Министерство здравоохранения Российской Федерации

Министерство здравоохранения Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ имени И.М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

Меньшикова

Лилия Андреевна

ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОРИГИНАЛЬНОГО

ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ТИОЗОНИДА

14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Раменская Галина Владиславовна

Москва – 2016

2

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1 Туберкулёз. Эпидемиология, новые тенденции в лечении,

современные лекарственные препараты 12

1.2 Доклинические исследования оригинальных

лекарственных средств 17

1.3 Особенности клинических фармакокинетических исследований

инновационных лекарственных препаратов 20

1.4 Обзор результатов доклинических исследований тиозонида 26

1.5 Заключение 30

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (СОБСТВЕННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 32

2.1 Оборудование и реактивы 32

2.2 Стандартный образец и объекты исследования 33

2.3 Дизайн фармакокинетического исследования 33

2.4 Программное обеспечение 35

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ

КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОЗОНИДА В

ПЛАЗМЕ КРОВИ 37

3.1 Методика пробоподготовки 38

3.2 Разработка методики определения тиозонида в плазме крови 41

3.3 Валидация методики определения тиозонида в плазме крови 45

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКОГО

ИССЛЕДОВАНИЯ 61

4.1 Динамика концентраций тиозонида в плазме крови 61

4.2 Описательная статистика и расчет фармакокинетических

параметров 78

3

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 87

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 102

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 104

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106

4

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

В настоящее время все проблемы, касающиеся как профилактики, так и

лечения туберкулеза принято считать весьма актуальными [1-4].

Одной из главных проблем в борьбе с туберкулезом является лекарственная

устойчивость микобактерий туберкулеза (МБТ) [14-17].

Так, в России за период 2004 - 2013 гг. на фоне снижения заболеваемости (с

83,3 до 68,1 случаев на 100 тысяч населения) и распространенности туберкулеза (с

218,3 до 157,7 случаев на 100 тысяч населения), распространенность

лекарственно-устойчивого туберкулеза за тот же период возросла почти в 2 раза

(с14,2 до 24,6 на 100 тысяч населения) [4].

Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) «О

глобальной борьбе с туберкулезом» в 2011 году было зарегистрировано 8,7

миллиона случаев заболевания туберкулезом и 1,4 миллиона случаев смерти от

него среди лиц, не имевших инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита

человека (ВИЧ-инфекции), и еще 430 тысяч случаев смерти от ВИЧ-

ассоциированного туберкулеза [2].

Попадая в легкие, микобактерии захватываются альвеолярными

макрофагами, однако способны к анабиозу и таким образом могут бесконечно

долго и бессимптомно персистировать в организме человека, оставаясь

недоступными для иммунной системы [5].

Правительство Российской Федерации выпустило Постановление от 1

декабря 2004 г. № 715 «Об утверждении перечня социально-значимых

заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для

окружающих», где туберкулез занимает первое место в перечне социально-

значимых заболеваний и 13-ую позицию в перечне заболеваний, представляющих

опасность для окружающих [81].

5

Лечение туберкулеза – комплексное и длительное, главным образом

базируется на использовании поликомпонентной противотуберкулезной

химиотерапии [6, 7]. Однако полихимиотерапия туберкулеза существенно

затруднена из-за большой частоты развития непереносимости и серьезных

побочных эффектов химиопрепаратов. Особенно часто они возникают при

наличии сопутствующих заболеваний.

В этих условиях становится очевидной необходимость создания более

эффективных и безопасных инновационных противотуберкулезных

лекарственных средств, способных расширить возможности для лечения больных

туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью, повысить

эффективность, сократить сроки лечения и снизить частоту нежелательных

эффектов этиотропной терапии.

Сегодня в стране происходят глобальные изменения в работе по

обеспечению населения лекарственными препаратами. В сложившейся

политической ситуации ведется активная работа по импортозамещению и

увеличению доли инновационных лекарственных средств в рамках госпрограммы

«Фарма-2020» [46], которая стартовала еще в 2011 году. По плану, к 2020 году

доля продукции отечественного производства в общем объеме потребления в

России должна вырасти до 50% в денежном выражении. В Послании

Федеральному Собранию на 2015 год президент России Владимир Владимирович

Путин выступил с серьезными стратегическими инициативами, определяющими

задачи страны на ближайшее время и перспективу, в том числе и в

фармацевтической отрасли, где еще раз подчеркнул стимулирование разработки и

производства отечественных инновационных лекарственных средств.

Финансирование выделяется самым значимым проектам, среди которых

подготовка производства фармацевтических субстанций для лекарственных

средств от туберкулеза, ВИЧ и онкологии.

Все вышесказанное определяет актуальность настоящего исследования.

6

Степень разработанности темы исследования

Тиозонид представляет собой инновационное лекарственное средство, в

литературе отсутствуют данные по биоаналитическим методикам определения

тиозонида в плазме крови человека.

В 2009 г. на базе ФГБУ «Центральный НИИ туберкулеза» РАМН было

проведено доклиническое исследование in vitro и in vivo противотуберкулезной

активности препарата Тиозонид [65]. В ходе исследований in vitro было выявлено,

что Тиозонид обладал антимикобактериальным эффектом, сравнимым с

ингибирующим действием Изониазида и Рифампицина, ингибировал рост

культуры вирулентного лабораторного штамма МБТ H37Rv, чувствительного ко

всем противотуберкулезным препаратам, культуры штамма МБТ CN-40 с

моноустойчивостью к Изониазиду и культуры штамма МБТ MS-115 с

множественной лекарственной устойчивостью. По результатам исследований in

vivo было определено, что продолжительность жизни экспериментальных

животных, получавших монотерапию препаратом Тиозонид, не отличалась от

продолжительности жизни животных, получавших Изониазид и Рифампицин.

Совместная терапия Тиозонидом с Этионамидом и Тиозонидом с Пиразинамидом

привела к достоверному увеличению продолжительности жизни

экспериментальных животных этих групп по сравнению с монотерапией

Пиразинамидом и Этионамидом. Показатели колониеобразующих единиц (КОЕ)

МБТ в легких экспериментальных мышей, принимавших Тиозонид,

свидетельствовали об эффективном противотуберкулезном эффекте in vivo в дозе

25 мг/кг, сравнимом с показателями КОЕ МБТ в легких животных, получавших

Рифампицин в аналогичной дозе.

Проводились исследования фармакокинетики препарата Тиозонид при

однократном пероральном введении на мини-свиньях Светлогорской популяции

[66]. Концентрация тиозонида в плазме крови мини-свиней определялась методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим

детектором, предел количественного определения методики составлял 2 нг/мл.

Исследования показали, что после внутрижелудочного введения животным

7

кинетика препарата характеризуется быстрым поступлением Тиозонида в

системный кровоток и длительной циркуляцией в нем (48 и более часов).

