MMetody molekulární genetiky etody molekulární genetiky v ... · Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight - identifikace narostlé bakteriální kultury - rychlost

MMetody molekulární genetiky etody molekulární genetiky v mikrobiologiiv mikrobiologii

Pavel Dřevínek

Plán semináře:

• rozdíly mezi klasickou a molekulární mikrobiologií• výhody a nevýhody molekulárního přístupu

• jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR • kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření

- detekce jednoho určitého agens- detekce jakéhokoli agens- kvantifikace agens

PCR diagnostika

hledá se konkrétní patogen

hledá se patogen, předem není

stanoveno jaký

Plán semináře:




• jak funguje identifikace přes MALDI TOF

• molekulární epidemiologie - genotypizace• příklady ze života

„Klasická“ mikrobiologie„Klasická“ mikrobiologie::

• přímý průkaz - kultivace, mikroskopie, antigeny

• nepřímý průkaz - protilátky

• zjišťování citlivosti na antibiotika

„Molekulární“ mikrobiologie„Molekulární“ mikrobiologie::

• přímý průkaz - DNA či RNA; proteiny

• detekce jednotlivých genů rezistence, popis genomu

• žádný nepřímý průkaz

Klasika MG

Princip detekce a identifikace

celý organismus, metabolicky aktivní

DNA či RNA

Kultivace vs. molekulární genetikaKultivace vs. molekulární genetika

Výhody MG:• vyšší rychlost provedení• záchyt organismů, které nelze kultivovat, jejichž kultivace je náročná• záchyt bez ohledu na způsob růstu (biofilm)• záchyt při podávané ATB léčbě

Nevýhody MG:• často chybí informace o tom, zda jsou bakterie živé • není k dispozici živý izolát, např. pro určení ATB citlivosti

Klasika MG

ATB citlivost komplexní jednotlivé geny rezistence


Nevýhody MG:mecA: MRSAvanA: VRENevýhody MG:

• chybí komplexní obraz, MICvanA: VRE

karbapenemázy - KPC- NDM-1- IMP- VIM

VanA-type glycopeptide resistance.

Van operon přenášený na transpozonu

Klasika MG

Sensitivita srovnatelná či vyšší u mol. gen. vyšetření


Výhody MG:• záchyt malého počtu agens (infekce dříve diagnostikována)

Nevýhody MG:• riziko falešné pozitivity (kontaminace)

Klasika MG

Kvantifikace orientační absolutní


Výhody MG:• určení infekční nálože• sledování dynamiky infekce

Výhody Úskalí

Rychlost vyšetření• Ale nebývá non-stop provoz laboratoří• Stačí PCR nález ke změně ATB léčby?

Vysoká specificita• Nelze detekovat ty mikroby, které nejsou součástí diagnostické soupravy

Často vyšší senzitivita • Riziko falešné pozitivity

Souhrn výhod molek. genetikySouhrn výhod molek. genetiky

Často vyšší senzitivita • Riziko falešné pozitivity

Kvantifikace

Záchyt při podávané ATB te• Nejedná se o záchyt DNA z rozpadlých buněk?

Záchyt pomalu rostoucích mikrobů

• Chybí izolát

• Nelze stanovit citlivost ke všem ATB

Plán semináře:


• jak funguje detekce a identifikace přes DNA: PCR• kdy uvažovat o indikaci k molekulárnímu vyšetření




• Detekce zaměřena na nukleotidovou sekvenci

ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA

TGCCGTAAGCCGTTGACACGTGAACCTGTATATGT

primer

primerJak vypadá výsledek výsledek

PCR

Jak vypadávýsledek

sekvenace

Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR?

mikrob 1

mikrob 2

A

ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACA

primery


varianta

mikrob 3 ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACA

mikrob 1

mikrob 2

B


primery

ACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACAACGGCATT TATACAACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACAACGGCATT TATACA

Jaké jsou možné cílové oblasti DNA pro PCR? varianta

mikrob 3 ACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACAACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACAACGGCATT TATACA

C


primery

ACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACAACTGCATT AATACAACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACAACTGCATT AATACAACGGCATTCGATTACTGTACACTTGCCCATATACAACTGCATT AATACA

mikrob 1

mikrob 2


ACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACAACGGCAAA GATACAACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACAACGGCAAA GATACAACGGCATTCGTCCACAGTGCACTTGGACATATACAACGGCAAA GATACAmikrob 3

D


primery

mikrob 1

mikrob 2


mikrob 3

A B C D

mikrob 1

mikrob 2

mikrob 3

Plán semináře:






