Modulation of ionising radiation-induced apoptosis by bantam microRNA in Drosophila B.Jaklevic et al.[April 2008] Developmental biology KOPLIKU Lela EL ASRI Hanane
Apr 03, 2015
Modulation of ionising radiation-induced apoptosis by bantam microRNA in
Drosophila
B.Jaklevic et al.[April 2008]
Developmental biology
KOPLIKU Lela EL ASRI Hanane
I-Introduction
Développement de la drosophileDéveloppement de la drosophile
I-Introduction
MV Iorio and CM Croce (2009) J Clin Oncol 27
Biogenèse et maturation des microRNA (miRs)Biogenèse et maturation des microRNA (miRs)
I-Introduction
Bantam microRNA (21nt) inhibe l’expression de Hid
Code une protéine de 410 aa
Partie N-ter de 14 aa commune = domaine RHG
Profil d’expression constitutif
Surexpression induit la mort( rôle pro-apoptotique)
bantam a un effet anti-apototique3’UTR
5’
ARNm hid
3’ 5’5 séquences cibles de bantam
HID (head involution defective)HID (head involution defective)
miRNA bantam
I-Introduction
Induction de cassures double brins de l’ADN Activation de p53 Activation de l’apoptose
Apoptose : réponse clé des radiations ionisantesApoptose : réponse clé des radiations ionisantes
www.sante.univ-nantes.fr/med/biolcell/apoptos.
Quel est le rôle de bantam en réponse aux radiations ionisantes?
Quel est le rôle de bantam en réponse aux radiations ionisantes?
II-Résultats
Fig. 1. Les disques imaginaux d’ailes ont été disséqués à partir des larves 3.5-4h après irradiation aux rayons-X avec 0R (-IR) ou 4000R (+IR), et colorées avec l’Acridine Orange.
La perte de fonction de ban induit l’augmentation de l’apoptose spontanée (-IR) et induite (+IR)
EP:allèle hypomorphe
:Délétion du locus ban
a- Effets des rayons-X sur les mutants bana- Effets des rayons-X sur les mutants ban
Rayon X
II-Résultats
EGFP bantam sensor transgène constitué du promoteur de tubuline, de la séquence
codante de l’EGFP fusionnée à deux copies de la séquence cible de ban en 3’UTR (appelé ‘bantam sensor’)
bantam sensor(3’UTR)
Une diminution du signal EGFP reflète une augmentation de l’activité du répresseur ban.
Promoteur tubuline EGFP
b- Effets des rayons-X sur l’activation de banb- Effets des rayons-X sur l’activation de ban
II-Résultats
Fig. 2
3ème stade larvaire
La fluorescence de l’EGFP a été analysés dans les disques imaginaux d’ailes après 5,18 ou 24 h d’irradiation avec 0 ou 4000 R
Les radiations ionisantes induisent l’activation de ban
EGFP ban sensor diminue au cours du temps
Rayon X
Augmentation de l’activité de ban au cours du temps
=>
b- Effets des rayons-X sur l’activation de banb- Effets des rayons-X sur l’activation de ban
II-Résultats
Fig. 3
•Irradiation des larves après 96h+/-4h du dépot des œufs.
• Toutes les larves irradiés ont formés des pupes.
% éclosion= pourcentage de pupes qui éclosent donnant des adultes viables.
ban est requis pour assurer la survie de l’organisme après irradiation
c- Importance de ban au niveau de l’organismec- Importance de ban au niveau de l’organisme
II-Résultats
Fig. 4. Les larves sont homozygotes pour p535A-1-4 et pour l’insertion 20.X du ‘ban sensor’.
•(A, B) La fluorescence d’EGF a été analysée 24 h après irradiation dans les disques imaginaux d’ailes .
•(D) Le niveau d’EGFP a été analysé par Western blot à partir des extraits larvaires .
p53 est requis pour l’activation de ban
En contexte mutant p53 la quantité d’expression de « ban sensor » ne diminue pas sous l’effet des rayons X
EGFP ban sensor
ban n’est pas activé chez les mutants p53
=>
d- Effets de p53 sur l’activation de band- Effets de p53 sur l’activation de ban
Hypothèse 1:
Après irradiation,p53 induirait l’activation de ban via l’augmentation de son niveau d’expression
Rayon X
p53miRNA bantam
Cassure double brins
?
+
+
EGFP -ban sensor
Récapitulatif 1Récapitulatif 1Effet des rayons X dans les disques
imaginaux d’ailes de larves
Effet des rayons X dans les disques
imaginaux d’ailes de larves
II-Résultats
pas de changement significatif du niveau d’expression de ban aprèsirradiation.
