BAB I
Model Obesitas Pada Tikus sebagai Metode............
MODEL OBESITAS PADA TIKUS SEBAGAI METODE UNTUK MENJELASKAN
MEKANISME PENGARUH BARIATRIC SURGERY TERHADAP PENGENDALIAN
OBESITAS
Oleh :
Dr.dr. Koernia Swa Oetomo, SpB. FINACS. FICS(K)Trauma
RUMAH SAKIT UMUM HAJI
SURABAYA
2014DAFTAR ISIDaftar
Isi.........................................................................................................iDaftar
Singkatan &
Istilah..............................................................................ii
Daftar
Gambar................................................................................................ivDaftar
Tabel....................................................................................................vRingkasan.......................................................................................................viSummary........................................................................................................vii
Bab I.
Pendahuluan........................................................................................1
1.1.
LatarBelakang........................................................................1Bab
II.
Pembahasan........................................................................................32.1.
Tikus Model
Obesitas...........................................................................32.1.1
Tikus Model Obesitas
Monogenik.............................................32.1.2. Tikus
Model Obesitas
Poligenik...............................................42.1.3
Diet-Induced
Obesity(DIO).......................................................62.2.
Teknik Operasi Adjustable bariatric surgery
pada............................92.2.1. Pengamatan Hasil Operasi
LAGB..........................................92.3 Metode
Pemeriksaan Beberapa Parameter
Adiposopati.......................102.4 Parameter
Adiposopati..........................................................................102.4.1
Leptin.........................................................................................102.4.2
Adiponektin...............................................................................12
2.4.3
Vaspin-1.....................................................................................142.4.4
Chemerin....................................................................................152.4.5
Teknik
Immunohistokimia...........................................................162.4.6.
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay).........................232.4.7. Identifikasi dengan metode
Western blot..................................262.4.8. Metode
Flowcytometery.............................................................26BAB
III.
Kesimpulan.....................................................................................28Daftar
Pustaka................................................................................................28DAFTAR
SINGKATAN DAN ISTILAH
ACRP
: adipocyte C-reactive protein
ADIPOR
: adiponectin receptor
ADSF
: Adipocyte Secreted Factor
AGRP
: Agouti-Related Peptide
AGT
: AngiotensinogenAP-1
: Activator protein-1
aP2
: Adipocyte protein 2
ATF-6
:Activating transcription factor-6ATP
ATP
: adenosin triphospate
BMI
: Body Mass Index
BMR
: basal metabolic rate
C/EBP
: CCAAT/enhancer-binding protein
CETP
: Cholesteryl ester transfer proteinCOX
: cyclooxygenase
CRP
: C-reactive protein
DMH
: Dorsomedial Hipotalamic Nucleus
ER
: Endoplasmic reticulum
ERK
: Extracellullar Signal Regulated Kinase
FABP
: fatty acid binding proteinFFA
: free fatty acid
FIZZ3
: Found in Inflammatory Zone
GLUT
: Glucose transporter
HDL
: High density lipoprotein
HDL
: High-density lipoprotein
HSL
: hormone-sensitive lipase
IKK
: Inhibitor of nuclear factor B kinase
IL
: interleukinIGT
: Impaired glucose tolerance
IRS
: insulin receptor substrat-1
JAK
: Janus Kinase
JNK
: C-Jun N-terminal kinase
LDL
: low density lipoprotein
LPL
: lipoprotein lipase
LPS
: Lipopolysaccharide
LRb
: leptin receptor b
MAPK
:Mitogen activated Protein Kinase
MC4R
: reseptor-melanokortin4
MCP-1
: Monocyte chemoattractant protein-1
MIF
: Migration inhibitory factor
MIP
: Macrophage Inflammatory protein
mTOR
: Mammalian target of rapamycin
NECP
: National cholesterol education program
NEFA
: nonesterified fatty acid
NF(B
: nuclear factor kappa Beta
NPY
: neuropeptide Y
PAI-1
: plasminogen activated inhibitor
PERK
: PKR-like eukaryotic initiation factor 2a kinase
PGE
: prostaglandin
PI3K
: phosphoinositol-3 kinase
PKB
: Protein kinase B
PKC
: Protein kinase C
POMC
: Pro-opiomelanokortin
PPAR(
: peroxisome proliferator activated receptor
PVN
: Paraventricular Nucleus
PYY
: peptide YY
RBP4
: Retinol Binding Protein
RE-1
: Inositol-requiring enzyme-1
STAT
: Signal Transducer and Activators of Transcription
TEE
: total energy expenditure
TGF
: Transforming growth factor
TLR
: Toll-like receptor
TNF
: tumor necrosis factor
TZD
: thiazolidinedione
UPR
: Unfolded protein responseVSMC
: vascular smooth muscle cell
VEGF
: Vascular endothelial growth factor
VLDL
: very low density lipoprotein
VN
: Ventromedial Hypothalamic Nucleus
WAT
: White Adipose Tissue
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Gambaran gastric banding pada tikus. Gaster
dibagi..........................9 Gambar 2. Fotomikrograf jaringan
paru janin gorilla pada fase akhir gestasi.......19Gambar 3.
Densitas reseptor leptin pada jaringan
lemak.......................................19Gambar 4. Densitas
Reseptor
Leptin.....................................................................19DAFTAR
TABEL
Tabel 1. Perbedaan fenotip antara model tikus obesitas dengan
cara diet.............7 Tabel 2. Komposisi diet tinggi lemak yang
digunakan pada model......................8Tabel 3. Komposisi
Larutan pada
ELISA............................................................25RINGKASAN
Obesitas didefinisikan sebagai kondisi abnormal atau kelebihan
lemak yang serius dalam jaringan adipose sehingga menyebabkan
ketidakseimbangan energi. Pengendalian asupan makanan menjadi
penting dalam kaitannya dengan obesitas, karena sebagian besar
jaringan lemak ini terpusat di perut yang selanjutnya menjadi
obesitas viseral. Adiposopati ("lemak sakit") didefinisikan sebagai
perubahan patogenisitas anatomi jaringan adiposa yang terjadi
karena tidak ada keseimbangan kalori, sehingga menghasilkan respon
patofisiologi endokrin dan kekebalan yang dapat menyebabkan
penyakit metabolik (Bays et al, 2008). Secara patofisiologi,
obesitas dan konsep adiposopati ditandai dengan hipertropi dan
hiperplasi jaringan adipose melalui proses diferensiasi dari
preadiposit menjadi adiposit matang (mature adipocyte). Pemahaman
mekanisme obesitas dan hubungannya dengan factor resiko masih belum
banyak diketahui. Karena itu diperlukan pengembangan model obesitas
pada hewan coba. Ada dua tikus model obesitas yaitu tikus model
dengan mutasi genetik dan dengan diet untuk menginduksi obesitas.
Ada beberapa tikus model obesitas dengan mutasi genetik seperti
Lethal Yellow Mutant Mouse (Ay), Ob/ob dan db/db, Tsumura Suzuki
Obese Diabetes (TSOD) Mouse, Tikus M16, tikus Kuo Kondo, Zucker
Fatty Rat, Wistar Fatty Rat, dan Diet-Induced Obesity (DIO). Di
Indonesia penggunaan tikus model mutasi genetik belum ada karena
itu pada penelitian ini akan digunakan tikus model obesitas dengan
pemberian diet tinggi lemak. Pentingnya penatalaksanaan obesitas
mendorong untuk dilakukan pencegahan atau pengobatan obesitas.
Salah satu metode yang sudah diketahui adalah metode teknik
bariatric surgery pada tikus. Mekanisme bariatric surgery dalam
perbaikan fungsi adiposit masih belum diketahui sehingga perlu
dikembangkan model hewan yang dapat menggambarkan peranan bariatric
surgery untuk penatalaksanaan obesitas. Laparoscopic adjustable
gastric banding (LAGB) adalah penempatan silicon inflatable gastric
band horizontal mengellingi bagian atas gaster. Keuntungan LAGB
adalah gastric banding tidak mengganggu penyerapan makanan sehingga
tidak terjadi kekurangan vitamin. Karena itu adjustable gastric
banding pada tikus merupakan model yang sesuai untuk
menginvestigasi efek bariatric surgery pada tikus model obesitas.
Kata Kunci : tikus model obesitas, adjustable gastric banding,
adiposopati
SUMMARY Obesity is defined as a condition of abnormal or excess
fat in adipose tissue so serious cause of energy imbalance.
Controlling food intake is important in relation to obesity,
because most of the fat tissue is concentrated in the stomach which
then becomes visceral obesity. Adiposopati ("sick fat") is defined
as the change in pathogenicity of the anatomy of adipose tissue
that occur because there is no balance of calories, resulting in
the pathophysiology of endocrine and immune responses that can lead
to metabolic diseases (Bays et al, 2008). The pathophysiology,
obesity and adiposopati concept characterized by hypertrophy and
hiperplasi adipose tissue through a process of differentiation from
preadiposit into mature adipocytes (mature adipocyte).
Understanding the mechanism of obesity and its relationship with
risk factors is still not well known. What is needed is the
development of obesity in animal models. There are two mouse models
of obesity that is mouse models with genetic mutations and with
diet to induce obesity. There are several mouse models of obesity
with a genetic mutation such as the Mutant Mouse Lethal Yellow
(Ay), Ob / ob and db / db, Tsumura Suzuki Obese Diabetes (TSOD)
Mouse, Rat M16, rat Kuo Kondo, Zucker Fatty Rat, Wistar Fatty Rat,
and Diet-Induced Obesity (DIO). In Indonesia the use of rat models
of genetic mutation has not been there because it is in this
research will be used rat models of obesity with the provision of
high-fat diet. The importance of the management of obesity
encouraged to do the prevention or treatment of obesity. One method
that is known is a method of bariatric surgery technique in rats.
Mechanism of bariatric surgery in the repair function of adipocytes
is still unknown so the need to develop animal models that can
describe the role of bariatric surgery for the treatment of
obesity. Laparoscopic adjustable gastric banding (LAGB) is an
inflatable silicone gastric band placement of the horizontal upper
gastric mengellingi. Advantages LAGB is gastric banding does not
interfere with the absorption of food so there is no shortage of
vitamins. Because it is adjustable gastric banding in rats is a
suitable model to investigate the effects of bariatric surgery on
rat model of obesity.
Keywords: obesity model of rat, adjustable gastric banding,
adiposophaty
BAB IPENDAHULUAN
1.1. Latar BelakangObesitas didefinisikan sebagai kondisi
abnormal atau kelebihan lemak yang serius dalam jaringan adipose
sehingga menyebabkan ketidakseimbangan energi. Mortalitas dan
morbiditas obesitas semakin meningkat dan peningkatan ini terkait
dengan factor resiko seperti diabetes mellitus tipe 2, hipertensi,
kanker, gangguan pernafasan, osteoarthritis, hipertensi dan
hipertrigliseritemia (Misra dan Khurana, 2008). Obesitas disebabkan
multifaktorial seperti diet, kebiasaan pola hidup, genetic,
polutan, agen infeksi dan endokrin. Untuk itu perlu dipahami
mekanisme patofisiologi obesitas terutama mekanisme yang
menjelaskan hubungan antara obesitas dengan factor resiko lainnya.
Pengendalian asupan makanan menjadi penting dalam kaitannya dengan
obesitas, karena sebagian besar jaringan lemak ini terpusat di
perut yang selanjutnya menjadi obesitas viseral. Pengendalian
asupan makanan melibatkan proses biokimia antara lain keterlibatan
beberapa hormon dan sitokin yang menentukan rasa lapar dan kenyang.