PCR diagnostika

hledá se konkrétní patogen

Patogen specifické PCRPatogen specifické PCR

Důvod použití patogen specifického PCR

Příklad

• pomalý (žádný) růst• složitá identifikace• vysoká citlivost• biohazard

Mycobacterium tuberculosisBordetella pertussisPneumocystis jiroveciPůvodci bakter. meningitid

Chlamydia trachomatisChlamydia trachomatisNeisseria gonorrhoeae

Clostridium difficileStaphyloccocus aureus (MRSA)

respirační viry (influenza)

Nemá náhodou pacient černý kašel?(potřeba detekovat bordetelu, ostatní mikroorganismy mě nezajímají)

bordetela

chlamydia

mycoplasma

A B C D

cílová sekvence pro primery musí být unikátní pro bordetelu

PCR

DETEKCE + IDENTIFIKACE bordetely

Plán semináře:






PCR diagnostika

hledá se patogen, předem není

stanoveno jaký

Broad range PCRBroad range PCRneboli panbakteriální PCR

Důvod použitíbroad range PCR

Příklad

rychlá detekcevysoká citlivostpomalý (žádný) růst

sepseendokarditidy

Horečka. Jedná se o infekční proces? Co je jeho příčinou?(potřeba detekovat kteroukoliv bakterii,

protože kterákoli bakterie může způsobit sepsi)

A B C D

S. aureus

S. epidermidis

E. faecalis

cílová sekvence pro primery je přítomna u všech bakterií

E. faecalis

A B C D

S. aureus

S. epidermidis

E. faecalis

PCR (16S rDNA )

DETEKCE IDENTIFIKACE

+ sekvenace

E. faecalis

Výsledek sekvenace PCR produktu:

S. aureus

C T G A

Výsledek sekvenace PCR produktu:

C T G A

ID materiál 16S / 18S sekvenace kultivace

1 trikuspidální chlopeň Staphylococcus aureus negativní

2 aortální chlopeň Bartonella quintana negativní

3 aortální chlopeň Enterococcus faecalis negativní


5 mitrální chlopeň Streptococcus anginosus negativní

6 mitrální chlopeň Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

7 trikuspidální chlopeň negativní negativní

Výsledek broad range “16S PCR” – vzorky z kardiovaskulární chirurgie:


9 aortální chlopeň Bartonella quintana negativní

10 mitrální chlopeň Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis

11 aortální chlopeň Enterococcus faecium negativní

12 trikupidální chlopeň Enterococcus faecium negativní

13 mitrální chlopeň Candida glabrata Candida glabrata

14 aortální chlopeň Enterococcus faecalis negativní

15 mitrální chlopeň Staphylococcus aureus negativní

16 chlopeň Bartonella quintana negativní

datum materiál 16S sekvenace kultivace

Pacientka 65 let

OA: před 11 měsíci reimplantace TEP kyčleNO: bolest v místě kyčle trvající 4 dny

Fyzikální vyšetření: fluktuující ložisko 5x5 cm laboratoř: CRP 195

� klindamycin + levofloxacin po výsledku kultivace ampicilin/sulbaktam + levofloxacin

datum materiál 16S sekvenace kultivace

30.1.2015 punkce ložiska - hnis nezasláno k vyšetření E. coli

11 dní po operaci dimise; CRP 69

5.2.2015 tkáň během operační revize kloubu negativní S. epidermidis po pomnožení

5.2.2015 punktát během operační revize E. coli negativní

Plán semináře:






Důvod kvantifikace cestou MG P říklad

exaktní herpesviry u imunosuprimovanýchHIVHCV

Kolik má pacient po transplantaci kostní dřeně kopií viru EBV?

ACGGCATTCGGCAACTGTGCACTTGGACATATACA


primer sonda

• přístroje real time PCR (kvantitativní PCR)


primer

• přístroje real time PCR (kvantitativní PCR)

• ředicí řada (standardy o definované kvantitě)

107106

105

108107

EBV detekce pomocí PCR

1.E+02

1.E+03

1.E+04

1.E+05

1.E+06

1.E+07

Log

of v

iral q

uant

ity in

100

000

GE

7

6

4

3

2

5

LPD

Log

viro

vé n

álož

e na

100

000

g.e

.

DNA from whole blood

1.E-01

1.E+00

1.E+01

1.E+02

0 20 40 60 80 100 120

Days after HSCT

Log

of v

iral q

uant

ity in

100

000

GE

2

1

ND

0

Log

viro

vé n

álož

e na

100

000

g.e

.

Dny po HSCT

DNA z plné krve

Plán semináře:






Nový fenomén v klinické mikrobiologii:Hmotnostní spektrometrieHmotnostní spektrometrie

Identifikace přes proteiny

MALDI-TOF

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight

- identifikace narostlé bakteriální kultury

- rychlost identifikace v minutách- zrychlení diagnostiky o desítky hodin- zrychlení diagnostiky o desítky hodin

- široká škála mikroorganismů (2150 rodů)- přesnost, reprodukovatelnost nálezu- v ČR 35 přístrojů

Plán semináře:






Epidemiologie infekcíEpidemiologie infekcí::

• Odhalení epidemie• Odhalení přenosného (epidemického) kmene

??