Имеющиеся результаты доклинических исследований позволяют сделать

заключение о безусловной перспективности дальнейшего изучения тиозонида в

качестве противотуберкулёзного препарата.

Цель исследования – разработать чувствительный и селективный метод

анализа тиозонида в плазме крови человека для последующего

фармакокинетического исследования оригинального отечественного препарата

Тиозонид.

Задачи исследования:

1. Сделать научно-обоснованный выбор аналитического метода определения

тиозонида в плазме крови человека.

2. Разработать методику количественного определения тиозонида в плазме

крови человека.

3. Провести валидацию методики определения тиозонида в плазме крови

человека.

4. Определить динамику концентраций тиозонида в плазме крови человека

после перорального приема возрастающих доз препарата с использованием

разработанной методики.

5. Изучить фармакокинетику оригинального противотуберкулезного

препарата Тиозонид и провести статистическую обработку полученных

данных.

Научная новизна

В работе впервые разработана и валидирована методика количественного

определения тиозониада в плазме крови здоровых добровольцев методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-

спектрометрическим детектором. Впервые изучена фармакокинетика

инновационного противотуберкулезного препарата Тиозонид в плазме крови

человека.

8

Теоретическая и практическая значимость

На основании результатов исследования представлен подход к анализу

тиозонида в биологических объектах (плазма крови). Выявлены закономерности

хроматографического поведения тиозонида при анализе методом ВЭЖХ с масс-

спектрометрическим детектором.

Разработанная методика количественного определения тиозонида в плазме

крови человека методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором была

успешно применена в клиническом исследовании по изучению фармакокинетики

препарата Тиозонид у здоровых добровольцев при однократном приеме

возрастающих доз препарата (25мг, 200 мг, 400 мг, 600 мг) (протокол № Тио 21).

Полученные результаты фармакокинетического исследования использованы для

дальнейшего изучения препарата Тиозонид (Государственный реестр

лекарственных средств, электронный ресурс -

http://grls.rosminzdrav.ru/CiPermitionReg.aspx?DateBeg=&DateEnd=&DateInc=&NumInc=&RegNm=&Statement=&Pro

tocol=&Torg=%d0%a2%d0%b8%d0%be%d0%b7%d0%be%d0%bd%d0%b8%d0%b4&LFDos=&Qualifier=&Producer=

&Recearcher=&OrgDocOut=2&Status=1&NotInReg=0&All=0&PageSize=8&order=date_perm&orderType=desc&pagen

um=1).

Полученные фармакокинетические параметры препарата Тиозонид

необходимы для дальнейшего изучения препарата и последующего внесения в

инструкцию по медицинскому применению при регистрации препарата.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Разработка биоаналитической методики количественного определения

тиозонида в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим

детектированием.

- Валидация биоаналитической методики количественного определения

тиозонида в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим

детектированием по следующим валидационным характеристикам:

селективность, линейность, правильность, прецизионность, предел

количественного определения, перенос пробы, стабильность растворов.

http://grls.rosminzdrav.ru/CiPermitionReg.aspx?DateBeg=&DateEnd=&DateInc=&NumInc=&RegNm=&Statement=&Protocol=&Torg=%d0%a2%d0%b8%d0%be%d0%b7%d0%be%d0%bd%d0%b8%d0%b4&LFDos=&Qualifier=&Producer=&Recearcher=&OrgDocOut=2&Status=1&NotInReg=0&All=0&PageSize=8&order=date_perm&orderType=desc&pagenum=1




9

- Результаты изучения фармакокинетики инновационного

противотуберкулезного препарата Тиозонид у здоровых добровольцев при

однократном пероральном приеме возрастающих доз препарата.

Методология и методы исследования

Методология исследования построена на анализе и обобщении литературных

данных, оценке степени разработанности и актуальности темы, существующих

подходов к изучению фармакокинетики лекарственных средств.

Методологическая основа работы при выборе методов анализа заключалась в

изучении физико-химических свойств препарата, подборе оптимальных условий

хроматографирования, пробоподготовки и фармакокинетических расчетов.

В процессе выполнения работы был использован метод ВЭЖХ с масс-

спектрометрическим детектированием, а также метод осаждения белков плазмы с

использованием ацетонитрила в качестве осаждающего реагента с целью

изолирования определяемого соединения.

Степень достоверности результатов исследования

Первичные данные, полученные в результате проведения настоящего

исследования, получены при помощи современных методов анализа, являются

достоверными и точными, что подтверждено в ходе проведения процедуры

валидации. Использованное в работе оборудование имело действующие

свидетельства о поверке и зарегистрировано в Реестре средств измерений, что

позволяет считать результаты исследования достоверными. Все результаты

обработаны статистически.

Апробация работы

Основные положения работы и результаты исследования доложены на

научном совете НИИ Фармации «Достижения и перспективы молодых ученых

НИИ Фармации» (Москва, 2014 г.), на Международной научно-практической

конференции «Актуальные проблемы фармации и медицины» (Шымкент, 2015 г.),

на VII Научно-практической конференции «Актуальные проблемы оценки

безопасности лекарственных средств» (Москва, 2016 г.), на VI Международной

научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования

10

фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных

веществ» (Воронеж, 2016 г.), на XII Научно-практической конференции

«Биомедицина и биомоделирование» (Москва, 2016 г). Апробация работы

проведена на Научном совете Научно-исследовательского института фармации

Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (21 июня 2016 г.).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментальных

исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Автором лично

проведена разработка и валидация методики определения тиозонида в плазме

крови человека, статистическая обработка результатов. Автору принадлежит

ведущая роль в проведении анализа плазмы крови здоровых добровольцев,

принимавших оригинальный препарат Тиозонид в рамках клинического

исследования с целью изучения фармакокинетики препарата при помощи

разработанной методики. Статистический анализ результатов определения

концентраций тиозонида в плазме крови и параметров фармакокинетики

проводился с использованием статистических программ. Вклад автора является

определяющим на всех этапах исследования: от постановки задач, их

экспериментально - теоретической реализации до обсуждения результатов в

научных публикациях, докладах и внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности

14.04.02 «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного

исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно

пункту 4 паспорта научных специальностей.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 - в

изданиях из Перечня ВАК, включенных в базу Scopus и Web of Science.