Pengendalian asupan makanan tersebut melibatkan system syaraf pusat
dan perifer (Perusse et al., 2001). Apabila tidak terjadi
keseimbangan energi dengan asupan makanan maka akan menyebabkan
disfungsi adiposit sehingga inilah yang melatarbelakangi timbulnya
adiposopati. Adiposopati ("lemak sakit") didefinisikan sebagai
perubahan patogenisitas anatomi jaringan adiposa yang terjadi
karena tidak ada keseimbangan kalori, sehingga menghasilkan respon
patofisiologi endokrin dan kekebalan yang dapat menyebabkan
penyakit metabolik (Bays et al, 2008).Secara patofisiologi,
obesitas dan konsep adiposopati ditandai dengan hipertropi dan
hiperplasi jaringan adipose melalui proses diferensiasi dari
preadiposit menjadi adiposit matang (mature adipocyte). Pada sel
preadiposa, mekanisme diferensiasi melibatkan 3 (tiga) factor
transkripsi yaitu Peroxisome proliferator activated receptor
(PPAR)-(, CCAAT-enhancer binding protein (C/EBP)( dan sterol
regulated enhancer binding protein (SREBP)-1. Ketiga factor
tersebut menginduksi gen untuk mensintesis beberapa sitokin
(adipositokin). Beberapa adipositokin yang dikeluarkan oleh
jaringan adipose adalah leptin, adiponektin, resistin, tumor
necrosis factor (TNF)-(, interleukin-6, vaspin dan chemerin.
Sitokin inilah yang menentukan factor resiko yang terkait dengan
obesitas (Goralski et al, 2007; Hajer et al, 2008). Pemahaman
mekanisme obesitas dan hubungannya dengan factor resiko masih belum
banyak diketahui. Karena itu diperlukan pengembangan model obesitas
pada hewan coba. Menurut Kanasaki et al (2011) ada dua tikus model
obesitas yaitu tikus model dengan mutasi genetik dan dengan diet
untuk menginduksi obesitas. Ada beberapa tikus model obesitas
dengan mutasi genetik seperti Lethal Yellow Mutant Mouse (Ay),
Ob/ob dan db/db, Tsumura Suzuki Obese Diabetes (TSOD) Mouse, Tikus
M16, tikus Kuo Kondo, Zucker Fatty Rat, Wistar Fatty Rat, dan
Diet-Induced Obesity (DIO). Di Indonesia penggunaan tikus model
mutasi genetik belum ada karena itu pada penelitian ini akan
digunakan tikus model obesitas dengan pemberian diet tinggi lemak.
Pentingnya penatalaksanaan obesitas mendorong untuk dilakukan
pencegahan atau pengobatan obesitas. Salah satu metode yang sudah
diketahui adalah metode teknik bariatric surgery pada
tikus.Prosedur bariatric surgery sampai saat ini semakin baik dan
merupakan satu-satunya pilihan untuk menurunkan berat badan secara
signifikan sehingga dapat bertahan dalam waktu yang lama (Aills et
al, 2008; Ahima dan Oseiy, 2008; Arias et al, 2009). Keberhasilan
bariatric surgery dalam penanganan obesitas adalah dapat menurunkan
berat badan sekitar 20 40 kg dari berat badan awal dan pengurangan
BMI sekitar 10 15 kg/m2. Mekanisme bariatric surgery dalam
perbaikan fungsi adiposit masih belum diketahui sehingga perlu
dikembangkan model hewan yang dapat menggambarkan peranan bariatric
surgery untuk penatalaksanaan obesitas (Ahima dan Oseiy, 2008).
Laparoscopic adjustable gastric banding (LAGB) adalah penempatan
silicon inflatable gastric banding horizontal mengellingi bagian
atas gaster. Keuntungan LAGB adalah gastric banding tidak
mengganggu penyerapan makanan sehingga tidak terjadi kekurangan
vitamin (Carson et al, 2004; Bult et al, 2008). Karena itu
adjustable gastric banding pada tikus merupakan model yang sesuai
untuk menginvestigasi efek bariatric surgery pada tikus model
obesitas. BAB II
PEMBAHASANObesitas, didefinisikan sebagai indeks massa tubuh
(BMI)> 30 kg/m2, merupakan masalah kesehatan yang signifikan.
Obesitas telah mencapai proporsi epidemi global, dan world
memperkirakan bahwa ada lebih dari 1 milyar orang dewasa mengalami
kelebihan berat badan sedangkan 300 juta mengalami obesitas.
Perubahan Masyarakat dan transisi gizi di seluruh dunia telah
mendorong epidemi obesitas selama beberapa dekade terakhir.
Pertumbuhan ekonomi serta modernisasi, urbanisasi dan globalisasi
pasar makanan adalah beberapa faktor yang telah memberikan
kontribusi terhadap epidemi obesitas. Penurunan aktivitas fisik
juga telah dikaitkan dengan peningkatan kesempatan untuk
menggunakan transportasi otomatis, memiliki teknologi di rumah, dan
terlibat di lebih pengejaran rekreasi pasif (Kopelman, 2008).
Obesitas dikaitkan dengan kematian dini melalui peningkatan risiko
penyakit kronis, termasuk diabetes tipe 2, penyakit jantung, dan
kanker tertentu. Selain itu, obesitas berhubungan dengan kesulitan
pernafasan, masalah muskuloskeletal kronis, sakit pinggang, masalah
kulit, dan infertilitas. Hasil penelitian epidemiologi menyebutkan
bahwa mekanisme molekuler dari masalah kesehatan yang terkait
dengan obesitas belum banyak diketahui (Kanasaki, 2011).Sebagian
besar bukti mengusulkan masalah kesehatan terkait obesitas telah
diperoleh dari analisis epidemiologi dari subyek manusia, mekanisme
molekuler yang tepat dari masalah kesehatan terkait. Dalam tulisan
ini, kami akan meringkas laporan yang berhubungan dengan patologi
obesitas dengan menggunakan model hewan.2.1. Tikus Model
ObesitasAda beberapa model tikus obesitas yaitu:2.1.1 Tikus Model
Obesitas Monogenik Lethal Yellow Mutant Mouse(Ay)Di antara beberapa
tikus obesitas yang biasa digunakan dalam penelitian pertama kali
dilaporkan adalah tikus mutasi agouti(agouti knockout mice). Agouti
adalah gen bertanggung jawab terhadap folikel melanosit untuk
memproduksi pigmen merah / pheomelanin pigmen kuning dan menghambat
pigmen hitam / pigmen coklat (Matsunaga et al, 2000). Lethal Yellow
Mutant Mouse (Ay) merupakan salah satu dari lima mutasi dominan
agouti dan telah digunakan sebagai tikus model obesitas yang sangat
baik (Kanasaki et al, 2011). Mutasi Ay dicirikan dengan delesi DNA
genomik pada urutan basa nukletida sekitar 120-170 kb, sehingga
terjadi gangguan ekspresi agouti (Trevaskis et al, 2005). Tikus
model Ay menunjukkan beberapa fenotip seperti warna bulu kuning,
obesitas dewasa, diabetes tipe-II, hyperleptinemia, peningkatan
pertumbuhan secara linier suseptibilitas tumor yang lebih tinggi,
dan infertilitas (Kanasaki et al, 2011). Tikus model ini
menunjukkan pertumbuhan jaringan adiposa yang berlebih dimana tidak
terjadi perubahan asupan makanan sehingga mengalami peningkatan
lemak akibat perubahan metabolisme energi. Model agouti yang
berlebih pada jaringan adiposa relevan dengan obesitas manusia
karena ekspresi gen agouti juga ditemukan dalam jaringan adiposa
manusia dan meningkat pada jaringan adiposa tipe 2. Kemungkinan
ekspresi ektopik dari agouti di pankreas tikus merangsang pelepasan
insulin oleh pankreas-sel sehingga dapat meningkatkan lipogenesis.
Ekspresi agouti transgenik di kulit tidak menginduksi obesitas akan
tetapi lebih mengarah pada peran agouti dalam obesogenik(Grayson et
al, 2010). Pada tahun 1949, peneliti menemukan tikus obesitas yang
dihasilkan dari mutasi gen obesitas (ob). Mutasi ob / ob adalah
resesif dimana terjadi mutasi pada gen leptin. Karakterisasi mutasi
ini adalah terjadi delesi sepasang basa tunggal di daerah pengkode
leptin. Protein leptin berperan penting dalam mengendalikan nafsu
makan. Oleh karena itu pada tikus ob / ob terjadi keinginan makan
tak terkendali sehingga terjadi obesitas, diabetes tipe 2,
resistensi insulin dan hyperinsulinemia (Prasad et al, 2010). Tikus
db / db diidentifikasi awalnya pada tahun 1966 sebagai tikus model
obesitas. Mutasi db (singkatan dari "diabetes") adalah mutasi yang
terjadi pada gen resesif autosomal dimana terjadi mutasi basa
nukleotida G menjadi T sehingga sinyal leptin terganggu. Gangguan
sinyal leptin di hipotalamus menyebabkan hyperphagia dengan
hyperleptinemia, resistensi insulin, dan meningkatnya kadar insulin
(Kodera et al, 2011).
2.1.2. Tikus Model Obesitas PoligenikMeskipun model monogenik
memberikan informasi penting tentang biologi obesitas, obesitas
manusia kemungkinan besar dimediasi oleh beberapa gen. Oleh karena
itu, model poligenik lebih relevan pada obesitas manusia. Strain
tikus obesitas Selandia Baru (NZO) adalah model tikus obesitas
poligenik yang menunjukkan diabetes tipe 2 hanya pada jantan. Tikus
NZO berat badan meningkat dengan cepat selama 2 bulan pertama
karena terjadi hiperphagia yang terkait dengan resistensi leptin,
meskipun memiliki gen leptin dan reseptor leptin yang normal. Di
antara model tikus obesitas poligenik, fenotipe tikus NZO yang
paling jelek dengan jumlah lemak lebih dari 40% dari total berat
badan umur 6 bulan. Selain itu, tikus NZO menunjukkan penurunan
aktivitas latihan dibandingkan dengan kontrol(Joost, 2010). Tsumura
Suzuki Obese Diabetes (TSOD) MouseTikus obesitas TSOD jantan
menunjukkan hiperglikemia dan hyperinsulinemia. Nilai rata-rata
konsentrasi glukosa darah pada tikus TSOD meningkat 232 mg / dl
pada 13 minggu, 269 mg / dl pada 16 minggu, dan 346 mg / dl pada 24
minggu.Diabetes berat tidak berkembang karena TSOD tikus
menunjukkan peningkatan jumlahsel dan melindungi sekresi insulin
untuk mengontrol glukosa darah (Iizuka et al, 2005). Tikus Model
M16Tikus M16, sebuah model tikus obesitas poligenik yang
dikembangkan melalui seleksi jangka panjang selama 3 sampai 6
minggu. Tikus model M16 menunjukkan hiperphagia, hiperinsulinemia,
dan hiperleptinemia dibandingkan dengan kontrol. Tikus M16 jantan
dan betina hiperglikemia sedang dibandingkan dengan kontrol. Kadar
glukosa pada tikus M16 adalah sekitar 56% dan 22% lebih tinggi pada
usia 8 minggu (Allan et al, 2004).
Tikus Kuo Kondo (KK)Tikus KK adalah model obesitas poligenik
yang juga menunjukkan diabetes tipe 2. Tikus KK ini dikembangkan di
Jepang dengan ukuran tubuh besar. Tikus KK menunjukkan fenotip
hiperphagia, hiperinsulinemia, resistensi insulin dan obesitas
moderat pada umur 2 bulan. Strain tikus KK telah dimodifikasi
dengan mentransfer gen obesitas (Ay); tikus KKAy banyak digunakan
untuk penelitian obesitas dan diabetes pada pengujian terapi
eksperimental (Okazaki et al, 2002).Zucker Fatty Rat (ZFR)Zucker
Fatty Rat adalah tikus model obesitas yang mengalami mutasi gen
lemak (fa) resesif autosomal pada kromosom 5. Gen fa merupakan gen
reseptor leptin.Tikus ini ditandai dengan hiperphagia dan obesitas
yang muncul usia 5 minggu akibat akumulasi lemak subkutan. ZFR juga
ditandai dengan resistensi insulin tetapi kadar gula darah normal
(Martin-Cordero et al, 2011).Wistar Fatty Rat (WFR)Pada tahun 1981,
Ikeda et al,(1981)melaporkan model lain tikus obesitas, lemak tikus
Wistar (WFR). Strain WFR diperoleh dengan mentransfer gen fa dari
ZFR (13 M strain) pada tikus Wistar Kyoto yang memperlihatkan
toleransi rendah glukosa. Tikus obesitas WFR umur 3 minggu
menunjukkan penyakit yang terkait obesitas seperti diabetes tipe 2,
hyperinsulinemia, hiperlipidemia. Kelainan metabolik yang menonjol
pada WFR jantan, tetapi tidak pada WFR betina, yang hanya
menampilkan resistensi insulin ringan dan intoleransi glukosa.