Taxonomie

Rod Druh KmenRod Druh Kmen

Druh Kmen

strain

strain

strain

strain

strain

• sekvence je jedinečná pro daný kmen

Identifikace kmeneIdentifikace kmene

A B C D

kmen 1

• genotypizace

kmen 2

kmen 3

Analýza bakteriálních genů

(genomu)

Princip genotypizacePrincip genotypizace

Odhad příbuznosti mezi izoláty téhož druhu

Geneticky Klinicky + = Epidemický Geneticky blízké izoláty

Klinicky blízké izoláty

+ = Epidemický kmen

Metody genotypizaceMetody genotypizace

• „Gel (image)-based“

- Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)- PCR metody

- Random amplified polymorphic DNA analysis (RAPD)

- rep-PCR (repetitive elements: ERIC, REP, BOX)- Amplified fragment length polymorphism analysis (AFLP)

- Ribotypizace

Metody genotypizaceMetody genotypizace

• „Sequence-based“

- Multilocus sequence typing (MLST)

Plán semináře:






Centrum cystické fibrózy(300 pacientů)

2001 - zavedena PCR diagnostika bakterií Burkholderia cepacia- 30 % pacientů s pozitivním nálezem

1998 - kultivační diagnostika odhalila

infikovaných pacientů

1998 - kultivační diagnostika odhalila cca 15 % pozitivních pacientů

- vyčleněna samostatná ambulance jen pro „cepaciové“ pacienty

do 1999 - pořádání letních táborů pro nemocné CF

30%30%

RAPD

ID atpD gltB gyrB recA lepA phaC trpB ST

1 16 11 10 14 11 6 79 32

2 16 11 10 14 11 6 79 32

MLST

2 16 11 10 14 11 6 79 32

3 16 11 10 14 11 6 79 32

infikovaných pacientů Kmen

ST-32

30%30% 96%96%

Princip izolačního režimu v centrech CF:

• Žádný pacient s CF by se neměl setkat s druhým pacientem s CF.

• Zvláště rizikové je setkání dvou pacientů s odlišným mikrobiologickým nálezem.

1. pacienti bez infekce (nekolonizovaní)2. pacienti s infekcí Pseudomonas aeruginosa3. pacienti s infekcí Burkholderia cepacia

Globální rozšíření ST32

Vysvětlení jevu ?

Vysvětlení jevu ?

Vysvětlení jevu ?

Další příklady ze života

Epidemie P. aeruginosa

Hematoonkologie (Itálie), oddělení otevřeno v březnu 2006

červen 2007: 2 zemřelí v jednom týdnu

- kmen PA, shodný ATBgram � uzavření jednotky- kmen PA, shodný ATBgram � uzavření jednotky� epidemiologické šetření

- retrospektivní studie- prospektivní studie - identifikace asymptomatických případů- HCW- audit hygienických pravidel- kontrola prostředí

Retrospektivní analýzabřezen 2006 - červen 200778 pts10 případů

hetegenní profil 3 izoláty stejný profil

Prostředí: 29 vzorků (desinfekce, odpady, umyvadla, sprchy …)

P. aeruginosa

P. mendocina P. aeruginosa

P. aeruginosa

P. stutzeri

dávkovač mýdla

odpady umyvadla

pacienti

Epidemie E. coli

• E. coli O104:H4 ~ (EHEC, EAEC), STEC

květen 2011 Německo

3,842 případů- 2,987 GI 18 úmrtí- 855 HUS 35 úmrtí

STEC O104:H4

příčina: klíčky/výhonky ? (nikoli maso x EHEC 0157:H7)časem zaznamenán i interhumánní přenos

sekvenovaný genom:• původ v EAEC,

ovšem zde navíc gen stxovšem zde navíc gen stx

• horizontální transfer - kombinace faktorů virulence EHEC (profág) a EAEC (plazmid)

• specifické PCR

EAEC

+profág s genem pro Shiga toxin

= STEC O104:H4

ZávěremZávěrem

• V klinické praxi mají molekulární metody své místo v předem definovaných situacích

- toho, co se špatně kultivuje- tam, kde se jedná o rychlost: infekce u kritických stavů- tam, kde zůstává podezření na infekční etiologii,

ale bez pozitivního nálezu

MMetody molekulární genetiky etody molekulární genetiky v ... · Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight - identifikace narostlé bakteriální kultury - rychlost

Documents