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Mémoire
Pour l’obtention du DIPLOME DE MAGISTER EN GESTION DES RESSOURCES
AQUATIQUES Laboratoire d’Aquaculture et de Bioremédiation (AQUABIOR)
Présenté par :
Melle. BENDADECHE Faiza
Intitulé
Devant le jury :
Président : M. BENSAHLA-TALET Ahmed Professeur à l’université d’Oran
Examinateur : M. ABI AYAD S.-M. El-amine Professeur à l’université d’Oran
Examinateur : M. TALEB Mohamed Zoheïr M.C.A. à l’université d’Oran
Promoteur : M. BABA HAMED Mohamed Bey Professeur à l’université d’Oran
Soutenu publiquement le : 25 - 09 - 2012
Empreinte protéique et génétique d’espèces de poissons de
consommation: Approches analytiques.
Année universitaire : 2011 - 2012
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Remerciement
Je voudrais exprimer toute ma gratitude aux personnes qui ont permis l’aboutissement
de ce travail. Je tiens ainsi à témoigner toute ma reconnaissance et ma gratitude aux personnes
ayant accepté de faire partie du jury d’évaluation de ce mémoire.
Un témoignage de ma profonde reconnaissance s’adresse à M. BENSAHLA-TALET
A., professeur à l’université d’Oran, pour avoir bien voulu présider le jury de soutenance.
Je remercie grandement M. ABI AYAD S-M-EL-amine, Professeur à l’université
d’Oran au département de biotechnologie, pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et
de m’avoir permis de réaliser ce mémoire…ses nombreux conseils et discussions brigués au
long de ces années, sa disponibilité et ses encouragements, et la grande autonomie
d’expression et d’action qu’il m’a données.
Je tiens à remercier sincèrement M. TALEB M.Z., Maître de conférences à
l’université d’Oran, de m’avoir fait l’honneur d’examiner ce travail, et pour son enseignement
et ses qualités aussi bien humaines que scientifiques.
Un remerciement particulier s’adresse à mon promoteur M. BABA HAMED M. B.,
Professeur à l’université d’Oran au département de biotechnologie, pour son encadrement de
la première heure et ses précieux conseils. Je le remercie pour la confiance qu’il m’a attribuée,
son soutien, sa patience et bonne humeur, et ses connaissances qu’il a partagées avec moi,
qu’il trouve ici l’expression de ma profonde gratitude.
Je remercie également M. ALI-MEHIDI S., Maître de conférences à l’université
d’Oran, pour ses conseils scientifiques avisés, ses remarques percutantes qui m’ont permis
d’avancer dans mon travail.
Un remerciement le plus sincère aussi, revient à mes enseignants pendant toute cette
formation, qu’étaient disponibles à m’éclaircir toute question, M. BOUTIBA, M. LAMARA
C.S., Mme. BOUKORTT F., Melle
DALOUCHE F., Mme. BOUKHATEM F., Mme
LACHICHI, … qu’ils trouvent ici l’expression de ma profonde gratitude.
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J’adresse également mes remerciements les plus chaleureux à tous les membres de
l’équipe «AQUABIOR», qui m’ont permis d’évoluer dans une ambiance conviviale. Merci pour
leur aide, leurs conseils, suggestions et encouragements dans l’élaboration de ce mémoire.
Un remerciement particulier est accordé à M. Hassain O., qui n’a cessé de me faire
bénéficier de ses orientations et ses précieux conseils, merci pour son aide, suggestions et
encouragements dans l’élaboration de ce mémoire.
Je voudrais remercier également, Mme Hatab K., Melle
Amrani A. et Mme
LACHEHEB F. pour leur sollicitation tant intellectuelle qu’amicale. Je remercie également
tout le personnel du Département de Biotechnologie d’Oran.
Enfin, tout ce travail n’aurait pu voir le jour sans les encouragements, l’aide et le
soutien inconditionnel de ma famille et mes fidèles amis. Merci de m’avoir accompagné,
soutenu et essayé de comprendre mes travaux. Un immense merci à mon père, ma mère et
mes frères et sœurs...
Merci pour votre confiance, votre gentillesse et votre compréhension…
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A mes parents
A ma famille
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« L’animal est sauvé par son ignorance,
l’Ange est sauvé par sa connaissance,
entre les deux l’Homme reste le litige »
Jalal Dine Rumi, Poète Soufi, XIII siècle
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Résumé
Le contrôle de qualité des produits de la mer est souvent limité à l’aspect
microbiologique. Commercialisés sous différentes formes, entiers, en filets, frais, congelés ou
en conserves, la nature même des poissons prête souvent à confusion, et fait l’objet de
fraudes.
Notre étude porte sur l’identification d’espèces de poissons à partir de pièces entières ou
de fragment musculaire.
Ainsi, l’aspect des otolithes est étudié en tant que support d’identification de différentes
espèces de poissons.
L’étude biochimique de l’empreinte protéique permet de mettre en évidence des
empreintes protéiques caractéristiques et d’établir la relation phylogénique entre des espèces
de poissons.
L’étude moléculaire, par l’extraction de l’ADN et l’amplification de fragment de gène
spécifique aux espèces, reste le moyen le plus simple et le plus précis, nous permettant une
meilleur identification d’espèces de poissons.
Mot-clés : Identification des espèces, empreinte protéique, PAGE-SDS, Clupéidés,
Scombridés, engraulidés, gène Cytochrome b, PCR, otolithes, phylogénie.
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Summary
The seafood quality control is usually limited to microbiological aspect. Manufactured
under different forms: fresh, frozen or canned, the nature of fish is often confused and also
subject to frauds.
Our study focuses on fish species identification on the basis of anatomic part muscle
fragment analysis.
Thus, the otolith shape is studied as method for identification of different fish species.
The biochemical study of protein pattern can highlight protein fingerprints characteristic
and establish the phylogenic relationship between fish species.
Molecular analysis by DNA extraction and amplification of a specific specie gene
fragment remains the easiest and most precise way, allowing a better identification of fish
species.
Keywords: Species identification, protein fingerprint, SDS-PAGE, Clupeidae,
Scombridae, phylogeny, Cytochrome b gene, PCR, otoliths.
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الملخص
هذ تسىك . يزالبت خىدة انتىخبث انبحزت يحذودة عهى اندبب انكىبىنىخغبنبب يب تكى
انتىخبث ف أشكبل يختهفت، طبسخت، يدذة، عهى شكم شزائح أو يعهبت، دعههب ف كثز ي األحب
.نهذا فأ يعزفت ىع األسبن انسىلت أيز خذ هبو ف إطبر يزالبت اندىدة .و انغش يىضىع االحتبل
.عضهانسح ان شء يتتزكش دراستب عهى تحذذ أىاع األسبن اطاللب ي أخشاء تشزحت أو خ
.ع األسبن انختهفتى دعب نتحذذ كىسهت األخشاء انتشزحتو تصى شكم دراست تى
انش ألىاعو خبصتك انذراست انبىكبئت نهبصت انبزوتت ي تسهظ انضىء عهى انبزوت
.األسبناع يختهفت ي األسبن،و كذا يعزفت انزابظ انفهىخ ب أى
انتحهم اندشئ ببستخزاج انحض انىوي ويضبعفت خشء خ يع و خبص بمى أسهم وأدق وسهت،
.األسبن ىعيب سح نب ببنتعزف بشكم أفضم عهى
انستىكزوو اند انبزوتت، سبن، انبصت ألىع ا تحذذ :الكلمات المقتاحية
otolithes
،PAGE-SDS ،b
، PCR .Otolithes
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Liste des abréviations
ADNmt
An
AQUABIOR
ARNm
BSA
CICTA
dNTP
DO
EDTA
Es
F.A.O.
Fr
IEF
J
KDa
M
MHC
ml
MLC
nm
PAGE
pb
PCR
Acide désoxyribonucléique mitochondrial.
Anglais.
Laboratoire d’Aquaculture et de Bioremédiation.
Acide ribonucléique messager.
Albumine de sérum bovin.
Commission internationale pour la conservation des thonidés de l’Atlantique.
Désoxyribonucléotides tri-phosphate.
Densité optique
Acide éthylène diamine tétra-acétique.
Espagnol.
Food and agriculture organization.
Français.
Iso-électro-focalisation.
Jour.
Kilo Dalton.
Molaire.
Myosin Heavy Chain.
millilitre
Myosin Light Chain.
Nanomètre.
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
Paire de bases.
Réaction de polymérisation en chaîne.
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PM
qsp
Rf
SDS
TBE
TEMED
WSP
Poids moléculaire.
Quantité suffisante pour.
Rapport frontal.
Sodium dodécyl sulfate.
Tampon Tris-Borate-EDTA.
N, N, N', N'-tétramethyl-éthylène-diamine.
Water soluble protein.
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LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Production mondiale des pêches de capture et de l’aquaculture………........ 3
Figure 2 : Evolution de la production halieutique en Algérie…………………………. 4
Figure 3 : Evolution annuelle des exportations et importation du poisson en Algérie
entre 2000 – 2009…………………………………………………………. 5
Figure 4 : Total des captures de thon rouge officiellement déclarées à la CICTA entre
1950 et 2007………………………………………………………………... 6
Figure 5 : Evolution des captures par groupes d’espèces les plus prisées…………….. 7
Figure 6 : Thon rouge Thunnus thynnus (Linné, 1758)……………………………...... 8
Figure 7 : Les pinnules jaunes du thon rouge Thunnus thynnus………………………. 10
Figure 8 : Thonine commune Euthynnus alletteratus (Rafinesque, 1810)…………..... 11
Figure 9 : Auxide Auxis rochei (Risso, 1810)…………………………………………. 13
Figure 10 : Maquereau espagnol Scomber japonicus (Houttuyn, 1780)……………....... 15
Figure 11 : Sardine commune Sardina pilchardus (Walbaum, 1792)………………….. 17
Figure 12 : Anchois commun Engraulis encrasicolus (Linné 1758)…………................ 18
Figure 13 : Sardinelle ronde Sardinella aurita (Valenciennes, 1847)………………….. 20
Figure 14 : Emplacement de l’otolithe sagitta………………………………………….. 22
Figure 15 : Carte du génome mitochondrial des Poissons……………………………… 27
Figure 16 : Positions du cytochrome b et de la région de contrôle dans le génome
mitochondrial et représentation schématique de leurs variabilités…………. 28
Figure 17 : Thon rouge (Thunnus Thynnus)…………………………………………….. 29
Figure 18 : Auxide (Auxis rochei)………………………………………………………. 30
Figure 19 : Thonine commune (Euthynnus alletteratus)……………………………….. 30
Figure 20 : Maquereau espagnol (Scomber japonicus)…………………………………. 30
Figure 21 : Sardinelle ronde (Sardinella aurita)……………………………………....... 31
Page 12
Figure 22 : Sardine commune (Sardina pilchardus)……………………………………. 31
Figure 23 : Anchois commun (Engraulis encrasicolus)……………………………....... 31
Figure 24 : Prélèvement des otolithes sagittae………………………………………….. 32
Figure 25 : Mode de prélèvement de l’échantillon musculaire…………………………. 33
Figure 26 : Principe de l’amplification en chaine par polymérase (PCR)………………. 38
Figure 27 : Otolithes sagittae observées au microscope optique grossissement (X4):
(A) Scomber japonicus, (B) Sardinella aurita, (C) Sardina pilchardus,
(D) Engraulis encrasicolus, (E) Auxis rochei, (F) Euthynnus alletteratus… 43
Figure 28 : Otolithes sagittae observées à la loupe binoculaire: (a) Sardinella aurita,
(b) Scomber japonicus, (c) Engraulis encrasicolus, (d) Sardina pilchardus,
(f) Auxis rochei, (e) Euthynnus alletteratus……………………………….. 44
Figure 29 : Courbe étalon des protéines……………………………………………........ 45
Figure 30 : Coubre étalon des protéines standards pour l’analyse en PAGE-SDS…....... 46
Figure 31 : Profils électrophorétiques des protéines musculaires solubles totales en
PAGE-SDS à 12 %, (1) Sardinella aurita ; (2) Sardina pilchardus ;
(3) Engraulis encrasicolus ; (4) Scomber japonicus ; (5) Auxis rochei ;
(6) Thunnus thynnus ; (7) Euthynnus alletteratus ; MT : marqueur (250 -
10 KDa) (Biolabs) ; MHC: chaine lourde de myosine ; MHC : chine légère
de myosine…………………………………………………………………. 47
Figure 32 : Profils électrophorétiques des protéines musculaires solubles totales en
PAGE-SDS à 15%, (1) Sardinella aurita ; (2) Sardina pilchardus ;
(3) Engraulis encrasicolus ; (4) Scomber japonicus ; (5) Auxis rochei ;
(6) Thunnus thynnus ; (7) Euthynnus alletteratus ; MT : Protéines
marqueur (250-10 KDa) (Biolabs) ; MHC: chaine lourde de myosine ;
MHC : chine légère de myosine……………………………………………. 48
Figure 33 : Analyse densitométrique du pattern protéique de Scomber japonicus……... 49
Figure 34 : Analyse densitométrique des patterns protéiques: (1) Euthynnus
alletteratus, (2) Thunnus thynnus et (3) Auxis rochei……………………… 50
Figure 35 : Analyse densitométrique des patterns protéiques: (5) Engraulis
encrasicolus, (6) Sardina pilchardus et (7) Sardinella aurita……………. 51
Page 13
Figure 36 : Dendogramme représentant la relation phylogénique obtenue en se basant
sur les différences et les ressemblances dans les patterns
électrophorétiques…………………………………………………………..