Terjadi diabetes pada WFR tetapi tidak pada ZFR, meskipun ada
mutasi fa (leptin reseptor) di kedua strain, hal ini dapat
dijelaskan karena adanya faktor genetik lainnya di WFR. Strain WFR
banyak digunakan untuk penelitian pada diabetes tipe 2 karena WFR
menampilkan komplikasi diabetes seperti nefropati dan neuropati
(Imai et al, 2003). Wistar Fatty Rat (WFR) bisa dipakai untuk diet
Induced Obesity sehingga bisa dipakai untuk melihat parameter
adiposopati seperti leptin, adiponectin, vaspin, dan chemerin
setelah dilakukan adjustable gastric banding. (Yuka
Onoa,2006,)2.1.3 Diet-Induced Obesity(DIO)High-Fat Diet. Faktor
genetik dan lingkungan berperanan dalam perkembangan obesitas dan
diet adalah salah satu faktor lingkungan utama yang berkontribusi
terhadap obesitas. Diet tinggi lemak (HFD) sering digunakan dalam
penelitian obesitas sebagai model kekurangan non-leptin. Ada
perbedaan spesifik strain tikus dan HFD dalam karakteristik tikus
model obesitas (Tabel 1). Di antara berbagai strain, tikus C57BL/6J
adalah yang paling banyak digunakan untuk HFD. Pada strain tikus
C57, ada perbedaan yang signifikan antara substrains dalam merespon
HFD. Tikus DIO strain C57BL/6J, hyperinsulinemia, dan resistensi
insulin yang sama dengan perkembangan penyakit manusia, tetapi
tikus C57BL/KsJ menunjukkan fenotipe yang kurang (Srinivasan dan
Ramarao, 2007).Diet tinggi lemak menginduksi tikus menjadi obesitas
dengan memanipulasi melalui asupan makanan yang tinggi lemak.
Watanabe et al (2006) melaporkan menemukan peran antiobesitogenic
asam empedu (BA) pada tikus. BA telah diakui sebagai solubilizers
lipid sederhana, yang berperanan penting dalam regulasi metabolik
yang kompleks. Watanabe et al. menemukan bahwa diet tinggi lemak
ditambah dengan asam kolat 0,5%, menyebabkan BA ditemukan dalam
jumlah terbesar, mencegah berat badan dan adiposity tanpa perubahan
jumlah asupan makanan. Hasil penelitian tersebut menemukan bahwa BA
mengaktifkan G-protein-coupledTGR5 reseptor dan menginduksi
deiodinase tipe 2. Aktivasi deiodinase tipe 2 menghasilkan konversi
tiroksin (T4) untuk triiodothyronine (T3), yang meningkatkan
pengeluaran energi. Selanjutnya, senyawa TGR5, INT-777, meniru efek
metabolik seperti BA dapat menghambat terjadinya steatosis pada
tikus diet tinggi lemak. Selanjutnya, INT-777 menginduksi efek
incretin melalui sekresi glukagon peptida seperti (GLP) -1 dan
toleransi glukosa. Penelitian ini mengungkapkan pentingnya potensi
BA untuk pencegahan diinduksi diet obesitas dan masalah kesehatan
yang terkait (Zhang et al, 2007). Metode lain intervensi gizi,
dapat mencegah kelainan metabolisme yaitu diet dengan asam amino
esensial ketogenic (KAA) tinggi seperti leusin, isoleusin, valin,
lisin, dan treonin. Zhang et al. telah melaporkan bahwa makan
tinggi leusin pada tikus mencegah obesitas yang diinduksi oleh diet
tinggi lemak. Pemberian diet campuran KAA tinggi akan termodulasi
jalur sintetis lipid dan pencegahan steatosis hati dan resistensi
insulin dengan penurunan berat badan. Menariknya seperti tinggi-KAA
telah menunjukkan peningkatan sensitivitas insulin pada
diabetestipe 2(Noguchi et al, 2010). Laporan-laporan ini
menunjukkan bahwa diet tinggi lemak-hewan yang disebabkan obesitas
bisa menjadi contoh yang baik untuk terapi eksperimental dan
penelitian translasi untuk menemukan strategi baru terapi untuk
epidemi obesitas. Tabel 1. Perbedaan fenotip antara model tikus
obesitas dengan cara diet dan genetik (Srinivasan dan Ramarao,
2007;Speakman et al, 2007; Clee dan Attie, 2007; Buettner et al,
).StrainKarakteristik
DietGenetik
C57BL/6J
Diet tinggi lemak dapat menginduksi obesitas dan diabetes
Lepob/ob menyebabkan obesitas tetapi tidak diabetes
C57BLKS/J
Menginduksi obesitas dan diabetes tetapi lebih lemah daripada
C57BL/6JLepob/ob menyebabkan obesitas dengan diabetes berat
DBA/2
Lebih toleran glukosa dibandingkan C57BL/6J
Lepob/ob menyebabkan obesitas dengan diabetes berat
129sv
Insulin rendah, lebih toleran glukosa dibandingkan strain
lainnya
Homozigot alel db menunjukkan hiperglikemia ringan
BTBR
Obesitas abdominal perifer tetapi bukan resisten insulin di
hepar
Lepob/ob menyebabkan obesitas dengan diabetes berat
A/J
Kadar glukosa rendah, resistensi obesitas dan diabetes Tidak ada
laporan
BALB/c
Sama dengan A/J, toleransi glukosa
Lepob/ob menyebabkan penurunan adiposit dan peningkatan
termogenesis
C3H
Toleransi glukosa tinggiTidak ada laporan
AKR
Sensitif terhadap DIO dengan hiperinsulinemia dan resistensi
insulin Tidak ada laporan
CAST/Ei
Kurus pada umur 12 minggu karena HFDTidak ada laporan
Nonobese diabetic
45% fat diet menginduksi hiperglikemia ringan dengan obesitas
beratTidak ada laporan
New Zealand Obese
Terjadi sindroma metabolik yang menyerupai manusia, dapat
menginduksi obesitas dan hiperglikemi Tidak ada laporan
M16
Meningkatkan berat badan, lemak dan intake makanan; baik jantan
maupun betina terjadi hiperinsulinemia dan khususnya pada jantan
terjadi hiperglikemia sedangTidak ada laporan
Wistar
HFD dapat menginduksi obesitas dan resistensi insulinTidak ada
laporan
Diet tinggi lemak yang digunakan dalam penelitian adalah diet
lemak yang mengandung 32 sampai dengan 60% kalori. Hasil penelitian
menyebutkan bahwa 60 kkal% lemak digunakan untuk menginduksi
obesitas pada tikus. Beberapa diet tinggi lemak yang digunakan
adalah diet yang mengandung lemak jenuh seperti minyak kelapa,
lard, beef tallaw. Berikut ini adalah tabel yang menunjukkan
komposisi diet yang digunakan untuk model tikus obesitas dengan
high fat diet.
Tabel 2. Komposisi diet tinggi lemak yang digunakan pada model
tikus obesitas (Gajda, 2008)
2.2. Teknik Operasi Adjustable bariatric surgery pada tikus
model obesitas
Gambar 1. Gambaran gastric banding pada tikus. Gaster dibagi
menjadi 2 kantong yaitu kardia dan fundus dengan menempatkan
adjustable silicone band dibawah gastroesophagealjunction sehingga
terbentuk kantong atas dengan volume kurang lebih 15 mL (Kanno et
al, 2008)Hewan coba dibius dengan 0.1ml/100 gram berat badan
ketamine secara intraperitoneal / intramuskuler. Pada bagian garis
tengah atas abdomen diinsisi dengan surgical blade pisau bedah
ukuran 15 sampai dengan peritoneum terbuka kemudian dipasang
retraktor. Gaster dikeluarkan kemudian dilakukan teknik gastric
banding dengan menempatkan band karet diameter 6 mm panjang dan 2
mm lebarnya dan ditempatkan melilingi bagian antara fundus dan
kardia dibawah esophageal gastric junction sehingga gaster terbagi
menjadi kantong atas dan bawah (Gambar 1). Band karet diusahakan
tidak mengalami dislokasi dengan jalan menjahit pada dinding
anterior gaster di dekat kurvatura minor yang lainnya dekat
kurvatura mayor. Dinding abdomen ditutup dengan jahitan dua lapis
memakai chromic cat gut 40 dan kulit memakai silk 40. Berat badan
dimonitor setiap hari sampai hari ke-14 (post operative day/POD).
Air masuk dan urin diukur setiap hari sampai hari ke-7 POD (Kanno
et al, 2008).2.2.1. Pengamatan Hasil Operasi LAGBLAGB menurunkan
berat badan dibandingkan dengan kontrol. Penurunan berat badan ini
dibawah fase pertumbuhan dari tikus. Tikus Wistar dipilih sebagai
model eksperimental bariatric surgery karena metabolisme telah
diperiksa secara detail. Pembentukan tikus model gastric banding
diperlukan eksperimen dengan berbagai teknik karena perbedaan
anatomi antara perut manusia dan tikus. Penelitian ini merupakan
upaya untuk membentuk model tikus baru. Gastroplasty Vertikal
banded (VBG) adalah membatasi prosedur yang tidak memungkinkan band
yang akan diikat. Ini membatasi volume lambung dengan menciptakan
kantong lambung vertikal di sepanjang lengkung dan membungkus
sebuah band dengan mesh polypropylene sekitar akhir kantong
vertikal untuk mencegah stoma dan dari peregangan. VBG telah hampir
ditinggalkan karena terjadi operasi ulang dari outlet stenosis dan
refluks serta rendahnya penurunan berat badan. Salah satu masalah
utama dengan band lambung terbuka karena ukuran kantong lambung
tidak disesuaikan. Jika stoma terlalu lebar, penurunan berat badan
terganggu. Jika stoma terlalu ketat, ada risiko intoleransi makanan
pasca operasi. Penyempurnaan perangkat telah menghasilkan sebuah
band adjustable yang dapat ditempatkan laparoskopi. Oleh karena itu
untuk mencegah muntah pada pasca operasi, sebagian besar ahli bedah
sekarang menunda penyesuaian band (Monteiro et al, 2006). Tikus
mengkonsumsi pakan normal paling selama satu jam pertama sebelum
dan saat malam dan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam berat
badan atau asupan makanan yang ditemukan antara tikus yang makan
dua kali sehari (Endo et al, 2007).
Gambar 2. Perubahan berat badan tikus dan intake pakan setiap
hari setelah gastric banding
Pada penelitian akan dikembangkan investigasi tentang pengaruh
adjustable gastric banding terhadap regulasi homeostasis energy dan
parameter adiposopati pada tikus model diet-induce obesity (DIO)
dengan pemberian diet tinggi lemak.
2.3. Metode Pemeriksaan Beberapa Parameter AdiposopatiMenurut
Goralski et al, (2007); Bay et al, (2008); Kanasaki et al, (2011)
bahwa masih belum diketahui pengaruh bariatric surgery terhadap
regulasi homeostasis energi dan beberapa parameter terkait dengan
adiposopati seperti leptin, adiponektin, vaspin dan chemerin.
Karena itulah parameter ini merupakan orisinalitas dari penelitian
yang akan kami lakukan. parameter adiposopati yang akan diteliti
adalah leptin, adiponektin, vaspin dan chemerin dalam darah.
Pengukuran beberapa parameter adiposopati dapat dilakukan dengan
beberapa teknik pengukuran seperti teknik Imunohistokimia, ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), western blot dan
flowcytometry. Berikut ini beberapa metode teknik pengukuran
adiposopati.
