p r o d u k c j i m R N A ( c h e m i c z n yc a p p i n g m R N A )
Z a h a m o w a ć o d c i n a n i e ka p u ( m a ł o c z ą s t e c z ko w e i n h i b i t o r y )
L e p i e j z r o z u m i e ć c o s i ę d z i e j e z m R N A w ko m ó r c e i p o z a n i ą ( m R N A z n a ko w a n e , f o t o z s z y w a l n e )
Ef e k t y w n i e j d o s t a r c z a ć m R N A d o ko m ó r k i
Ditiofosforanowe analogi kapu – biją
rekordy, ale…
Powinowactwo do eIF4E
2003 2010
Analogi kapu z modyfikacją bis(tiofosforanową)
wydajność ekspresji mRNA w niedojrzałych ludzkich komórkach dendrytycznych (hiDCs).
Współpraca: U. Sahin (Mainz, Niemcy)
Strenkowska et al. Nucleic Acids Res. 44, 9578-9590 (2016)
MalwinaSTRENKOWSKA
KatarzynaWNĘK
JoannaKOWALSKA
Równie skuteczne lecz prostsze w produkcji (brak centrum stereogenicznego)
B. Wojtczak, P. Sikorski et al. JACS 140, 5987-5999 (2018)
Równie skuteczne lecz prostsze w produkcji (brak centrum stereogenicznego)
B. Wojtczak, P. Sikorski et al. JACS 140, 5987-5999 (2018)
Dwa stereoizomery Brak izomerów
Odporne na nukleazy
PS versus PSL w DNA
B. Wojtczak, P. Sikorski et al. JACS 140, 5987-5999 (2018)
7
• Ekspresja białek w komórkach z mRNA zawierającym analog 7 jest porównywalna z mRNA zawierającym β-S-ARCA
• ale bez stereoizomerów
J. Mugridge et al. Nature Struct. Mol. Biol. 23, 987–994 (2016)
Współpraca z John G. Gross (UCSF, San Francisco, USA)
J. Mugridge et al. Nature Struct. Mol. Biol. 23, 987–994 (2016)
mRNA with cap1, cap2, m6A and othermodifications
NAD-capped RNA
…more tools for exploring mRNA biology
Warmiński, Sikorski et al., unpublished
A. Mlynarska-Cieslak, A.Depaix et al. Org. Lett., 2018, 20, pp7650–7655
Znakowanie
cap
labelled mRNA
Znakowanie ko-transkrypcyjne i post-transkrypcyjne
Dwie startegie znakowania mRNA
cap
labelled cap
labelled mRNA
Strategies for 5’ mRNA cap labelling
Co-transcriptionallabelling
Dwie startegie znakowania mRNA
cap
labelled mRNA
mRNA
Strategies for 5’ mRNA cap labelling
Post-transcriptionallabelling
Dwie startegie znakowania mRNA
cap
labelled mRNA
mRNA
Strategies for 5’ mRNA cap labelling
Post-transcriptionallabelling
labelled cap
Co-transcriptionallabelling
Dwie startegie znakowania mRNA
NHS chemistry ”click” chemistry
+ NHS activated labelcap analogue with linker terminated with amino group
+ DIBAC labelcap analogue with linkerterminated with azide group
Carboxylic acids of labels can be easilyconverted into NHS esters using in situactivation.
Allows for bioorthogonal labelling.
Krok 1: Wybór strategii chemicznej
Jemielity et al. Organic & Biomolecular Chemistry 10, 8570–8574 (2012)
+ 2’ isomer
Mamot et al. Angewandte Chemie Int. Ed. 56, 15628–15632 (2017)
• Lokalizują się w cytoplazmie • Ulegają translacji
Transfected HeLa cells
Mamot et al. Angewandte Chemie Int. Ed. 56,15628–15632 (2017)
mRNAtransfection
N3
visualization
Cy5
in celllabelling
HoechstCy5 Merge
9d-R
NAlu
cAR
CA-R
NAlu
cm
ock
N3
Mamot et al. Angewandte Chemie Int. Ed. 56,15628–15632 (2017)
Perspektywy na przyszłość
• Monitorowanie decappingu w P-bodies
• Badanie lokalizacji i transportu mRNA w zależności od sekwencji i wprowadzonych modyfikacji strukturalnych (fluorescencja pojedynczych molekuł
• Badanie cyrkularyzacji mRNA (w połączeniu ze znakowaniem końca 3’)
• Znakowanie mRNA w żywych komórkach w czasie rzeczywistym przy użyciu sond fluorogenicznych
Koniugaty
• Synthesis of affinity resins for purification of cap-related proteins, includingdecapping enzyme DcpS
Szczepaniak S. A. , Zuberek J., Darzynkiewicz E., Kufel J., Jemielity J., RNA18, 1421-1432 (2012).