54
Figure 37 : Electrophorèse sur gel d’agarose d’ADN génomique à 0,8%. (1, 2, 7, 8, 9,
10) : Thon rouge (Thunnus thynnus) ; (3, 4) : Auxide (Auxis rochei) ;
(5, 6) : Thonine (Euthynnus alletteratus) ; (11) : Conserve de thon C1 ;
(12) : Conserve de thon C2………………………………………………… 56
Figure 38 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2 % des produits de PCR, les amorces
utilisés (Cb146L/ Cb146H), (MT) marqueur de taille de 3000-50 pb
(Sigma-Aldrich) ; (1) Thon rouge (Thunnus thynnus) ; (2) Thon rouge
(Thunnus thynnus) traité thermiquement ; (4) Thonine (Euthynnus
alletteratus) ; (3) Auxide (Auxis rochei) ; (5) Conserve de thon C1 ;
(6) Conserve de thon C2…………………………………………………..... 57
Page 14
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Protéines musculaires caractérisées par ordre de taille décroissante……….... 25
Tableau 2 : Poids et longueurs totaux des poissons étudiés………………………………. 29
Tableau 3 : Composition des gels de polyacrylamide…………………………………….. 35
Tableau 4 : Nombres de bandes protéiques obtenues par l’électrophorèse en SDS-PAGE,
selon les zones de migration………………………………………………….. 49
Page 15
SOMMAIRE
INTRODUCTION…………………………………………………………………… 1
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE…………………………………………………….. 3
1. Généralités…………………………………………………………………….. 3
1.1. Situation mondiale de la pêche et de l’aquaculture……………………… 3
1.2. Statistique de pêche des poissons non identifiés………………………… 4
1.3. Activité halieutique en Algérie………………………………………….. 4
1.3.1. Ressources halieutiques de l’Algérie…………………………... 4
1.3.2. La production de pêche en Algérie…………………………….. 4
1.3.3. Importation du poisson en l’Algérie…………………………… 5
1.4. Valeur économique des scombridés……………………………………... 5
1.4.1. Valeur économique et marché mondial du thon rouge……….... 5
1.4.2. Pêche mondiale du thon rouge…………………………………. 6
1.5. Utilisation et transformation du poisson………………………………… 7
2. Présentation des espèces étudiées……………………………………………. 8
2.1. Thon rouge : Thunnus thynnus (Linné, 1758)………………………........ 8
2.1.1. Position systématique………………………………………….. 8
2.1.2. Biologie du thon rouge…………………………………………. 9
2.1.3. Caractères distinctifs………………………………………….... 9
2.1.4. Coloration……………………………………………………… 10
2.1.5. Régime alimentaire du thon……………………………………. 10
2.1.6. Migration……………………………………………………….. 10
2.2. Thonine commune : Euthynnus alletteratus (Rafinesque, 1810)………. 11
2.2.1. Position systématique………………………………………….. 11
2.2.2. Biologie de la thonine commune………………………………. 11
2.2.3. Caractères distinctifs…………………………………………… 12
2.2.4. Coloration……………………………………………………… 12
2.2.5. Distribution géographique et habitat…………………………… 12
2.3. Auxide : Auxis rochei (Risso, 1810)…………………………………… 13
2.3.1. Position systématique…………………………………………... 13
2.3.2. Biologie de l’auxide…………………………………………… 13
Page 16
2.3.3. Caractères distinctifs…………………………………………… 14
2.3.4. Coloration……………………………………………………… 14
2.3.5. Distribution géographique et habitat…………………………… 14
2.4. Maquereau espagnol : Scomber japonicus (Houttuyn, 1780)…………... 15
2.4.2. Biologie du maquereau espagnol………………………………. 15
2.4.3. Caractère distinctif…………………………………………….. 15
2.4.4. Coloration………………………………………………………. 16
2.4.5. Distribution géographique et habitat…………………………… 16
2.5. La sardine commune : Sardina pilchardus (Walbaum, 1792)………….. 16
2.5.1. Position systématique…………………………………………... 16
2.5.2. Biologie de la sardine commune……………………………….. 17
2.5.3. Coloration………………………………………………………. 18
2.5.4. Distribution géographique et migration………………………... 18
2.6. L’anchois commun : Engraulis encrasicolus (Linné, 1758)…………… 18
2.6.1. Position systématique…………………………………………... 18
2.6.2. Biologie de l’anchois commun………………………………… 19
2.6.3. Description et caractères distinctifs……………………………. 19
2.6.4. Coloration……………………………………………………… 19
2.6.5. Localisation et répartition géographique……………………….. 19
2.7. La sardinelle ronde : Sardinella aurita (Valenciennes, 1847)………….. 20
2.7.1. Position systématique…………………………………………... 20
2.7.2. Biologie de la sardinelle ronde…………………………………. 20
2.7.3. Description et caractère distinctifs……………………………... 20
2.7.4. Coloration……………………………………………………… 21
2.7.5. Distribution géographique……………………………………… 21
3. Les otolithes…………………………………………………………………… 21
3.1. Utilisation des otolithes…………………………………………………. 21
3.1.1. Reconnaissance et classification des espèces par les otolithes… 22
3.1.2. Utilisation de la forme des otolithes dans l’étude du régime
alimentaire……………………………………………………… 23
4. Le muscle……………………………………………………………………… 23
4.1. Choix de l’étude des protéines…………………………………………. 23
4.2. Protéines musculaires…………………………………………………... 24
Page 17
4.2.1. Les protéines sarcoplasmiques…………………………………. 24
4.2.2. Les protéines myofibrillaires…………………………………... 24
4.3. Utilisation des techniques électrophorétiques dans les études de la
taxonomie et l’identification des espèces………………………………... 26
5. L’ADN………………………………………………………………………… 26
5.1. L’ADN mitochondrial………………………………………………… 26
5.2. Gene cytochrome b………………………………………………............ 28
MATERIEL ET METHODES……………………………………………………… 29
1. Matériel biologique…………………………………………………………… 29
2. Etude des pièces anatomiques: Les otolithes………………………………... 32
2.1. Prélèvement des otolithes………………………………………………... 32
2.2. Observation des otolithes………………………………………………... 32
3. Etudes des protéines musculaires……………………………………………. 33
3.1. Préparation des échantillons musculaires………………………………... 33
3.2. Obtention de l’extrait brute protéique…………………………………… 33
3.3. Dosage des protéines…………………………………………………….. 33
3.4. Etude électrophorétiques………………………………………………… 34
3.4.1. Préparation des échantillons protéiques ……………………….. 34
3.4.2. Migration des protéines………………………………………… 34
3.4.3. Coloration du gel et révélation des bandes protéiques…………. 35
3.4.4. Détermination du Poids Moléculaire des bandes protéiques…... 35
4. Etude du pattern moléculaire………………………………………………... 36
4.1. Extraction de l’ADN total………………………………………………. 36
4.2. Contrôle de pureté de l’extrait d’ADN…………………………………. 36
4.3. Dosage de l’ADN extrait………………………………………………... 37
4.4. Etude par PCR…………………………………………………………... 37
4.5. Electrophorèse sur gel d’agarose………………………………………... 39
5. Analyse des patterns protéiques……………………………………………... 40
5.1. Analyse statistique……………………………………………………… 40
5.2. Analyse densitométrique………………………………………………... 40
RESULTATS ET DISCUSSION……………………………………………………. 41
1. Etude des otolithes……………………………………………………………. 41
Page 18
2. Etude biochimique……………………………………………………………. 45
2.1. Analyse des patterns protéiques…………………………………………... 46
2.2. Analyse des liens phylogéniques…………………………………………. 53
3. Etude moléculaire…………………………………………………………….. 55
CONCLUSION .…………………...…………………………………………………. 58
REFERENCES BIBLIOGHRAPHIQUES………………………………………… 59
Page 20
Introduction
1
La qualité d’un produit alimentaire est souvent liée à son état microbiologique,
physicochimique ou organoleptique. Les poissons présentés sous différentes formes, en filets,
congelés, ou en conserve peuvent faire l’objet de tricherie de par les ressemblances entre les
différentes espèces. Ainsi, une espèce de moindre valeur marchande peut remplacer une autre
de haute valeur marchande.
En effet, il est important de pouvoir assurer la traçabilité de tels produits sachant qu’à
l’échelle internationale, 21 espèces différentes peuvent être commercialisées sous
l’appellation «Sardine». La diagnose moléculaire permet à l’heure actuelle de discriminer à
coup sûr l’espèce Sardina pilchardus des sardinops, sardinelles, sprats, harengs et anchois
constituant la majorité des espèces considérées de type « sardine » (Ifremer, 2003).
Des études anatomiques simples peuvent résoudre ce problème, telle que l’étude des
otolithes, sachant que l’aspect de ces pièces anatomiques est spécifique à chaque espèce
(Tusert et al., 2008), mais ce moyen d’identification est valable uniquement pour les poissons
entiers. Par contre, le plus souvent, les poissons de consommation sont sous forme de filets ou
en conserves et sont dépourvus d’otolithes.
Les protéines, molécules organiques les plus abondantes dans les cellules, jouent un rôle
fondamental dans l'établissement de la structure et dans le fonctionnement cellulaire. Leur
rôle dans l'expression de l'information génétique a probablement induit les travaux visant à
lier composition protéique et taxonomie. Sur ce plan et chez les poissons, les protéines
musculaires se sont révélées être douées d'une forte spécificité, tout particulièrement la
fraction sarcoplasmique soluble dans l'eau et dans les solutions de faible force ionique. Cette
fraction protéique, encore appelée myogène, représente 20 à 30% de l'ensemble des protéines
musculaires, elle est formée par la myoglobine et par plus d'une centaine d'enzymes (Durand
et al., 1985).
L’étude biochimique du pattern protéique s’avère une méthode d’identification des
espèces de poisson, mais la dénaturation thermique et chimique de ces protéines du fait de la
préparation de différentes conserves reste un facteur limitant.
L’étude moléculaire serait, de ce fait, la méthode la plus adéquate et la plus précise de
par l’empreinte génétique spécifique, résistante aux différents traitements physico-chimiques
utilisés lors de la préparation industrielle.
Page 21
Introduction
2
Lors de ce travail, nous nous somme attelés à utiliser ces méthodes pour l’identification
d’espèces de poissons de consommation :
L’étude des otolithes est réalisée sur différentes espèces de poissons à savoir
la sardinelle ronde Sardinella aurita et la sardine commune Sardina pilchardus
de famille des clupéidés, l’anchois commun Engraulis encrasicolus de la famille
des engraulidés, et le thon rouge Thunnus thynnus, la thonine commune
Euthynnus alletteratus, l’auxide Auxis rochei et le maquereau espagnol Scomber
japonicus de la famille des scombridés.
L’étude de l’empreinte protéique est réalisée pour l’identification de ces mêmes
espèces.
L’étude moléculaire a porté sur l’identification du thon rouge par un fragment du
gène mitochondrial cytochrome b (146 pb), et la vérification de la
thermorésistance de ce fragment, afin d’identifier les conserves dites de thon.
.
Page 22
ETUDE
BIBLIOGRAPHIQUE
Page 23
Etude bibliographique
3
1. Généralités
La composition particulière de la chair de poisson, sa richesse en protéines hautement
digestibles, en minéraux notamment en phosphore et en iode, en vitamines, en particulier la
vitamine D, et en acides gras polyinsaturés de la série (n-3), tels que l’acide
eicosapentaénoïque (EPA) et l’acide docohexaénoïque (DHA), en fait un aliment aux
caractéristiques nutritionnelles uniques parmi les produits d'origine animale (Kolditz, 2008).
En 2007, le poisson fournissait au niveau mondial 15,7 % de toutes les protéines
d’origine animale, et 6,1 % de l’ensemble des protéines. Il fournit à plus de 1,5 milliard
d’habitants de la planète près de 20 % de leur consommation de protéines animales, et à 3
milliards de personnes 15 % de ces mêmes protéines. Lorsqu’on établit la moyenne mondiale,
la contribution du poisson à l’apport calorique est relativement faible, soit 30,5 calories par
habitant et par jour F.A.O., 2010).
1.1. Situation mondiale de la pêche et de l’aquaculture
Les pêches de capture et l’aquaculture ont produit en 2010 environ 148 millions de
tonnes de poissons (Fig. 1), dont 128 million de tonnes étaient destinées à la consommation
humaine, soit une offre apparente par habitant de 18,6 kg de poisson (F.A.O., 2012).
Les petits pélagiques ont une grande importance socioéconomique dans le monde, leurs
captures représentent environ 40 % des prises mondiales de poissons (FAO, 2006).
Figure 1 : Production mondiale des pêches de capture et de l’aquaculture (F.A.O., 2012).
Millions de tonnes
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1950 1955 1960 1965 1970 1975 19 80 1985 1990 1995 2000 2005 2010
Production d’aquaculture
Production de capture
Page 24
Etude bibliographique
4
1.2. Statistique de pêche des poissons non identifiés
Le problème d’identification des espèces de poissons survient souvent. En effet, en
2008, dans l’océan Indien, précisément dans la baie du Bengale et en mer d’Andaman, un
pourcentage très élevé de captures (environ 42 %) est classé dans la catégorie de «poissons de
mer non identifiés», ce qui est préoccupant vu la nécessité de surveiller l’état et les tendances
des stocks (F.A.O., 2010).
1.3. Activité halieutique en Algérie
1.3.1. Ressources halieutiques de l’Algérie
Du point de vue richesse biologique, la marge continentale de l’Algérie recèle des
ressources halieutiques non négligeables, en particulier, ses ressources pélagiques estimées à
191468 tonnes lors de la campagne acoustique réalisée par le navire océanographique
«THALASSA» au mois d’octobre 1982 (ISTPM, 1982), et 187000 tonnes sont estimés lors de
la campagne acoustique effectuée en février 2003, réalisée par le navire océanographique
Espagnol VIZCONDE DE EZA (MPRH, 2004).
1.3.2. La production de pêche en Algérie
La flottille de pêche nationale arrêtée à la fin de 2009 est de 4532 unités, dont 494
chalutiers, 1077 sardiniers, 2935 petits métiers et 15 Thoniers, enregistrant ainsi une légère
augmentation de 2% par rapport à 2008. Toutefois, une croissance de 84% a été enregistrée en
2009 par rapport à 1999 (Fig. 2) (www.mpeche.gov.dz).
Figure 2 : Evolution de la production halieutique en Algérie (www.mpeche.gov.dz).