11

Связь темы исследования с проблемным планом фармацевтических

наук

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы НИИ

Фармации ФГБОУ ВО Первого МГМУ имени И.М. Сеченова МЗ РФ «Разработка

современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и

фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических

исследований», номер государственной регистрации 01200606352.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 117 страницах машинописного текста,

состоит из введения, 5 глав, содержащих обзор литературных данных по

излагаемой проблеме (1 глава), экспериментальной части (собственного

исследования), где описаны: материалы и методы, использованные в ходе

проведения эксперимента (2 глава), разработка и валидация методики

определения тиозонида в плазме крови человека (3 глава), применение

разработанной методики для изучения фармакокинентики оригинального

противотуберкулёзного препарата Тиозонид в клиническом исследовании,

статистическая обработка полученных значений индивидуальных

фармакокинетических параметров препарата после приема в изучаемых

дозировках (4 глава), обсуждения полученных результатов (глава 5), списка

сокращений и условных обозначений и списка литературы.

Диссертация включает 19 таблиц и 35 рисунков. Библиографический список

содержит 108 источников, из них 43 на иностранных языках.

12

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Туберкулёз. Эпидемиология, новые тенденции в лечении,

современные лекарственные препараты

Динамика основных эпидемиологических показателей по туберкулезу в

России в течение последнего десятилетия свидетельствует об улучшении

эпидемической ситуации, однако в то же время на фоне снижения заболеваемости

и распространенности туберкулеза сохраняются негативные тенденции к

дальнейшему росту лекарственно-устойчивых форм туберкулеза, сочетанных

инфекционных поражений ВИЧ-туберкулез [3].

В России за период 2004 - 2013 гг. на фоне снижения заболеваемости (с 83,3

до 68,1 случаев на 100 тысяч населения) и распространенности туберкулеза (с

218,3 до 157,7 случаев на 100 тысяч населения), распространенность

лекарственно-устойчивого туберкулеза за тот же период возросла почти в 2 раза

(с 14,2 до 24,6 на 100 тысяч населения) [4]. Согласно докладу ВОЗ «О глобальной

борьбе с туберкулезом» за 2012 год в 2011 году было зарегистрировано 8,7

миллиона случаев заболевания туберкулезом и 1,4 миллиона случаев смерти от

него среди лиц, не имевших ВИЧ-инфекции, и еще 430 тысяч случаев смерти от

ВИЧ-ассоциированного туберкулеза [2].

Попадая в легкие, микобактерии захватываются альвеолярными

макрофагами, однако способны к анабиозу и таким образом могут бесконечно

долго и бессимптомно персистировать в человеке, оставаясь недоступными для

иммунной системы [5].

Лечение туберкулеза – комплексное и длительное, главным образом

базируется на использовании поликомпонентной противотуберкулезной

химиотерапии [6, 7].

13

Согласно классификации, предложенной Международным союзом борьбы с

туберкулезом, противотуберкулезные лекарственные препараты (ПТП) в

зависимости от их активности в отношении к МБТ, подразделяют на три группы:

1) лекарственные средства высокой эффективности - изониазид,

рифампицин;

2) лекарственные средства средней эффективности - стрептомицина

сульфат, канамицина сульфат, флоримицина сульфат, циклосерин, этионамид,

этамбутол и др.;

3) лекарственные средства умepeнной эффективности -

парааминосалициловая кислота (ПАСК), тиоацетазон [8].

Также существует еще одна общепринятая классификация,

систематизированная на различиях в активности и токсичности ПТП. Согласно

данной классификации ПТП делятся на:

- препараты I ряда (основные): изонизид, рифампицин, пиразинамид,

этамбутол и стрептомицин;

- препараты II ряда (резервные): этионамид, канамицин (амикацин),

капреомицин, циклосерин, ПАСК и фторхинолоны (ципрофлоксацин,

офлоксацин), рифабутин, тиацетозон [9, 10].

Препараты I ряда сочетают высокую активность против МБТ, умеренную

токсичность и применяются для лечения пациентов с впервые выявленным

туберкулёзом, их действие направлено на прекращение размножения и

уменьшение количества МБТ [10, 11].

Препараты II ряда характеризуются и/или меньшей активностью, и/или

более высокой токсичностью, применяются при неэффективности или плохой

переносимости основных препаратов, обладают преимущественно

бактериостатическим механизмом действия.

В современном арсенале ПТП есть ряд комбинированных

противотуберкулезных средств, которые представляют собой сочетания в

основном препаратов I ряда, такие как рифинаг (рирфампицин+изониазид),

рифатер (изониазид+пиразинамид+рифампицин), майрин

14

(изониазид+рифампицин+этамбутол), майрин П

(изониазид+пиразинамид+рифампицин+этамбутол), фтизоэтам

(изониазид+этамбутол), фтизопирам (изониазид+пиразинамид). Такие

лекарственные препараты имеют ряд преимуществ: наиболее удобная форма

приема для пациента, обеспечение на этой основе более высокой комплаентности

[9, 12, 13].

Выбор ПТП и длительность их применения зависят от формы туберкулеза,

чувствительности МБТ, переносимости ПТП, клинического течения и характера

предыдущего лечения.

Туберкулез остается ведущий причиной смерти среди излечимых

инфекционных заболеваний, несмотря на тенденции к улучшению ряда целевых

показателей (снижение заболеваемости и смертности от туберкулеза). Одной из

главных проблем в борьбе с туберкулезом является лекарственная устойчивость

МБТ [14-17]. Устойчивость (резистентность) определяется как снижение

чувствительности до такой степени, что данный штамм микобактерий способен

размножаться при воздействии на него препарата в критической или более

высокой концентрации [18].

В структуре лекарственной устойчивости микобактерий туберкулёза

различают: монорезистентность - устойчивость к одному из

противотуберкулёзных препаратов, чувствительность к другим препаратам

сохранена; полирезистентность - устойчивость к двум и более препаратам;

множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) - устойчивость к изониазиду

и рифампицину одновременно (независимо от наличия устойчивости к другим

препаратам); суперустойчивость или широкая лекарственная устойчивость

(ШЛУ) - МЛУ в сочетании с устойчивостью к фторхинолонам и к одному из

инъекционных препаратов (канамицин, амикацин, капреомицин) - за рубежом

принято обозначать этот вариант МЛУ как XDR (Extreme drug resistance);

перекрёстную устойчивость – возникновение устойчивости к одному препарату

влечет за собой устойчивость к другим препаратам [19-21].

15

Кроме первичной (наблюдается у больных, которые никогда ранее не

получали противотуберкулезных препаратов более 1 месяца, эти больные

первоначально инфицируются лекарственно-устойчивым штаммом МБТ) и

вторичной (приобретенной, развивается во время лечения в результате

неправильного ведения больного или невыполнения больным врачебных

рекомендаций и/или прерывания лечения), а также моно-, поли- и

мультирезистентности существуют такие понятия, как «истинная», «ложная»,

«скрытая» и «полная» лекарственная устойчивость (встречается довольно редко)

[18, 22].

В настоящее время для определения лекарственной устойчивости

микобактерий к ПТП в международной практике используются следующие

методы:

-метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена или на среде Миддлбрука

7Н10;

-метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-

Йенсена;

-метод коэффициента резистентности;

-радиометрический метод Bactec 460.

