MINISTERUL EDUCAIEI, CERCETRII, TINERETULUI I SPORTULUI UNIVERSITATEA DE VEST „VASILE GOLDI” ARAD FACULTATEA DE TIINE CATEDRA DE BIOLOGIE Annamaria (Pallag) Ritli EFECTELE TERAPIEI ANTICANCEROASE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR Rezumatul tezei de doctorat Conductor tiinific Prof. univ. dr. Aurel Ardelean - ARAD, 2010 –
20
Embed
MINISTERUL EDUCA IEI, CERCET RII, TINERETULUI I SPORTULUI ... · Se eviden iaz anizocitoza, celule gigante, o morfologie foarte variat a nucleilor, cromatina granular neomogen , raportul
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
UNIVERSITATEA DE VEST „VASILE GOLDI�” ARAD FACULTATEA DE �TIIN�E CATEDRA DE BIOLOGIE
Annamaria (Pallag) Ritli
EFECTELE TERAPIEI ANTICANCEROASE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR
Rezumatul tezei de doctorat
Conduc�tor �tiin�ific Prof. univ. dr. Aurel Ardelean
- ARAD, 2010 –
2
CUPRINS INTRODUCERE............................................................................................................. 6 PARTEA I. ASPECTE GENERALE............................................................................
42 2.1. Caracteristicile fenotipice ale celulei maligne....................................................... 42 2.2. Generalit��i despre chimioterapia antineoplazic�................................................ 45 2.2.1. Principiile generale ale chimioterapiei antineoplazice...................................... 46 2.2.2. Clasificarea medicamentelor antineoplazice...................................................... 48 2.3. Modalit��i de urm�rire a efectelor chimioterapiei............................................... 50 PARTEA A II-A. CERCET�RI PROPRII..................................................................
CAPITOLUL 4. MATERIALE �I METODE UTILIZATE......................................
59
4.1. Organizarea cercet�rii............................................................................................. 59 4.1.1. Stabilirea loturilor de studiu pentru tumori solide……………........................ 59 4.1.1.1. Organizarea loturilor pentru studiul tumorilor mamare.............................. 59 4.1.1.2. Organizarea loturilor pentru studiul tumorilor colorectale.......................... 61 4.1.1.3. Descrierea administr�rii ciclurilor de tratament antiangiogenetic………... 63 4.1.2. Alegerea �i stabilirea loturilor de studiu pentru hemopatii maligne................ 65 4.1.2.1. Organizarea lotului de studiu LA..................................................................... 69 4.1.2.2. Organizarea lotului martor LA-M................................................................... 71 4.2. Metode �i tehnici utilizate în studiul efectelor terapiei antineoplazice asupra metabolismului energetic celular în tumori solide �i hemopatii maligne...................
71
4.2.1. Metode histologie................................................................................................... 71 4.2.2. Tehnici histoenzimatice........................................................................................ 73
4.2.2.1. Metoda Wachstein i Meissel pentru determinarea activit�ii adenozintrifosfatazei (ATP-azei).............................................................................
75
4.2.2.2. Metoda Hess-Scarpelli-Pearse pentru determinarea activit�ii lactatdehidrogenazei (LDH)..........................................................................................
75
4.2.2.3. Metoda Nachlas-Tsou-Souza-Chang-Seligman pentru determinarea activit��ii succinatdehidrogenazei (SDH)......................................................................
76
3
4.2.3. Tehnici imunohistochimice................................................................................... 77 4.2.4. Tehnici biochimice................................................................................................ 81 4.2.4.1. Determinarea malondialdehidei prin metoda colorimetric�......................... 81 4.2.4.2. Determinarea ceruloplasminei prin metoda colorimetric� (metoda Ravin)…………………………………………………………………………………...
84
4.2.5. Metode �i tehnici hematologice............................................................................ 86 4.2.5.1. Testul cu nirtobleu tetrazolium (NBT)............................................................. 86 4.2.5.2. Studiul apoptozei prin analize de citometrie în flux....................................... 87 4.2.6. Metode pentru evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional în timpul tratamentului antineoplazic �i a tratamentului antiangiogenetic...............................
90
4.2.6.1. Utilizarea m�sur�torilor antropometrice....................................................... 92 4.2.6.2. Utilizarea chestionarelor pentru evaluarea st�rii de s�n�tate �i a st�rii func�ionale ......................................................................................................................
5.1. EFECTELE TERAPIEI ANTICANCEROASE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELLULAR ÎN TUMORI SOLIDE.............
94
5.1.1. Rezultatele analizelor histologice......................................................................... 96 5.1.2. Rezultatele analizelor histoenzimatice................................................................ 104 5.1.3. Studiul neoangiogenezei……………………....................................................... 122 5.1.4. Studiul apoptozei cu ajutorul tehnicii imunohistochimice de eviden�iere a citocromului c citosolic……………………….………………………………………..
134
5.1.5. Influen�a terapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului �i a sistemelor antioxidante plasmatice......................................................
144
5.1.6. Evolu�ia statusului metabolic �i nutri�ional în timpul tratamentului antiangiogenetic...............................................................................................................
159 5.2.1 Studiul activit��ii enzimelor oxidoreduc�toare în timpul polichimioterapiei antineoplazice în leucemii acute……………….............................................................
160
5.2.2. Studiul apoptozei în leucemii acute prin citometrie în flux.............................. 165 5.2.3. Influen�a polichimioterapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului �i a sistemelor antioxidante plasmatice în leucemiile acute.
BIBLIOGRAFIE............................................................................................................. 186 Lista lucr�rilor �tiin�ifice publicate din teza de doctorat…………………................ 202 Anexe................................................................................................................................ 204
4
“Metabolismul celulelor maligne
reprezint� tendonul lui Achile pentru tumori.” �������������� �������������
PARTEA I. ASPECTE GENERALE
Se cunoa�te de mult faptul c� celula tumoral� are un metabolism modificat. La începutul secolului XX. cercet�torul german O. Warburg a ini�iat cercet�ri privind
leg�tura dintre alterarea respira�iei mitocondriale �i apari�ia celulelor canceroase. El a propus un mecanism pentru a explica transform�rile care duc la procesul carcinogenezei, punând în eviden�� c� la baza carcinogenezei st� “stricarea ma�in�riei respiratorii” �i cre�terea sintezei de ATP pe cale glicolitic� (Warburg O., 1956; Carew J.S. �i colab., 2002).
Celulele maligne î�i satisfac necesit��ile energetice prin producerea unei cantit��i mari de ATP prin glicoliz� �i nu prin fosforilare oxidativ�, dar astfel aceste celule vor consuma cantit��i mult mai mari de glucoz�.
Aceasta reprezint� o deosebire dintre celulele maligne �i normale, care utilizeaz� fosforilarea oxidativ� pentru sinteza de ATP, proces cu eficien�� mult mai mare.