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
1998 2000 2002 2004 2006 2008 2010
Année
Production annuelle (tonne)
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Etude bibliographique
5
1.3.3. Importation du poisson en l’Algérie
Selon le ministère de la pêche en Algérie, l’importation du poisson n’a cessé
d’augmenter ces dernières années, dont un total de 54 M$ été destiné à cet effet en 2009, alors
que les revenus de l’exportation ne dépassent pas 14 M$ (Fig. 3) (www.mpeche.gov.dz).
Figure 3 : Evolution annuelle des exportations et importations du poisson en Algérie
entre 2000 - 2009 (www.mpeche.gov.dz).
1.4. Valeur économique des scombridés
Les scombridés ont une valeur économique très importante. Ils disposent d’une masse
musculaire atteignant 70 % de leur masse totale, une proportion des plus élevées des poissons
de mer. Ils sont de ce fait très estimés par les consommateurs. Appréciés pour leur chair de
qualité remarquable, ils sont commercialisés à l'état frais, congelé, salé et en conserve. Les
thons mineurs sont en particulier commercialisés surtout à l'état frais (Hattour, 2000).
1.4.1. Valeur économique et marché mondial du thon rouge
Le thon est connu pour sa capacité à atteindre les plus hauts prix commerciaux sur les
marchés internationaux, avec des prix à l’unité pouvant s’élever à plus de 150000 $ US. Ces
prix extrêmement élevés du thon rouge d’Atlantique, encouragés par le marché mondial des
sushis, ont conduit à une surpêche croissante et incontrôlée (Fig. 4) menaçant cette espèce
d’extinction (France AgriMe, 2011).
0
10
20
30
40
50
60
1998 2000 2002 2004 2006 2008 2010
60
50
40
30
20
10
0
M $
Année
Imp (millions $) Exp (millions $)
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6
Figure 4 : Total des captures de thon rouge officiellement déclarées à la CICTA entre
1950 et 2007 (ICCAT, 2008).
En 2008, la part occupée par le thon dans le total des exportations de poisson a été
d’environ 8 %. Les marchés du thon se sont montrés instables en raison des importantes
fluctuations des volumes de capture. Au cours de l’année 2009, le cours du thon a été en
moyenne inférieur de 550 $ /tonne à celui de 2008. En conséquence, après l’année 2008, les
opérations de mise en conserve sont devenues plus rentables. Les négociants ont pu baisser
leurs prix, ce qui a entraîné un renforcement de la demande en matière de préférence des
consommateurs (F.A.O., 2010).
1.4.2. Pêche mondiale du thon rouge
La pêche mondiale du thon représente 4,4 millions de tonnes en 2009. Le thon rouge
(Thunnus thynnus) représente 21 000 tonnes. Les premiers producteurs mondiaux de toutes les
espèces de thon confondues sont l’Indonésie (476 000 tonnes), le Japon (463 000 tonnes), les
Philippines (412 000 tonnes) et Taiwan (326 000 tonnes). La France se situe au 15eme
rang.
Le Japon, même s’il n’est plus qu’en deuxième position depuis 2009, est le pays
incontournable des captures de thon depuis 1950. Il a connu une croissance considérable entre
les années 50 et 80, à la faveur du développement industriel du pays. Depuis les années 90,
ses captures se réduisent, du fait de l’essor spectaculaire des pêcheries des autres pays
asiatiques : Taïwan, Indonésie, Philippines et Corée du Sud. Le développement des pêcheries
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005
Atlantique Ouest
Atlantique Est
Méditerranée
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Etude bibliographique
7
thonières est principalement fondé sur l’essor des captures d’albacore Thunnus albacares et
de listao Katsuwonus pelamis qui représentent 85 % des volumes pêchés en 2009 et dans une
moindre mesure, du patudo Thunnus obesus. Le germon Thunnus alalunga ne représente plus
que 6 % des captures (contre 25 % en 1950) et le thon rouge Thunnus thynnus moins de 1 %
(contre 6 % en 1950) (France AgriMe, 2011).
La croissance des pêches du thon ne cesse d’augmenter. En 2008 les captures ayant
baissé de 2,6 %, après la production record de 2007, qui atteignait presque 6,5 millions de
tonnes (Fig. 5). (F.A.O., 2010).
Figure 5 : Evolution des captures par groupes d’espèces les plus prisées.
1.5. Utilisation et transformation du poisson
. Les nombreuses options disponibles pour la préparation du poisson permettent une
large gamme de présentations, ce qui fait du poisson un aliment très adaptable. Il est
généralement distribué sous l’une des formes suivantes: vivant, frais, réfrigéré, congelé, traité
thermiquement, fermenté, séché, fumé, salé, mariné, bouilli, frit, lyophilisé, haché, en poudre
ou en conserve, et plusieurs de ces formes sont combinées. Le poisson peut néanmoins être
conservé de nombreuses autres façons (F.A.O., 2010).
En 2008, 39,7 % (56,5 millions de tonnes) de la production mondiale de poisson ont été
commercialisés à l’état frais, tandis que 41,2 % de la production de poisson (58,6 millions de
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Millions de tonnes
1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2008
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Etude bibliographique
8
tonnes) été vendus congelés, fumés ou préparés d’une autre manière pour la consommation
humaine directe. Dans les pays développés, le poisson vendu au détail est en grande partie
congelé, préparé ou mis en conserve (F.A.O., 2010).
2. Présentation des espèces étudiées
2.1. Thon rouge : Tunnus thynnus (Linné, 1758)
Noms vernaculaires (FAO) : An.: Atlantic blue fin tuna ; Es.: Atun ; Fr.: Thon rouge
2.1.1. Position systématique
Classe Actinopterygii
Ordre Perciformes
Sous ordre Scombroidei
Famille Scombridae
Sous famille Scombrinae (Thonidés)
Genre Thunnus
Espèce Thunnus thynnus (Linné, 1758)
Figure 6 : Thon rouge Thunnus thynnus (Linné, 1758).
Longueur à la fourche suivant la courbe du corps
Longueur nageoire pectorale - fourche
1er nageoire dorsale 2
e nageoire dorsale mâchoire supérieure
nageoire caudale
ouverture des branchies nageoire pectorale pinnules nageoire anale nageoire caudale
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Etude bibliographique
9
2.1.2. Biologie du thon rouge
Le thon rouge est la plus grande espèce de scombridé. Il possède un corps trapu et très
hydrodynamique (Fig. 6). Il est aussi le plus grand de tous les thons. Comme son nom
l'indique sa chair est rouge et son sang contient un taux d'hémoglobine assez important pour
un poisson. Son cœur est particulièrement volumineux (Fromentin et Powers, 2005).
C’est un poisson à sang chaud, il nage en permanence afin de maintenir sa température
corporelle. Il est doté d’un système de régulation thermique lui permettant également d’élever
sa température interne de 10°C par rapport au milieu dans lequel il évolue, ce qui lui permet
de fréquenter des eaux dont la température varie de 3 à 30°C. Il est le seul animal, avec le
requin, capable de supporter de tels écarts de température tout en maintenant son activité
nutritionnelle (Carey et Teal, 1969 ; Blank et al., 2004).
Il évolue à diverses profondeurs et descend fréquemment à des profondeurs allant de
500 à 1000 mètres. Sa vitesse de nage peut atteindre les 80 Km/heure et ses capacités
d’accélération sont stupéfiantes. Le thon rouge est une espèce grégaire, se rencontre au large
en banc allant de quelques individus à plus d'une centaine d'individus. Une même femelle ne
pondrait pas chaque année, mais tous les deux ou trois ans au mois de juin (Ravier-Mailly,
2003).
Son système musculaire est évolué et particulièrement développé. Formé de muscle
blanc, mais aussi de muscle rouge dont le rendement métabolique est plus élevé. Il lui permet
de parcourir des distances considérables à grande allure pendant de nombreuses heures
(Korsmeyer et Dewar, 2001).
2.1.3. Caractères distinctifs
Le thon rouge possède un corps fusiforme de section subcirculaire, très robuste à
l’avant, mais plus ramassé que celui des Euthynnus et Auxis ; 34 à 43 branchiospines sur le
premier arc branchial. Deux nageoires dorsales séparées seulement par un intervalle étroit, la
seconde plus haute que la première ; 8 à 10 pinnules présentes derrière la seconde dorsale et 7
à 9 derrière l’anale (Fig. 7) ; pectorales très courtes (moins de 23 % de la longueur à la
fourche et moins de 80 % de la longueur de la tête) n’atteignant jamais l’intervalle séparant
les dorsales ; appendice bifide (processus interpelvien) entre les nageoires pelviennes, très
petites écailles sur le corps, un corselet d’écailles plus grandes bien développé. Pédoncule
caudal mince avec une forte carène médiane entre 2 petites carènes latérales situées à la base
de la caudale (Gibbs et Collette, 1967 ; Collette et Nauen, 1983 ; Nakamura et Séret, 2002).
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Etude bibliographique
10
2.1.4. Coloration
Dos bleu plus ou moins foncé, flancs et ventre blanc argenté avec des lignes
transversales incolores alternant avec des rangées de points incolores (ces derniers dominent
chez les individus les plus âgés), visibles seulement sur les spécimens frais ; première dorsale
jaune ou bleuâtre, seconde dorsale brun rougeâtre ; anale et pinnules jaunâtres bordées de noir
(Fig. 7) ; carène latérale noire chez les adultes (Nakamura et Séret, 2002).
Figure 7 : Les pinnules jaunes du thon rouge Thunnus thynnus.
2.1.5. Régime alimentaire du thon
Ce poisson est un prédateur par excellence. Son régime alimentaire évolue au cours de
sa croissance : planctonophage au stade larvaire, il se nourrit de crevettes, poissons et calmars
au stade juvénile. Les adultes sont des prédateurs de poissons pélagiques comme l’anchois,
sardine, maquereau, hareng, sprat, etc. Ils sont eux-mêmes la proie des grands requins
pélagiques et des orques (Ravier-Mailly, 2003).
2.1.6. Migration
Le thon rouge atlantique est réparti dans l’ensemble de l’Atlantique Nord et des mers
adjacentes (en particulier la Méditerranée), depuis l’équateur jusqu’au nord de la Norvège,
et du golfe du Mexique jusqu’à la Mer Noire. Il effectue d’importantes migrations, suivant
des voies qui relient les régions froides où il se nourrit, aux régions plus chaudes dans
lesquelles il se reproduit. Cependant, le thon rouge est la seule espèce de thon à réaliser
l’ensemble de son cycle de vie en eaux tempérées. Il se rapproche des côtes Méditerranéennes
au printemps pour se reproduire (Block et al., 1998 ; 2001).
AQUABIOR, 2011
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Etude bibliographique
11
2.2. Thonine commune : Euthynnus alletteratus (Rafinesque, 1810)
Noms vernaculaires (FAO) : An. : Little tunny ; Es. : Bacoreta ; Fr. : Thonine commune.
2.2.1. Position systématique
Classe Actinopterygii
Ordre Perciformes
Sous ordre Scombroidei
Famille Scombridae
Sous famille Scombrinae (Thonidés)
Genre Euthynnus
Espèce Euthynnus alletteratus (Rafinesque, 1810)
Figure 8 : Thonine commune Euthynnus alletteratus (Rafinesque, 1810).
2.2.2. Biologie de la thonine commune
La thonine est une espèce incluse dans les thonidés mineurs. Sa taille maximale signalée
en Méditerranée est d’environ 100 cm de longueur à la fourche pour un poids d’environ 12
kg. Dans l’Atlantique est-tropical, elle atteint 90 cm (Cayré et al., 1993 ; Macias et al., 2006).
La thonine adulte est un poisson prédateur opportuniste qui s’alimente de pratiquement
tout ce qui se trouve à sa portée, des crustacés, des poissons, des calmars, des hétéropodes et
des tuniciers. Les poissons clupéidés sont particulièrement importants dans son régime
alimentaire (Etchevers, 1976 ; Menezes et Aragao, 1980 ; Kahraman et al., 2008).
0 15 cm
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Etude bibliographique
12
2.2.3. Caractères distinctifs
Le corps de la thonine est fusiforme (Fig. 8), de section presque circulaire. La tête est
longue au museau pointu. La bouche est grande dépassant la limite du bord antérieur de l’œil.
Les mâchoires sont garnies d'une seule rangée de très petites dents plutôt coniques. On peut
passer le doigt sans se faire la moindre égratignure. La peau est nue sauf au niveau de la partie
antérieure du corps, le long de la ligne latérale et le long du dos jusqu'aux deux nageoires
dorsales ; le corselet écailleux est parfaitement délimité. L'opercule et le pré-opercule sont
nus. La ligne latérale ne montre pas de courbure accentuée au-dessus de l'insertion des
nageoires pectorales (Collette et Nauen, 1983 ; Antonio et al., 2009).
2.2.4. Coloration
Le dos est d'une couleur verdâtre virant au bleu, passant au bleu foncé à la mort de
l'animal. Il est traversé d'un réseau compliqué de bandes sombres et irrégulières ne dépassant
pas, vers l'avant, le milieu de la première nageoire dorsale (Fig. 8).
Sous la ligne latérale se trouvent quelques bandes longitudinales ; de même sous la
pectorale il y a un ensemble de taches noires ocellées en nombre de 5 (Fig. 8). En dehors de la
dorsale et de la caudale qui sont brunâtres, les autres nageoires sont claires (Collette et Nauen,
1983 ; Hattour, 2000).
2.2.5. Distribution géographique et habitat
La thonine semble être une espèce endémique aux eaux tropicales et subtropicales de
l'océan Atlantique en plus de la Méditerranée et de la Mer Noire. C'est une espèce
épipélagique, erratique, se déplaçant en bancs plus ou moins importants même avec d'autres
thonidés (Kahraman et al., 2008).
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Etude bibliographique
13
2.3. Auxide : Auxis rochei (Risso, 1810)
Noms vernaculaires (FAO) : An.: Bullet tuna ; Es.: Melva ou Bonitou ; Fr.: Auxide.
2.3.1. Position systématique
Classe Actinopterygii
Ordre Perciformes
Sous ordre Scombroidei
Famille Scombridae
Sous famille scombrinae (Thonidés)
Genre Auxis
Espèce Auxis rochei (Risso, 1810)
Figure 9 : Auxide Auxis rochei (Risso, 1810).