2.4. PARAMETER ADIPOSOPATI
2.4.1 Leptin
Leptin diproduksi secara proporsional untuk menyimpan lemak
(Munzberg & Myers 2005). Leptin merupakan protein dengan 167
asam amino yang ditranskripsikan oleh gen ob. Nama leptin diambil
dari bahasa Yunani yang artinya kurus. Gen leptin pada manusia
terletak di kromosom 7q31; DNA-nya memiliki lebih dari 15.000
pasang basa dan ada 3 ekson yang merupakan tempat utama pengkodean
sintesis protein. Leptin terutama di produksi di jaringan lemak
putih dan sangat sedikit ditemukan di jaringan lemak coklat. Banyak
penelitian mengungkap hubungan yang kuat antara leptin dengan
kejadian obes dan resistensi insulin pada anak dan dewasa (Kempf et
al 2006). Meskipun peran utama leptin adalah dalam pengaturan berat
badan dan metabolisme energi, beberapa penelitian menunjukkan bahwa
hormon ini dapat terlibat dalam mekanisme patofisiologi lainnya.
Leptin dilaporkan ikut mengatur fungsi imun, angiogenesis,
pembentukan tulang dan fertilitas. Selain itu leptin ternyata juga
ikut terlibat dalam proses agregasi platelet (Corsonello et al
2003).Leptin bekerja secara langsung menghambat konsentrasi lipid
intrasel dengan mereduksi sintesis asam lemak dan triasilgliserol
(TG) dan meningkatkan lipid oksidasi. Efek terhadap metabolisme
lipid mungkin dimediasi oleh efek hambatan leptin terhadap
aktivitas asetil-CoA karboksilase yaitu enzim yang membatasi
kecepatan sintesis asam lemak. Hambatan enzim ini memicu reduksi
malonil-CoA, yaitu suatu inhibitor karnitiltransferase I dan proses
-oksidasi di mitokodrial. Hambatan terhadap asetil-koA karboksilase
akan memblok sintesis asam lemak serta ambilan dan oksidasi asam
lemak di mitokondria. Leptin dengan memutarbalikan akumulasinya di
jaringan perifer akan memiliki efek menguntungkan terhadap
resistensi insulin dan fungsi sel beta, yang akhirnya meningkatkan
homeostasis glukosa. Leptin juga secara signifikan menurunkan
sekresi insulin oleh sel beta pankreas (Kim & Moussa 2000).
Ketika leptin kurang atau reseptor leptin tidak berfungsi,
kandungan triasilgliserol di jaringan nonadiposa misalnya pankreas,
jantung dan otot skelet dapat meningkat 10-50 kali. Hal ini
menunjukkan bahwa leptin mengontrol sistem homeostatis
triasilgliserol intraseluler. Kenyataan bahwa fungsi dan viabilitas
jaringan non adiposa bekerja sama ketika kandungan TG meningkat di
atas normal mengimplikasikan bahwa homeostasis normal asam lemak
intraseluler menjadi titik penting untuk mencegah komplikasi
obesitas. Kelebihan asam lemak pada otot skelet, myocardium dan
pankreas menyebabkan resistensi insulin, lipotoxic hearth disease
dan diabetes tipe 2 adipogenik. Pada obes akibat diet, sinyaling
leptin awalnya normal dan perubahan akibat lipotoksik dapat
dicegah, namun kemudian terjadi resistensi leptin post reseptor
yang memicu disfungsi dan lipoapoptosis jaringan nonadiposa, suatu
komplikasi yang sering terjadi pada obesitas (Unger dan Orci
2000).
Leptin berfungsi mengatur sensitivitas insulin dan homeostasis
glukosa melalui 2 mekanisme yakni (1) dengan mengontrol
keseimbangan energi dan lemak tubuh yaitu meningkatkan sel adiposit
untuk memicu resistensi insulin; (2) melalui jalur
adiposity-independent yang dimediasi oleh kontrol sistem saraf
pusat terhadap output glukosa hepatik. Akan tetapi, fakta
menunjukkan bahwa kadar leptin yang tinggi dalam sirkulasi ternyata
gagal untuk meningkatkan kehilangan berat badan pada individu obes,
sehingga menimbulkan hipotesis adanya resistensi leptin yaitu
terbatasnya kerja leptin pada keadaan obes (Munzberg & Myers
2005).Pemberian leptin pada individu obes yang secara genetik
kekurangan leptin, dapat menurunkan nafsu makan dan memicu
penurunan berat badannya serta memperbaiki hiperfagi dan
abnormalitas endokrin yang berhubungan dengan kandungan lemak tubuh
yang rendah karena sejumlah lipodistropik dan gangguan makan
(Munzberg & Myers 2005). Kebanyakan individu obes memiliki
kadar leptin di sirkulasi yang meningkat sebagai konsekuensi dari
massa lemak yang besar, tetapi tidak adekuat merespon peningkatan
kadar leptin tersebut dengan menurunkan nafsu makan. Hipotalamus
tidak mampu untuk mentransduksi sinyal leptin tersebut untuk
mengurangi berat badan, sehingga dikenal dengan istilah resistensi
leptin (Lustig et al 2004, Munzberg & Myers 2005, Kempf et al
2006). Resistensi leptin juga mencegah pemberian leptin eksogen
untuk meningkatkan pengurangan berat badan. Resistensi leptin
mencegah transduksi sinyal leptin yang normal pada ventromedial
hypothalamus (VMH), sehingga terjadi asupan kalori terus menerus
dan berkembang menjadi obesitas (Lustig et al 2004).Ada 2 hipotesa
yang telah diterima dalam mekanisme yang mendasari resistensi
leptin yaitu kegagalan leptin di sirkulasi untuk mencapai targetnya
di otak dan penghambatan cascade sinyaling LRb intraseluler. Leptin
mencapai otak melalui sejumlah mekanisme, meliputi mekanisme
transpor spesifik menembus sawar darah otak, berdifusi dari organ
circum ventricular dan langsung menyeberang dari darah ke
neuroendokrin. Leptin secara jelas dihantar melintasi sawar darah
otak dengan sistem transpor jenuh. Aktivitas transpor ini terlihat
menurun pada tikus obese yang diinduksi makanan. Namun demikian
penjelasan terhadap sejauh mana leptin menembus sawar darah otak
berkontribusi terhadap kerja leptin masih belum jelas, khususnya
nukleus arcuatus (Munzberg & Myers 2005).Hipotesa kedua yaitu
penghambatan kaskade sinyaling LRb intraseluler. Tidak aktifnya
transpor leptin berkontribusi terhadap resistensi leptin. Hal ini
jelas ditunjukkan bahwa kemampuan leptin untuk mengaktivasi
sinyaling hipotalamus menurun pada obesitas yang diinduksi diet.
Sejumlah penelitian mendukung peran potensial 2 molekul inhibitor
yakni SOCS 3 dan protein tyrosine phosphatase PTP1B dalam regulasi
LRb sinyaling in vitro dan in vivo (Munzberg & Myers 2005).
Pada tikus obes yang diinduksi oleh diet tinggi lemak menunjukkan
respon STAT3 terhadap pemberian leptin intracerebrovascular
dilemahkan, meyakinkan adanya defek pada transduksi sinyal leptin
neuronal (Lustig et al 2004).2.4.2 AdiponektinAdiponektin adalah
hormon yang terutama diproduksi oleh jaringan adiposa.
Penelitian-penelitian mengungkapkan peran adipokin pada
patofisiologi resistensi insulin dan sindrom metabolik
(Mendez-Sanchez et al 2006). Adiponektin merupakan protein dengan
244 asam amino yang mirip dengan kolagen tipe VIII dan tipe X dan
protein komplemen C1q. Struktur tiga dimensi pada domain globular
C-terminal homolog dengan tumor necrosis factor- (TNF-). Akan
tetapi, efek fisiologis adiponektin dan TNF- sangat berbeda dan
beberapa berlawanan. Lebih jauh, adiponektin menghambat sekresi
TNF- (Tre 2007).Adiponektin ditemukan dengan kadar total yang
tinggi dalam darah normal berkisar 5 - 30 g/ml (Sharma et al 2008).
Adiponektin disekresikan dari jaringan adiposa dan beredar dalam
bentuk multimerik mulai dari trimers, heksamer (berat molekul
rendah, ~180kDa) sampai oligomer dengan berat molekul tinggi yang
mengandung 12-18 subunit kompleks (berat molekul tinggi, ~400 kDa)
(Mendez-Sanchez 2006, Sharma et al 2008). Monomer-monomer
adiponektin dihubungkan dengan ikatan disulfida yang bergantung
pada cystein-39 di regio variabel amino-terminal. Polimorfisme
single-nucleotide (G84R, G90S, Y111H dan I164T) memodifikasi
pembentukan ikatan disulfida ini, dan dapat mengubah kemampuan
adiponektin menjadi bentuk multimer yang lebih besar dari pada
trimer, mempengaruhi aktivitas biologisnya. Hal penting lainnya
terkait dengan struktur adiponektin dihubungkan dengan modifikasi
post-translational, terutama glikosilasi hidroksilisil pada empat
residu lysin dalam domain kolagenosa yang kritis untuk aktivitas
insulin-sensitizing berkenaan dengan penghambatan produksi glukosa
hepatik (Mendez-Sanchez 2006).Reseptor adiponektin terdiri atas
AdipoR1 dan AdipoR2 (Mendez-Sanchez 2006, Sharma 2007) dan
T-cadherin telah dilaporkan (Tre 2007). Reseptor-reseptor ini
banyak diteliti sebagai target farmakoterapi. AdipoR1 terletak pada
kromosom 1p36.13-q41, sedangkan AdipoR2 terletak pada kromosom
12p13.31. AdipoR1 mengkode protein dengan 375 asam amino, massa
molekul 42,4 kDa, dan AdipoR2 mengkode protein dengan 311 asam
amino, massa molekul 35,4 kDa. AdipoR1 dan adipoR2 secara
struktural berhubungan memiliki kesamaan 66,7%. Mereka menggunakan
AMP-kinase sebagai second messenger tetapi tidak terlihat bergabung
dengan protein G. AdipoR2 juga mengaktivasi PPAR dan p38 mitogen-
activated protein kinase. AdipoR1 diekspresikan terutama di otot
skelet, sementara adipoR2 diekspresikan di hepar. AdipoR1 dan
AdipoR2 merupakan reseptor yang memiliki tujuh domain transmembran
(Mendez-sanchez 2006).Adiponektin meningkatkan sensitivitas
insulin, menstimulasi oksidasi asam lemak, ambilan glukosa dan
produksi laktat di sel-sel otot (rhabdomyocytes). Di hepar
adiponektin menstimulasi oksidasi asam lemak dan mengurangi
glukoneogenesis (Mendez-sanchez, 2006). Sampai saat ini adiponektin
merupakan salah satu adipokin terbaik dengan potensi besar untuk
pengembangan terapi beberapa penyakit. Selain sebagai
insulin-sensitizing, adiponektin juga sebagai anti-inflamasi,
anti-aterogenik, anti-diabetik, anti-obesitas, anti-fibrotik dan
anti kanker (Tre 2007). Hasil penelitian Torigoe et al (2007)
dilaporkan bahwa kadar adiponektin plasma dapat memprediksi
disfungsi endotel sebelum terjadi penyakit vaskular yang lebih
jauh. Adiponektin dengan berat molekul tinggi lebih baik digunakan
sebagai marker disfungsi endotel daripada adiponektin total.Efek
adiponektin terhadap sensitisasi insulin disertai oleh
anti-inflamasi. Adiponektin panjang menghambat ekspresi beberapa
molekul adesi pada permukaan sel endotel yang diinduksi oleh TNF-,
antara lain vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), E-selectin,
dan intercellular adhesion molecule (ICAM). Adiponektin panjang
juga menekan perubahan inflamasi pada sel endotel yang diinduksi
TNF- dengan memblok aktivasi nuclear factor-B tanpa mempengaruhi
aktivasi c-jun N-terminal kinase yang dimediasi TNF-, p38 dan
protein kinase B (Akt). Selain itu, efek anti-inflamasi adiponektin
meliputi penekanan terhadap pembentukan koloni leukosit, mereduksi
aktivitas fagositosis dan mereduksi sekresi TNF- dari makrofag.