Выбор того или иного метода определяется традиционно используемыми в

данной стране подходами. Однако необходимо иметь в виду, что обязательным

условием эффективного мониторинга, обеспечения эпидемиологического надзора

за лекарственной устойчивостью микобактерий и распространением

лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя, а также сопоставления

результатов исследований и эффективности лечения в масштабах страны является

применение только одного из предложенных унифицированных методов. В нашей

стране получило распространение определение лекарственной устойчивости

методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена. В последнее

время разрабатываются новые методы оценки лекарственной устойчивости на

уровне генотипа [23, 24]. Работа по изучению молекулярных механизмов

резистентности показала наличие у микобактерий генов, связанных с

16

устойчивостью к различным препаратам: к изониазиду – гены kat G, inh A, kas A,

к рифампицину – rpo B и т.д. [25].

Для различных препаратов установлена определенная критическая

концентрация (максимальная концентрация препарата (количество микрограмм в

1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение

микобактерий). Она имеет клиническое значение, так как отражает воздействие

препарата на МБТ в условиях макроорганизма.

Внедрение коротких курсов терапии под непосредственным наблюдением

DOTS (directly observed treatment, short course) оказало существенное влияние на

продуктивность лечения туберкулеза. DOTS представляют собой

программированное двухэтапное лечение. В начальной фазе (направлена на

ликвидацию клинических проявлений заболевания и максимальное воздействие

на популяцию МБТ, прекращение выделения бактерий и предотвращение

развития лекарственно-устойчивых штаммов) в течение 2-3 месяцев назначается

4-5 ПТП. В фазе продолжения лечения (воздействует на сохраняющуюся

микобактериальную популяцию и обеспечивает дальнейшее уменьшение

воспалительных изменений и инволюцию туберкулезного процесса, а также

восстановление функциональных возможностей организма больного) назначается

2-3 препарата в течение 4-6 месяцев [21, 26- 29].

Стандарты лечения и основные схемы химиотерапии больных с

туберкулезом в Российской Федерации (РФ) изложены в Приказе Минздрава РФ

от 21.03.2003 N 109 от 29.10.2009 «О совершенствовании противотуберкулезных

мероприятий в Российской Федерации» [10].

Однако одной этой меры оказалось недостаточно для полной ликвидации

туберкулезной инфекции [30-34]. В связи с этим ВОЗ разработана новая стратегия

борьбы с туберкулезом, основанная на DOTS и учитывающая современные

особенности заболевания, а также сложности, с которыми приходится

сталкиваться в ходе лечения. Целью стратегии является снижение заболеваемости

и смертности от туберкулеза, а также устранение туберкулеза как проблемы для

общественного здравоохранения к 2050 г. [35]. Первым и основополагающим

17

компонентом новой стратегии является выведение на рынок новых ПТП,

способных расширить возможности для лечения больных туберкулезом с МЛУ,

повысить эффективность, сократить сроки лечения и снизить частоту

нежелательных эффектов этиотропной терапии [26-28, 36].

Таким образом, всё вышесказанное делает необходимым разработку и

внедрение более эффективных и безопасных инновационных

противотуберкулезных лекарственных средств.

1.2 Доклинические исследования оригинального лекарственного

средства

С момента формирования идеи о создании нового лекарственного препарата

процесс его разработки неразрывно связан с проведением доклинических

исследований. Такие исследования позволяют оценить эффективность того или

иного вещества или их комбинации и выбрать наиболее оптимальный состав

будущего ЛП. После разработки его состава проводят доклинические

исследования безопасности и эффективности.

Доклиническое исследование (ДИ) – это изучение фармакологических,

токсических и фармацевтических (включая физико-химические) свойств веществ

и\или их комбинаций и разработка и исследование новых лекарственных форм

[37].

Внедрение современных препаратов в клиническую практику осуществимо

лишь при условии детального изучения их специфической фармакологической

активности и безопасности на этапе экспериментальных (доклинических)

исследований. В России эти исследования проводятся в соответствии с Приказом

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

18

№708н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» [38],

ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (Рrinciples

of Good Laboratory Practice) [39] и Руководством по проведению доклинических

исследований лекарственных средств под редакцией профессора А.Н. Миронова

[40], предполагающими тщательное изучение нового препарата на различных

животных с их современным качественным обследованием с целью исключения

неблагоприятных последствий при применении препарата у людей.

Целью ДИ лекарственных средств является получение научными методами

оценок и доказательств безопасности и эффективности лекарственных средств

[37].

Доклинические исследования безопасности ЛП направлены на выявление

возможного повреждающего действия ЛС. Такие исследования условно делятся

на изучение общетоксического действия (общая токсичность) и исследование

специфических видов токсичности.

При исследовании общей токсичности происходит выявление переносимых

и токсических доз фармакологического вещества [37], а также основных органов

и систем организма, подверженных повреждающему действию изучаемого

вещества. Доклинические исследования общетоксического действия включают:

исследование острой токсичности (при однократном или дробном введении через

короткие (не более 3-6 часов) интервалы времени в течение суток),

субхронической (подострой) токсичности (продолжительность введения 2-12

недель), хронической токсичности (включает в себя повторные введения

препарата на протяжении 1 года, а иногда и более) [37].

Исследование специфической токсичности направлено на выявление

репродуктивной токсичности (эмбриотоксичности, тератогенности, влияния на

генеративную функцию), аллергенности, иммунотоксичности, мутагенности и

канцерогенности фармакологического средства.

Доклинические исследования эффективности – это изучение

фармакокинетических свойств препарата, а также специфической

фармакологической активности лекарственного препарата, проводимое на

19

моделях заболеваний/синдромов у лабораторных животных. Данный вид

исследований позволяет изучить его фармакодинамические свойства,

определяющие в последующем объем и дизайн клинических исследований, а

также показания к применению лекарственного препарата.