2.3.2. Biologie de l’auxide
L’auxide est une espèce incluse dans les thonidés mineurs. Sa taille maximale signalée
est de 65 cm (Cayré et al., 1993), alors que sa taille habituelle est de 25 à 40 cm, selon l’engin
de pêche, la saison et la région (Collette et Nauen, 1983). Elle se nourrit de petits poissons et
particulièrement les anchois, de larves de crustacés, de crabes et de stomapodes (Macias et al.,
2006).
0 8 cm
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Etude bibliographique
14
2.3.3. Caractères distinctifs
Le corps de la melva est fusiforme (Fig. 9), de section plus circulaire que chez
Euthynnus. La tête est longue, aplatie au niveau de la région inter-orbitale et terminée par un
museau court et pointu. La bouche est relativement petite ; les mâchoires sont égales et
garnies d'une série de petites dents. Les yeux, relativement grands, sont proches du profil
supérieur de la tête (Collette et Nauen, 1983).
Le pré-opercule est arrondi ; l'opercule, à bord postérieur presque droit, est finement
découpé. Les écailles sont présentes uniquement sur la partie postérieure du corps, le long de
la ligne latérale et le long du dos jusqu'à la deuxième nageoire dorsale. Les nageoires
pectorales sont courtes et atteignent la verticale du septième ou huitième rayon de la première
dorsale (Collette et Nauen, 1983).
Le processus interpelvien est constitué d'un prolongement important entre les nageoires
pelviennes. La vessie natatoire est absente et le nombre de vertèbres est constant, il est de 39
(Hattour, 2000 ; Collette et Nauen, 1983).
2.3.4. Coloration
Le dos est d’une couleur bleu verdâtre tournant au bleu violet, presque noir à la mort du
poisson. Il est traversé par au moins 15 barres sombres, larges et presque verticales (Fig.9). Le
ventre est blanc ne présentant pas de taches (Collette et Nauen, 1983).
2.3.5. Distribution géographique et habitat
L’auxide est une espèce à large distribution dans le monde, occupant les eaux tropicales
et subtropicales. Elle est commune en Méditerranée et Mer Noire, les côtes africaines (Est et
Ouest), les côtes européennes jusqu'en Grande Bretagne et en Scandinavie, les côtes
asiatiques jusqu'au Japon, les côtes australiennes et les côtes américaines Est et Ouest
(Sabatés et Recasens, 2001).
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15
2.4. Maquereau espagnol : Scomber japonicus (Houttuyn, 1780)
Noms vernaculaires (FAO): An.: Chub mackerel, E.s.: Estornino, Fr.: Maquereau espagnol.
2.4.1. Position systématique:
Classe Actinopterygii
Ordre Perciformes
Sous ordre Scombroidei
Famille Scombridae
Sous famille Scombrinae (Thonidés)
Genre Scomber
Espèce Scomber japonicus (Houttuyn, 1780)
Figure 10 : Maquereau espagnol Scomber japonicus (Houttuyn, 1780).
2.4.2. Biologie du maquereau espagnol
Le maquereau espagnol est une espèce épipélagique ou mésopélagique, occupe tous les
fonds depuis les côtiers atteignant même 300 m de profondeur. Il vit en bancs groupant des
individus de même taille et effectue d'importantes migrations saisonnières. La reproduction
s’étale de juin à août, se nourrissant de petits poissons pélagiques, particulièrement d’anchois,
de Clupéidés et d’invertébrés pélagiques (Hunter et Kimbrell, 1980).
2.4.3. Caractère distinctif
Comme tous les scombridés, le maquereau espagnol a un corps allongé et fusiforme
(Fig. 10). Il est couvert d'écailles de tailles variables, un peu plus grandes au niveau des
0 5 cm
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16
pectorales où elles délimitent un corselet. La tête est longue, assez haute et pointue ; les
mâchoires sont égales et les yeux beaucoup plus grands que chez l'espèce précédente, d'où
l’appellation de Macrophthalmus (gros œil).
Les deux nageoires dorsales sont nettement bien séparées (Fig. 10), les premiers rayons
de la première dorsale sont plus élevés que les suivants et les derniers rayons étant très courts.
La vessie natatoire est présente, d'où l'appellation de Pneumatophorus (Collette et Nauen,
1983 ; Fischer et al., 1987).
2.4.4. Coloration
Le dos du Scomber japonicus est bleu verdâtre ; il est orné de bandes sombres en forme
de V très ouvert qui s’arrêtent au niveau de la ligne latérale. Les flancs et le ventre sont munis
de petites tâches grises, plus ou moins nombreuses et s'orientent parallèlement à la ligne
latérale (Fisher et al., 1987).
2.4.5. Distribution géographique et habitat
Le maquereau espagnol est une espèce cosmopolite, occupant les zones tièdes et
tempérées des océans Atlantique, Indien et Pacifique et des mers adjacentes. Très commun en
Méditerranée (Hollowed, 1992).
2.5. La sardine commune : Sardina pilchardus (Walbaum, 1792)
Noms vernaculaires (FAO): An.: European pilchard; Es. : Sardina; Fr. : Sardine commune.
2.5.1. Position systématique
Classe Ostéichtyens
Sous-classe Actinoptérygiens
Ordre Clupéiformes
Classe Clupéidés
Famille Clupeidae
Genre Sardina
Espèce Sardina pilchardus (Walbaum, 1792)
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17
Figure 11 : Sardine commune Sardina pilchardus (Walbaum, 1792).
2.5.2. Biologie de la sardine commune
La sardine commune (Sardina pilchardus) (Fig. 11) est un poisson pélagique vivant
dans les eaux côtières et jusqu'à 120 mètres de profondeur. Elle vit en bancs parfois très
importants, près de la surface la nuit et plus en profondeur le jour. Sa taille maximale est de
25 cm. Elle fraie toute l’année avec une période de ponte variant en fonction de la répartition
géographique (Gaamour et al., 2000 ; HATTOUR, 2000). La maturité sexuelle est acquise à
une taille variable comprise entre 10 et 20 cm en fonction du groupe de sardine concerné
(environ 2 ans). Une femelle peut pondre jusqu’à 60 000 œufs pélagiques qui flottent entre 10
et 70 mètres, éclosent 2 à 4 jours après la ponte et donnent naissance à une larve de 4 mm de
long qui aboutira à une sardine juvénile au bout de 12 jours, qui retournera près des côtes
(Aldebert et Tournier, 1971 ; Amenzoui et al., 2006).
C’est une espèce planctonphage, la jeune sardine se nourrit de phytoplancton, d’œufs et
de larves de petits crustacés, alors que l’adulte consomme essentiellement des crustacés
planctoniques, des larves de crabes ou d’ophiures (Ettahiri, 1996). En effet, les poissons
planctophages effectuent des migrations verticales entre la nuit et le jour, suivant exactement
celles du plancton animal dont ils se nourrissent. En période de pleine lune cette migration est
réduite par le risque d'exposition aux prédateurs qui peuvent profiter de la brillance des
poissons, facilement repérable à partir des couches d'eau inférieures. La sardine effectue des
déplacements saisonniers de faible amplitude, commandés par la nutrition, la reproduction et
les conditions thermiques (Fréon et al., 2005).
0 4 cm
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18
2.5.3. Coloration
Le dos de la sardine adulte est bleu foncé, son ventre est argenté et présente, dans la
zone intermédiaire, une frange bleu-verdâtre avec reflets métalliques ; au commencement de
cette frange une ou plusieurs taches, pas toujours apparentes (Fischer et al., 1987).
2.5.4. Distribution géographique et migration
La sardine commune évolue en Atlantique Nord-est de la Norvège à l’Ecorce jusqu’au
Sénégal, et en Méditerranée (Ettahiri et al., 2003).
La sardine atlantique est une espèce pélagique et grégaire dont la distribution est
conditionnée par la température, la salinité de l’eau, l’intensité lumineuse et la quantité de
nourriture (Belvere, 1984 ; Ettahiri et al., 2003).).
2.6. L’anchois commun : Engraulis encrasicolus (Linné, 1758)
Noms vernaculaires (FAO): An.: European anchovy, Es.: Anchoa europea, Boqueron,
Fr. Anchois commun.
2.6.1. Position systématique
Classe Ostéichtyens
Sous-classe Actinoptérygiens
Ordre Clupéiformes
Famille Engraulidae
Genre Engraulis
Espèce Engraulis encrasicolus (Linné, 1758)
Figure 12 : Anchois commun Engraulis encrasicolus (Linné, 1758).
2.6.2. Biologie de l’anchois commun
0 3 cm
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Etude bibliographique
19
Cette espèce pélagique vit en bancs et croît très rapidement, se nourrissant de petits
crustacés planctoniques, d'œufs et d'alevins de poissons pélagiques (Garcia et Palomera,
1996).
L'anchois se reproduit dans des eaux entre 14°C et 19°C, et atteint sa maturité sexuelle
dès 1 an. Les adultes frayent deux à trois fois au cours de leur vie (Basilone et al., 2006).
Les œufs pélagiques de forme allongée sont pondus entre 10 et 30 mètres. Une femelle
peut pondre de 10.000 à 20.000 œufs, et les alevins éclosent dans les 2 à 4 jours après la
ponte. La longévité de l’anchois se situerait autour de 3 ans, il mesure 10 à 15 cm
communément, et atteint 20 cm maximum (Palomera et al., 1988).
2.6.3. Description et caractères distinctifs
Engraulis encrasicolus (LINNE, 1758) se présente comme un poisson ayant un corps
élancé à section transversale. Ce poisson possède un museau proéminant, une mâchoire
inférieure très longue et la bouche dépasse très nettement le bord postérieur de l’œil (Fig. 12).
Une seule nageoire dorsale courte, insérée à peu prés au milieu du corps. La ligne latérale est
invisible et les écailles sont caduques. Caractérisé surtout par l'allongement du museau en
rostre au-dessus d'une bouche infère largement fendue (Fisher et al., 1987).
2.6.4. Coloration
D'un corps bleuté allongé et cylindrique, la Coloration du dos est bleu-vert, passant
rapidement au gris clair ; flancs avec une bande argentée bordée dorsalement d’une ligne
sombre ; le ventre est pâle (Fisher et al., 1987).
2.6.5. Localisation et répartition géographique
L’anchois se trouve dans l'Atlantique nord-est, la mer du Nord et en Méditerranée. Il vit
dans les eaux côtières jusqu'à 150 mètres de profondeur, évoluant entre la surface et le fond.
C’est un migrateur grégaire et se rassemble en bancs immenses. Il apprécie les eaux dessalées,
on peut donc le trouver dans les estuaires, les étangs et dans les eaux saumâtres (Garcia et
Palomera, 1996).
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Etude bibliographique
20
2.7. La sardinelle ronde : Sardinella aurita (Valenciennes, 1847)
Noms vernaculaires (FAO): An. : Round sardinella ; Es.: Alacha ; Fr. : Allache.
2.7.1. Position systématique
Classe Ostéichtyens
Sous-classe Actinoptérygiens
Ordre Clupéiformes
Classe Clupéidés
Famille Clupeidae
Genre Sardinella
Espèce Sardinella aurita (Valenciennes, 1847)
Figure 13 : Sardinelle ronde Sardinella aurita (Valenciennes, 1847).
2.7.2. Biologie de la sardinelle ronde
La durée de vie des allaches est d'environ 6 ans. La maturité sexuelle est atteinte à 2 ans.
Elles forment d'immenses bancs qui se déplacent entre la surface et 150 mètres de profondeur.
Elles vivent dans des eaux non turbides, de température inférieure à 24°C et préfère les eaux
salées (35 ‰) ; sa commune est de 15 à 23 cm et peut atteindre 33 cm maximum (Blaxter et
Hunter, 1982 ; HATTOUR, 2000).
2.7.3. Description et caractère distinctifs
Le corps est allongé, subcylindrique, parfois assez comprimé. Le ventre est plutôt
arrondi. La nageoire dorsale possède 17 à 19 rayons, l’anale 17 à 21 et les ventrales 9. Les
écailles cycloïdes, sont au nombre de 42 à 47 le long de la ligne longitudinale, jusqu’à la base
de la nageoire caudale. On compte 17 à 19 écussons prépelviens et 14 à 16 postpelviens.
0 5 cm
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21
La partie inférieure du premier arc branchial possède 130 à 248 branchiospines (Fischer et al.,
1987).
2.7.4. Coloration
Le dos est bleu à bleu vert, les flancs argentés et le ventre blanc. Présente une tache
noire en haut de l'opercule et dépourvu de taches sur le corps. Une ligne longitudinale jaunâtre
située à mi-flancs caractérise également l'espèce (Ettahiri et al., 2003 ).
2.7.5. Distribution géographique
L’espèce est présente tout le long des côtes africaines de l’océan Atlantique, de
Gibraltar jusqu’en Afrique du Sud. Ailleurs, elle est connue dans la Méditerranée et des côtes
atlantiques européennes (Ettahiri et al., 2003).
3. Les otolithes
Le mot otolithe vient du grec «oto» qui désigne l'oreille, et «lithos» qui signifie pierre. Il
s'agit, donc, de la «pierre de l'oreille», véritable pièce d'identité de l'espèce, organe de
l'équilibre sensible à la pesanteur et à l'accélération. Les poissons osseux (Ostéichthyens) en
possèdent trois par oreille interne, la sagitta, le lapillus et l’asteriscus. Ils baignent dans
l'endolymphe du système membraneux, de part et d'autre de l'encéphale, en arrière des yeux.
La forme de ces pièces est caractéristique de l'espèce et leur taille n’est pas proportionnelle à
celle du poisson (Dunkelberger et al., 1980 ; Raymonde, 1999 ; Popper et Fay, 1993).
La sagitta est la plus grande des otolithes (Fig. 14), souvent visible à l’œil nu, et c'est
donc la plus utilisée dans les études (Panfili et al., 2002).