Organitele celulare implicate direct în desf��urarea metabolismului energetic celular sunt mitocondriile.
Etapele metabolismului energetic celular au leg�turi strânse cu generarea speciilor reactive ale oxigenului, cu ini�ierea procesului de apoptoz� celular�, precum �i cu fenomenele de hipoxie, perturbarea ciclului celular �i angiogenez�. Orice perturbare la nivelul acestor mecanisme vor avea ca rezultat modific�ri sesizabile la nivelul întregului organism.
În ultimii ani, au fost eviden�iate o multitudine de evenimente �i mecanisme biologice ce reflect� interac�iunea permanent� a celulelor maligne cu organismul gazd�, rezultatul fiind un proces selectiv continuu �i secven�ial.
Medicamentele antineoplazice sau citostaticele utilizate ac�ioneaz� prin inhibarea diviziunii sau prin distrugerea celulelor canceroase �i au o selectivitate foarte variat�.
Aten�ia cercet�torilor se îndreapt� azi c�tre posibilit��ile terapeutice oferite de medicamentele care ac�ioneaz� prin modificarea metabolismului energetic al celulelor tumorale.
PARTEA II. CERCET�RI PROPRII
Pornind de la aceste premize am considerat util� ini�ierea unui studiu pentru eviden�ierea mecanismelor metabolismului energetic care sunt modificate în urma tratamentului antineoplazic. Pornind de la nivel celular, molecular �i ajungând la nivelul organismului am studiat efectele terapiei antineoplazice asupra metabolismului �i în special asupra metabolismului energetic.
Din dorin�a de a ob�ine rezultate cât mai exacte �i complete, având în vedere în acela�i timp diversitatea neoplaziilor maligne, a manifest�rilor clinice �i patofiziologice extrem de complexe, cercet�rile noastre s-au orientat spre cele dou� mari grupe de neoplazii maligne, tumorile solide �i hemopatiile maligne. Din acest punct de vedere partea practic� a lucr�rii se împarte în dou� subcapitole independente.
În cadrul tumorilor solide studiul s-a realizat cu scopul investig�rii evenimentelor ce caracterizeaz� metabolismul energetic celular în timpul terapiei antineoplazice cu bevacizumab. Au fost inclu�i în studiu pacien�i cu neoplazie mamar� �i colorectal� care au parcurs tratamentul primar antineoplazic cu r�spuns par�ial (RP) sau boal� sta�ionar� (BS). Nu au fost inclu�i pacien�i care au prezentat r�spuns complet (RC) sau boal� în evolu�ie
5
(BEv) dup� tratamentul primar. În lotul A sunt inclu�i pacien�ii cu tumori mamare, în lotul B pacien�ii cu tumori colorectale.
În lotul A.I. de studiu, format din 21 paciente (vârsta medie 56,50 ± 10,60 ani), au fost inclu�i paciente care dup� parcurgerea tratamentului oncologic primar nu au primit tratament antiangiogenetic. Acest lot reprezint� lotul martor din punct de vedere a cercet�rii r�spunsului la tratamentul antiangiogenetic. În lotul A.II. de studiu, format din 22 paciente (vârsta medie 53,75 ± 12,77 ani), au fost inclu�i paciente care dup� tratamentul oncologic primar au urm�rit un tratament antiangiogenetic cu bevacizumab.
Lotul B.I. sau lotul martor cuprinde 24 pacien�i (vârsta medie 57,55± 9,80 ani) care dup� parcurgerea tratamentului oncologic primar nu au primit tratament antiangiogenetic, iar în lotul B.II sau lotul de studiu au fost inclu�i 22 pacien�i (vârsta medie 54,95 ±10,25 de ani) care dup� tratamentul oncologic primar au urm�rit un tratament antiangiogenetic cu bevacizumab.
În cazul hematopatiilor maligne s-au urm�rit acelea�i efecte de modificare a metabolismului energetic în urma aplic�rii de tratamente citostatice polichimioterapeutice standard.
Lotul de studiu LA cuprinde 21 bolnavi cu leucemie acut�, din care 18 cu LAL (leucemie acut� limfoblastic�), 3 cu LAM (leucemie acut� mieloblastic�), copii cu vârsta cuprins� între 0-16 ani. Pentru oganizarea lotului martor M-LA, am selectat caz pereche, 20 persoane s�n�toase, care prezint� urm�toarele caractere comune cu lotul de studiu LA: vârst�, sex, mediul de provenien��.
Obiectivele stabilite de la început ne-au permis s� apreciem în mod punctual:
- efectul tratamentului antineoplazic la nivel celular în tumori solide prin evaluarea intensit��ii desf��ur�rii metabolismului energetic; - corela�ia dintre ac�iunea biologic� a tratamentului antiangiogenetic, neoangiogeneza �i poten�ialul apoptotic al celulelor tumorale; - evolu�ia nivelului speciilor reactive ale oxigenului în timpul tratamentului citostatic �i antiangiogenetic; - evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional precum �i a st�rii de s�n�tate în timpul tratamentului antiangiogenetic; - impactul produs de tratamentul antineoplazic polichimioterapeutic în hemopatii maligne, asupra celulelor prin corelarea procentului de celule apoptotice, activitatea enzimelor oxidoreduc�toare �i evolu�ia nivelului speciilor reactive ale oxigenului; - corelarea datelor ob�inute �i punerea în eviden�� a importan�ei practice
Pentru realizarea obiectivelor propuse am efectuat o gam� complex� de analize bazate pe metode �i tehnici biochimice, hematologice, histologice, histoenzimatice �i imunohistochimice, dar �i m�sur�tori antropometrice �i chestionare pentru evaluarea calit��ii vie�ii pacien�ilor.
REZULTATE �I DISCU�II
EFECTELE TERAPIEI ANTICANCEROASE ASUPRA METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR ÎN TUMORI SOLIDE
Analizele au început la nivel macroscopic a pieselor proaspete preluate de la sec�ia
de chirurgie imediat dup� extirpare (10-15 minute), continuate apoi de analize histologice, histoenzimologice �i imunohistochimice în laboratorul de Anatomie patologic�, a Spitalului Clinic Jude�ean de Urgen��, Oradea.
Fiecare caz din studiu reprezint� un pacient de la care s-a recoltat material biopsic, fie prin interven�ie minim�, fie prin interven�ie larg�. Colora�ia uzual� HE pune în eviden�� structura tisular� general� �i unele tr�s�turi celulare, fiind utilizate pentru toate tipurile de
6
preparate histologice. La pacine�ii din lotul AI, cu carcinom ductal invaziv cu recidive loco-regionale la colora�ia hematoxilin�-eozin� (HE), apar microscopic celule carcinomatoase dispuse sub form� de glande sau sub forma unor grupuri izolate. Se eviden�iaz� anizocitoza, celule gigante, o morfologie foarte variat� a nucleilor, cromatina granular� neomogen�, raportul nucleo-citoplasmatic evident modificat în favoarea nucleului, distrofie la nivelul citoplasmei, alterând cu zone în care citoplasma este eozinofil�.