Изучение фармакокинетических свойств инновационных лекарственных

препаратов является одним из главных аспектов доклинических исследований,

которое позволяет обосновать выбор путей и методов введения препарата,

установить зависимость «концентрация-эффект», а также оптимизировать выбор

его лекарственной формы. Структура этих исследований подробно изложена в

Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств

под редакцией профессора А.Н. Миронова [40]. По результатам проведенных

доклинических испытаний на параметры фармакокинетики ЛС составляется

подробный отчет, в котором в обязательном порядке указываются все сведения о

проделанных исследованиях:

- предоставляется полная информация об использованных лабораторных

животных (вид, линия, возраст, пол, масса тела), их содержании до исследования

[41];

- предоставляется информация о состоянии животных в момент проведения

исследования (бодрствование или наркоз, в последнем случае указывают данные

о применявшихся для наркоза препаратах и их дозах); в качестве модельных

животных обычно используют крыс [42], кроликов, собак [43] и обезьян (также

допускается использование морских свинок, кошек, мышей) [37,44];

- указываются способы введения препарата и отбора биоматериала,

предоставляется информация о подготовке, хранении проб, а также о

максимальных сроках хранения содержащих препарат образцов биожидкостей;

- подробно описывается методика определения концентрации препарата в

биологических жидкостях, подаются сведения об использованных реактивах,

приборах и оборудовании с указанием необходимых метрологических

характеристик (диапазон линейности, точность, порог чувствительности,

воспроизводимость);

20

- приводятся результаты определяемой в ходе исследования концентрации

фармакологического средства, предпочтительно в графической форме с

нанесением средних значений найденных концентраций и границ доверительного

интервала, зависимость – предпочтительно линейная или логарифмическая, в

редких случаях допускается и нелинейная [41];

- приводятся данные обработки полученных результатов с указанием

методики вычисления фармакокинетических параметров, а также сведений о

применявшихся программных средствах (компьютеризированные вычисления);

- указываются ориентировочные дозы для 1 фазы клинических испытаний, а

также период полувыведения оригинального лекарственного вещества [37, 44].

Согласно законодательству Российской Федерации отчет по ДИ составляет

значительную часть регистрационного досье, формируемого с целью

государственной регистрации ЛП [45].

1.3 Особенности клинических фармакокинетических исследований

инновационных лекарственных препаратов

Утвержденная Правительством России «Стратегия развития

фармацевтической промышленности на период до 2020 года», предполагает

переход на инновационную модель развития фармацевтической промышленности.

Программа призвана стимулировать разработку и производство инновационных

лекарственных препаратов [46]. Изучение фармакокинетики лекарственных

веществ и учет их фармакокинетических параметров на сегодняшний день

является необходимым этапом в комплексе работ, как при создании новых

оригинальных лекарственных средств, так и при применении известных, так

называемых, генерических препаратов. Связано это, прежде всего, с получением

объективных характеристик всех процессов, которые происходят в организме

21

человека с препаратом, начиная с этапа всасывания из места введения, и

заканчивая его выведением из организма. Полученные при этом данные

позволяют получить потенциальные пути введения разрабатываемого препарата,

определить взаимосвязь между дозой и концентрацией, эффектом и его

продолжительностью, механизм действия, данные об общей фармакологии,

исследования абсорбции, распределения, метаболизма и выведения.

Фармакокинетические исследования лекарственных средств проводят с

целью определения фармакокинетических параметров, дающих количественную

оценку процессов, происходящих с лекарственным веществом (ЛВ) в организме

пациента после приема препарата - от момента попадания в организм до полной

элиминации.

Любое фармакокинетическое исследование состоит из двух главных этапов:

биоаналитического метода и собственно расчетов фармакоктнетических

параметров. В свою очередь биоаналитический метод включает в себя два

основных этапа: а) подготовку образца - выделение лекарственного вещества

и/или его метаболита (-ов) из биологической матрицы (исследуемый материал:

кровь, плазма, моча и т.д.) и б) идентификации с последующим проведением

количественного анализа.

Подготовка образца к анализу преследует три основные цели: растворение

анализируемого вещества в соответствующем растворителе, удаление

максимально возможного количества мешающих определению веществ и

концентрирование анализируемого соединения. Пробоподготовку проводят с

использованием таких процедур, как осаждение белков, жидкостная экстракция,

твердофазная экстракция.

Существуют различные аналитические методы качественного и

количественного определения ЛС. Ассортимент как имеющихся, так и

разрабатываемых ЛС представляет собой широкий спектр различных классов

химических соединений, обладающих различными химическими свойствами.

Исходя из этого, в каждом конкретном случае необходимо подбирать такой метод

анализа, который обладает наиболее высокой чувствительностью,

22

специфичностью, воспроизводимостью, позволяет работать с малыми объемами

материала, является универсальным, экономичным и простым в исполнении [47,

48]. На сегодняшний день для количественного определения ЛВ в биоматериале

при оценке фармакокинетики ЛС наиболее широко применяются следующие

аналитические методы: высокоэффективная жидкостная хроматография и

сверхвысокопроизводительная высокоэффективная жидкостная хроматография

(СВЭЖХ) в частности со спектрофотометрическим, флуоресцентным и масс-

спектрометрическим (ВЭЖХ-МС) методами детектирования [47, 49],

газожидкостная хроматография (ГЖХ) [50, 51] и иммуноферментный анализ

(ИФА) [52, 53].

Вышеперечисленные процедуры определяют перечень требуемого

оборудования, квалификацию и компетентность персонала лаборатории [54-56].

Для многих принимаемых внутрь лекарственных препаратов, особенно с

модифицированным (пролонгированным) высвобождением, необходимо оценить

влияние приема пищи на биодоступность.

Необходимо предусмотреть исследование фармакокинетических свойств у

особых групп пациентов, как то пациенты с нарушением выведения (почечная

или печеночная недостаточность), пожилые, дети, женщины и этнические

подгруппы. Для большинства лекарственных препаратов необходимы

исследования лекарственных взаимодействий. Такие исследования, как правило,

проводят на более поздних фазах, однако результаты исследований метаболизма и

возможных взаимодействий на животных, исследования in vitro могут

способствовать проведению таких исследований раньше [57].

Клиническим исследованиям фармакокинетики новых фармакологических

веществ принадлежит важная роль. Потенциальный кандидат должен иметь

приемлемый профиль безопасности по отношению к потенциальной пользе

лечения [58].

Клиническое исследование - любое исследование, проводимое с участием

человека в качестве субъекта для выявления или подтверждения клинических

и/или фармакологических эффектов исследуемых продуктов и/или выявления

23

нежелательных реакций на исследуемые продукты, и/или изучения их

всасывания, распределения, метаболизма и выведения с целью оценить их

безопасность и/или эффективность [59].

Последовательность изучения ЛС в ходе клинических исследований

подразделяют на четыре фазы. Качество лекарственного препарата должно

соответствовать этапу его клинической разработки [57].

I Фаза клинических исследований

I фаза клинических испытаний – это первый шаг тестирования нового

лекарственного вещества на людях. Основной задачей является проверка данных,

полученных при доклиническом изучении не менее, чем на двух видах

экспериментальных животных [54, 60]. Эти исследования спланированы таким

образом, чтобы установить переносимость, безопасность, наличие

терапевтического действия, фармакокинетические и фармакодинамические

характеристики, а иногда и первоначальные показатели эффективности

потенциального ЛС.

Цель I фазы – обеспечить необходимый уровень безопасности

лекарственного средства, установить его фармакокинетический профиль.