Les otolithes, généralement comprimées latéralement, sont symétriques (droite-gauche),
constituées d'aragonite, une forme cristallisée de carbonate de calcium (Watabe et al., 1982 ;
Morales-Nin, 1987a).
3.1. Utilisation des otolithes
Les otolithes sont connus depuis longtemps pour leur utilisation comme indicateur de
l’âge. Au cours des dernières années leur intérêt s’est accru. En effet, ils apparaissent comme
de véritables mémoires, enregistrant tous les évènements marquants de la vie du poisson
depuis sa naissance (Raymonde, 1999).
Page 42
Etude bibliographique
22
Figure 14 : Emplacement de l’otolithe sagitta.
3.1.1. Reconnaissance et classification des espèces par les otolithes
La forme et les dimensions de la sagitta varient selon les espèces. Cependant, la
morphologie est constante au sein d’une espèce (Tuset et al., 2008). Cette notion de
spécificité est importante et sert de base à une reconnaissance ou une identification
systématique du Poisson (Raymonde, 1999). En effet, certains otolithes, ont une forme
particulière qui permet leur identification rapide et leur rattachement instantané à une famille,
un genre ou même souvent une espèce donnés (Béarez, 1996).
L’aspect, la structure, et la composition chimique fine de l’otolithe sont autant de
critères permettant d’appréhender la classification (Raymonde, 1999). En effet, grâce à leur
variation morphologique interspécifique, les otolithes se sont avérés utiles en taxonomie
(Hecht, 1979 ; Nolf et Brzobohaty, 2002 ; Angela, 2006 ; Girone et al., 2006 ; Angela et Dirk,
2009). Leurs différences morphologiques tendent à refléter leur phylogénie et leur
développement (Panfili et al., 2002). La morphométrie des otolithes a aussi été utilisée pour
l'identification et l'étude des variations géographiques des populations et des stocks de
poissons (Messieh et al., 1989 ; Castonguay et al., 1991 ; Campana et Casselman, 1993 ;
Friedland et Reddin, 1994 ; Burke et al., 2008).
Les différences interspécifiques de la forme des otolithes apparaissent être dues à des
influences génétiques et environnementales (Morales-Nin, 1987b ; Lombarte et Lleonart,
1993 ; Nolf, 1995 ; Torres et al., 2000 ; Swain et al., 2005).
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Etude bibliographique
23
L’otolithe, outre son intérêt taxonomique et son utilisation classique dans l’évaluation
de l’âge, peut également apporter des informations d’ordre biologique: passé larvaire,
changements d’habitats, métamorphose, reproduction... (Raymonde, 1999).
De même, les otolithes issus de sites archéologiques et paléontologiques permettent de
reconstruire les paléo-environnements et les paléofaunes (Nolf, 1995 ; Girone et Nolf, 2009).
3.1.2. Utilisation de la forme des otolithes dans l’étude du régime
alimentaire
L’analyse morphologique des otolithes permet de déduire le régime alimentaire de
poissons, et de Cétacés ichtyophages, et donc, et de connaître le comportement trophique. La
composition chimique de l’otolithe lui permet de résister à l'attaque des enzymes digestives,
ainsi, lors d'une étude sur le régime alimentaire, les otolithes des poissons ingérés, et
partiellement digérés, sont récupérés, nous informant sur l’identité des poissons éventuels
consommés présents dans le contenu stomacal (Suter et Morel, 1996 ; Olsson et North, 1997 ;
Watanabe et Saito, 1998 ; Alonso et al., 1999 ; Veiga et al., 2011).
4. Le muscle
Le muscle du poisson représente pratiquement la totalité de la partie consommable de
l'animal, par sa structure d'une part et son organisation anatomique d'autre part. Il diffère
notablement de ce que le consommateur est habitué à rencontrer chez les oiseaux et les
mammifères (Bone, 1978 ; Medale, 2005).
4.1. Choix de l’étude des protéines
La fraction lipidique a dans un premier temps fait l'objet de différents travaux basés sur
la comparaison inter-espèce de paramètres, tels que : la teneur en graisse, les indices de
réfraction des huiles, la composition en acides gras ou en insaponifiables. D'une manière
générale, ces critères sont trop globaux ou sujets à des variations quantitatives et qualitatives
trop importantes pour être suffisamment spécifiques. Ces résultats ont orienté les recherches
sur la fraction protéique (Durand et al., 1985).
Page 44
Etude bibliographique
24
4.2. Protéines musculaires
Les protéines musculaires constituent, après l’eau, la fraction pondérale la plus
importante. Elles comprennent trois grands groupes : les protéines fibrillaires (actine,
myosine, tropomyosine), sarcoplasmiques ou «myogènes» et les protéines de soutien (tissu
conjonctif) (Kim et al., 2005). De ces trois groupes, seul le myogène est doué d’une
spécificité très marquée entre les espèces. Il est constitué en majeure partie par la myoglobine
et par un grand nombre d’enzymes facilement solubles dans l’eau ou les solutions saline
faiblement concentrées (de 0,05 à 0,15 M) (Stefansson et Hultin, 1994 ; Kim et al., 2003).
Malgré la très large variété taxonomique des poissons, la teneur en protéines des tissus
musculaires est d'une constance remarquable. L'analyse de 540 espèces révèle une gamme de
variation de 16 à 22 % (valeur moyenne 18,5 %), les valeurs les plus basses étant trouvées
dans le muscle rouge et les plus élevées dans le muscle blanc (Medale, 2005).
4.2.1. Les protéines sarcoplasmiques
Les protéines solubles dans l’eau (WSP) offrent différents avantages : un degré de
stabilité important lors de la congélation des filets de poissons, une rapide et facile extraction,
et donnent des profils avec un nombre de bandes important (Chen et al., 2010, Demir et al.,
11).
L'étude de cette fraction est particulièrement importante, pour l’identification des
espèces (Rehbein et al., 1999 ; Berrini et al., 2006 ; Montowska et Pospiech, 2007 ; Demi et
al., 2011 ).
4.2.2. Les protéines myofibrillaires
Les protéines myofibrillaires ne sont pas solubles dans l’eau mais elles le sont dans des
solutions salines à 0,6 - 1,0 M (SAHA et al., 2006 ; Mohan et al., 2008). Elles constituent
55 % des protéines musculaires (Medale, 2005). La myosine et l’actine sont les principaux
constituants des protéines myofibrillaires (Johnston, 1981 ; Camou et Sebranek, 1991).
De nombreuses protéines en dehors de l'actine et de la myosine sont également
nécessaires à la contraction musculaire (Tableau 1). Alors que l'actine et la myosine sont
conservées parmi toutes les espèces animales, d'autres protéines musculaires présentent plus
de variabilité (ANDO et al., 1985 ; Delbarre-Ladrat et al., 2006).
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Etude bibliographique
25
Tableau 1 : Protéines musculaires caractérisées par ordre de taille décroissante (Alberts et al.,
1994).
Protéines
PM (KDa) Fonction
Titine
3000 Centre la myosine dans le sarcomère
Dystrophine
400 Ancrage à la membrane plasmique
Filamine
270 Réticule les filaments d’actine dans un gel
chaine lourde de myosine
210 Fait glisser les filaments d’actine
Spectrine
265 Fixe les filaments à la membrane plasmique
M1/ M2
190 Produits de la dégradation de la myosine
M 3
150 Produits de la dégradation de la myosine
Protéine C
140 Produits de la dégradation de la myosine
Nébuline
107 Régule l’assemblage de l’actine
Alpha- actinine
100 Groupe les filaments d’actine
Gelsoline
90 Fragmente les filaments d’actine
Fimbrine
68 Groupe les filaments d’actine
Actine
42 Forme des filaments
Tropomyosine
35 Renforce les filaments d’actine
Troponine (T)
30 Régule la contraction
Chaine légère de myosine
24, 17, 15 Fait glisser les filaments d’actine
Troponine(I)
19 Régule la contraction
Troponine (C)
17 Régule la contraction
Thymosine
5 Séquestre des monomères d’actine
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Etude bibliographique
26
4.3. Utilisation des techniques électrophorétiques dans les études de la
taxonomie et l’identification des espèces
Depuis 1962 la technique de polyacrylamide sur gel (PAGE) a été employée dans
l’étude de la taxonomie par l’analyse de l’empreinte protéique de différents organismes, pour
son extrême sensibilité, sa facilité de mise en œuvre, sa rapidité et sa reproductibilité (Bursey
et al., 1980). Les profils électrophorétiques, sont aussi utilisés dans la taxonomie des poissons
(Khoo et al., 1997 ; Knuutinen et Harjula, 1998 ; Turkoz et al., 2000 ; Colombo et al., 2000 ;
Piñeiro et al., 2001 ; Chen et Hwang, 2002 ; Yılmaz et al., 2005 ; Yılmaz et al., 2007, Chen et
al., 2010 ; Demir et al., 2011).
L'utilisation des protéines est limitée à l'identification des poissons à l'état frais,
réfrigérés pour quelque jours ou congelés, et ne s'adresse pas à l'identification de poissons
ayant subi des traitements physico-chimiques (Toyohara et al., 1999 ; Kristinsson et al.,
2005 ; Gratacos-Cubarsi et Lametsch, 2008 ; Ortea et al., 2010 ; Tadpitchayangkoon et al.,
2010). L’étude moléculaire est la plus adaptée.
5. L’ADN
La transmission des caractères héréditaires d’une génération à une autre repose sur
l’acide désoxyribonucléique (ADN). Identifié dès la fin du 19ème
siècle par Miescher,
Altmann et Kossel, l’ADN a été modélisé en 1953, par Watson et Crick. Il existe au sein de la
cellule deux types d’ADN: l’ADN nucléaire et l’ADN mitochondrial (Stoneking et Soodyall,
1996).
5.1. L’ADN mitochondrial
Le génome mitochondrial est petit (de 17000 à 18000 paires de bases chez les poissons
osseux), circulaire et de structure simple (Fig. 15) (Kartavtsev et al., 2007).
De part la nature externe au noyau, l'ADNmt ne serait transmis que par les femelle, car
apporté par les ovocytes lors de la fécondation. Cet ADN échappe au brassage des gènes qui
se produit à chaque génération, est sera donc conservé au sein de l’espèce (Taanman, 1999).
L'ADNmt est un excellent marqueur d'espèces. Il est souvent utilisé en phylogénie
(Alvarado-Bremer et al., 1997 ; Espiñeira et al., 2009 ; Catanese et al., 2010). En effet, selon
l'espèce étudiée, certaines portions de l'ADNmt permettent de différencier entre les espèces.
D'autres ont un pouvoir de résolution plus fin et permettent de distinguer des populations
différentes (races géographiques, sous-espèces): tels que la région de contrôle de la réplication
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Etude bibliographique
27
de l'ADNmt et la régions codant pour le cytochrome b ou codant pour les ARN
mitochondriaux (ARN 12S ou ARN 16S) (Bartlett et Davidson, 1991; Ram et al., 1996 ;
Quinteiro et al., 1998 ; 2001, Paine et al., 2007 ; Zhang et Hanner, 2011 ; Besbes et al., 2012).
L'analyse de cet ADN spécifique est donc devenue un outil d'investigation dans un grand
nombre de recherches historiques, archéologiques voire paléontologiques. La plupart des
études menées sur l'ADNmt des gadiformes analysent la diversité génétique des espèces d'un
point de vue populationnelle, en comparant les séquences entres elles ou en utilisant des
marqueurs microsatellites (Zhan et al., 2008 ; Tzeng et al., 2009).
Figure 15 : Carte du génome mitochondrial des Poissons.
D'autres études se basent sur une région précise de l'ADNmt, et calculent des taux de
divergence afin d'étudier l'évolution d'une espèce par rapport à une autre (Miya et al., 2001 ;
Lavoué et al., 2007 ; Tseng et al., 2011). Il est possible aussi de retracer leur histoire
évolutive et d'apporter de nouveaux éléments quant à la place d'une espèce sur un arbre
phylogénétique (Jonniaux et Kumazawa, 2008 ; Lavoué et al., 2008).
L'ADNmt a été séquencé en entier chez plusieurs espèces (Hurst et al., 1999 ;
Broughton et al., 2001 ; Vinas et al., 2003 ; Kartavtsev et al., 2007 ; Catanese et al., 2008),
et notamment chez le thon rouge Thunnus Thynnus (Manchado et al., 2004).
Génome
Mitochondrial
16700 pb ˷
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Etude bibliographique
28
Ainsi, différentes études de biologie moléculaire ont utilisé L’ADNmt pour la détection
d’éventuelles fraudes dans les produits marins et notamment les poissons vendus sous
différentes formes (Rasmussen-Hellberg et Morrissey, 2010). Dans l’ADNmt différent
fragment du gène cytochrome b ont été utilisé comme marqueurs pour l’identification des
espèces de poissons.
5.2. Gene cytochrome b
Le gène codant pour le cytochrome b est une région de plus d’un millier de paires de
bases du génome mitochondrial, situé en positions 14201 à 15341 (Fig. 16) (Hurst et al.,
1999 ; Manchado et al., 2004), et présente une variabilité relativement élevée malgré le fait
qu’il s’agisse d’une séquence codante, ce qui justifie souvent le choix de ce marqueur (Levy,
2003).
Figure 16 : Positions du cytochrome b et de la région de contrôle dans le génome
mitochondrial et représentation schématique de leurs variabilités.
14360 15460 15600 16700 / 1 70 1020 1090 ˷ ˷ ˷ ˷ ˷ ˷ ˷
Position (pb)
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MATERIEL &
METHODES
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Matériels & Méthodes
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1. Matériel biologique
Cette étude porte sur trois familles de poissons bleus: la famille des scombridés
représentée par quatre espèces, à savoir le thon rouge Thunnus thynnus (Fig. 17), l’auxide
Auxis rochei (Fig. 18), la thonine commune Euthynnus alletteratus (Fig. 19), et le
maquereau espagnol Scomber japonicus (Fig. 20), la famille des clupéidés représentée par
deux espèces, la sardinelle ronde Sardinella aurita (Fig. 21), et la sardine commune
Sardina pilchardus (Fig. 22), et la famille des engraulidés représentée par une espèce,
l’anchois commun Engraulis encrasicolus (Fig. 23).
