Jan 14, 2016
A MITOCÔNDRIAGlicose
Responsável pela energia celular
Possui seu próprio DNA
mtDNA
Local de várias rotas metabólicas
A MITOCONDRIAGlicose
Responsável pela energia celular
Possui seu próprio DNA
mtDNA
Local de várias rotas metabólicas
Espaço intermembranas
Matriz: diversas proteínas e ciclo de Krebs e o mtDNA
Membrana
interna: CRM
Membrana
externa crist
a
Subunidades codif.pelo mtDNA
Subunidades codif.pelo nDNA
7 0 1 3 2 = 13
39 4 10 10 12 = 75
CADEIA RESPIRATÓRIA CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIALMITOCONDRIAL
complexo I complexo II complexo III complexo IV complexo V
Succinato fumarato
gordura
carboidrato
proteínas
Dig
est
ão e
ab
sorç
ão
Ácidos graxos
+ glicerol
glicose
amino ácidos
MITOCÔNDRIA
Acetil CoA
Ciclo de
Krebs 2H
Beta -oxidação
ADP
ATP
O2
H2O
CRM
OXOPHOS: requer uma OXOPHOS: requer uma ação orquestrada de 5 ação orquestrada de 5 complexos enzimáticos complexos enzimáticos com transferência de com transferência de elétrons pelos carreadores elétrons pelos carreadores NADH e FADHNADH e FADH2 2 para a para a molécula de oxigênio molécula de oxigênio
gradiente eletroquímico que gradiente eletroquímico que converte ADP em ATPconverte ADP em ATP
Produção aeróbia de energia:
AS DOENÇAS MITOCONDRIAISAS DOENÇAS MITOCONDRIAIS
Patologias de expressão clínica Patologias de expressão clínica heterogênea caracterizadas por uma heterogênea caracterizadas por uma disfunção na produção de energia disfunção na produção de energia
CERÉBRO
MÚSCULO CORAÇÃO
MULTISSISTÊMICAS
MIOPATIAINSUF. MEDULA ÓSSEA
INSUF. HEPATICA
TUBULOPATIA RENAL
CARDIOMIOPATIA HIPERTRÓFICA
OU
DILATADA
DEFEITO DE CONDUÇÃO CARDÍACO
ALTERAÇÕES NA FIBRA MUSCULAR
FRAQUEZA
FADIGA
INTOLERÂNCIA AO EXERCÍCIO
NEUROPATIA PERIFÉRICA
ALT. TIREÓIDE
DIABETE MELITUS
BAIXA ESTATURA
ENCEFALOPATIA
CONVULSÕES
RETINITE PIGMENTAR
DEMÊNCIA
DEPRESSÃO
ATAXIA
ENXAQUECA
AVC
SURDEZ NEUROSSENSORIAL
HERANÇA MITOCONDRIALHERANÇA MITOCONDRIAL
nN
CÉLULA PROGENITORA
N
Proliferação mtDNA e Citocinese
Segregação Randomizada
90% 70% 50% 30% 10%
Limiar para a expressão fenotípica
FENÓTIPO FENÓTIPO
A herança materna:Cada célula
humana contém 100 mitocôndrias
e cada uma contém 2 a 10
cópias de mtDNA
37 genes:37 genes:
2 RNAs 2 RNAs
ribossômicos ribossômicos
22 RNAs22 RNAs
transportadorestransportadores
13 RNAs 13 RNAs mensageiros = 13 mensageiros = 13 genes que genes que codificam para as codificam para as proteínas da CRMproteínas da CRM
mtDNAmtDNA
DOENÇAS MITOCONDRIAISDOENÇAS MITOCONDRIAIS
Devido ao número variável de mitocôndrias e de Devido ao número variável de mitocôndrias e de mtDNA nos diferentes tecidos mtDNA nos diferentes tecidos co-existência de co-existência de mtDNA normal e mutado mtDNA normal e mutado Heteroplasmia.Heteroplasmia.
Mesma mutação Mesma mutação diferentes manifestações diferentes manifestações clínicas.clínicas.
Diferentes mutações Diferentes mutações manifestação clínica igual. manifestação clínica igual.
Crianças X adultos.Crianças X adultos.
Elevada freqüência: 1/5.000- 10.000 nascidos Elevada freqüência: 1/5.000- 10.000 nascidos vivosvivos(McFarland R. (McFarland R. et alet al, 2002)., 2002).