Żywice powinowactwa
UV-VIS
Cap analog for AuNP decoration
Gold nanoparticles decorated with nucleotides: towards theranostic applications
AuNP synthesis
Goal: Biosensor for cap-binding proteins(molecular markers)
Perzanowska, et al. unpublished
0
20
40
60
80
100
120
140
160
% C
on
tro
l
Tumor size (HCC rat model)
Dd
Dd-cap
anti-Dd anti-cap
Immunodetection
Zochowska et al. Nanomedicine: NMB 11, 67-76 (2015)
1/5x1x1x1x
40% tumor size reductionCollaboration: J. Chroboczek, La Tronche, France
Dostarczanie do komórek – koniugatydodekahedron - kap
Sztuczny kap
P. Wanat et al. Org. Lett. 17, 3062-3065 (2015)
1. Synteza nukleotydów modyfikowanych w łańcuchu fosforanowym grupą alkinową
m= 0, 1, 2
MgCl2, DMF0,5 h
2. Wykorzystanie modyfikowanych nukleotydów w reakcji CuAAC
Cu+
1h
mm
• 15 przykładów• Wydajności 72 – 100 %• Czas reakcji:0,5 – 2 h
n= 0, 1
JoannaKOWALSKA
BłażejWOJTCZAK
PrzemysławWANAT
SylwiaWALCZAK
Nowe reagnety do modyfikacji mostka trifosfornaowego
Czy triazol w łańcuchu oligofosoranowym będzie
zaburzał inicjację translacji? Czy możliwe będzie tworzenie
kapu w reakcji „click”?Optymalizowane parametry:
• Pozycja reszty triazolowej• Orientacja grupy triazolowej
• Długość łańcucha fosforanowego (2-4)
• Długość linkera (0-2)• Atom łącznikowy (O, N, S, C)
S. Walczak et al. Chemical Science 8, 260 - 267 (2017)
Lab. Chemii Bioorganicznej:Dr Joanna KOWALSKADr Błażej WOJTCZAKDr Dorota KUBACKADr Paweł SIKORSKIDr Tomasz RATAJCZAKDr Natalia KLECZEWSKADr Mikołaj CHROMIŃSKIDr Mirosław ŚMIETAŃSKIDr Anaix DEPAIXMgr Sebastian CHMIELIŃSKIMgr Karolina KACZMARSKAMgr Marcin WARMIŃSKIMgr. Zofia WARMIŃSKAMgr Przemysław WANATMgr Sylwia WALCZAK, Mgr Anna NOWICKAMgr Michał KOPCIAŁMgr Dominika STRZELECKA Mgr Renata KASPRZYKMgr Marek BARANOWSKIMgr Agnieszka MŁYNARSKAMgr Marcelina BEDNARCZYKMgr Adam MAMOT Mgr Mateusz KOZARSKIMgr Olga PERZANOWSKASebastian GOŁOJUCHRadosław WÓJCIKTeodor OLEJKOBeata STAREKAgnieszka BRZEZIŃSKAJędrzej KUBICA
Współpraca:John D. GROSS (University of California San Francisco, USA) Marcin NOWOTNY, IIMCB Warsaw)Ugur SAHIN (Gutenberg University of Mainz, GERMANY)Edward DARŻYNKIEWICZ (Faculty of Physics/CeNT UW)Robert E. RHOADS (Louisiana State University, Shreveport, USA)Zbigniew WIECZOREK (Univ. Warmia and Mazury, Olsztyn, POLAND)Joanna KUFEL (Faculty of Biology, University of Warsaw)Jadwiga CHROBOCZEK, (CNRS, Univ. Fourier, La Tronche, FRANCE)Franck MARTIN (Université de Strasbourg, CNRS, FRANCE)Maciej MAZUR (Faculty of Chemistry, University of Warsaw,)Andrzej DZIEMBOWSKI (IBB PAS, Warsaw)Rolf BARTENSCHLAGER (University of Heidelberg, GERMANY)Roger STROMBERG (Karolinska Intstytutet, Stockholm, SWEEDEN)