Основные фармакокинетические параметры, которые определяют в ходе

клинических исследований I фазы, следующие [61, 62]:

1. Значения площади под кривыми «концентрация-время» (AUC);

2. Максимальная концентрация (Сmax);

3. Время достижения максимальной концентрации (Тmax);

4. Период полувыведения (Т ½);

5. Показатель скорости всасывания (Сmax/AUC);

6. Время удерживания вещества в плазме (MRT);

7. Константа элиминации (kel).

Обычно в I фазе клинических испытаний принимают участие не более 100

здоровых добровольцев (в среднем 25-30 человек), за которыми ведется

тщательное наблюдение. Исключением являются клинические исследования

лекарственных средств против онкологических заболеваний, ВИЧ-инфекции,

24

психических заболеваний. С точки зрения медицинской этики, в связи с

потенциальной токсичностью таких лекарственных средств, предпочтительнее

проводить их исследования на пациентах, а не на здоровых добровольцах [63].

Процесс проведения исследований I фазы занимает от 6 месяцев до одного года.

На ранних этапах исследований Фазы I, начальную дозу, кратность и путь

введения препарата обычно устанавливают в доклинических испытаниях. Однако

из-за различий в фармакокинетике и фармакодинамике у человека и у животных

такие дозы могут требовать коррекции [37].

Важность проведения клинических испытаний I Фазы состоит в получении

данных о переносимости и безопасности препарата с целью принять решение о

его дальнейшей разработке или прекращении исследований. Если препарат

оказался безопасным и хорошо переносимым, клиническое исследование

переходит в Фазу II. Эта фаза требует включения большего количества

испытуемых (100—200 человек), но с заболеванием (или состоянием), для

лечения (диагностики и/или профилактики) которого предназначен

разрабатываемый препарат.

II Фаза клинических исследований

Цель фазы II - доказать эффективность и безопасность исследуемого

лекарственного средства (ЛС) и установить оптимальные режимы дозирования.

Фаза II включает 2 вида клинических исследований:

- пилотные исследования (фаза IIа);

- контролируемые исследования (фаза IIb).

Пилотные исследования проводятся с целью поиска дополнительных

свойств ЛС у пациентов. В ходе этих исследований выявляется необходимость

дальнейших контролируемых исследований в этом направлении.

Контролируемые исследования предусматривают наличие контроля или

контрольной группы (контроль исходного состояния, плацебо-контроль,

активный контроль), что позволяет избежать погрешностей, связанных с

влиянием различных зависимых или независимых факторов на результаты

лечения. Основная и контрольная группы не должны различаться по полу,

25

возрасту, тяжести заболевания и другим факторам, что достигается с помощью

метода рандомизации.

Используется четыре типа контроля:

• контроль исходного состояния (измерения исходного состояния,

производится у каждого пациента до начала лечения с целью получения исходных

данных, которые затем будут сравниваться с результатом после окончания

лечения);

• плацебо-контроль или технология «негативного контроля» (назначение

пациенту плацебо-неактивного вещества, которое невозможно отличить от

экспериментального ЛС ни по каким признакам – внешнему виду, вкусу, запаху);

• активный контроль, «позитивный контроль» (лечение с применением

лекарственного средства, которое является эффективным относительно

исследуемого показания, ЛС активного контроля; как и в случае применения

плацебо, не отличается от изучаемого препарата);

• контроль по архивной статистике, «исторический контроль» (позволяет

сравнить экспериментальный курс лечения с существующими данными об

исходах конкретного заболевания при многолетних наблюдениях; способ

контроля по архивной статистике используется в том случае, когда не существует

другого эффективного метода лечения известной патологии или редкого

заболевания) [55, 59, 64].

Контролируемые исследования часто носят сравнительный характер:

сравнение эффективности и переносимости с другими препаратами, сравнение

эффективности разных доз ЛС и др. В качестве препарата сравнения может

использоваться плацебо или другое ЛС, а также разные дозы одного препарата.

Исследования II фазы считаются критическим моментом в создании ЛС,

Начало проведения исследований, в которых основной целью является

подтверждение терапевтической пользы, как правило, считается стартом III фазы.

III Фаза клинических исследований

III Фаза клинических испытаний представляет собой расширенные

клинические исследования, главная цель которых получить дополнительную

26

информацию об эффективности и безопасности новых лекарственных средств у

пациентов в условиях, максимально приближенных к клинической практике. В

ходе этих исследований изучаются особенности действия препарата у больных с

сопутствующими заболеваниями, дополнительно исследуют взаимосвязь между

дозой и эффектом, возможность применения лекарственного препарата у

различных групп пациентов, на различных стадиях заболевания, выявляются

относительно редко встречающиеся побочные реакции и особенности

взаимодействия нового препарата с другими ЛС. Также изучаются

фармакоэкономические аспекты.

Фаза III клинических исследований завершается представлением препарата

на регистрацию, в связи с чем она делится на две фазы:

• фаза IIIa - охватывает период до представления заявки на регистрацию;

• фаза IIIb - период с момента подачи заявки на регистрацию и до

окончательной регистрации препарата [55, 59, 64].

После разрешения применения нового препарата в медицинской практике и

его внедрения возможно проведение фазы IV клинических исследований, целью

которых является изучение возможностей для расширения показаний к

применению ЛС, усовершенствование режимов назначения и схем лечения в

процессе длительного наблюдения (в течение многих лет).

1.4 Обзор результатов доклинических исследований тиозонида

Основанием для выбора способа введения, дозировки и режима

дозирования служат результаты доклинического изучения тиозонида.

Проводились доклинические исследования противотуберкулезной

активности тиозонида in vitro и in vivo [65]. В качестве биологической модели

27

использовали самцов-мышей массой 22 г. Оценивали противотуберкулезный

эффект тиозонида в сравнении с эффективностью ПТП первого ряда (изониазида,

рифампицина, пиразинамида и этамбутола), а также изучали взаимодействие

препарата тиозонид с ПТП первого ряда.

В ходе исследований in vitro было выявлено, что тиозонид обладал

антимикобактериальным эффектом, сравнимым с ингибирующим действием

изониазида и рифампицина, ингибировал рост культуры вирулентного

лабораторного штамма МБТ H37Rv, чувствительного ко всем

противотуберкулезным препаратам, культуры штамма МБТ CN-40 с

моноустойчивостью к изониазиду и культуры штамма МБТ MS-115 с

множественной лекарственной устойчивостью.

Результаты исследований in vivo показали, что продолжительность жизни

экспериментальных животных, получавших монотерапию препаратом тиозонид,

не отличалась от продолжительности жизни животных, получавших изониазид и

рифампицин.

Совместная терапия тиозонидом с этионамидом и тиозонидом с

пиразинамидом привела к достоверному увеличению продолжительности жизни

экспериментальных животных этих групп по сравнению с монотерапией

пиразинамидом и этионамидом.