Adiponektin juga secara cepat melakukan up-regulasi IL-10 dan
secara selektif meningkatkan ekspresi jaringan penghambat
metalloproteinases-1 pada level mRNA maupun protein, sedangkan
mRNA, kadar protein dan aktivitas MMP-9 tidak berubah pada makrofag
derivat monosit. Hal ini menunjukkan bahwa adiponektin memodulasi
respon inflamasi melalui IL-10 (Mendez-sanchez 2006). Penelitian
Unoki et al (2008) menyimpulkan bahwa makrofag dapat menyebabkan
rangkaian patologis dengan adiposit melalui sekresi
metalloproteinase-3 (MMP-3) diikuti oleh ekspresi TNF- pada
adiposit di jaringan lemak viseral. Adiponektin berpartisipasi pada
angiogenesis melalui kemampuannya untuk menstimulasi sinyal
AMPK-dependent, yang dapat memicu sintesis faktor angiogenik di
otot skeletal dan angiogenesis yang diinduksi hipoksia dan respon
antiapoptotic cellular pada sel endotel (Mendez-sanchez 2006). Hung
et al (2008) berdasarkan hasil penelitiannya menyimpulkan 3 hal
berkaitan dengan kadar adiponektin dalam sirkulasi yaitu :
1. konsentrasi adiponektin plasma berhubungan terbalik dengan
marker-marker inflamasi yang ada di sirkulasi
2. kadar adiponektin plasma berhubungan terbalik dengan skor
resistensi insulin yang tidak bergantung pada obesitas
3. konsentrasi adiponektin yang lebih tinggi berhubungan dengan
menurunnya prevalensi sindrom metabolik, dan hubungan ini tidak
bergantung pada tingkat obesitas, resistensi insulin dan
marker-marker inflamasiHasil penelitian juga menunjukkan tingkat
indeks massa tubuh (BMI) dan rasio pinggang-pinggul, adiposit total
dan viseral berhubungan dengan menurunnya konsentrasi adiponektin
plasma. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian lain yaitu kadar
mRNA adiponektin di jaringan adiposa pada penderita obes lebih
rendah dibandingkan dengan subyek kurus, dan lebih rendah pada
jaringan adiposa viseral dibandingkan dengan subkutaneus (Hung et
al 2008)
2.4.3 Vaspin-1Visceral adipose tissue derived serpin (Vaspin)
diidentifikasi sebagai anggota kelompok serin yang terdapat dalam
jaringan adiposa viseral pada tikus obesitas dengan konsentrasi
insulin plasma meningkat (Hida et al, 2005). Ekspresi vaspin tampak
pada kondisi diabetes yang berat dan penurunan berat badan.
Sedangkan serum vaspin bisa dinormalisasi apabila diberikan
pengobatan insulin atau pioglitazone. Pemberian vaspin pada tikus
obes memperbaiki toleransi glukosa, sensitivitas insulin, dan
perubahan ekspresi gen pada resistensi insulin. Ekspresi mRNA
vaspin dalam jaringan adiposa manusia obesitas adalah lemak tetapi
tidak terdeteksi pada individu kurus yang mengalami glucose
tolerant (Kloting et al, 2006). Induksi mRNA vaspin di jaringan
adiposa manusia merupakan mekanisme kompensasi yang terkait dengan
obesitas, resistensi insulin yang berat, dan diabetes tipe 2
(Kloting et al, 2006; Zvonic et al, 2007). 2.4.4 ChemerinChemerin
(RARRES2 atau TIG2) adalah protein kemoatraktan yang berfungsi
sebagai ligan untuk reseptor protein Gn CMKLR1 (ChemR23 atau DEZ)
dan memiliki peran dalam imunitas adaptif (Roh et al, 2007).
Chemerin disekresikan sebagai protein tidak aktif dengan ukuran
18-kDa dan mengalami pembelahan ekstraseluler serin protease bagian
C-terminal untuk menghasilkan chemerin aktif 16-kDa (Wittamer et
al, 2003; Goralski et al, 2007). Konsentrasi chemerin aktif dalam
plasma dan serum, masing-masing adalah pada manusia 3,0 dan 4,4 nM
dan 0,6 dan pada tikus 0,5 nM (Goralski et al, 2007).Ekspresi
chemerin dan CMKLR1 dalam jaringan adiposa putih dan coklat tikus
berperan dalam proliferasi dan diferensiasi jaringan adiposit
putih. Sedangkan peningkatan ekspresi chemerin dan CMKLR1 dalam
lemak coklat mencit ob/ob dibandingkan dengan kontrol adalah
berperan dalam diferensiasi jaringan adiposa coklat untuk fenotipe
adiposa putih (Bozaoglu et al, 2007; MacDouglad et al, 2007).
Konsentrasi chemerin didapatkan dalam plasma, serum, dan cairan
inflamasi manusia (Bozaoglu et al, 2009). Jumlah sekresi fisiologis
chemerin aktif terjadi pada awal diferensiasi adiposit. Dan
ditemukan CMKLR1 dalam jaringan adiposa tikus dan kultur sel
adipose baik murin maupun manusia. Ekspresi CMKLR1 dan sekresi
chemerin, merupakan autokrin yang berperan dalam pengaturan jalur
mekanisme adipogenesis. Selama 72 jam pertama dari diferensiasi
adipocyte chemerin sudah dapat diketahui. Setelah pemberian factor
diferensiasi seperti IBMX, deksametason, dan insulin selama 24 jam
pada sel 3T3-L1, sel mengalami klonal ekspansi yang terdiri dari
1-2 putaran pembelahan sel (Tan et al, 2009).CMKLR1 memiliki efek
spesifik pada reseptor permukaan yang mempengaruhi diferensiasi
adiposit, ekspresi gen, dan metabolisme. Peningkatan sekresi
adipokines (misalnya leptin, TNF(, dan CCL2) serta asam lemak bebas
merangsang infiltrasi dan aktivasi makrofag dari inflamasi lokal.
Sehingga makrofag melepaskan molekul pro-inflamasi dan terjadi
menganggu sensitifitas adiposity terhadap insulin (Cash et al,
2008). Sel L1.2. dan makrofag tikus mengekspresikan CMKLR1 yang
mengikat chemerin, dan bermigrasi ke ligan (Yoshimura dan
Oppenheim, 2008). Karena itu chemerin berperan sebagai regulator
parakrin untuk mengaktifkan sel imunitas sehingga jaringan adiposa
putih merupakan jaringan yang berperan dalam respon inflamasi lokal
dan berhubungan dalam perkembangan obesitas.Mengingat tingginya
tingkat ekspresi chemerin di adipocytes dan peningkatan sekresi
chemerin dalam maturasi adipocyte, maka adiposa merupakan sumber
sekresi chemerin yang berhubungan dengan perubahan dengan massa
jaringan adiposa. Sehingga dapat menggambarkan terjadinya sistemik
inflamasi chemerin pada fungsi metabolisme dalam jaringan yang
lainnya. Chemerin memiliki peran regulasi adipogenesis dan
metabolisme adipocyte dalam biologi jaringan adiposa. Dengan
demikian, karakterisasi fungsi chemerin dan sinyal CMKLR1 di
adiposit memiliki potensi pendekatan terapi terbaru untuk
pengobatan obesitas, tipe2 diabetes, dan penyakit
kardiovaskuler.
2.4.5 Teknik ImmunohistokimiaImunohistokimia (IHC) adalah teknik
yang menggabungkan anatomi histologi, teknik imunologi dan biokimia
untuk mengidentifikasi komponen jaringan melalui interaksi antigen
dengan antibodi spesifik target ditandai dengan label tertentu. IHC
memungkinkan untuk memvisualisasikan distribusi dan lokalisasi
komponen seluler tertentu dalam sel dan dalam konteks jaringan yang
tepat (Walker dan Rapley, 2005; Westermeier dan Marouga, 2005).
Prinsip dasar immunofluorescence adalah fluorescent untuk melihat
antigen yang terletak di dalam intraseluler sel tertentu (misalnya,
nukleus, organel, sitoplasma, membran) atau di ekstraselular
(Cregger M et al. 2006). Pada teknik ini pengukuran yang akan
dilakukan adalah dengan mengidentifikasi ekspresi adiposopati
seperti leptin, adiponektin, vaspin dan chemerin dengan teknik
Imunohistokimia hampir sama dengan metode Imunositokimia, tetapi
pada imunohistokimia yang dideteksi adalah antigen pada organ yang
telah difiksasi (Hida K. 2005, Goraslki 2007, Sharma 2010).
Prosedur imunohistokimia adalah sebagai berikut (Walker dan Rapley,
2005):
Bahan :
Organ
Slide
Coverglass staining jar
Cover slide
4 % (v/v) paraformaldehid dalam PBS
Alkohol 70%
Alkohol bertingkat (70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%)
Xylol
Parafin
Gliserol
PBS pH 7.4
~ 8 mM Na2HPO4~ 1.4 mM KH2PO4~ 140 mM NaCl
~ 2.7 mM KCl
Adjust pH sampai 7.4 dengan NaOH
0.02% Sodium azida (NaN3) dalam PBS
Aquades
3% H2O2 dalam PBS
1% (v/v) BSA dalam PBS
Antibodi Primer
Antibodi Sekunder (Anti Rabbit IgG Berlabel Biotin)
DAB
Mayers Hematoxilen
Entellan
Alat :
Inkubator 55-63C
Hot plate
Pinset
Pipet tetes
Kotak preparat
Waterbath suhu 95C
Pembuat blok
Mikrotom
Pisau mikrotom
Bunsen
Mikroskop
METODE
Embedding1. Organ direndam dalam larutan fiksatif berupa
Formalin/PFA (1-7 hari).
2. Direndam dalam etanol 70% selama minimal 24 jam, dan
dilanjutkan dengan etanol 80% selama 2 jam. Direndam dalam etanol
90% dan 95% secara berurutan selama masing-masing 30 menit.
Dilanjutkan perendaman sebanyak 3 kali dalam etanol absolut selama
30 menit masing-masing dalam botol yang berbeda.
3. Direndam dalam xylol sebanyak 2 kali masing-masing selama 30
menit.
a. Proses selanjutnya dikerjakan dalam inkubator dengan suhu
56-58(C.
4. Direndam dalam xylol, kemudian ke dalam parafin sebanyak 3
kali.
5. Dilanjutkan dengan embedding dengan mencelupkan organ dalam
parafin cair yang telah dituang dalam wadah. Setelah beberapa saat,
parafin akan memadat dan organ berada dalam blok parafin.
Coating Obyek Gelas1. Obyek gelas (baru) ditandai dengan kikir
dan direndam dalam alkohol 70% selama minimal semalam. Dikeringkan
dan dihindarkan dari debu.
2. Dicelupkan selama 30 detik dalam 0,5 % gelatin hangat yang
dilarutkan dalam aquabides. Gelatin 0,5% sebanyak 100 ml digunakan
untuk 100 obyek gelas. Poly-lisin lebih bagus digunakan dalam
coating daripada gelatin.
3. Dikeringkan dalam ruang tertutup. Obyek gelas dapat digunakan
dalam 2 hari.Pembuatan Preparat Organ1. Organ pada blok parafin
hasil embedding dimasukkan ke penjepit (block holder) mikrotom dan
diatur kesejajaran permukaan potong dengan mata pisau mikrotom.
2. Pemotongan diawali dengan mengatur ketebalan irisan diatas 10
(m untuk mempercepat pencapaian bidang potong jaringan.
3. Organ diiris dengan ukuran 4 (m. Pemotongan yang bagus akan
menghasilkan bentuk potongan seperti pita.
4. Irisan diambil dengan pinset dan dimasukkan air (suhu ruang)
untuk membuka lipatan yang mungkin terjadi pada preparat.
5. Hasil irisan dipindahkan dengan jarum bertangkai ke dalam air
hangat (38-40(C) untuk meluruskan kerutan halus yang ada.
6. Irisan yang terentang sempurna diambil dengan gelas
objek.
7. Potongan terpilih dikeringkan dan diletakkan di atas hotplate
(38-40(C) sampai kering.
8. Preparat disimpan dalam inkubator suhu 38-40(C selama 24
jam.