Causadas por mutações que envolvem o genoma Causadas por mutações que envolvem o genoma mitocondrial e nuclear.mitocondrial e nuclear.
deleções e duplicações
de larga escala
esporádico
CLASSIFICAÇÃO
Mutações do mtDNA
Mutações do DNA nuclear
CPEO - Oftalmoplegia Externa Crônica Progressiva
KSS - Síndrome de Kearns Sayre – alterações cardíacas, proteínorraquia elevada,
oftalmoplegia
PS – Síndrome de Pearson – alterações na medula óssea – pancitopenia, anemia sideroblástica
DOENÇA MULTISSISTÊMICA
PADRÃO MIOPÁTICO
CPEO –17 ANOS
KSS –35 ANOS
KSS–30 ANOS
KSS –35 ANOS
CPEO –30 ANOS
10 ANOS
8 ANOS
13 ANOS
13 ANOS
CLASSIFICAÇÃO
Mutações do mtDNA
mutações de ponto e microdeleç
ão
Herança materna > 200 tipos
diferentes
tRNA:tRNA:MELAS- Miopatia, Encefalopatia, Acidose Lática e
Episódios de Acidente Vascular Cerebral (Mutação A3243G)
MERRF- Epilepsia Mioclônica com Fibras Rotas Vermelhas (RRF) (Mutação A8344G)
NARP- Neuropatia, Ataxia e Retinopatia Pigmentar (mutação T8993G)
Síndrome de LEIGH (DE TRANSMISSÃO MATERNA)-
Encefalomiopatia Subaguda Necrotizante
mRNA: gene ATPase
DOENÇA MULTISSISTÊMICA
ENCEFALOPATIA PROGRESSIVA
MELAS – PACIENTE 18 ANOS
MELAS – PACIENTE 7 ANOS
LEIGH – PACIENTE 1 ANO RRF
CLASSIFICAÇÃO
Mutações do mtDNA
Mutações do DNA nuclear
defeitos bioquímicos
na CRM
Herança mendeliana
CLASSIFICAÇÃO
Mutações do mtDNA
Mutações do DNA nuclear
Defeitos de sinalização
intergenômica
deleções e duplicações de larga
escala
DIAGNÓSTICO DAS MIOPATIAS DIAGNÓSTICO DAS MIOPATIAS MITOCONDRIAISMITOCONDRIAIS
Manifestações Clínicas Músculo: CPEO, fraqueza, fadigaSNC: ataxia, surdez, atrofia óptica
HF sugestiva
Investigação Clínica
Sindrome mitocondrial?(MELAS, MERRF,NARP,LHON) SIM
Testar mutações comuns no sangue
Negativo
NÃO
BIOQUÍMICA
HISTOQUÍMICA
MOLECULAR
ASPECTOS HISTOQUÍMICOSASPECTOS HISTOQUÍMICOS
Corte transversal de tecido muscular: Paciente com S. de Kearns Sayre apresentando hiperatividade (RRF) em SDH e ausência de atividade em Citocromo C Oxidase
RRF na coloração de Tricromio de Gomori.
RRF representada na reação SDH.
Hipoatividade da citocromo C oxidase
ASPECTOS BIOQUÍMICOSASPECTOS BIOQUÍMICOS
Medida da atividade das enzimas da CRM por fluorimetria
Idealmente com homogeneizado de tecido muscular fresco - Medida dos Complexos I, II, III, IV, V
Trabalhoso
Custo elevado
Difícil padronização
Difícil interpretação
Defeitos isolados ou mistos
ASPECTOS MOLECULARESASPECTOS MOLECULARES
Mutações de ponto:
A3243G, 3271-T, A8344G, T8356C e T8993G PCR e digestão por endonuclease de restrição.
Deleção:
Extração de DNA (músculo) digestão com a PvuII separação dos fragmentos por eletroforese em gel de agarose 0,8% transferência para membrana de nylon Hybond+ hibridização com sonda previamente marcada com o kit ECLTM Direct nucleic acid labelling and detection system auto-radiografia da membrana.
Seqüenciamento:
método da terminação por fluorescência em seqüenciador automático (ABI PrisMTM 310 - Applied Biosystems).
Canaleta 1: controle positivo; canaletas 3 e 7: pacientes com uma deleção no DNA mitocondrial; canaletas 2, 4, 5 e 6: pacientes que não apresentam uma deleção no DNA mitocondrial.
1 2 3 4 5 6 7 16.569 kb
11.592 kb
Auto-radiografia da detecção de deleções no mtDNA
Arpa, J. et al. Prevalence and Progression of Mitochondrial Diseases: a study of 50 patients
Muscle Nerv 28: 690-695, 2003
PROGNÓSTICOPROGNÓSTICO
TRATAMENTOTRATAMENTO
1) Acompanhamento multidisciplinar: neuro, oftalmo, endócrino, cardio, nefro, gastro, fisioterapeuta, outros.
2) Exercício físico regular individualizado e respeitando limites
3) Evitar stress físico e mental, frio, calor, uso de alcool, nicotina, medicações como corticóides, ác. Valpróico, barbitúricos, tetraciclina, cloranfenicol, etc.
4) Dieta: regular, evitar jejum prolongado, redução de gorduras e rica em CH.
TRATAMENTOTRATAMENTO
5) Vitaminas e outras medicações: sem comprovação científica, tto empírico, mínimo benefício:
• Aceptores de elétrons como a menadiona (vitamina K3) e filoquinona (vitamina K1), e ácido ascórbico (vitamina C) tem sido usados no sentido de melhorar o transporte de elétrons na cadeia respiratória,
• Riboflavina (vitamina B2), na dose de 50-100 mg/dia age como cofator dos complexos I e II.