Показатели КОЕ МБТ в легких экспериментальных мышей, принимавших

тиозонид, свидетельствовали об эффективном противотуберкулезном эффекте in

vivo в дозе 25 мг/кг, сравнимом с показателями КОЕ МБТ в легких животных,

получавших рифампицин в аналогичной дозе. В двух сериях эксперимента острой

токсичности на мышах препарат относится к IV классу опасности [65].

Проводились исследования фармакокинетики тиозонида в виде изомера Р2

(R/S-изомерия) при однократном внутрижелудочном введении на мини-свиньях

Светлогорской популяции [66]. Концентрация тиозонида в плазме крови мини-

свиней определялась методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором,

предел количественного определения методики составлял 2 нг/мл. В качестве

биологического материала использовали кровь и мочу мини-свиней. Однако в

28

пробах мочи тиозонид не был обнаружен. Динамика концентрации тиозонида

определялась в сыворотке крови при трех дозировках: 100 мг, 200 мг и 400 мг.

График отбора проб крови для изучения фармакокинетики был следующим: 0.5, 1,

2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 72, 96 часов. Индивидуальные профили изменения

концентраций тиозонида в сыворотке крови во времени, заpегистpиpованные

после внутрижелудочного введения тиозонида Р2 в вышеуказанных дозах,

хаpактеpизовали максимальной концентрацией вещества и временем ее

достижения, площадью под кривой «концентрация – время» в пределах от нуля до

момента отбора последней пробы крови (96 ч), рассчитанной методом трапеций, а

также периодом полувыведения. При обработке полученных результатов

оценивали среднее значение, стандартное отклонение и стандартную ошибку,

коэффициент вариации, минимальное и максимальное значения.

Исследования показали, что после внутрижелудочного введения животным

кинетика препарата характеризуется быстрым поступлением тиозонида в

системный кровоток и длительной циркуляцией в нем (48 и более часов).

Максимальная концентрация в сыворотке крови животных после

внутрижелудочного введения составила в среднем 31,7±6,0 нг/мл, 118,7±62,0

нг/мл, 1043,3±66,1 нг/мл для дозировок 100 мг, 200 мг, 400 мг соответственно и

достигалась в диапазоне 1-8 часов. Значения концентраций тиозонида в каждой

временной точке колебались в значительных пределах (значение коэффициента

вариации доходило до 170%). Период полувыведения колебался в интервале 20-45

часов. Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат быстро и полно

всасывается в системный кровоток, длительно циркулирует в организме

животных.

Коллективом наших сотрудников проводилось исследование двух изомеров

тиозонида – тиозонид Р1 и тиозонид Р2 (R/S-изомерия). В результате серии

экспериментов была разработана методика количественного определения

тиозонида Р1 и тиозонида Р2 в биологических объектах (биологическая жидкость

– плазма крови; органы - мышцы, сальник, печень, почки, легкие) методом

жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором на приборе

29

«Agilent 1200» (США). Оптимальными были признаны следующие условия

извлечения и хроматографирования тиозонида Р1 и тиозонида Р2.

Извлечение тиозонида Р1 и тиозонида Р2 из плазмы крови:

200 мкл плазмы помещали в микропробирки Eppendorf, прибавляли 300 мкл

ацетонитрила, встряхивали на шейкере при скорости 2500 об/мин в течение 5

минут, затем центрифугировали в течение 10 минут при 13200 об/мин. Далее

отбирали 200 мкл центрифугата в виалу, добавляли 200 мкл воды, тщательно

перемешивали на шейкере и помещали в автосамплер.

Извлечение тиозонида Р1 и тиозонида Р2 из органов:

точную навеску гомогенизированного органа помещали в микропробирки

Eppendorf, добавляли 2 мл этанола подкисленного ТФУ (100:1), встряхивали на

шейкере при скорости 2500 об/мин в течение 10 минут, затем помещали в

ультразвуковую баню на 10 минут, встряхивали на шейкере при скорости 2500

об/мин в течение 10 минут. Далее проводили настаивание в течение 30 минут,

снова встряхивали на шейкере в течение 5 минут, полученный экстракт

центрифугировали при скорости 13500 об/мин в течение 10 минут. Центрифугат

переносили в виалу и помещали в автосамплер.

Условия хроматографирования

Разделение проводили на колонке «ZORBAX SB C18 5мкм, 150*2,1мм» при

температуре колонки 400С. В качестве подвижной фазы использовали смесь

ацетонитрила и 0,1 % раствора трифторуксусной кислоты (рН 2,6) в соотношении

60:40. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Детектор: масс-спектрометрический,

квадруполь. Ионизация: электрораспылительный вариант (Electrospray

Ionization,ESI). Напряжение на капилляре 4000V. Детектирование проводили в

SIM режиме по ионам 559,1 (Р1) и 561,1 (Р2). Время удерживания тиозонида Р1

составило 3,59 мин; время удерживания тиозонида Р2 составило 4,41 мин.

Предел обнаружения тиозонида Р1 и тиозонида Р2 в биологических объектах

составил 2 нг/мл.

30

1.5 Заключение

Анализ литературных данных показал, что с начала 90-х годов в Российской

Федерации отмечается отчетливая тенденция к ухудшению эпидемиологической

ситуации по туберкулезу. Наиболее вероятной причиной этого является

лекарственная резистентность МБТ к основным противотуберкулезным

препаратам.

Распространение штаммов туберкулеза с множественной и широкой

лекарственной устойчивостью представляет собой серьезную угрозу здоровью

общества и требует новых подходов к лечению заболевания. Курсы

противотуберкулезной химиотерапии, которая является основным компонентом

лечения туберкулеза, включают в себя продолжительный (от 6 месяцев) прием

большого количества ПТП (от 3 и более в зависимости от степени тяжести и

характера заболевания). Нарушение комплаентности, досрочное прекращение

лечения в силу появления тяжелых побочных эффектов ПТП, приводит к

снижению эффективности противотуберкулезной терапии, и, как следствие, к

распространению лекарственно устойчивых форм туберкулезной инфекции.

Пациентам с МЛУ туберкулезом и ШЛУ туберкулезом необходимы

индивидуальные режимы противотуберкулезной терапии, которые включают

подбор оптимальной комбинации лекарственных препаратов с учетом

лекарственной устойчивости МБТ.

Таким образом, для национальных программ борьбы с туберкулезом стала

очевидной потребность в уменьшении сроков химиотерапии и использовании

новых противотуберкулезных препаратов.

Анализ литературных данных доклинических исследований тиозонида на

животных позволил оценить токсические свойства препарата и прогнозировать

высокую степень безопасности его применения в клинических исследованиях.