Deparafinisasi dan Rehidrasi Preparat dicelup dalam xylol
sebanyak 2 kali, alkohol bertingkat (100%, 90%, 80%, 70%, 30%), dan
aquades secara berurutan.
Dicuci dalam PBS pH 7,4 selama 3 x 5 menit. Permeabilisasi
Sel
Cuci sel 1 kali dengan PBS.
Inkubasi sel pada 3% H2O2 dalam PBS selama 10 menit suhu
ruang.
Cuci sel 3 kali dengan PBS.Bloking Sel
Inkubasi sel pada 1% BSA (Bovine Serum Albumin) selama 1 jam
pada suhu ruang.
Cuci 3 kali dengan PBS.Inkubasi Sel pada Antibodi Primer
Encerkan Antibodi primer dalam Goat serum/FBS/BSA hingga
konsentrasi dan volume yang diinginkan (Antibodi leptin 1:500 dalam
Goat serum atau FBS).
Inkubasi sel pada antibodi primer pada suhu 4C selama 12 jam
atau pada suhu ruang selama 2 jam.
Cuci sel dalam PBS selama 3 x 5 menit.Inkubasi Sel pada Antibodi
Sekunder
Encerkan antibodi sekunder berlabel biotin dalam PBS sampai
konsentrasi dan volume yang diinginkan (Anti Rabbit IgG -Biotin1 :
500 dalam PBS)
Inkubasi sel dengan antibodi sekunder selama 1 jam pada suhu
ruang.
Cuci sel pada PBS selama 3 x 5 menit.
Tetesi dengan SA-HRP (Strept avidin horseradish peroxidase)
1:500 dalam PBS selama 40 menit.
Cuci sel dengan PBS selama 3 kali 5 menit.
Tetesi dengan DAB (Diaminobenzidine) selama 10 menit.
Cuci sel dengan aquades 3 x 5 menit.
Lakukan counterstain dengan Mayers hematoxilen selama 10
menit.
Cuci / tetesi dengan air kran
Cuci dengan aquades selama 10 menit. Biarkan pada suhu
kamar.Mounting
Setiap slide diberi label. Satu tetes medium mounting (Entellan)
dijatuhkan ke atas preparat. Cover glass ditutupkan ke atas
preparat yang telah diberi mounting medium.
Visualisasi sel dengan menggunakan mikroskop cahaya
Fiksasi dan Embedding Organ
Pembuatan preparat organ
2.4.6. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Prinsip dasar
ELISA adalah mendeteksi pengikatan antigen (Ag) antibodi (Ab)
dengan menggunakan enzim. Enzim mengubah substrat berwarna
(chromogen) untuk menghasilkan warna, yang mengindikasikan
keberadaan ikatan Ag: Ab. Sebuah ELISA dapat digunakan untuk
mendeteksi keberadaan antigen atau absorbansi dalam sampel,
tergantung pada bagaimana tes dirancang (Walker dan Rapley,
2005).Pengukuran Leptin, Reseptor Leptin, Adiponektin, vaspin dan
chemerin dalam serum darah tikus DIO Melalui Metode Indirect ELISA
(Keller 2005, Goralski 2007, Seeger 2008, Halberg 2009)Penentuan
Kondisi Optimal Tes Pada Uji ELISA
Untuk menciptakan uji fase padat yang non kompetitif, baik kadar
antibodi atau antigen pelapis maupun pengenceran konjugat perlu
ditentukan. Titrasi chequerboard merupakan cara yang paling mudah
untuk dilaksanakan, sebab melalui cara ini tiga tolok ukur dari uji
dapat divariasi secara bersamaan dengan menggunakan aspek-aspek
yang berbeda dari plate (Walker dan Rapley, 2005).Titrasi
chequerboard dilakukan dengan cara sebagai berikut :
Plate untuk ELISA dilapisi secara horisontal pada baris A sampai
H seperti tampak pada gambar 6. Empat macam kadar atau pengenceran
antigen atau antibodi dapat diuji dalam satu seri pemeriksaan,
dimana masing-masing kadar / pengenceran dilakukan duplo
(pengulangan dua kali) ke dalam sepasang baris horisontal dari
plate (A dan B atau C dan D atau E dan F atau G dan H).Sesudah
coating, celah-celah pada sumuran plate diblok dengan protein
non-spesifik seperti BSA, gelatin atau non fat dry milk. Untuk
sampel dipakai satu serum kontrol positif kuat, satu serum kontrol
negatif dan hanya PBS saja.Ketiga jenis kontrol sampel tersebut
dimasukkan secara vertikal ke dalam sumuran plate dalam 4 jalur (
4x3 ) seperti tampak pada gambar 6. Setelah inkubasi dan pencucian
dengan PBS, antibodi konjugat juga ditambahkan secara vertikal
(Walker dan Rapley, 2005).
Gambar 6. Titrasi chequerboard
Pilihan optimal untuk suatu assay yaitu kombinasi Ag dan
konjugat yang memberi :
nilai PBS ............... < 0,05
nilai kontrol negatif < 0,2
nilai kontrol positif > 1,0
Metode ELISA
Antigen (serum) dilarutkan dalam coating buffer (1:50). Antigen
di-coating pada plate ELISA selama semalam pada suhu 4(C. Dicuci
dalam PBS-Tween 3x3 menit. Diblok dengan blocking buffer (BSA 1%
dalam PBS) 50 (l / well. Diinkubasi selama 2 jam suhu ruang. Dicuci
dalam PBS-Tween 3x3 menit (Ma et al, 2006).
Coating antibodi primer (50 (l / well) dengan inkubasi selama 2
jam pada suhu ruang. Dicuci dalam PBS-Tween 3x3 menit. Coating
antibodi sekunder Anti Human IgG AP Conjugated (1:2500) dalam TBS
melalui inkubasi selama 2 jam pada suhu ruang. Dicuci dalam
PBS-Tween 3x3 menit. Ditambahkan substrat pNPP dalam dietanolamin
10% (50 (l / well). Diinkubasi 30 menit, suhu ruang (tidak dicuci,
yang dibaca adalah pNPP yang terikat Ab sekunder). Ditambahkan NaOH
3M (50 (l/ well) sebagai stop reaction. Setelah 15 menit, dibaca
dengan ELISA reader pada =405 nm. Prosedur Metode ELISA (Ma et al,
2006) Siapkan plate ELISA dan plate layout.
Coating Antigen
Antigen (serum) dilarutkan dalam coating buffer (coating Ag 1:
50).
Plate ELISA dibungkus dengan aluminium foil dan diberi
label.
Diinkubasi pada suhu 4(C semalam.
Dicuci dalam PBS-Tween 3 x, @ 3 menit.
Coating Ab primer dalam BSA 1% (50 (l / well)
Diinkubasi selama 1 jam, suhu ruang.
Dicuci dalam PBS-Tween 3 x, @ 3 menit.
Coating Ab sekunder (1:2500) dalam TBS
Ab sekunder yang digunakan : Anti Rabbit IgG AP Conjugated
Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang.
Dicuci dalam PBS-Tween 3 x, @ 3 menit.
Ditambahkan substrat pNPP dalam Dietanolamin 10% (50 (l /
well).
Diinkubasi 30 menit, suhu ruang.
(Tidak dicuci, yang dibaca adalah pNPP yang terikat Ab
sekunder)
Ditambahkan NaOH 3M (50 (l/ well) sebagai stop reaction.
Setelah 10 menit dan 15 menit, dibaca dengan ELISA reader pada
=405 nmKomposisi LarutanTabel 3. Komposisi Larutan pada ELISA
Nama LarutanKomposisi BahanJumlah
Coating buffer
PBS-T
Blocking Buffer
(BSA 1% dalam PBS)
Diethanolamin 10% pH 9,8
PNPP dalam DietanolaminNa2CO3NaHCO3NaN3dd H2O
(cek pH 9,6!)
PBS
Tween-20
BSA
PBS
Dietanolamin
dd H2O
NaN3MgCl2 . 6 H2O
(cek pH 9,8!)
PNPP
Dietanolamin0,159 g
0,293 g
0,02 g
sampai 100 ml
100 ml
50 (l
0,1 g
10 ml
2,425 ml
20 ml
0,005 g
0,0025 g
1 tablet
5 ml
2.4.7. Identifikasi dengan metode Western blott Pengukuran
Leptin, Reseptor Leptin, Adiponektin, vaspin dan chemerin dalam
serum darah tikus DIO Melalui Metode western blot (Goralski 2007,
Bee K 2008, Halberg 2009, Maeeda 2009). Prinsip metode ini adalah
metode analisis sampel protein dimana dielektroforesis pada
SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran nitroselulosa. Protein
ditransfer dideteksi menggunakan antibody pesifik dan sekunder
berlabel enzim dan substrat antibodi. Contoh protein dikenakan
poliakrilamid elektroforesis gel. Setelah ini gel ditempatkan di
atas lembar nitro selulose dan protein dalam gel adalah
elektroforesis ditransfer ke nitro selulosa tersebut. Nitro
selulosa tersebut kemudian direndam dalam buffer blocker (3% skim)
untuk "blok" yang spesifik mengikat protein. Nitro selulosa
tersebut kemudian diinkubasi dengan antibodi spesifik untuk
protein. Nitro selulosa tersebut kemudian diinkubasi dengan
antibodi kedua, yang spesifik untuk pertama antibodi. Metode
Western blot digunakan untuk mengetahui ekspresi parameter
adiposopati pada jaringan setelah diperlakukan dengan perlakuan
(Walker dan Rapley, 2005; Ma, 2006). Metode Western blot adalah
sebagai berikut masing-masing sampel jaringan disuspensi dengan
buffer yang mengandung 20mM TrisHCl, 1mM EDTA dan 0,1 mM PMSF.
Suspensi sel diputar 12.000 rpm selama 5 menit, 4OC kemudian
diputar lagi 15.000 rpm, 1 jam, 4OC Sampel diseparasi dengan 15 %
gel SDS-PAGE. Gel hasil elektroforesis dicuci dengan aquades dan
direndam dalam buffer blotting. Membran NC (nitroselulose)
dipotong, selanjutnya dibasahi dengan PBS selama 10 menit pada suhu
kamar. Membran direndam dalam buffer blotting sebelum dilakukan
proses blotting. Selanjutnya transfer dilakukan selama 12 jam pada
25 Volt pada suhu 4(C. Setelah selesai transfer, membran
di-blocking dalam PBS-T Skim milk 5% selama 1 jam sambil digoyang.
Dicuci 3x5 menit dalam PBS-T. Inkubasi dengan antibodi primer PI3K
yang telah diencerkan dalam PBS-T Skim 5% (1:200) semalam pada suhu
4(C. Dicuci 3x5 menit dengan TBS. Diinkubasi dengan antibodi
sekunder AP Conjugated (1:2500 dalam TBS) selama 1 jam pada suhu
ruang. Dicuci dengan PBS-T selama 4x5 menit. Selanjutnya dideteksi
pita protein atau antigen dengan penambahan substrat Western Blue
(dalam ruang gelap) ke membran selama semalam atau sampai terlihat
warna band. Reaksi dihentikan dengan pencucian membran dalam
akuades (Walker dan Rapley, 2005; Ma, 2006).