Fig.II.11. Lotul AI Carcinom ductal invaziv. a -
mitoz� atipic�, b - vas de sânge intratumoral,
c - distrofie citoplasmatic� (HE X400)
Fig.II.12. Lotul AI Carcinom ductal invaziv.
cu s�geat� sunt marcate mitoze atipice (HE
X400)
La lotul de studiu AII, la colora�ia cu hematoxilin�-eozin�, apare invazie tumoral�,
boal� în plin� evolu�ie. Dup� �ase luni de tratament antiangiogenetic, în urma anlizelor f�cute în colora�ia hematoxilin�-eozin�, la obiectivul X40 �i detaliu, s-au putut identifica corpii apoptotici (Fig II.17, II.18.). În loturile BI �i BII au fost inclu�i pacien�i cu cancer metastatic colonorectal la care s-au ob�inut rezultate asem�n�toare.
Fig. II.17. Lotul AII (luna 6) Carcinom ductal
invaziv Eviden�ierea corpilor apoptotici,(HE X
400)
Fig. II.18. Eviden�ierea corpilor apoptotici,
a- cromatina nuclear� în form� de semilun�; b-
halou clar în jurul celulei (HE X 1200 ) Rezultatele analizelor histoenzimatice Colora�iile speciale, cum sunt cele histoenzimologice �i imunohistochimice permit
eviden�ierea unor mecanisme �i structuri moleculare. Analizele histoenzimatice au fost incluse astfel în protocolul experimental, cu ajutorul lor se poate preciza desf��urarea diferitelor procese metabolice în celule �i �esuturi (Mure�an E. �i col.,1976) permi�ând eviden�ierea unei activit��i enzimatice în chiar situsul celular în care se produce aceasta (Ross M.H. �i col., 2007). Pe de alt� parte, integritatea frac�iunilor subcelulare poate fi demonstrat� printr-o activitate specific� mare a enzimelor caracteristice acelei frac�iuni. Astfel, pentru mitocondrii �i activitatea enzimatic� mitocondrial� marker enzimatic specific este adenozintrifosfataza (ATP-aza) �i succinatdehidrogenaza (SDH), (Mixici �i col, 1997), iar pentru matricea citoplasmatic�, terenul glicolitic, lactat dehidrogenaza (LDH). (Rusu �i col. 2005, Cucuianu M.. �i col., 1998, Rusu M.A. �i col., 1980).
7
Deoarece tehnicile de colorare histoenzimatice utilizate nu permit vizualizarea structurilor tisulare, pentru analiza imaginilor microscopice �i cuantificarea rezultatelor s-au achizi�ionat câte trei imagini la m�rimea X200, imaginile au fost captate cu camer� digital� �i stocat� ca fil� JPEG (1550x1070 pxl, 16,7 milioane culori, 24-bit). la nivelul acestor imagini s-au ales aleator 10 câmpuri diferite, în care evaluarea activit��ii enzimatice s-a realizat semicantitativ, astfel:
� = lipsa activit��ii enzimatice; �/+ = activitate enzimatic� sc�zut�; + = activitate enzimatic� intens�; ++ = activitate enzimatic� foarte intens� (Tudose N., Laz�r E, 1996; Olinici C.D.,
Vaida M.F., 1997; Fox S.B., Harris A.L, 2004; Bancroft J.D., Gamble M., 2007). Rezultatele ob�inute s-au centralizat, astfel am primit o imagine real� �i cuantificat�
asupra activit��ii enzimelor studiate.
Studiul activit��ii adenozintrifosfatazei (ATP-azei) ATP-aza se vizualizeaz� printr-o colora�ie brun� prin metoda Waschstein �i Meissel.
Lot A I. Luna 0 Lot A I. Luna 6 Lot A II. Luna 0 Lot A II. Luna 6
++ 28,3
+/- 30,5
+ 41,2
++ 37,1
+/- 26,4
+ 36,5
++ 24,2
+/- 27,3
+ 48,5
++ 8,7
+/- 52 +
39,3
Fig.II.29. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii ATP-azice la loturile AI �i AII
Atât la lotul de studiu AII cât �i la lotul de studiu BII se observ� o sc�dere a activit��ii
ATP-azice în urma tratamentului antiangiogenetic.
Lot B I. Luna 0 Lot B I. Luna 6 Lot B II. Luna 0 Lot B II. Luna 6
++38,1
+/- 25,9
+ 36
++40,5
+/- 23
+ 36,5
++ 34
+/- 27,9
+ 38,1
++5
+/- 38,4
+ 56,4
Fig. II.34. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii ATP-azei la loturile BI �i BII
Fig. II.35. Lotul BII (luna 0) Adenocarcinom
de colon. Activitate ATP-azic� (X100);
cu s�ge�i sunt marcate zonele cu activitate
enzimatic� intens�
Fig. II.36. Lotul BII (luna 6) Adenocarcinom
de colon ascendent Activitate ATP-azic�
(X100);cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
activitate enzimatic� intens�
8
Studiul activit��ii lactatdehidrogenazei (LDH)
Enzima lactat dehidrogenaza (LDH) localizat� în citoplasm� se eviden�iaz� histoenzimatic printr-o colora�ie albastru închis�.
Lot A I. Luna 0 Lot A I. Luna 6 Lot A II. Luna 0 Lot A II. Luna 6
+ 49,4
+/- 11,3
++40,3
+ 54,4
+/- 9,5
++36
+ 48,4
+/- 17,4++
34,2
++ 35,1
+/- 7,4
+ 57,5
Fig. II.39. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii LDH la loturile AI �i AII
Fig. II.38. Lotul AII (luna 0) Activitatea LDH
(X100); cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
activitate enzimatic� intens�
Fig.II.40. Lotul AII (luna 6) Activitatea LDH
(X100); cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
activitate enzimatic� intens�
Se remarc� o cre�tere a activit��ii LDH la loturile de studiu AII �i BII fa�� de loturile martor AI �i BI (Fig. II.39, II.44).
Lot B I. Luna 0 Lot B I. Luna 6 Lot B II. Luna 0 Lot B II. Luna 6
+ 56
+/- 6,6
++37,4
+ 52,4
+/- 8,1
++39,5
+ 53,6
+/- 10,1
++36,3
++ 56,1
+/- 6,2
+ 47,7
Fig. II.44. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii LDH la loturile BI �i BII
Studiul activit��ii succinatdehidrogenazei (SDH)
Succinatdehidrogenaza (SDH) a fost pus� în eviden�� cu ajutorul metodei Nachlas-Tsou-Souza-Chang-Seligman.