Fig. 5•Extraction de l’ARN total de larves WT (A) et homozygotes mutantes p53 (B)
•Analyse du niveau d’expression du miRNA ban mature.
• exposition des larves aux Rayons X
0(-) ou 4000 R(+)
Northern blot
Quantification Northern blot
=> P53 active ban sans augmenter son niveau d’expression
d- Effets de p53 sur l’activation de band- Effets de p53 sur l’activation de ban
Hypothèse 2:
L’apoptose serait nécessaire à l’activation de bantam après irradiation
p53miRNA bantam
Rayon X
apoptoseapoptose
L’’activation de p53 est nécessaire à l’activation de ban
p53 active l’apoptose
+
++
Récapitulatif 2Récapitulatif 2
Cassure double brins
Effet des rayons X dans les disques
imaginaux d’ailes de larves
Effet des rayons X dans les disques
imaginaux d’ailes de larves
II-Résultats
Fig. 6. Les disques imaginaux d’ailes des larves controles (A, B) et irradiés (C, D) ont été analysés pour la fluorescence d’EGFP (A, B) ou pour la coloration en Acridine Orange (B, D) 24h après irradiation aux rayons-X à 0 ou 4000 R.
Hh-GAL4>UAS-p35:expression de p35 dans la partie postérieur du disque imaginal d’aile
La mort cellulaire est requise pour une activation optimale de ban après irradiation.
Contrôle:Partie antérieur de l’aile
corrélation entre l’’absence d’apoptose et l’ inactivation de bantam
p35
e- Effets de l’inhibition de l’apoptose sur l’activation de ban e- Effets de l’inhibition de l’apoptose sur l’activation de ban
Récapitulatif 3Récapitulatif 3Effet des rayons X dans les disques imaginaux
d’ailes de larves
Effet des rayons X dans les disques imaginaux
d’ailes de larves
p53
apoptoseapoptose
+
+ miRNA bantam
II-Résultats
Fig. 7. Les disques imaginaux d’ailes contrôle (A, C) et irradiés (B, D) ont été analysés par la fluorescence EGFP 24 h après irradiation aux rayons-X avec 4000R.
Les larves sont homozygotes pour le hid-3’UTR sensor (A, B; ‘hid’) ou le hid 3’UTR sensor delété pour les deux sites cibles de ban (C, D; ‘hid Δ 1,4).
L’expression de hid-3’UTR sensor est réduit au niveau des disques imaginaux irradiés.
5’ 3’
hid Δ 1,4
EGFPARNm
hid 3’UTR sensor
L’expression de hid Δ 1,4 n’ est pas réduit au niveau des disques imaginaux irradiés.
hid est une cible importante de ban en réponse aux irradiations
f- Effet de l’irradiation sur la régulation de l’expression de hid par banf- Effet de l’irradiation sur la régulation de l’expression de hid par ban
II-Résultats
Fig. 8. Les larves ont été irradiés à 96+/- 4 h après dépôt des œufs aux rayons-X. Toutes les larves irradiés ont formés des pupes. Le pourcentage des pupes qui éclosent et donnent des adultes ,a été quantifié 10 jours après irradiation.
La suppression de hid sauve les mutants ban de la sensibilité aux irradiations
g- Effet de la suppression de hid dans les mutants bang- Effet de la suppression de hid dans les mutants ban
Récapitulatif 4Récapitulatif 4Effet des rayons X dans les disques imaginaux
d’ailes de larves
Effet des rayons X dans les disques imaginaux
d’ailes de larves
p53
apoptoseapoptose
+
+
miRNA bantam
3’UTR
ARNm hid 5’
Survie des larves
3’
Inhibition de l’expression de hid
miRNA bantam
III-Conclusion
Les rayons X induisent une augmentation de l’activité de ban dans les disques imaginaux et permettent la survie des cellules et des larves
irradiées via l’inhibition de hid imliqué dans la voie apoptotique.
IV-DiscussionComment ban est activé dans les cellules?Hypothèse: les cellules apoptotiques activeraient ban de manière non-autonomecellulaire!
Par quel mécanisme moléculaire est régulé l’activation de ban?L’activité de ban augmente après irradiation, alors que son niveau reste inchangé!
Voie Hippo: voie suppresseur de tumeur conditions normales : ---| ban
Après irradiations
Modèle hypothétique
Est-ce qu’il y a d’autres cibles de ban?
Comment la cellule choisi entre apoptose et survie cellulaire.
Hpo Yorkie
p53 Hpo