Tous les poissons sont récoltés du port d’Oran. De chaque espèce nous avons utilisé
cinq spécimens. Les poissons sont identifiés par la clé d’identification F.A.O. (Fischer,
1987), pesés et mesurés, les poids et les longueurs totaux des espèces étudiées sont montrés
dans le tableau 2.
Tableau 2 : Poids et longueurs totaux des poissons étudiés.
Espèce Poids total Longueur totale
Thunnus thynnus 168,33 ± 10,41 Kg 2,01 ± 0,41 m
Euthynnus alletteratus 2,0 ± 0,88 Kg 50,60 ± 6,02 cm
Auxis rochei 816 ± 73,04 g 38,58 ± 1,02 cm
Scomber japonicus 205 ± 33,6 g 28,7 ± 1,1 cm
Sardina pilchardus 40,44 ± 4,07 g 17,35 ± 0,48 cm
Sardinella aurita 54,53 ± 13,2 g 19,8 ± 1,2 cm
Engraulis encrasicolus 14,71 ± 1,85 g 13,4 ± 0,5 cm
Figure 17 : Thon rouge (Thunnus Thynnus).
AQUABIOR, 2011
10 cm
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Matériels & Méthodes
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Figure 18 : Auxide (Auxis rochei).
Figure 19 : Thonine commune (Euthynnus alletteratus).
Figure 20 : Maquereau espagnol (Scomber japonicus).
AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011
1cm
1cm
1cm
AQUABIOR, 2011
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Matériels & Méthodes
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Figure 21 : Sardinelle ronde (Sardinella aurita).
Figure 22 : Sardine commune (Sardina pilchardus).
Figure 23 : Anchois commun (Engraulis encrasicolus).
AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011
1cm
1cm
1cm
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Matériels & Méthodes
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2. Etude des pièces anatomiques: Les otolithes
2.1. Prélèvement des otolithes
Nous avons opté pour toutes les espèces que nous avons étudiées, pour la coupe
transversale du neurocrâne, juste derrière les yeux. La partie postérieure de la tête est
ensuite soumise à un jet d'eau qui fait évacuer la partie restante du cerveau et met à nu les
oreilles internes, ceci nous permet aisément l'extraction de leurs sacs les otolithes sagittae
(Fig. 24), logés dans des fossés situés de part et d'autre de la partie ventrale de la partie
céphalique.
Figure 24 : Prélèvement des otolithes sagittae.
2.2. Observation des otolithes
Nous nous sommes contentés simplement de voir l’aspect et la morphologie générale
des otolithes des poissons étudiés, sachant que chaque otolithe a un aspect spécifique et
caractéristique de l’espèce.
Les observations sont faites sous loupe binoculaire (Stemi 2000, ZEISS), et sous
microscope optique au grossissent (X4) (Axiolab, ZEISS).
AQUABIOR, 2011
Sacs des otolithes
Partie céphalique
du poisson
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Matériels & Méthodes
33
3. Etudes des protéines musculaires
3.1. Préparation des échantillons musculaires
A l’arrivée du poisson frais au laboratoire, des échantillons de muscle sont prélevés
de la partie dorsale du poisson (Fig. 25). Ces fragments sont soigneusement débarrassés de
toute trace de peau et d’écailles.
Figure 25 : Mode de prélèvement de l’échantillon musculaire.
3.2. Obtention de l’extrait brute protéique
Deux grammes de muscle sont broyés sous glace à l’aide d’un homogénéiseur ultra
turrax (WiseTis HOMOGENIZER), en présence de 8 ml de tampon phosphate 10 mM, à
pH7. Après filtration, la solution est centrifugée à 10 000 g pendant 30 minutes à 4°C
(Altinelataman et al., 2009). Le surnageant est stocké à - 20 °C en aliquote de 1 ml jusqu’à
l’utilisation.
3.3. Dosage des protéines
La concentration totale en protéine solubles du muscle blanc est déterminée par la
méthode de Bradford (1976). Cette technique utilise du bleu de Coomassie G-250 qui a la
propriété de se fixer sur les protéines de manière non spécifique et indépendamment de
leur séquence. Cette fixation s’accompagne par une modification du spectre d’absorption
de la molécule qui est décalé vers le bleu. L’intensité de la coloration est proportionnelle à
la concentration en protéines.
AQUABIOR, 2011
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Matériels & Méthodes
34
10 µl du surnageant sont ajoutés à 490 µl d’eau distillée et 500 µl du réactif de
Bradford. Le mélange est incubé pendant 15 minutes à l’obscurité et à température
ambiante. Les absorbances sont mesurées à 595 nm.
Une courbe étalon est réalisée avec l’albumine de sérum bovin (BSA) comme
protéine standard.
3.4. Etude électrophorétiques
Les extraits protéiques sont analysés par PAGE-SDS selon Laemmli (1970).
3.4.1. Préparation des échantillons protéiques
Les extraits protéiques sont dilués à 1,25 mg/ml avec du tampon de Laemmli (1M
Tris-HCl (pH 6,8), SDS, Glycérol, bleu de Bromophénol (2 %), β- mercaptoéthanol, eau
distillée). Les dilutions sont faites de façon à avoir la même concentration en protéines
pour tous les échantillons, et ceci pour pouvoir comparer les profils protéiques obtenus.
Les échantillons dilués sont dénaturés à 95°C pendant trois minutes.
3.4.2. Migration des protéines
Nous avons utilisé des gels de séparation à 12 % et 15 %, et des gels de
concentration à 5 % (Tableau 3). Les échantillons protéiques sont déposés dans les puits du
gel à raison de 25 µg par échantillon, en même temps que les marqueurs de taille à l’aide
d’une micro-seringue (HAMILTON).
Nous avons utilisé des gels de 10 cm x 8 cm x 1 mm. La migration est effectuée à
une tension de 100 V et une intensité de 30 mA (TARSON, Electrophorsis Power Supply
Mc-01), dans le tampon de migration à pH 8,3 composé de 0,96 M glycine, 0,12 M Tris et
0,017 M SDS. Cette migration est arrêtée lorsque le bleu de bromophénol atteint le bord
inférieur du gel, soit en moyenne après 1 heure et 30 minutes de migration.
Le kit de marqueur de taille protéique (Biolabs) est constitué de protéines
recombinées, ayant les masses molaires suivantes: 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100,
150, 250 KDa.
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Matériels & Méthodes
35
Tableau 3 : Composition des gels de polyacrylamide.
3.4.3. Coloration du gel et révélation des bandes protéiques
Après la migration, le gel est baigné dans une solution de bleu de Coomassie R-250
(Merck) dissout dans un mélange de méthanol, acide acétique glacial et eau distillée (5/4/1)
(v/v/v) pendant 30 minutes, puis décoloré sous agitation douce (Heidolph UNIMAX 2010),
dans plusieurs bains contenant l’acide acétique glacial, le méthanol, et l’eau distillée, (3/1/6)
(v/v/v) jusqu’à la décoloration totale du gel. Ce dernier est en suite scanné.
3.4.4. Détermination du Poids Moléculaire des bandes protéiques
Les poids moléculaires des bandes protéiques sont estimés par des protéines
standards de 10 – 250 KDa (Kit Biolab), on utilisant la courbe étalon tracée par le Log PM
en fonction des (Rf). Sachant que le Rf est le rapport entre la distance parcourue par la
protéine et la distance du front de migration marquée par le bleu de Bromophénol.
Produits
Gel de
concentration
5%
Gel de
séparation
12%
Gel de
séparation1
5%
Solution d’acrylamide/bisacrylamide
(37/1) (40%)
500 µl 3 ml 3,75 ml
Tampon tris-HCl 1M (pH 8,8)
/ 3,75 ml 3,75 ml
Tampon tris-HCl 1M (pH 6,8)
500 µl / /
SDS (10%)
40 µl
100 µl 100 µl
Persulfate d’ammonium (10%)
20 µl
50 µl 50 µl
TEMED 2 µl
5 µl 5µl
Eau distillée 2,94 ml
3,1 ml 2,35 ml
Volume totale 4 ml
10 ml 10 ml
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Matériels & Méthodes
36
4. Etude du pattern moléculaire
4.1. Extraction de l’ADN total
A l’arrivée du poisson frais au laboratoire, un échantillon de muscle de chaque
spécimen est prélevé et stocké à - 20°C pour l’extraction de l’ADN.
L’ADN total est extrait selon la méthode NaCl (Cawthorn et al., 2010). Les
échantillons d’ADN sont extraits des espèces de scombridés (thon, thonine et auxide), ainsi
que différentes conserves de «thon» achetées du marché, et également du thon rouge traité
thermiquement à 120°C pendant 15 minutes, afin de représenter les conditions de
préparation la conserve de thon.
50 mg d’échantillon de muscle sont émincés et mis dans 400 µl de tampon de lyse
(10 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 2 mM EDTA pH 8,0 ; 0,4 M NaCl), 40 ml de SDS 20 % et 10
µl de protéinase K à 20 mg / ml (Sigma-Aldrich), dans un eppendorf stérile de 1,5 ml, et
mélangés par le vortex. Le mélange est incubé à 65°C pendant une heure, puis 300 ml de
6 M NaCl sont ajoutés à chaque échantillon. Les échantillons sont vortexés à vitesse
maximale pendant 30 secondes puis centrifugés à 10 000 g pendant 30 minutes à 4°C. La
phase aqueuse de chaque échantillon est récupérée dans un nouveau eppendorf stérile, et
ajoutée à un volume égal d’isopropanol (Sigma-Aldrich), puis agitée au vortex.
Les échantillons sont incubés à - 20°C pendant une heure, puis centrifugés à 10 000 g
pendant 20 minutes à 4°C. Le culot d’ADN est lavé par l’éthanol 7 % froid (v/v) (Sigma-
Aldrich), puis séché à l’air libre, ensuite resuspendus dans 100 µl de tampon T.E (10 mM
Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).
4.2. Contrôle de pureté de l’extrait d’ADN
Deux lectures de densité optique sont effectuées, une à 260 nm qui correspond au
domaine d’absorption des bases puriques et pyrimidiques, et une autre à 280 nm permet
d’estimer la contamination éventuelle de l’extrait par des protéines.
Un ADN pur, débarrassé de protéines, doit avoir un rapport DO260 / DO280 compris
entre 1,8 et 2,0. Quand ce rapport est inférieur à 1,8 , la solution d’acide nucléique est
contaminée par des protéines. Quand le rapport est supérieur à 2, la solution est contaminée
par l’ARN.
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Matériels & Méthodes
37
Une électrophorèse sur gel d’agarose permet de contrôler la qualité de l’ADN après
extraction. A ce stade, l'ADN précipité correspond à l'ADN total présent dans les cellules
du tissu (ADN nucléaire et ADN mitochondrial).
4.3. Dosage de l’ADN extrait
Une unité de D.O. à 260 nm correspond à l’absorption d’une solution d’ADN double
brin à la concentration de 50 µg/ml, ou à l’absorption d’une solution d’ADN simple brin
(ou d’ARN) à la concentration de 25 µg/ml. Ainsi, la concentration d’ADN est calculée en
multipliant la densité optique à 260 nm par 50 et par le facteur de dilution. Elle est
exprimée par (µg/ml).
4.4. Etude par PCR
La PCR (Polymerase Chain Reaction) est une méthode découverte en 1983 et mise
au point par Mullis en 1985, qui permet de sélectionner un fragment d’ADN de 100 à
plusieurs milliers de bases nucléotidiques à partir d’un génome complexe, et une
amplification enzymatique in vitro de celui-ci.
L’ADN est dénaturé par chauffage à 95°C, puis apparié à un excès de deux
oligonucléotides spécifiques complémentaires aux brins opposés de l’ADN, de part et
d’autre de la séquence à amplifier (séquence cible). Chaque oligonucléotide sert d’amorce
(primer) à une ADN polymérase (Taq polymérase, résistante à des températures de 100°C)
pour la copie de chacun des brins d’ADN (Fig. 26). Ce cycle peut être répété de manière
automatisée par dénaturation - renaturation successives : 20 cycles permettent ainsi une
amplification théorique de 220
= 106 fois de la séquence cible initiale (Bouissac, 2005).
Page 59
Matériels & Méthodes
38
Figure 26 : Principe de l’amplification en chaine par polymérase (PCR)
(Jourdier et al., 1998).
1. Dénaturation
(Séparation des deux brins)
ADN matrice
2. Fixation des amorces
3. Elongation par une ADN polymérase
Page 60
Matériels & Méthodes
39
En vue de la mise en évidence d’un fragment de gène mitochondrial cytochrome b de
146 pb spécifique au thon rouge Thunnus thynnus, nous avons utilisé un couple d’amorce
Cb146L/ Cb146H décrites par Lin et Hwang (2007), dont les séquences sont les
suivantes:
Cb146L (5’-CCT CGC AAT ACA CTA TAC CCC-3’).
Cb146H (5’-CGA TGT GGA AGT AGA TGC AG-3’).
Cet auteur préconise pour ces amorces le programme suivant : une étape de
dénaturation à 95°C pendant 10 minutes, suivie par 30 cycles consistant chacun à 1 minute
à 95°C, 1 minute à 59°C et 1 minute à 72°C. L’étape d’extension finale est étendue à 10
minutes.
Toutes les réactions de PCR sont réalisées dans un volume total de 25 µl, contenant
0,5 µg de l’ADN total, 5 µM de chaque amorce, 200 µM de dNTP et 2,5 U de Pro Taq
ADN polymérase (Biolabs), dans du tampon de PCR mix prêt à l’emploi (Biolabs), et une
eau distillée stérile qsp 25 µl (Lin et Hwang, 2007). Les amplifications par PCR sont
effectuées dans un thermocycleur (Mastercycler Personal, Eppendorf). Les produits
d’amplification sont ensuite maintenus à 4°C.