Locurile tisulare cu activitate enzimatic� apar colorate în albastru. Activitatea enzimei d� indica�ii despre func�ionarea ciclului Krebs.
9
Lot A I. Luna 0 Lot A I. Luna 6 Lot A II. Luna 0 Lot A II. Luna 6
+ 31
+/- 46,4
++22,6
++ 20,3
+/- 51,2
+ 28,5
+ 42,3
+/- 47,3
++10,4
+ 28,5
+/- 67,5
++4
Fig. II.48. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii SDH la loturile AI �i AII
Fig. II.50. Lotul BII (luna 0) Activitatea SDH
(X100);cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
activitate enzimatic� intens�
Fig. II.51. Lotul BII (luna 6) Activitatea SDH
(X100)cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
activitate enzimatic� intens�
Lot B I. Luna 0 Lot B I. Luna 6 Lot B II. Luna 0 Lot B II. Luna 6
++ 19,5
+/- 49,7
+ 30,8
++ 21,6
+/- 48,4
+ 30
++ 23,5
+/- 50,4
+ 26,1
+ 32 +/-
61,2
++6,8
Fig. II.52. Evaluarea semicantitativ� a activit��ii SDH la loturile BI �i BII
Medicamentul antiangiogenetic analizat ac�ioneaz� asem�n�tor la nivelul enzimelor
metabolismului energetic indiferent de localizarea tumorii. Studiul neoangiogenezei Am considerat deosebit de important studiul neoangiogenezei având în vedere faptul c� medicamentul antineoplazic studiat este un anti-angiogenetic.
Evaluarea extinderii re�elei vasculare nou formate s-a exprimat cantitativ prin aprecierea la microscop a densit��ii microvasculare (microvessel density) - MVD pe baza num�r�rii vaselor neoformate.
Determinarea MVD, prin identificarea celulelor endoteliale, constituentele de baz� ale vaselor, s-a f�cut prin metoda anatomopatologic� de rutin� �i prin examen imunohistochimic. Identificarea imunohistochimic� a endoteliilor vasculare a utilizat anticorpul monoclonal anti-CD31. Am apelat la reac�ia imunohistochimic�, deoarece examenul histopatologic la colora�ia de rutin� nu a permis diferen�ierea între vasele sanguine normale �i cele intratumorale.
10
S-a efectuat tehnica imunohistochimic� de rutin�, utilizând anticorpul monoclonal CD31. CD31 s-a exprimat pe suprafa�a celulelor endoteliale.
Am utilizat metoda semicantitativ�, propus� de Korkolopoulou �i colaboratorii (2001), astfel:
- s-au prelucrat sec�iuni colorate pentru CD31; - prin examinare, cu obiectiv mic �i mare, s-au identificat ariile de capilare �i vase
mici cu densitate maxim�; - s-a ales câmpul microscopic x 200, cu densitatea cea mai mare; - imaginea a fost captat� cu camer� digital� �i stocat� ca fil� JPEG (1550x1070 pxl,
16,7 milioane culori, 24-bit); - când nu a fost evident� o arie de maxim� vasculariza�ie, s-au ales 3 câmpuri, �i s-au
stocat MVD; - s-a luat în considerare doar câmpul cu vasculariza�ie maxim�; - s-au exclus din interpretare ariile cu infiltrat abundent, necroze �i ulcera�ii; - celulele endoteliale, izolate sau în grupuri mici, au fost considerate vase individuale;
au fost excluse din num�r�toare vasele cu perete muscular; - s-au apreciat cantitativ tipurile de vase intratumorale: imature, intermediare �i
mature, calculându-se a�a numitul indice de pozitivare pentru fiecare caz în parte, �i s-a calculat media (câmp conven�ional de 0,5/0,5 cm);
- s-a f�cut cuantificarea MVD pe fiecare caz în parte. (Korkolopoulou �i colab., 2001).
Vasele intratumorale observate au avut o structur� heterogen�, adesea peretele fiind incomplet maturat. Vasele intratumorale au fost împ�r�ite pe baza dimensiunii perfuz�rii, respectiv a prolifer�rii celulelor endoteliale �i a prezen�ei pericitelor, în trei categorii:
- vase imature; - intermediare; - mature.
AI luna 0 AI luna 6 AII luna 0 AII luna 6
Vase imature
43%
Vase mature
31%
Vase interme
diare26%
Vase interme
diare36%
Vase imature
12%
Vase mature
52%
Vase imature44,7%
Vase mature31,3%
Vase interme
diare24%
Vase imature24,3%
Vase mature6,6%
Vase interme
diare69,1%
Fig. II.55. Cuantificarea procentual� a densit��ii microvasculare pentru lotul AI �i AII
7
2 3
9
4
13
16
7
11
22
19
26
13
4,3
7,8
12,9
9,3
18,6
0
5
10
15
20
25
30
IMATURE
luna 0
IMATURE
luna 6
INTERMED
luna 0
INTERMED
luna 6
MATURE
luna 0
MATURE
luna 6
Fig. II.61. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul AI
11
6
02
45
0
20
5
109
18
2
14,5
1,8
7,8
5,2
10,1
0,50
5
10
15
20
25
IMATURE
luna 0
IMATURE
luna 6
INTERMED
luna 0
INTERMED
luna 6
MATURE
luna 0
MATURE
luna 6
Fig.II.62. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul AII
BI luna 0 BI luna 6 BII luna 0 BII luna 6
Vase imature
46%
Vase interme
diare21% Vase
mature33%
Vase imature
15%
Vase interme
diare28%
Vase mature
57%
Vase imature41,3%
Vase interme
diare28,5
Vase mature30,2%
Vase imature
23%
Vase interme
diare68,6
Vase mature8,4%
Fig. II.63. Cuantificarea procentual� a densit��ii microvasculare la lotul BI �i BII
Fig. II.65. Lotul BII (luna 0) Adenocarcinom de
colon, a - imunoreac�ie pozitiv� pentru CD 31;
b – glande atipice transformate malign, celule
cu nuclei tahicromi pseudostratifica�i;(X 400)
Fig. II.67. Lotul BII (luna 6) Adenocarcinom
de colon,Cu s�ge�i sunt marcate zonele cu
imunoreac�ie slab pozitiv� pentru CD 31;(X
400)
9
42
8
4
9
21
12 12
16
20
30
15,5
5,67
10,4 11
21,2
0
5
10
15
20
25
30
35
IMATURE
luna 0
IMATURE
luna 6
INTERMED
luna 0
INTERMED
luna 6
MATURE
luna 0
MATURE
luna 6
Fig. II.69. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul BI
12
10
13
4 4
0
21
7
1311
15
3
14,4
2,3
10
7,1
10,5
0,90
5
10
15
20
25
IMATURE
luna 0
IMATURE
luna 6
INTERMED
luna 0
INTERMED
luna 6
MATURE
luna 0
MATURE
luna 6
Fig. II.70. Num�rul minim, maxim �i mediu de vase neoformate la lotul BII
În perioada studiat� apar modific�ri majore atât la nivelul num�rului de vase f�r� a
�ine cont de diferen�ierea pe tipuri de vase, dar �i la nivelul vaselor diferen�iate în cele trei tipuri, atât la lotul de studiu AII cât �i la lotul de studiu BII. Aceste diferen�e demonstreaz� clar ac�iunea antiangiogenetic� a medicamentului bevacizumab, care const� în supresia marcat� a angiogenezei, reducerea num�rului de vase intratumorale, inhibarea dezvolt�rii de noi vase sangvine, inhibarea matur�rii vaselor existente.