2.4.8. Metode FlowcytometeryTeknik flowcytometry digunakan untuk
mengukur prosentase vaspin dan chemerin dalam darah. Flowcytometery
menggunakan prinsip-prinsip hamburan cahaya, eksitasi cahaya, dan
emisi molekul fluorochrome untuk menghasilkan data multi-parameter
khusus dari partikel dan sel-sel dalam kisaran ukuran diameter
0.5um sampai dengan 40um. Sel adalah hydro-dinamis tersuspensi
dalam PBS sebelum menangkap sumber cahaya secara optimal. Laser
yang paling sering digunakan sebagai sumber cahaya di
flowcytometer. Energi ini dirilis sebagai foto dan cahaya dengan
sifat spektral tertentu yang unik untuk setiap fluorochromes. Salah
satu fitur unik dari flowcytometer bahwa pengukuran fluoresensi per
sel atau partikel. Hal ini kontras dengan spektrofotometri dimana
penyerapannya per panjang gelombang (Walker dan Rapley, 2005).Sel
dipanen dan diputar dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit dengan
suhu 4oC. Endapan sel dicuci dengan phosphate buffer saline (PBS)
kemudian dikocok secara perlahan. Cuci sel sampai 2 kali. Endapan
terakhir ditambah dengan 100 L PBS dan ditambah anti-CD146-FITC
(1:100) dan anti-CD45-PE (1:100). Sel diinkubasi dengan antibody
selama 30 menit pada suhu ruang. Sampel diencerkan sampai 1 mL dan
dibaca dengan flowcytometry (FACS Callibur, BD).Alat cytometers
yang modern mampu menganalisis beberapa ribu partikel setiap detik,
saat itu juga. Cara kerja cytometer mirip dengan mikroskop, tetapi
bukan menghasilkan gambar sel melainkan menghasilkan gambar untuk
sejumlah besar sel sesuai parameter ditetapkan secara otomatis
(Canonico, 2010; Masouleh, 2010) . Bahan-bahan yang bisa diperiksa
dengan flow cytometry adalah
1. Darah perifer 2. Aspirasi sumsum tulang3. Cairan
cerebrospinal (CSF)4. Fluida non-CSF,FNA (Fine Needle Aspiration)/
Biopsi Jaringan BAB III
KESIMPULANModel hewan obesitas dapat digunakan untuk mempelajari
penyakit terkait obesitas manusia. Model hewan yang cocok adalah
penting untuk menguji strategi terapi baru terhadap penyakit. Model
tikus obesitas yang sesuai adalah dengan diet induce obesity
melalui pemberian diet tinggi lemak. Tikus model baraitric surgery
dengan metode gastric banding lebih efektif daripada metode lainnya
untuk menurunkan berat badan.Beberapa metode yang dapat digunakan
untuk mengetahui dan mempelajari parameter adiposopati yang akan
diteliti seperti leptin, adiponektin, vaspin dan chemerin dalam
darah memakai metode ELISA, Western blot, Imunohistokimia dan
Flowcytometry. Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa tikus
model obesitas dengan diet tinggi lemak lebih baik dan sesuai
dibandingkan dengan tikus model mutasi
genetik.__________________________________________________________________DAFTAR
PUSTAKA[1]. Ahima RS, Osei SY. Adipokines in obesity. Front Horm
Res 2008. 36:182-97.
[2]. Angela M. Gajda, MS, Michael A. Pellizzon, Ph.D.,Matthew R.
Ricci, Ph.D. and Edward A. Ulman, Ph.D. Diet-Induced Metabolic
Syndrome in Rodent Models Research Diets, Inc. 20 Jules Lane,
NewBrunswick 2007, NJ 08901.[3]. Aills L, Blankenship J, Buffington
C, Furtado M, Parrott J. ASMBS guidelines: ASMBS Allied Health
nutritional guidelines for the surgical weight loss patient. Surg
Obes Relat Dis 2008;4(5 Suppl):S73-108. Epub 2008 May 19.
[4]. Allan M. F., E. J. Eisen, and D. Pomp, The M16 mouse: an
outbred animal model of early onset polygenic obesity and
diabesity, Obesity Research 2004., vol. 12, no. 9, pp.
13971407.
[5]. Arias E, Martnez PR, Ka Ming Li V, Szomstein S, Rosenthal
RJ. Mid-term followup after sleeve gastrectomy as a final approach
for morbid obesity. Obes Surg. 2009.,19(5):544-8. Epub Mar 12.
[6]. Arslan U, Turkoglu S, Balcioglu S, Tavil Y, Karakan T,
Cengel A. Association between nonalcoholic fatty liver disease and
coronary artery disease. Coron Artery Dis. 2007.,18:433 436
[7]. Bays H, Lawrence Blonde and Robert Rosenson. Adiposopathy:
how do diet, exercise and weight loss drug therapies improve
metabolic disease in overweight patients? Expert Review of
Cardiovascular Therapy. 2008.,Vol. 4, No. 6, Pages 871-895
[8]. Brown W. V., K. Fujioka, P. W. Wilson, and K. A. Woodworth,
Obesity: why be concerned? The American Journal of Medicine 2009,
vol. 122, no. 4, pp. S4S11,.
[9]. Buettner R, Parhofer KG, Woenckhaus M, Wrede CE,
Kunz-Schughart LA, Schlmerich J, Bollheimer LC. Defining
high-fat-diet rat models: metabolic and molecular effects of
different fat types. J Mol Endocrinol 2006. 6(3):485-501
[10]. Bult MJ, Thijs Van dan Muller AF. Surgical treatment of
obesity. European Journal of Endocrinology 2008,. 158. 135-145
[11]. Bozaoglu K, Bolton K, McMillan J, Zimmet P, Jowett J,
Collier G, et al. Chemerin is a novel adipokine associated with
obesity and metabolic syndrome. Endocrinology 2007.,
148:4687-94.
[12]. Cash JL, Christian AR, Greaves DR. Chemerin peptides
promote phagocytosis in a ChemR23- and Syk-dependent manner
2010.[13]. Carson JL, Ruddy ME, Duff AE, Holmes NJ, Cody RP, Brolin
RE. The effect of gastric bypass surgery on hypertension in
morbidly obese patients. Arch Intern Med 2004.,154(2):193-200.[14].
Cash JL, Hart R, Russ A, Dixon JP, Colledge WH, Doran J, Hendrick
AG, Carlton MB & Greaves DR. Synthetic chemerinderived peptides
suppress inflammation through ChemR23. Journal of Experimental
Medicine 2008 205 767775.
[15]. Canonico B, Betti M, Luchetti F, Battistelli M, Falcieri
E, Ferri P, Zamai L, Barnett D, Papa S. Flow cytometric profiles,
biomolecular and morphological aspects of transfixed leukocytes and
red cells.Cytometry B Clinical Cytometry 2010., 78(4): 267-78
[16]. Corsonello A, Perticone F, Malara A, De Domenico D, Loddo
S, Buemi M, et al. Leptin-dependent platelet aggregation in
healthy, overweight and obese subjects, Int J Obes 2003.,27:
566-573
[17]. Chatzantoni
References and further reading may be available for this
article. To view references and further reading you must purchase
this article.
[18]. Kokona, Panagiotis Papathanassopoulos, Euthymia
Gourzoulidou, Athanasia Mouzaki. Leptin and its soluble receptor in
plasma of patients suffering from remittingrelapsing multiple
sclerosis (MS): In vitro effects of leptin on type-1 and type-2
cytokine secretion by peripheral blood mononuclear cells, T-cells
and monocytes of MS patients 2004.
[19]. Clee S. M. dan A. D. Attie. The genetic landscape of type
2 diabetes in mice, Endocrine Reviews 2007, vol. 28, no. 1, pp.
4883
[20]. Endo Y, Ohta M, Kai S, et al.: An obese rat model of
bariatric surgery with gastric banding. Obes Surg 2007; 17:
815819.
[21]. Gajda A.M. High fat diet to induce obesity model. Obesity
review 2008.
[22]. Goralski KB, McCarthy TC, Hanniman EA, Zabel BA, Butcher
EC, Parlee SD, et al. Chemerin, a novel adipokine that regulates
adipogenesis and adipocyte metabolism. The J of Biol Chemistry
2007.,282:28175-88
[23]. Gregory B. Lesinski, Sri Vidya Kondadasula, Tim Crespin,
Lei Shen, KariKendra, Michael Walker, William E. Carson III.
Multiparametric Flow Cytometric Analysis of Inter Patient Variation
in STAT1 Phosphorylation FollowingInterferon Alfa Immunotherapy.
Journal of the National Cancer Institute 2004, Vol. 96, No. 17,
September 1
[24]. Grayson BE, Levasseur PR, Williams SM, Smith MS, Marks DL,
Grove KL. Changes in melanocortin expression and inflammatory
pathways in fetal offspring of nonhuman primates fed a high-fat
diet. Endocrinology 2010.151(4):1622-32.
[25]. Guh D. P., W. Zhang, N. Bansback, Z. Amarsi, C. L.
Birmingham, and A. H. Anis, The incidence of co-morbidities related
to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis,
BMC Public Health 2009, vol. 9, article 88,.
[26]. H. Ikeda, A. Shino, T. Matsuo, H. Iwatsuka, and Z.
Suzuoki, A new genetically obese-hyperglycemic rat (Wistar
fatty),Diabetes 1981, vol. 30, no. 12, pp. 10451050,.
[27]. Hung J, McQuillan BM, Thompson PL, Beilby JP. Circulating
adiponectin levels associate with infalmatory markers, insulin
resistance and metabolis syndrome independent of obesity, Int J
Obes 2008.,32:772-779
[28]. Hajer, Gideon R., Timon W. van Haeften, and Frank L.J.
Visseren1. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and
vascular diseases. European Heart Journal 2008. 29, 29592971
[29]. Halberg Nils ,, Todd D. Schraw, Zhao V. Wang, Ja-Young
Kim, James Yi, Mark P. Hamilton, Kate Luby-Phelpsand Philipp E.
Scherer. Systemic Fate of the Adipocyte-Derived Factor Adiponectin.
American Diabetes Association 2009.,[30]. Iizuka S, Suzuki W,
Tabuchi M, Nagata M, Imamura S, Kobayashi Y, Kanitani M, Yanagisawa
T, Kase Y, Takeda S, Aburada M, Takahashi KW. Diabetic
complications in a new animal model (TSOD mouse) of spontaneous
NIDDM with obesity. Exp Anim 2005. 54(1):71-83.
[31]. Iizuka S, W. Suzuki, M. Tabuchi et al., Diabetic
complications in a new animal model (TSOD mouse) of spontaneous
NIDDM with obesity, Experimental Animals 2005, vol. 54, no. 1, pp.
7183,.
[32]. Imai K, N. Kudo, M. Koyama, and Y. Kawashima,. Effects of
dehydroepiandrosterone on oleic acid accumulation in rat liver.
Biochemical Pharmacology 2003, vol. 65, no. 10, pp. 15831591,
[33]. Joost HG. The genetic basis of obesity and type 2
diabetes: lessons from the new zealand obese mouse, a polygenic
model of the metabolic syndrome. Probl Cell Differ 2010.
52:1-11.
[34]. Kanasaki H, dan Daisuke K. Biology of obesity: lessons
from animal model of obesity. Journal of Biomedicine and
Biotechnology 2011.
[35]. Kanno H, Teruo K, Itsuo F, Shunji K, Toshiro Y dan Takashi
T. A rat gastric banding model for bariatric surgery. J Nippon Med
Sch.2008., 75(4).p202-206[36]. Kazuyuki Hida, Jun Wada, Jun Eguchi,
Hong Zhang, Masako Baba, Aya Seida, Izumi Hashimoto, Tatsuo Okada,
Akihiro Yasuhara, Atsuko Nakatsuka, Kenichi Shikata, Shinji Hourai,
Junichiro Futami, Eijiro Watanabe, Yasushi Matsuki, Ryuji
Hiramatsu, Shigeru Akagi, Hirofumi Makino, and Yashpal S. Kanwar.,.
Visceral adiposetissue-derived serine proteaseinhibitor: A unique
insulin sensitizing adipocytokine in obesity Communicated by George
E. Palade, University of California at San Diego 2005., La Jolla,
CA, June 6 (received for review November 24, 2004)[37]. Kempft AM,
Myra LS, Chaoying Li, Harsohena K, Terry TK, Huang. Leptin as a
marker of body fat and hyperinsulinemia in college students, J of
ACH 2006.,55: 175-180
[38]. Keller Pernille, Keller Charlotte, Adam Steensberg,
Lindsay E. Robinson, and Bente K. Pedersen . Leptin gene expression
and systemic levels in healthy men: effect of exercise,
carbohydrate, interleukin-6, and epinephrine. J Appl Physiol 2005.,
98:1805-1812. First published 7 January.