4.5. Electrophorèse sur gel d’agarose
On utilise un gel d’agarose à 0,8 % pour l’électrophorèse des extraits d’ADN
génomique, et à 2% pour les produits d’amplification par PCR, en présence de BET (10
µg/ml), dans du tampon TBE (Tris 40 mM, borate de sodium 5 mM pH 8, EDTA 1 mM),
ce même tampon est utilisé comme tampon de migration.
La manipulation est réalisée dans un appareil d’électrophorèse horizontale (VWR
European, Kuro GEL Mini Plus 10 Electrophoresis Horizontal), à 80 V, 100 mA pendant
30 min.
Pour l’ADN génomique 2 µg de chaque extrait d’ADN sont mélangés avec 3 µl de
tampon de charge (0,25 % de bleu de Bromophénol, 0,25 % de Cyanol Xylène FF et 15 %
de Ficoll 400) dans des microtubes eppendorfs. Quant aux produits d’amplification par
PCR, 3 µg de produit sont mélangés à 2 µl du même tampon de charge, les marqueurs de
poids moléculaire de 3000-50 pb (Sigma) sont utilisés comme référence.
Après migration, l’observation est faite sous lumière ultraviolette (Achtung ; UV-
Strahlen).
Page 61
Matériels & Méthodes
40
5. Analyse des patterns protéiques
5.1. Analyse statistique
Afin de comparer les différents patterns protéiques obtenus par l’électrophorèse de
polyacrylamide PAGE-SDS, et d’établir la relation phylogénique entre les espèces étudiées
par un dendrogramme, le test Classification hiérarchique (logiciel STATISTICA, Version
5,7) est utilisé.
5.2. Analyse densitométrique
Les patterns protéiques sont analysés par le logiciel ImagJ (1,43 U).
Page 62
RESULTATS &
DISCUSSION
Page 63
Résultats et discussion
41
Nous avons travaillé sur sept espèces de poissons bleus largement consommées,
et souvent confondues, ou sujets de tremperie, dont la sardine commune Sardina
pilchardus, l’anchois commun Engraulis engrasicolus, et la sardinelle ronde (allache)
Sardinella aurita. Ces espèces sont voisines et se commercialisent souvent sous
l’appellation « sardine », appartenant à l’ordre des clupéiformes. D’autres espèces
appartenant à la famille des scombridés, font aussi l’objet de ce travail dont le maquereau
espagnol Scomber japonicus, le thon rouge Thunnus thynnus, la thonine commune
Euthynnus alletteratus, et l’auxide (Bonitou) Auxis rochei, qui sont susceptibles de fraudes.
En effet, la thonine se vend comme étant du thon, même à l’état frais. Il en est de même
pour les conserves. Concernant le maquereau, il est entre les deux groupes de poissons
pélagiques, de même que ses juvéniles sont confondus avec la sardine. Dans le cadre de
contrôle de qualité et d’identification de ces différentes espèces nous avons, dans un
premier temps fait une étude anatomique des otolithes complétée par une identification
biochimique et moléculaire.
1. Etude des otolithes
Les otolithes sont des pièces anatomiques d’aspect spécifique à chaque espèce.
Différents travaux ont pu caractériser ces pièces comme moyen d’identification des
espèces de poisson.
L’isolement des otolithes sagittae à partir des échantillons de poissons étudiés, et leur
observation sous loupe binoculaire (Stemi 2000, ZEISS), et sous microscope optique
(Axiolab, ZEISS), a permis, en effet, de confirmer l’appartenance des échantillons de
poissons aux espèces citées, et ceci en comparant leur aspect par rapport à des travaux de
référence.
Ainsi, l’aspect des otolithes isolées de l’anchois commun Engraulis encrasicolus
(Fig. 27 (D) et 28 (c)) est identique à celles isolées de la même espèce par Veen et
Hoedemakers (2005) ; Girone et al. (2006) et Tuset et al. (2008). Aussi, l’otolithe de la
sardine commune Sardina pilchardus (Fig. 27 (C) et 28 (d)) est référencée dans les travaux
de Veen et Hoedemakers (2005) ; Prinet (2002) ; Girone et al. (2006) et Tuset et al. (2008),
de même que chez la sardinelle ronde Sardinella aurita (Fig. 27 (B) et 28 (a)), l’aspect de
ces pièces anatomique est identique à celles isolées de la même espèce par Tuset et al.
(2008).
Page 64
Résultats et discussion
42
Ainsi, la forme des otolithes de l’auxide Auxis rochei (Fig. 27 (E) et 28 (f)) est
similaire à celles isolées par Veiga et al. (2011). Chez la thonine commune Euthynnus
alletteratus (Fig. 27 (F) et 28 (e)) et le maquereau espagnol Scomber japonicus (Fig. 27
(A) et 28 (b)) l’aspect de ces pièces est identique à celles isolées par Tuset et al. (2008).
Pour le thon rouge Thunnus thynnus, nous n’avons pas pu isoler d’otolithe, vu que
ces pièces sont relativement minuscules par rapport au crâne du poisson.
Nous avons constaté que la taille des otolithes n’est pas toujours proportionnelle à la
taille du poisson, ceci a été rapporté par Tuset et al. (2008).
Les résultats de la présente étude et ceux de Raymonde Lecomte-Finiger (1999) ;
Popper et Fay (1993) et Tuset et al. (2008), montrent qu’on peut utiliser les otolithes
sagittae comme moyen d’identification, vu que leur forme est spécifique et caractéristique
de l’espèce. Ces pièces sont bien conservées à l’intérieur du poisson contre les agressions
environnementales même après la mort de l’animal. Ce moyen est particulièrement utile
lors des études sur le régime alimentaire d’une espèce piscivore (Smale et al., 1995 ;
Lombarte et al., 2006 ; Tuset et al., 2008 ; Veiga et al., 2011), où les poissons ingérés et
partiellement ou totalement digérés, sont difficiles ou impossibles à identifier. Ainsi, ces
pièces sont résistantes à l’action des enzymes digestives.
Aussi, une étude poussée des otolithes, permet même de différencier des stocks de
poissons de la même espèce (Messieh et al., 1989 ; Castonguay et al., 1991 ; Campana et
Casselman, 1993 ; Friedland et Reddin, 1994 ; Rooker et al., 2003 ; Galley et al., 2006 ;
Canas et al., 2012).
Les otolithes, formations extracellulaires, sont constituées d'aragonite, une forme
cristallisée de carbonate de calcium, fixée sur une matrice organique composée largement
d'une protéine proche de la kératine, l'otoline, qui est riche en résidus aspartate et
glutamate (Degens et al., 1969 ; Watabe et al., 1982 ; Panfili et al., 2002 ; Tuset et al.,
2008).
Vu la résistance des otolithes aux différents actions physico-chimiques, elles restent
bien conservées, au même titre que les ossements. De ce fait, elles ont été utilisées en
paléontologie, pour identifier des espèces fossiles (Nolf, 1995 ; Nolf et Brzobohaty 2002),
et permettent même de reconstruire les paléo-environnements (Girone et Nolf, 2009).
Page 65
Résultats et discussion
43
Figure 27 : Otolithes sagittae observées au microscope optique grossissement (X4) :
(A) Scomber japonicus, (B) Sardinella aurita, (C) Sardina pilchardus,
(D) Engraulis encrasicolus, (E) Auxis rochei, (F) Euthynnus alletteratus.
AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011
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Résultats et discussion
44
Figure 28 : Otolithes sagittae observées à la loupe binoculaire: (a) Sardinella aurita,
(b) Scomber japonicus, (c) Engraulis encrasicolus, (d) Sardina pilchardus,
(f) Auxis rochei, (e) Euthynnus alletteratus.
AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011 AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011
AQUABIOR, 2011
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Résultats et discussion
45
Les otolithes restent de ce fait, le caractère phénotypique d’un grand intérêt, pour
l’identification d’espèces de poissons osseux. Cette étude nous a permis d’identifier ou
alors de confirmer l’appartenance des d’échantillons de poissons aux espèces utilisés.
Cependant, l’identification des espèces en contrôle de qualité nécessite d’autres
approches, vu que le produit en notre possession, représenté par les conserves ou filets de
poissons ou autre forme ne possédant pas d’otolithes.
De ce fait, l’étude phénotypique du pattern protéique serait d’un grand apport dans ce
genre de travaux.
2. Etude biochimique
Cette étude a porté sur les protéines extraites du muscle dorsal des poissons étudiés.
La concentration en protéines par 100 g de muscle a été déterminée selon la méthode de
Bradford (1976). A partir d’une courbe étalon, avec la BSA comme protéine de référence
(Fig. 29).
Figure 29 : Courbe étalon des protéines.
y = 0,0073x
R² = 0,9475
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 20 40 60 80 100
BSA (µg/ml)
Absorbance
à 595 nm
Page 68
Résultats et discussion
46
Les teneurs en protéines des extraits brutes varient entre 17,45 ± 2,30 et 25,76 ±
4,7g/ 100 g de muscle.
La connaissance de la concentration des extraits de protéiques, des différents
échantillons, nous permet d’uniformiser la méthode d’étude des patterns protéiques en
PAGE-SDS. En effet, lors de la migration électrophorétiques, nous utilisons les mêmes
concentrations protéiques, d’échantillons à analyser, afin de pouvoir comparer nos
résultats. Ainsi, 25 µg de protéines de chaque échantillon ont été soumis à migration, en
présence de protéines standards de PM variant entre 10 – 250 KDa (Kit Biolabs).
Après migration, le PM des différentes protéines est déterminé à partir d’une courbe
étalon des protéines standards (Fig. 30).
Figure 30 : Coubre étalon des protéines standards pour l’analyse en PAGE-SDS.
2.1. Analyse des patterns protéiques :
Deux concentrations en acrylamide ont été utilisées, en vue d’une meilleure
séparation. Une première migration à 12% en acrylamide a permis d’obtenir les patterns
observés en figure 31. Une autre migration à 15% permet de mieux visualiser les protéines
à faibles PM (Fig. 32).
y = -2,3983x + 3,1191
R² = 0,9821
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000
Log PM
Rf
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Résultats et discussion
47
Figure 31 : Profils électrophorétiques des protéines musculaires solubles totales en PAGE-
SDS à 12 %, (1) Sardinella aurita ; (2) Sardina pilchardus ; (3) Engraulis encrasicolus ;
(4) Scomber japonicus ; (5) Auxis rochei ; (6) Thunnus thynnus ; (7) Euthynnus
alletteratus ; MT : marqueur (250 - 10 KDa) (Biolabs) ; MHC: chaine lourde de myosine ;
MLC : chine légère de myosine.
A la lumière de ces deux figures (31 et 32), nous distinguons essentiellement trois
zones de migration électrophorétique : La zone 1 comprenant les protéines à migration
lente (PM > 60 KDa) de moyen contenu protéique, la zone 2 à fort contenu protéique, de
mobilité moyenne (PM: 60 - 20 KDa), et la zone 3 à faible contenu protéique, à migration
rapide (PM < 20 KDa).
A première vue, les zones 2 et 3 permettent déjà de différencier nettement entre le
groupe 1 qui comprend les espèces de clupéiformes (sardina pilchardus, Sardinella aurita
et Engraulis encrasicolus), et le groupe 2 qui comprend les espèces de Perciformes de la
famille des scombridés (Thunnus thynnus, Auxis rochei, Euthynnus alletteratus et Scomber
japonicus).
150
MLC
Actine
MHC
20
30
40
60
80
100
50
Z3
Z2
Z1
1 2 3 4 5 6 7 MT
25
10
250
15
Page 70
Résultats et discussion
48
Figure 32 : Profils électrophorétiques des protéines musculaires solubles totales en PAGE-
SDS à 15%, (1) Sardinella aurita ; (2) Sardina pilchardus ; (3) Engraulis encrasicolus ;
(4) Scomber japonicus ; (5) Auxis rochei ; (6) Thunnus thynnus ; (7) Euthynnus
alletteratus ; MT : Protéines marqueur (250-10 KDa) (Biolabs) ; MHC: chaine lourde de
myosine ; MLC : chine légère de myosine.
En effet, le groupe 1 comporte 9 bandes protéiques en zone 2, tandis que le groupe 2
en comporte 7. Le groupe 1 comporte 3 bandes protéiques en zone 3, alors que le groupe 2
en comporte 4 (Tableau 4).
Z3
Z2
250
2 1 7 6 5 4 3
20
25 30
40
50
60
100
150
MT
80
10
Z1
MHC
Actine
MLC 15
Page 71
Résultats et discussion
49
Tableau 4 : Nombres de bandes protéiques obtenues par l’électrophorèse en PAGE-SDS,
selon les zones de migration.
N° du
profile
Nombres de
bandes dans la
Zone 1
Nombres de
bandes dans la
Zone 2
Nombres de
bandes dans la
Zone 3
Sardinella aurita 1 9 9 3
Sardina pilchardus 2 7 9 3
Engraulis encrasicolus 3 10 9 3
Scomber japonicus 4 12 7 4
Auxis rochei 5 14 7 4
Thunnus thynnus 6 10 7 4
Euthynnus alletteratus 7 10 7 4
Au sein d’un même groupe, des espèces peuvent être caractérisées de par la présence
de protéines de PM spécifique.
L’étude densitométrique des patterns protéiques obtenus par PAGE-SDS permet une
meilleure distinction des bandes protéiques (Fig. 33, 34, 35). Ainsi, la présence ou
l’absence de bandes protéiques de PM donné permet de caractériser une espèce donnée.
Figure 33 : Analyse densitométrique du pattern protéique de Scomber japonicus.
: Piques correspondant aux bandes protéiques caractéristiques.
4
10 250
Page 72
Résultats et discussion
50
Figure 34 : Analyse densitométrique des patterns protéiques: (1) Euthynnus alletteratus,
(2) Thunnus thynnus et (3) Auxis rochei.
: Piques correspondant aux bandes protéiques caractéristiques.
1
2
3
250 10
2
Page 73
Résultats et discussion
51
Figure 35 : Analyse densitométrique des patterns protéiques: (5) Engraulis encrasicolus,
(6) Sardina pilchardus et (7) Sardinella aurita.
: Piques correspondant aux bandes protéiques caractéristiques.