Studiul apoptozei cu ajutorul tehnicii imunohistochimice de eviden�iere a citocromului c citosolic Pentru eviden�ierea �i evaluarea procesului apoptotic s-a efectuat tehnica imunohistochimic� de rutin�, utilizând anticorpul monoclonal citocrom c, kitul Cytochrome c Ab-2 (Clone 7H8.2C12). Kitul utilizat marcheaz� citocromul c eliberat din spa�iul intermembranar mitocondrial în citosol, eveniment necesar pentru finalizarea apoptozei. Citocromul c citosolic activeaz� caspaza-3 �i moleculele enzime, cistein proteazelor din familia ICE, care sunt efectorii cheie al apoptozei.
S-a efectuat tehnica imunohistochimic� de rutin�, utilizând anticorpul monoclonal citocrom c, care s-a exprimat la nivel citoplasmatic celular.
Sec�iunile colorate pentru cit c au fost examinate cu obievtive diferite, s-au identificat ariile cu imunoreac�ie pozitiv�, s-au ales câte 3 câmpuri microscopice x 200 pentru fiecare caz în parte, imaginile au fost captate cu camer� digital� �i stocat� ca fil� JPEG (1550x1070 pxl, 16,7 milioane culori, 24-bit). La nivelul acestor imagini s-au ales aleator 10 câmpuri diferite, în care num�rul de celule cu imunoreac�ie pozitiv� sau negativ� pentru anticorpul monoclonal utilizat, a fost evaluat semicantitativ astfel:
� = imunoreac�ie negativ�; �/+ = rare elemente cu imunoreac�ie pozitiv�; + = elemente cu imunoreac�ie pozitiv� prezente constant; ++ = numeroase elemente cu imunoreac�ie pozitiv�.
Lot A I. Luna 0 Lot A I. Luna 6 Lot A II. . Luna 0 Lot A II. Luna 6
�
64,3
+/- 35,7
�
87,7
+/- 12,3
� 62,6
+/- 37,4
+ 43,2
+/- 25,1
++ 31,7
Fig. II.75. Cuantificarea procentual� a imunoreactivit��ii pentru citocromul c la lotul AI �i AII
13
Fig. II.79. Lotul AII luna 0. Imunoreac�ie slab
pozitiv� pentru citocromul c ,(X 800); cu
s�ge�i sunt marcate celulele în care citoplasma
prezint� imunoreac�ie pozitiv� pentru
citocromul c
Fig.II.81. Lotul AII luna 6 Imunoreac�ie
intens pozitiv� pentru citocromul c (X 1200);
cu s�ge�i sunt marcate celulele tumorale cu
nucleu balonizat, meganucleoli, citoplasm�
cu imunoreac�ie pozitiv� pentru citocromul c
Lot B I. . Luna 0 Lot B I. Luna 6 Lot B II. . Luna 0 Lot B II. Luna 6
� 76,8
+/- 23,2
+/- 10,5
� 89,5
� 67,5
+/- 32,5
+
36,4
+/-
21,2++
42,4
Fig. II.82. Cuantificarea procentual� a imunoreactivit��ii pentru citocromul c la lotul BI �i BII
Rezultatele ob�inute arat� cre�terea imunoreactivit��ii pentru citocromul c în urma tratamentului antiangiogenetic. Influena terapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului i a sistemelor antioxidante plasmatice
Am studiat efectele terapiei antineoplazice antiangiogenetice asupra sintezei de specii reactive ale oxigenului prin m�surarea malondialdehidei serice (MDA), care este unul din produ�ii de peroxidare lipidic�, determinarea ei din sânge reprezintând o metod� standard pentru evaluarea stresului oxidativ. Pentru urm�rirea ac�iunii antioxidan�ilor plasmatici în timpul tratamentului antineoplazic am urm�rit nivelul ceruloplasminei serice.
Nivelul seric al malondialdehidei �i al ceruloplasminei s-a determinat la debutul studiului �i lunar în cele �ase luni de studiu.
La loturile de studiu (AII �i BII) are loc o cre�tere a nivelului seric de MDA fa�� de loturile martor, împreun� cu o cre�tere progresiv� a nivelului seric de CP.
Comparând valorile ob�inute pentru luna 0 �i luna 6 pentru nivelul seric al malondialdehidei �i a ceruloplasminei la lotul martor �i la lotul de studiu se constat� c� diferen�ele penrtu MDA nu sunt semnificative statistic (p > 0,05) dar cele ob�inute pentru CP sunt semnificative statistic (p < 0,05). Nivelele de semnifica�ie sunt asem�n�toare penrtu pacien�ii cu tumori mamare �i tumori colorectale,
Evolu�ia statusului metabolic �i nutri�ional în timpul tratamentului antiangiogenetic
Evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional s-a f�cut în func�ie de determin�rile antropometrice periodice, lunare. Indicatorii antropometrici urm�ri�i au fost: greutatea, înâl�imea, rata metabolismului bazal (RMB) �i indicele de mas� corporal� (IMC).
14
La toate loturile luate în studiu a sc�zut rata metabolismului bazal dar �i a indicelui de mas� corporal� în decursul celor �ase luni, dar diminuarea parametrilor urm�ri�i au fost mai evidente în cadrul loturilor martor f�r� tratament antiangiogenetic.
���
���
���
���
���
���
���
����
����
����
p < 0.05
RM
B
LOT MARTOR BI 991,53 1000,13 1011,32 1017,32 995,92 968,87 915,33
LOT STUDIU BII 1004,4 999,62 997,52 1000,87 994,75 991,88 975,53
0 1 2 3 4 5 6
Fig.II.97. Evolu�ia ratei metabolismului bazal (RMB) la pacien�ii cu neoplazii colorectale
Evaluarea calit��ii vie�ii Dup� completarea lunar� a chestionarelor de evaluare a st�rii de s�n�tate �i a st�rii func�ionale, a avut loc prelucrarea datelor. Se constat� c� are loc sc�derea nivelului st�rii func�ionale �i a st�rii de nutri�ie în decursul celor �ase luni, dar la pacien�ii care au urm�rit tratamentul antiangiogenetic sc�derea a fost mult mai lent� comparativ cu lotul martor, iar dup� �ase luni atât starea de nutri�ie cât �i starea func�ional� a fost mult mai bun� la lotul de studiu decât la lotul martor. Diferen�ele între loturile martor �i cele aflate în terapie sunt semnificative statistic în ceea ce prive�te starea de s�n�tate �i starea func�ional�, indiferent de localizarea tumorii.