[39]. Kerry B. Goralski, Tanya C. McCarthy, Elyisha A. Hanniman,
Brian A. Zabel, Eugene C. Butcher, Sebastian D. Parlee , Shanmugam
Muruganandan and Christopher J. Sinal. Chemerin, a Novel Adipokine
That Regulates Adipogenesis and Adipocyte Metabolism 2007,.[40].
Kim S, Naima MM. Secretory, endocrine and autocrine/paracrine
function of the adipocyte, J Nutr 2000.,130: 3110S-3115S
[41]. Kodera R, Shikata K, Kataoka HU, Takatsuka T, Miyamoto S,
Sasaki M, Kajitani N, Nishishita S, Sarai K, Hirota D, Sato C,
Ogawa D, Makino H. Glucagon-like peptide-1 receptor agonist
ameliorates renal injury through its anti-inflammatory action
without lowering blood glucose level in a rat model of type 1
diabetes. Diabetologia 2011.
[42]. Kopelman P, Health risks associated with overweight and
obesity, Obesity Reviews 2007,. vol. 8, no. 1, pp. 1317,.[43].
Lustig RH, Sen, Soberman JE, Velasquez-Mieyer,. Obesity, leptin
resistance, and the effects of insulin reduction, Int Jl of Obes
2004.,28: 1344-1348[44]. M. Watanabe, S. M. Houten, C. Mataki et
al., Bile acids induce energy expenditure by promoting
intracellular thyroid[45]. Ma H, Kuan-Jiunn S, Sheau-Long L. Study
of ELISA Technique. Nature and Science 2006, 4(2),p36-37[46]. Ma H.
Western Blotting Method. The Journal of American Science 2006.,
2(2), p:23-27
[47]. Masouleh BM, Baraniskin A, Schmiegel W. Quantification of
circulating endothelial progenitor cells in human peripheral blood:
Establishing a reliable flow cytometry protocol Journal of
Immunological Methods 2010.,357: 38-42
[48]. Maedaa Takehiko, , Norikazu Kiguchia, Yuka Kobayashia,
Toshihiko Ikutaa, Masanobu Ozakib, and Shiroh Kishiokaa. Leptin
derived from adipocytes in injured peripheralnerves facilitates
development of neuropathic painvia macrophage stimulation.
aDepartment of Pharmacology, Wakayama Medical University, Wakayama
641-0012, Japan; and Department of Toxicology, Niigata University
of Pharmacyand Applied Life Science 2009, Niigata 950-2028,
Japan
[49]. Martn-Cordero L, Garca JJ, Hinchado MD, Bote E, Manso R,
Ortega E. Habitual physical exercise improves macrophage IL-6 and
TNF- deregulated release in the obese zucker rat model of the
metabolic syndrome. Neuroimmunomodulation 2011. 18(2):123-30.
[50]. Matsunaga N, Virador V, Santis C. et al., In situ
localization of agouti signal protein in murine skin using
immunohistochemistry with an ASP-specific antibody, Biochemical and
Biophysical Research Communications 2000, vol. 270, no. 1, pp.
176182,.
[51]. Monteiro MP, Monteiro JD, Aguas AP, et al.: A rat model of
restrictive bariatric surgery with gastric banding. Obes Surg 2006;
16: 4851.
[52]. Monteiro MP, Monteiro JD, Aguas AP, et al.: Rats submitted
to gastric banding are leaner and show distinctive feeding
patterns. Obes Surg 2006; 16: 597602.
[53]. Munzberg H, Martin GM. Molecular and anatomical
determinants of central leptin resistance, Nat Neurosci 2005.,8:
566-570[54]. Noguchi Y. N. Nishikata, N. Shikata et al. Ketogenic
essential amino acids modulate lipid synthetic pathways and prevent
hepatic steatosis in mice, PLoS One 2010, vol. 5, no. 8, Article ID
e12057,
[55]. Ohta M, Shiromizu A, Endo Y, et al.: Intragastric balloon
and laparoscopic adjustable gastric banding: treatments for
patients with morbid obesity in Japan (in Japanese). J Jpn Soc
Endosc Surg 2006; 11: 631638
[56]. Okazaki M. Y. Saito, Y. Udaka et al., Diabetic nephropathy
in KK and KK-A mice, Experimental Animals 2002, vol. 51, no. 2, pp.
191196,
[57]. Perusse, L., Chagnon, YC., Weisnagel, J. The human obesity
gene map: the 2000 update, Obes Res 2001.,9:135-169[58]. Prasad SS,
Prashanth A, Kumar CP, Reddy SJ, Giridharan NV, Vajreswari A. A
novel genetically-obese rat model with elevated 11
beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 activity in subcutaneous
adipose tissue. Lipids Health Dis 2010. 17;9:132.
[59]. Roh S, Song SH, Choi KC, Katoh K, Wittamer V, Parmentier
M, et al. Chemerin A new adipokine that modulates adipogenesis via
its own receptor. Biochem and Biophys Research Comm
2007.,362:1013-18.
[60]. Seeger Jeannette, Michaela Ziegelmeier, Anette Bachmann,
Ulrike Lo ssner, Ju rgen Kratzsch,Matthias Blu her, Michael
Stumvoll, and Mathias Fasshauer. Serum Levels of the Adipokine
Vaspin in Relation to Metabolic and Renal Parameters. J Clin
Endocrinol Metab 2008, January, 93(1):247251[61]. Shahab Uddin,
Rong Bu, Maqbool Ahmed, Jehad Abubaker, Fouad Al-Dayel, Prashant
Bavi and Khawla S Al-Kuraya. Overexpression of leptin receptor
predicts an unfavorable outcome in Middle Eastern ovarian cancer
Molecular Cancer 2009.,2, 8:74.
[62]. Sharma D, Wang J, Fu PP, Sharma S, Nagalingam A, Mells J,
Handy J, Page AJ, Cohen C, Anania FA, Saxena NK. Adiponectin
antagonizes the oncogenic actions of leptin in hepatocellular
carcinogenesis. Hepatology. Nov;52(5):1713-22.[63]. Speakman J. C.
Hambly, S. Mitchell, and E. Kr ol. Animal models of obesity.
Obesity Reviews 2007. 8(1). pp. 5561,
[64]. Srinivasan K dan P. Ramarao. Animal models in type 2
diabetes research: an overview, Indian Journal of Medical Research
2007, vol. 125, no. 3, pp. 451472
[65]. Tan BK, Chen J, Farhatullah S, Adya R, Kaur J, et al.
Insulin and metformin regulate circulating and adipose tissue
chemerin. Diabetes 2009., 58(9):19711977.[66]. Tan Bee K., Dennis
Heutling, Jing Chen, S. Farhatullah, Raghu Adya, Stephen D. Keay,1
C. Richard Kennedy, Hendrik Lehnert, and Harpal S. Randeva.
Metformin Decreases the Adipokine Vaspin in Overweight Women With
Polycystic Ovary Syndrome Concomitant With Improvement in Insulin
Sensitivity and a Decrease in Insulin Resistance. Diabetes 2008,
vol. 57, june .
[67]. Trevaskis J, Walder K, Foletta V, Kerr-Bayles L, McMillan
J, Cooper A, Lee S, Bolton K, Prior M, Fahey R, Whitecross K,
Morton GJ, Schwartz MW, Collier GR. Src homology 3-domain growth
factor receptor-bound 2-like (endophilin) interacting protein 1, a
novel neuronal protein that regulates energy balance.
Endocrinology. 146(9):3757-64.
[68]. Vivian Berg1 , Baldur Sveinbjrnsson 2,3 , Signy Bendiksen4
, Jan Brox1,5 , Khaled Meknas6 and Yngve Figenschau1,5,. Human
articular chondrocytes express ChemR23 and chemerin; ChemR23
promotes inflammatory signalling upon binding the ligand
chemerin21-157, Arthritis Research & Therapy 2010, 12:R228.
[69]. Walker J.M dan Rapley Ralph. Medical biomethods handbook.
Humana Press. Toronto 2005.[70]. Westermeier R, Marouga R. Protein
detection methods in proteomics research. Biosci Rep 2005.
25(1-2):19-32[71]. World Health Organization, Fact sheet: Obesity
and overweight, http://www.who.int/hpr/gs.fs.obesity.shtml.
[72]. Yoshimura T & Oppenheim JJ. Chemerin reveals its
chimeric nature. Journal of Experimental Medicine 2008.,205
21872190.
[73]. Yuka Onoa, Eri Hattori a, Yukitaka Fukaya a, Shoji Imai a,
Yasushi Ohizumi b,. Anti-obesity effect of Nelumbo nucifera leaves
extract in mice and rats. Journal of Ethnopharmacology 2006., 106 ,
238244[74]. Zhang Y., K. Guo, R. E. LeBlanc, D. Loh, G. J.
Schwartz, and Y. H. Yu,. Increasing dietary leucine intake educes
diet-induced obesity and improves glucose and cholesterol
metabolism in mice via multimechanisms, Diabetes 2007. vol. 56, no.
6, pp. 16471654,
Gambar 2. Fotomikrograf jaringan paru janin gorilla pada fase
akhir gestasi yang menunjukkan : (A) Pengecatan hematoxylin-eosin,
(B) surfac tant protein A , (C) LEP receptor protein pada pulmo
nary epithelial cells. Kontrol negative imunohistokimia (tanpa
antibodi primer) reseptor LEP (D). Tanda panah menunjukkan
pulmonary type II cells ( Henson et al. 2004)
Gambar 3. Densitas reseptor leptin pada jaringan lemak (kelompok
kontrol)
Gambar 4. Densitas Reseptor Leptin (restricted diet 40%
group)
Organ
Direndam dalam paraformaldehida (PFA) 4% dalam PBS, suhu 4 C
selama 1-7 hari
Xylol, 30 menit, 60-63(C
Parafin 3x30 menit (56-58(C)
Dehidrasi etanol bertingkat
(Ethanol 70% 24 jam; 80% 2 jam; 90% 20 menit; 95% 20 menit;
etanol absolut 3x20 menit), suhu ruang
Xylol , suhu ruang, 2 x 30 menit
EMBEDDING
(Organ dimasukkan dan ditata posisinya dalam parafin hangat
dalam blok hingga mendingin, bagian organ yg akan diiris menghadap
bawah)
Blok parafin disimpan pada 4 C
Irisan dipindah ke air hangat (38-40(C)
Diambil dengan gelas objek
Dikeringkan diatas hot plate (38-40(C)
Preparat disimpan di suhu 38-40(C, 24 jam
Organ diiris ukuran 4 (m
Organ dalam blok parafin
Preparat Organ
(yg masih mengandung parafin)
Dicuci PBS pH 7,4
5 menit, 3 x
Dicuci PBS pH 7,4
5 menit, 3 x
Dicuci PBS pH 7,4
5 menit, 3 x
3% hidrogen peroksida (dalam DI water), 20 menit
DEPARAFINISASI & REHIDRASI
Dimasukkan dalam Xylol I, Xylol II, Alkohol bertingkat (100%,
90%, 80%, 70%), Aquadest, @ 3-5 menit
1% NGS atau BSA dalam PBS, 30 menit, suhu ruang
Dicuci PBS pH 7,4
5 menit, 3 x
Dicuci aquades
5 menit, 3 x
Dicuci air kran
5 menit, 3 x
Dicuci PBS pH 7,4
5 menit, 3 x
Counterstain (Hematoxilen), 2 menit, suhu ruang
Cromogen DAB (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride), 10- 20
menit, suhu ruang
SA-HRP (Sterp Avidin- Hoseradish Peroxidase), 30-60 menit, suhu
ruang
Antibodi Sekunder berlabel biotin
(Anti Rabbit IgG BiotinLabelled), 1 jam suhu ruang
Pengamatan dengan mikroskop
Mounting dengan Entellan
Dicuci PBS pH 7,4
5 menit, 3 x
Antibodi Primer (Rabbit Anti Human Leptin) semalam, suhu dingin
4(C
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ag pelapis
Pengenceran 1
Pengenceran 2
Pengenceran 3
Pengenceran 4
Pengenceran 1
Pengenceran 2
Pengenceran 3
Pengenceran 4
Ab konjugat
+ -PBS+ -PBS+ -PBS+ -PBS
Sampel Pengenceran 1: 100