5
6
7
10 250
Page 74
Résultats et discussion
52
Dans le groupe 1 (clupéiformes), une bande de 83 KDa (Zone 1) caractérise l’espèce
Engraulis encrasicolus (Fig.31, 35). Dans ce même groupe des bandes de 58, 28 KDa (Fig.
31, 35) et 15 KDa (Fig. 32) sont observées uniquement chez l’espèce Sardina pilchardus,
cette dernière ne présente pas de bandes à 25 KDa, alors que les autres espèces de ce
groupe en présente (Fig. 32). L’espèce Sardinella aurita est caractérisée par la présence de
bande de 48 KDa (Fig. 31, 35).
Dans le groupe 2 (scombridés), l’étude du pattern protéique a permis de différencier
les espèces. Ainsi une des bandes de 85 et 170 KDa (Zone 1) sont observées uniquement
chez Scomber japonicus (Fig. 32, 33). Cette espèce est la seule à ne pas présenter de bande
à 121 KDa, présente chez toutes les espèces du groupe 2 (Fig. 31, 33). Dans le même
groupe, l’espèce Auxis rochei est caractérisée par la présence de bande protéique de 50
KDa (Fig. 31, 34), alors que l’espèce Euthynnus alletteratus présente une bande protéique
spécifique à 45 KDa (Fig. 31, 34). Des bandes de 26 et 6 KDa caractérisent l’espèce
Thunnus thynnus (Fig. 31, 32).
D’après Etienne et al. (2001) ; Ladrat et al. (2003) ; Chéret et al. (2006) ; Mohan et
al. (2008) et Demir et al. (2011), les bandes de 200 et 42 KDa correspondent
respectivement à la chaine lourde de myosine et l’actine, alors que les bandes protéiques de
taille comprise entre 24 et 15 KDa correspondent aux chaines légères de myosine.
Nous avons enregistré une importante résolution et reproductibilité des patterns
électrophorétiques par la méthode PAGE-SDS. Ceci a été rapporté également par Saha et
al. (2006) ; Ortea et al. (2010) et Demir et al. (2011).
D’après les résultats obtenus, et en accord avec Rehbein et al. (1999), les différences
interspécifiques des patterns protéiques sont suffisantes pour permettre de discriminer entre
les espèces, ainsi chaque profil est une signature de l’espèce, et lui est spécifique, d’où
l’appellation empreinte protéique.
Des études précédentes ont montré que ces différences entre les patterns des
protéines musculaires solubles peuvent être utilisées dans la taxonomie des poissons.
Anisi, Knuutinen et Harjula (1998) ont observé des différences dans le nombre de bandes
et les poids moléculaires entre les profils protéiques de 16 espèces de poissons d’eau
douce. Des travaux similaires ont permis de différencier 14 espèces de poissons (Colombo
et al., 2000) , et 4 variétés de Betta splendens (Khoo et al., 1997). D’autres travaux sur le
merlu Merluccius sp. (Piñeiro et al., 2001) montrent des relations d’apparenté entre cinq
Page 75
Résultats et discussion
53
espèces différentes étudiées en PAGE-SDS. Durna (2010) a rapporté d’étroites similarités
entre les bandes protéiques de Cyprinus carpio et Chalcalburnus chalcoides.
Lors de cette étude, les protéines musculaires solubles ont été choisies, car cette
fraction est d’une grande stabilité. En effet, Ortea et al. (2010) a signalé que ces protéines
présentent une stabilité remarquable lors du stockage à 4°C de J0 à J7. Ce résultat est
confirmé par des travaux antérieurs de Angsuppanich et Ledward (1998). De plus, Losada
et al. (2005) a contrasté que les profils des protéines musculaires de trachurus trachrus, ne
présentent pas de modifications considérables lors du stockage sous glace de J0 à J22. .
D’autre part, la région de prélèvement du muscle blanc dorsal importe peu. Mohan
et al. (2008) a analysé les patterns des protéines musculaires solubles de Rastrelliger
kanagurata, de plusieurs régions de la partie dorsale du poisson (antérieure, médiane et
postérieure), et a trouvé que les patterns des trois régions étaient similaires.
Les variations des protéines musculaires entre les espèces peuvent refléter des
raffinements de la fonction et des performances musculaires qui s'adaptent à des habitats,
environnements et stress physiologiques particuliers (Alberts, 1994 ; Delbarre-Ladrat et
al., 2006).
2.2. Analyse des liens phylogéniques
Les patterns protéiques ont permis d’analyser et d’établir la relation phylogénique
entre les différentes espèces (Fig. 36). Le dendogramme est obtenue par le traitement
statistique (logiciel STATISTICA, Version 5,7) basé sur la présence (1) ou absence (0) des
bandes protéiques des profils électrophorétiques (Fig. 31).
Le dendogramme de l’analyse phénotypique établie par les ressemblances et les
différences de la composition protéique, fait apparaître deux groupes bien distincts (Fig.
36). Le premier groupe correspond à l’ordre des clupéiformes, constitué par l’espèce
Sardina pilchardus, Sardinella aurita et Engraulis encrasicolus. Le deuxième groupe
correspond à l’ordre des perciformes qui rassemble Scomber japonicus, Auxis rochei,
Thunnus thynnus et Euthynnus alletteratus. Deux sous groupes apparaissent : le premier
correspondant à la famille des clupéidés, constitué par l’espèce Sardina pilchardus et
Sardinella aurita, et le deuxième, formé par l’espèce Auxis rochei et Euthynnus
alletteratus appartenant à la famille des scombridés. Ces résultats concordent avec la
classification hiérarchique de Fisher et al. (1987), et les résultats obtenus par Paine et al.
Page 76
Résultats et discussion
54
(2007) ; Espiñeira et al. (2009) ; Catanese et al. (2010) et Besbes et al. (2012), basés sur
l’étude moléculaire.
Figure 36 : Dendogramme représentant la relation phylogénique obtenue en se basant sur
les différences et les ressemblances dans les patterns électrophorétiques.
Le dendogramme (Fig. 36) montre que la sardine Sardina pilchardus est plus proche
de l’allache Sardinella aurita, que l’anchois Engraulis encrasicolus. Ainsi, la thonine
Euthyunnus alletterattus est plus proche du bonito d’Auxis rochei, que du thon rouge
Thunnus thynnus.
D’après nos résultats, et ceux de Chen et Hwang (2002) et Yilmaz et al. (2005 ;
2007), il est possible d’effectuer une approche systématique en utilisant l’empreinte
protéique.
L’utilisation de l’empreinte protéique pour l’identification est limité au poisson frais,
réfrigéré pour quelques jours, ou congelé (Losada et al., 2005 ; Ortea et al., 2010 ).
Cependant, vu les différents traitements physico-chimiques utilisés dans les conserveries,
les protéines subissent d’importantes dénaturations (Tadpitchayangkoon et al., 2010).
Il convient donc de trouver d’autres moyens d’identification mieux adaptés. Pour cela,
l’étude moléculaire reste l’outil le plus adapté, vu que souvent les fragments d’ADN
permettant l’identification sont résistants aux différents traitements physico-chimiques.
Auxis rochei
i Thunnus thynnus
Engraulis encrasicolus
Scomber japonicus
Sardina pilchardus
Sardinella aurita
Taux de similitude
Euthynnus alletteratus
Page 77
Résultats et discussion
55
3. Etude moléculaire
Cette étude porte sur l’identification d’espèces de thon, en utilisant l’outil
moléculaire, par amplification de fragment d’ADN spécifique.
Le choix porte sur un petit fragment de 146 pb d’ADN mitochondrial, présent au
niveau du gène cytochrome b. Ce fragment est spécifique au genre Thunnus, et donc
commun aux espèces de thon, Thunnus thynnus, T. albacore, T. obesus, T. alalunga (Lin et
Hwang, 2007). Ce fragment est thermorésistant.
Le paramètre de thermorésistance est important. En effet, les conserves de thon sont
souvent traitées à la chaleur, soit lors de leur préparation, ou pendant la stérilisation.
La thermorésistance permet donc de conserver intact le fragment d’ADN à identifier.
La notion de thermorésistance est directement liée à la taille du fragment d’ADN à
amplifier (Espineira et al., 2009). 176 pb est déterminée comme étant la taille maximale
thermorésistante (Quinteiro et al., 1998).
D’autre fragments d’ADN de 375 pb peuvent être utilisés dans le cas du thon à l’état
frais ou en en conserve, mais non traité à la chaleur (Pardo et Pérez-Villareal, 2004 ; Lopez
et Pardo, 2005 ; Espineira et al., 2009).
En vue de pallier à une éventuelle dénaturation thermique, nous avons choisi le
fragment de 146 pb pour notre étude, ainsi que les amorces et méthodes décrites par Lin et
Hwang (2007).
Notre but est de mettre en évidence la présence de ce fragment de gène
mitochondrial chez le thon rouge Thunnus thynnus, et son absence chez la thonine
commune Euthynnus alletteratus et chez l’auxide Auxis rochei, ainsi que l’identification de
quelques espèces de thons en boites de conserves.
L’ADN génomique total (nucléaire et mitochondrial) est extrait à partir du muscle de
différentes espèces fraîches de scombridés (thon rouge, thonine et auxide), et de deux
marques différentes de conserves de thon (C1 et C2), ainsi que de thon rouge frais que nous
traitons thermiquement à 120 °C pendant 15 min, en vue de simuler le traitement
thermique de la préparation en conserve. L’ADN est extrait selon la méthode de
(Cawthorn, 2010).
L’ADN obtenue présente une bonne pureté vu que le rapport DO260 / DO280 est
compris entre 1,8 et 2.
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Résultats et discussion
56
Aussi l’analyse électrophorétique sur gel d’agarose à 0,8 % confirme cette pureté de
par l’existence de bandes uniques homogènes et intenses (Fig. 37).
Figure 37 : Electrophorèse sur gel d’agarose d’ADN génomique à 0,8%. (1, 2, 7, 8, 9,
10) : Thon rouge (Thunnus thynnus) ; (3, 4) : Auxide (Auxis rochei) ; (5, 6) : Thonine
(Euthynnus alletteratus) ; (11) : Conserve de thon C1 ; (12) : Conserve de thon C2.
L’identification du thon rouge de par la mise en évidence du fragment du gène
mitochondrial spécifique cytochrome b de 146 pb, a nécessité l’utilisation d’amorces
spécifiques et d’un programme d’amplification spécifique (Lin et Hwang, 2007).
Tous les échantillons d’ADN extraits ont été étudiés par PCR comme décrit en
matériel et méthodes.
Les amplicons obtenus ont été mis en évidence par électrophorèse sur gel d’agarose à
2% en présence de marqueurs de taille (Fig. 38).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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Résultats et discussion
57
Figure 38 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2 % des produits de PCR, les amorces
utilisés (Cb146L/ Cb146H), (MT) marqueur de taille de 3000-50 pb (Sigma-Aldrich) ;
(1) Thon rouge (Thunnus thynnus) ; (2) Thon rouge (Thunnus thynnus) traité
thermiquement ; (3) Auxide (Auxis rochei) ; (4) Thonine (Euthynnus alletteratus) ; (5)
Conserve de thon C1 ; (6) Conserve de thon C2.
L’amplicon de 146 pb correspondant au fragment du gène mitochondrial cytochrome
b est présente au niveau de l’ADN du thon rouge comme attendu. Aussi, l’ADN extraits du
thon rouge traité à 120°C pendant 15min présente également ce gène, ce qui témoigne de la
thermorésistance du fragment d’ADN de 146 pb, et de sa possible mise en évidence même
dans les conserves de thon. En effet, l’échantillon d’ADN extrait de la conserve C2
présente l’amplicon de 146 pb, ce qui confirme la nature du produit en tant que thon.
L’échantillon C1 commercialisé sous l’appellation thon ne présente pas d’amplicon
de 146 pb. Ce produit ne serait pas du thon, et pourrait être de la thonine ou de l’auxide qui
présentent des propriétés organoleptiques proches de celles du thon, mais de moindres
valeurs ajoutées, et qui peuvent être sujets à tromperie.
L’auxide et la thonine ne présentent pas d’amplicons. En vue de la confirmation de la
substitution de produit et de fraude, il serait intéressant de mettre en évidence des gènes
spécifiques à la thonine et à l’auxide.
600
400
300
800
1000
200
100
150
50
2000
3000
146 pb
pb MT 1 2 3 4 5 6 MT
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Conclusion
58
L’identification des espèces de poissons a d’abord été liée aux aspects anatomiques.
L’étude des otolithes, entre autres, reste un très bon moyen dans ce genre d’études, vu la
spécificité de l’aspect de ces pièces anatomiques et leur résistance aux différents traitements
physico-chimiques. Ces pièces, vu leur bonne conservation, ont même été objets
d’identification d’espèces fossiles (Girone et Nolf, 2009).
Mais le développement de l’industrie du poisson et sa présentation sous différentes
formes, cuisiné, en conserve, en filet et autres, nécessitent d’autres méthodes d’identification
dans le cadre de contrôle de qualité.
Ainsi, l’étude du pattern protéique sur PAGE-SDS du muscle de différentes espèces
montre une spécificité de ce pattern permettant une identification. Des bandes protéiques
peuvent êtres utilisées comme protéines marqueurs d’une espèce donnée, et permettant surtout
de différencier des espèces apparentées.
L’étude moléculaire, reste à notre sens, la plus adaptée au contrôle de qualité. Dans le
cas du thon, poisson sujet à une forte commercialisation. Nombre d’études ont été réalisées, et
le choix a porté sur un fragment d’ADN de 146 pb, thermorésistant, stable et spécifique.
Aussi pour l’identification des différentes espèces de thon, l’étude par PCR-RFLP après
digestion enzymatique de ce fragment serait intéressante. En effet, des polymorphismes de ce
gène sont observés, en fonction de l’espèce (Lin et Hwang, 2007).
Le développement de l’outil moléculaire dans le contrôle de qualité dans notre pays est,
à notre sens, indispensable surtout au niveau des frontières, où l’importation de ce que nous
consommons est souvent du domaine de personnes pas très au fait des produits importés.
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