Urm�rind curbele de supravie�uire se constat� beneficiul semnificativ statistic adus de terapia antiangiogenetic� administrat� pe parcursul celor �ase luni de studiu. Diferen�ele de supravie�uire sunt mai pronun�ate în cazul loturilor de studiu cu cancer colorectal, iar influen�a negativ� a bolii asupra statusului biologic �i metabolic al organismului se traduce printr-o mortalitate mai mare decât în cazul loturilor de studiu cu neoplasm mamar. (Fig. II. 104, II. 105)
Fig.II.104.Curba de supravie�uire la loturile
de studiu cu cancer mamar Fig.II.105. Curba de supravie�uire la loturile
de studiu cu cancer colorectal
STUDIUL EFECTELOR POLICHIMIOTERAPIEI ANTINEOPLAZICE ÎN HEMOPATII MALIGNE ASUPRA
METABOLISMULUI ENERGETIC CELULAR
În aceast capitol am studiat pe loturi de pacien�i cu leucemii acute diversele aspecte ale modific�rilor metabolismului energetic în timpul tratamentului antineoplazic. Boala
15
leucemic� trebuie v�zut� nu numai ca o proliferare necontrolat� a unei clone celulare ci ca o boal� a întregului organism. Am eviden�iat activitatea enzimelor oxidoreduc�toare �i viabilitatea celular�, desf��urarea procesului de apoptoz�, precum �i varia�ia nivelului speciilor reactive ale oxigenului �i a antioxidan�ilor plasmatici. Toate procesele studiate sunt p�r�i integrante sau legate foarte strâns de procesele metabolismului energetic celular. Studiul activit�ii enzimelor oxidoreduc�toare în timpul polichimioterapiei antineoplazice în leucemii acute
Am studiat intensitatea metabolismului energetic celular prin punerea în eviden�� a activit��ii enzimelor oxidoreduc�toare, atât înainte cât �i în timpul tratamentului antineoplazic, cu ajutorul testului cu nitrobleutetrazolim (NBT).
Înainte de începerea tratamentului în medie 14,73 % dintre celulele studiate prezint� o activitate oxido-reduc�toare intens�. Acest procent este apropiat de cel ob�inut la lotul mator. Rezultatele procentuale medii sunt prezentate tabelul 2.3. �i figura II. 106.
înainte de tratamentzi 1-3
zi 15/33
0
2
4
6
8
10
12
14
16
% c
elu
le N
BT
po
ziti
ve
Momentul
recolt�rii
Varia�ia procentului de celule sangvine NBT pozitive
LA
MLA
Fig.II .106. Varia�ia procentului de celule sangvine NBT pozitive
la lotul LA fa�� de lotul martor M LA
Realizând o compara�ie între valorile procentuale medii de celule NBT pozitive de la
cele dou� tipuri de leucemii acute, se constat� diferen�e mici, nesemnificative (p > 0,05). O caracteristic� ce le deosebe�te semnificativ r�mâne momentul în care se ating
valorile minime, cu valoare predictiv� a r�spunsului la tratament, reprezentat� de ziua 15 dup� tratament la loturile LAM �i ziua 33 la LAL. Studiul apoptozei în leucemii acute prin citometrie în flux
Interesul tot mai mare pentru studiul apoptozei a stimulat introducerea unor metode variate de detectare, una dintre ele fiind utilizarea coloran�ilor fluorescen�i în citometria în flux. Analizele s-au realizat din sângele periferic recoltat de la pacien�ii cu leucemie acut� limfoblastic� �i leucemie acut� mieloblastic�, fiind inclu�i în lotul de studiu LA. Popula�ia de celule din sângele periferic în leucemia acut� are în general urm�torul spectru: în faza de diagnostic, de invazie blastic� se caracterizeaz� prin prezen�a de bla�ti leucemici în propor�ie de 80-95% �i celule normale 5-20%.
Rezultatele ob�inute sunt reprezentate grafic în programul Cell-Quest sub form� de citograme (dot plot Annexin V-PE/7-AAD). Pe citogramele rezultate, bidimensionale, fiecare eveniment (celul�) este reprezentat printr-un punct.
16
Înainte detratament
zi 1-3zi 33
5,2
37,15
59,57
0,2
38,18
8,55
94,6
24,67
31,88
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Pro
cen
t ce
lule
Momentul evalu�rii
Evolu�ia poten�ialului apoptotic al celulelor sangvine la pacien�ii cu LAL
Celule vii
Celule în proces
Celule moarte
Înainte detratament zi 1-3
zi 15
Cel ule vi i
Celule în proces
Celule moart e
7,27
29,59
52,38
0,35
38,01
13,56
92,38
32,4 34,06
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Pro
cen
t ce
lule
Momentul evalu�rii
Evolu�ia poten�ialului apoptotic al celulelor sangvine la pacien�ii cu LAM
Celule vii
Celule în proces
Celule moarte
Fig.II.116. Evolu�ia poten�ialului apoptotic al celulelor sangvine la pacien�ii cu LAL �i LAM
Fig.II.118. Citograme ob�inute prin analiz� de citometrie în flux în 1-3 zile (24-72 ore) de la
PE/7-AAD). Nr. de celule num�rate: 10000. Rezultatele prezentate prin citograme sunt reprezentative
pentru lotul de studiu LA, pacien�i cu leucemie acut� limfoblastic�. (LAL).
Rezultatele noastre arat� c� eviden�ierea apoptozei prin citometrie de flux este o metod� sigur� �i extrem de sensibil� petru aprecierea gradului de r�spuns la ac�iunea medicamentelor antineoplazice, pe tot parcursul tratamentului polichimioterapeutic. Coroborat� cu datele clinice ale pacien�ilor devine o metod� foarte util� în luarea deciziilor terapeutice subsecvente de continuare sau de modificare a terapiei.
Influena chimioterapiei antineoplazice asupra nivelului speciilor reactive ale oxigenului i a sistemelor antioxidante plasmatice în leucemii acute
Pân� acum, nu s-a stabilit cu precizie dac� stresul oxidativ prezent la pacien�ii cu boli neoplazice rezult� dintr-o producere crescut� a radicalilor liberi în organism sau dintr-un e�ec al sistemului fiziologic antioxidant. În cercetarea de fa�� am urm�rit nivelul seric al ceruloplasminei în timpul polichimioterapiei în paralel cu nivelul seric al malondaldehidei, determinarea lor din sânge reprezentând o metod� standard pentru evaluarea stresului oxidativ.