• Coenzima Q10 (5-15 mg/kg/dia)
• Creatina 100-200 mg/kg/dia
• Dicloroacetato – redução dos níveis de lactato
UM ESTUDO CLÍNICO, BIOQUÍMICO,
HISTOQUÍMICO E GENÉTICO-MOLECULAR
DE PACIENTES COM DOENÇAS DO DNA
MITOCONDRIAL
VARIÁVEL PROBABILIDADEVARIÁVEL PROBABILIDADE
Alta
Combinação de sintomas multisistêmicos patognomônicos de doença mitocondrial, incluindo, no mínimo, 3 sistemas (neurologico, muscular, cardíaco, endócrino, gastrointestinal, renal, hematológico, otológico, oftalmológico ou hepático);
Apresentação de síndrome clássica como MELAS, MERRF, Kearns Sayre, Leigh com herança materna;
Baixa
Crianças com encefalopatia não específica apresentando crises convulsivas, acidose lática e/ou hipotonia;
Pacientes com evolução atípica de doença envolvendo SNC sem achados clínicos característicos e em que já foram excluídas outras patologias;
Sintomas isolados: AVC em pacientes jovens, cardiomiopatia, manifestações endocrinológica ou neurológicas;
43 pacientes
Triagem para 5 mutações de ponto PCR/RFLP
5 pacientes com mutação de ponto no mtDNA (11.6%)
38 sem mutação detectada no mtDNA (88.4%)
4 pacientes com A3243G 1 paciente com T8993G
Biópsia de músculo
SIM23 (53.5%)
NÃO15 (34.9%)
Sequenciamento do tRNALeu(UUR) and tRNAlys
Southern blot
12 pacientes com deleção (27.9%)
26 pacientes negativos para as mutações investigadas
(60,5%)
11 pacientes negativos(25.6%)
RESULTADOS – RESULTADOS – análise de mutaçõesanálise de mutações
Mutação no mtDNA: 17 (39,5%)
RESULTADOS – RESULTADOS – comparação dos positivos com comparação dos positivos com negativosnegativos
Positivo para mutação mtDNA
Negativo para mutação mtDNA
Valor p
Média de idade início dos sintomas 29.5* 17.1* < 0.001
Média de idade na avaliação 28.8* 17.5* 0.004
Média do lactato jejum 18.4* 13.5* NS
Média lactato pós-prandial 17.9* 13.0* NS
Diferença do lactato pré e pós prandial
20.1* 16.4* NS
% (N) % (N)
Sinais e sintomas clínicos:
óbito 23.5 (4) 11.5 (3) NS
alteração EEG 52.9 (9) 65.4 (17) NS
Alteração ENMG (miopatia) 46.7 (7) 11.5 (3) 0.032
Alteração TC ou RNM 64.7 (11) 42.3 (11) NS
Retinopatia pigmentar 41.2 (7) 3.8 (1) 0.007
Oftalmoplegia e ptose palpebral 70.6 (12) 19.2 (5) 0.002
Baixa estatura 59.0 (10) 23.1 (6) 0.04
Atraso no DNPM 35.3 (6) 53.8 (14) NS
Convulsões 41.0 (7) 65.4 (17) NS
Hipotrofismo 76.5 (13) 38.5 (10) 0.033
Acidose lática 82.4 (14) 34.6 (9) 0.006
Herança materna 5.9 (1) 19.2 (5) NS
* Média do Rank
RESULTADOS – RESULTADOS – comparação dos positivos com comparação dos positivos com negativosnegativos
Positivo para mutação mtDNA
Negativo para mutação mtDNA
Valor p
Média de idade início dos sintomas 29.5* 17.1* < 0.001
Média de idade na avaliação 28.8* 17.5* 0.004
Média do lactato jejum 18.4* 13.5* NS
Média lactato pós-prandial 17.9* 13.0* NS
Diferença do lactato pré e pós prandial
20.1* 16.4* NS
% (N) % (N)
Sinais e sintomas clínicos:
óbito 23.5 (4) 11.5 (3) NS
alteração EEG 52.9 (9) 65.4 (17) NS
Alteração ENMG (miopatia) 46.7 (7) 11.5 (3) 0.032
Alteração TC ou RNM 64.7 (11) 42.3 (11) NS
Retinopatia pigmentar 41.2 (7) 3.8 (1) 0.007
Oftalmoplegia e ptose palpebral 70.6 (12) 19.2 (5) 0.002
Baixa estatura 59.0 (10) 23.1 (6) 0.04
Atraso no DNPM 35.3 (6) 53.8 (14) NS
Convulsões 41.0 (7) 65.4 (17) NS
Hipotrofismo 76.5 (13) 38.5 (10) 0.033
Acidose lática 82.4 (14) 34.6 (9) 0.006
Herança materna 5.9 (1) 19.2 (5) NS
* Média do Rank