17
înainte de tratamentzi 1-3
zi 33
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Val
ori
med
ii M
DA
(n
mo
l/ml)
Momentul evalu�rii
Evolu�ia valorilor medii pentru malondialdehid� seric�
MLA LA
Fig.II.122. Evolu�ia valorilor medii pentru malondialdehida seric� (lotul de studiu LA
comparativ cu lotul martor M LA)
înainte de tratamentzi 1-3
zi 15/33
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
Val
ori
med
ii C
P (
mg
/ml)
Momentul evalu�rii
Evolu�ia valorilor medii ale CP la loturile LA/MLA
LA
Martor MLA
Fig.II.126. Evolu�ia valorilor medii pentru ceruloplasmina seric� (lotul de studiu LA comparativ cu
lotul martor M LA )
Înainte de începerea tratamentului exist� un nivel u�or crescut al speciilor reactive al oxigenului în sângele periferic al pacien�ilor cu leucemie acut�, împreun� cu un nivel sc�zut al antioxidantului plasmatic, ceruloplasmina.
Nivelul sc�zut al ceruloplasminei (CP) men�inut pe tot parcursul terapiei împreun� cu un nivel mult crescut al malondialdehidei (MDA), arat� c� stresul oxidativ persist�, iar ceruloplasmina se consum� în reac�iile antioxidante din organism, sc�zând capacitatea lui de sintez� în ficat. Organismul r�spunde astfel la stersul oxidativ ap�rut, încercând s� anihileze ac�iunea distructiv� a speciilor reactive acumulate. CONCLUZII
Cercet�rile noastre s-au orientat spre cele dou� mari grupe de neoplazii maligne, tumorile solide �i hemopatiile maligne. Cele dou� sunt tratate separat reprezentând fa�ete diferite ale temei cercetate, nu beneficiaz� de compara�ii deoarece arat� aspecte particulare diferite ale celor dou� tipuri de tumori �i au fost realizate pe loturi diferite de pacien�i.
Prin urm�rirea efectelor terapiei antineoplazice antiangiogenetice asupra metabolismului energetic celular, cu ajutorul metodelor �i tehnicilor histologice, histoenzimatice, imunohistochimice �i biochimice, prin urm�rirea evolu�iei st�rii generale de s�n�tate, comparând rezultatele ob�inute pentru loturile de studiu cu cele ob�inute pentru loturile martor, putem formula urm�toarele concluzii:
1. Studiile au eviden�iat înaintea ini�ierii tratamentului un metabolism glicolitic foarte intens, demonstrat prin activitatea excesiv� a LDH-ului. Sinteza de ATP se realizeaz�
18
mai ales pe cale glicolitic�. La nivel mitocondrial, activitatea metabolic� este de o intensitate mai redus�, dar mitocondriile au membranele integrale, citocromul c nu se elibereaz� în citosol, celulele nefiind antrenate în procesul apoptotic;
2. S-a eviden�iat prezen�a vasculariza�iei intratumorale, furnizând oxigen �i substan�e nutritive celulelor tumorale, care împreun� cu prezen�a unei glicolize intense demonstreaz� ac�iunea efectului Warburg în celulele tumorale;
3. În timpul tratamentului antiangiogenetic scade activitatea ATP-azic�, se amplific� u�or glicoliza împreun� cu diminuarea activit��ii mitocondriale. Datorit� amplific�rii hipoxiei glicoliza devine mai intens�, activitatea enzimatic� mitocondrial� scade prin reducerea fosforil�rii oxidative �i a activit��ii ciclului acizilor tricarboxilici;
4. Exist� o activitate antiangiogenetic� accentuat� în urma tratamentului antineoplazic, ac�iune anti-VEGF (VEGF – factor de cre�tere endotelial vascular), care se realizeaz� printr-o supresie marcat� a vasculogenezei, inhibarea dezvolt�rii de noi vase sangvine dar �i printr-un efect asupra vaselor sangvine tumorale deja existente, prin inducerea apoptozei celulelor endoteliale. Se remarc� reducerea semnificativ� a num�rului de vase sanguine, precum �i a tipurilor de vase, mai ales a celor imature (inhibarea dezvolt�rii de noi vase) �i mature (distrugerea vaselor existente);
5. Reducerea vasculariza�iei tumorale, determinând sc�derea aportului de oxigen, duce la aprofundarea st�rii de hipoxie. În aceast� stare se destind invagin�rile mitocondriale, cristele, scade sinteza de ATP la nivel mitocondrial, astfel se activeaz� calea glicolitic� a metaboliz�rii glucozei. Datorit� acumul�rii acidului lactic scade pH-ul care determin� inhibarea enzimelor celulare �i duce la autoliza celulei. Tot hipoxia induce �i activarea factorului HIF (hypoxia inducing factor) care stimuleaz� angiogeneza prin reglarea factorului VEGF, fapt ce explic� utilitatea administr�rii anticorpului monoclonal bevacizumab pân� la evolu�ia bolii;
6. Rezultatele ob�inute arat� c� poten�ialul apoptotic al celulelor maligne cre�te semnificativ în timpul tratamentului antiangiogenetic, împreun� cu reducerea vasculariza�iei tumorale, este activat� calea apoptotic� mitocondrial� prin eliberarea citocromului c din spa�iul intermembranar mitocondrial;
7. În timpul tratamentului antiangiogenetic se dimiueaz� gradul de peroxidare lipidic�. O sc�dere a nivelului seric de specii reactive ale oxigenului se constat� �i la loturile martor incluse în studiu dar într-o m�sur� mult mai mic�;
8. Capacitatea antioxidant� a organismului pentru neutralizarea activit��ii radicalilor liberi cunoa�te o cre�tere progresiv� semnificativ� (p < 0,05);
9. Evaluarea statusului metabolic �i nutri�ional, evolu�ia st�rii generale de s�n�tate arat� o diminuare progresiv�, dar mult mai lent� la loturile de studiu decât cea observat� la loturile martor, f�r� tratament antiangiogenetic;
10. În privin�a aspectelor metabolismului energetic celular studiate la nivel celular, nu exist� diferen�e semnificative între tumorile mamare �i colorectale, dar rezultatele m�sur�torilor antropometrice, a st�rii de s�n�tate �i func�ionale, arat� c� la loturile de pacien�i cu cancer colorectal degradarea biologic� este mai rapid� decât la loturile cu cancer mamar, probabil �i datorit� influen�ei mai mari a localiz�rii tumorii în statusul metabolic general al organismului, împiedicând frecvent un aport �i o metabolizare eficient� a nutrien�ilor;
11. Curbele de supravie�uire realizate arat� beneficiul semnificativ statistic adus de terapia antiangiogenetic� administrat� pe parcursul celor �ase luni de studiu. Diferen�ele de supravie�uire sunt mai pronun�ate în cazul loturilor de studiu cu cancer colorectal, iar influen�a negativ� a bolii asupra statusului biologic �i metabolic al organismului se traduce printr-o mortalitate mai mare decât în cazul loturilor de studiu cu neoplasm mamar;
12. Pe tot parcursul studiului am comparat rezultatele cu cele ob�inute la loturile martor �i am constatat c� administrarea acestui medicament a determinat urm�toarele rezultate pozitive: a crescut poten�ialul apoptotic al celulelor maligne, s-a diminuat gradul de peroxidare lipidic�, a crescut capacitatea antioxidant� a organismului, starea general� a
19
organismului, statusul metabolic �i nutri�ional au fost mai pu�in afectate, s-a încetinit evolu�ia bolii împreun� cu cre�terea supravie�uirii generale a pacien�ilor;
13. Rezultatele ob�inute descriu un tablou complex metabolic al ac�iunii medicamentului antineoplazic studiat �i reprezint� o contribu�ie original� în ceea ce prive�te investigarea evenimentelor ce caracterizeaz� metabolismul energetic celular în timpul terapiei antiangiogenetice.
Rezultatele studiului efectelor polichimioterapiei antineoplazice asupra metabolismului energetic celular, în leucemiile acute, arat� c�:
1. Medicamentele antineoplazice au o ac�iune semnificativ� de inhibare a proliferativit��ii �i viabilit��ii celulare prin diminuarea accentuat� a activit��ii enzimelor oxidoreduc�toare. Diminuarea este semnificativ� (p < 0,05) deja în primele 1-3 zile de tratament;
2. Inducerea apoptozei are loc la 1-3 zile de la începerea tratamentului, iar propor�ia celulelor moarte prin apoptoz� cre�te semnificativ pân� la induc�ia remisiei. Deficien�a c�ii apoptotice ar determina rezisten�a celulelor la polichimioterapie, ducând la sc�derea ratei de remisie. Studiul poten�ialului apoptotic, prin tehnica citometriei în flux, confer� informa�ii valoroase pentru aprecierea gradului de r�spuns la ac�iunea medicamentelor antineoplazice, pe tot parcursul tratamentului polichimioterapeutic;
3. Perturbarea echilibrului oxidant/antioxidant este confirmat. Sub ac�iunea terapiei antineoplazice se ini�iaz� peroxidarea lipidic� poten�ând stresul oxidativ. Substan�ele citotoxice activeaz� o succesiune de c�i metabolice în urma c�rora sunt generate specii reactive de oxigen. Concentra�ia acestor specii reactive a crescut semnificativ (p < 0,05) în timpul tratamentului polichimioterapeutic, deteriorând mecanismul de ap�rare antioxidant endogen, a c�rui nivel scade semnificativ (p < 0,05);
4. Antioxidantul endogen, ceruloplasmina se consum� în reac�iile antioxidante din organism, sc�zând capacitatea lui de sintez� în ficat. Organismul r�spunde astfel la stersul oxidativ ap�rut, încercând s� anihileze ac�iunea distructiv� a speciilor reactive acumulate;
5. Aspectele metabolismului energetic celular supuse studiului efectuat asupra hemopatiilor maligne nu arat� diferen�e semnificative în r�spunsul la nivel celular la tratamentul polichimioterapeutic între cazurile de leucemie acut� limfoblastic� �i cazurile de leucemie acut� mieloblastic�;
6. Datele prezentate reflect� atât condi�iile de metabolism celular caracteristice celulelor tumorale cât �i tulbur�rile induse de citostatice. Separarea acestor dou� elemente nu are consecin�e practice, ne intereseaz� imaginea global� care poate s� sugereze puncte de interven�ie diagnostic�, prognostic�, de supraveghere �i poate explica anumite fenomene atât pentru cercet�tor cât �i pentru clinician.
Rezultatele studiilor întreprinse î�i aduc aportul în domeniul cercet�rilor fundamentale,
prin eviden�ierea unor mecanisme moleculare ale metabolismului energetic, implicate în r�spunsul la tratamentul antineoplazic. În acela�i timp studiul prezint� posibilit��i reale de aplicabilitate în modificarea strategiilor �i standardelor terapeutice din domeniul oncologiei �i onco-hematologiei.
BIBLIOGRAFIE
1. Ardelean A., Biologia molecular� a medicamentului, “Vasile Goldi�” University Press, Arad, 2009, 49-53. 2. Carew J.S., Huang P., Mitochondrial defects in cancer, Molecular Cancer, 2002; 1:9, 7. 3. Kopper L., Fesus L., Apoptozis, Medicina Konyvkiado R.T., Budapest, 2002, 103-115. 4. Korkopoulou P., Konstantinidou A.E., Kavantzas N., Patsouris E., Pavlopoulos P.M., Cjristodoulou P., Thomas-Zsalgi E., Davaras P. - Morphometric microvascular characteristics predict prognosis in superficialand invasive bladder cancer, Virchows Arch, 2001, 438: 603-611.
20
5. Kroemer G., Pouysseger J., Tumor cell metabolism: Cancer’s Achilles Heel, Cancer Cell, 2008, 13, 6:472-482. 6. Lopez-Lazaro M., A new view of carcinogenesis and an alternative approach to cancer therapy, Molecular Medicine, 2010, 16 (3-4), 144-153. 7. Lopez-Lazaro M., Role of oxygen in cancer looking beyound hypoxia, Anticancer Agents Medical Chemystry, 2009, 9: 517-525. 8. Lopez-Lazaro M., The Warburg effect why and how do cancer cells activate glycolysis in the presence of oxygen, Anticancer Agents Medical Chemistry, 2008, 8(3): 305-312. 9. Mixich F., Ardelean A., Principii fundamentale de biologie molecular�, Editura Medical� Universitar� Craiova, 2002, 292-305. 10. Mure�an, E., Bogdan, A.T., Gaboreanu, M., Baba, A.I., Tehnici de histochimie normal� �i patologic�, Ed. Ceres, Bucure�ti, 1976, 5-74, 185-214, 317-319. 11. Nagy V. Principii de cancerologie, Celula malign� �i fenotipul malign, Editura Medical� Universitar� Cluj-Napoca, 2007, 46-67. 12. Nicolau S. Popa I., Oncologie general� �i oncopediatrie, Editura Helicon, Timi�oara, 1999, 358-379. 13. Ross M.H., Pawlina W., Histology: A Text and Atlas, With Correlated Cell and Moleclar Biology, Fifth Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2007, 459-472. 14. Verde� D., Mitocondria, Editura Mirton, Timi�oara, 2000, 78-106. 15. Warburg O., On the origin of cancer cells, Science, 1956; 123: 309-314. Lista lucr�rilor tiinifice publicate din teza de doctorat cuprinde 9 titluri Anexa 1 cuprinde Formular de informare �i consim��mânt Anexa 2 cuprinde Chestionarul de evaluarea st�rii de s�n�tate �i func�ional