31

В серии экспериментов in vitro доказан антимикобактериальный эффект

тиозонида, сравнимый с таковым у изониазида и рифампицина, а также

эффективность в отношении вирулентного штамма МБТ H37Rv, чувствительного

ко всем противотуберкулезным препаратам, культуры штамма МБТ CN-40 с

моноустойчивостью к изониазиду и культуры штамма МБТ MS-115 с

множественной лекарственной устойчивостью. По результатам исследований in

vivo выявлено, что тиозонид достоверно увеличивал продолжительность жизни

экспериментальных животных при совместной терапии с этионамидом и с

пиразинамидом. В двух сериях эксперимента острой токсичности на мышах

препарат относится к IV классу опасности [65].

Результаты фармакокинетических исследований тиозонида демонстрируют,

что тиозонид быстро и полно всасывается в системный кровоток и длительно

циркулирует в нем (48 и более часов) [66].

По результатам доклинических исследований предположительно Тиозонид

должен обеспечить:

1) повышение эффективности стандартной химиотерапии лекарственно-

чувствительного туберкулеза;

2) повышение эффективности химиотерапии туберкулеза с множественной

и широкой лекарственной устойчивостью микобактерий;

3) уменьшение общей продолжительность эффективной терапии МЛУ

туберкулеза и/или значимое снижение общего количества назначаемых

препаратов.

Тиозонид представляет собой инновационное лекарственное средство, в

литературе отсутствуют данные по биоаналитическим методикам определения

тиозонида в плазме крови человека. Имеющиеся результаты доклинических

исследований позволяют сделать заключение о безусловной перспективности

дальнейшего изучения тиозонида в качестве противотуберкулёзного препарата.

32

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (СОБСТВЕННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Оборудование и реактивы

жидкостной хроматограф Agilent 1200 с масс-спектрометрическим

детектором MS 6120, AgilentTechnologies, США;

весы аналитические OHAUS DV 214C, Китай;

портативный рН-метр 728 рН lab, Metrohm AG, Швейцария;

центрифуга Eppendorf 5415D, Германия;

встряхиватель типа вортекс ELMI, Латвия;

концентратор Eppendorf Concentrator plus, Германия;

дозаторы переменного объема Ленпипет 10 – 100 мкл и 100 – 1000 мкл,

Россия;

холодильник Indesit, SD 125, Россия;

морозильник для плазмы Sanyo, Япония;

система водоподготовки Millipore, Milli-Q Advantage A10, Франция;

микропробирки Eppendorf 1,5 мл;

колбы мерные класса «А» вместимостью 20, 50 и 100 мл;

пипетки аналитические класса «AS» вместимостью 5, 10 мл.

Реактивы

ацетонитрил Super Gradient, Lab-Scan Analytical Sciences;

муравьиная кислота (х.ч.);

вода очищенная;

вода Milli-Q;

метанол (Scharlau, Испания, класс «для ВЭЖХ»).

33

2.2 Стандартный образец и объекты исследования

Стандартный образец

тиозонид цитрат, субстанция-порошок (предоставлен ЗАО «Фарм-Синтез»,

серия 09112012, годен до 11.2014, чистота более 99 %, Россия).

Объекты исследования

Для изучения фармакокинетики препарата тиозонид в качестве объектов

исследования использовали образцы плазмы крови после однократного

перорального приема препарата здоровыми добровольцами в дозе 25 мг, 200 мг,

400 мг и 600 мг.

2.3 Дизайн фармакокинетического исследования

Проводили одноцентровое проспективное нерандомизированное

исследование с последовательным включением добровольцев с эскалацией дозы

для оценки безопасности, переносимости и изучения фармакокинетического

профиля препарата, впервые применяющегося у человека. В исследовании

принимали участие 4 группы здоровых добровольцев (по 10 добровольцев в

каждой группе), которые принимали перорально препарат в дозах 25 мг (капсулы

были изготовлены для исследования), 200, 400 и 600 мг (по 2, 4 и 6 капсул по 100

мг соответственно):

1-ая группа – 25 мг;

34

2-ая группа – 200 мг;

3-я группа – 400 мг;

4-я группа – 600 мг.

Для каждой из групп осуществлялось последовательное включение

добровольцев с промежуточной оценкой параметров безопасности. Группа (10

добровольцев) делилась на три когорты (3+3+4). Первоначально в исследование

включали первую когорту (3 добровольца), которая принимала препарат в дозе 25

мг однократно. После оценки промежуточных результатов анализов безопасности

(общий и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, клиническая оценка

состояния здоровья) через 7 суток исследования, исследователь принимал

решение о включении в исследование второй когорты, и через 7 суток после

оценки безопасности включения первых двух когорт, включали третью когорту из

группы, которая продолжала прием препарата в дозе 25 мг однократно. Все

нежелательные реакции (включая сдвиги лабораторных показателей),

регистрировались и учитывались при анализе результатов исследования. По

промежуточным результатам исследования 1-ой группы добровольцев

составлялся отчет по безопасности исследуемой дозы препарата. На основании

отчета по безопасности принималось решение об эскалации дозы для следующей

группы добровольцев.

Основные требования к добровольцам были следующие: мужской пол,

возраст – 18-45 лет включительно, вес от 60 до 100 кг включительно, индекс

массы тела от 18 до 32 кг/м2, верифицированный диагноз «здоров».

Данное исследование проводилось с соблюдением требований

законодательных документов и этических принципов, изложенных в ФЗ № 61 «Об

обращении лекарственных средств» от 12 апреля 2010 г. [45], в соответствии с

правилами Надлежащей клинической практики [59] и регламентировалось

действующим законодательством.

Период приема препарата включал в себя период стационарного

наблюдения (отбор проб крови для ФК анализа и мониторинг нежелательных

реакций/нежелательных явлений в условиях стационара) и периода

35

амбулаторного наблюдения с отбором проб крови для проведения ФК анализа на

2, 3, 4, 5, 6, 7 сутки и последующего наблюдения на 14 и 28 сутки.

Длительность периода скрининга составляла до 14 дней. Длительность

периода приема препарата: период стационарного наблюдения – 2 суток (48

часов), период амбулаторного наблюдения – 28 суток (визиты в

исследовательский центр на 3-и, 4-ые, 5,-ые, 6-ые, 7-ые, 14-ые и 28-ые сутки).

Общая продолжительность исследования для добровольца составила до 43 дней.

Для анализа фармакокинетических параметров учитывали данные

добровольцев, получавших дозу препарата и сдавших не менее 75% проб крови.

График отбора проб крови для изучения фармакокинетики был следующим: 0 (до

приема препарата), 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120,144, 168

часов после приема препарата. Кровь для определения фармакокинетических

параметров отбиралась в обработанные натриевой солью гепарина пробирки

«Вакутейнер» в объеме не более 4 мл для каждой временной точки. Затем кровь

центрифугировали в течение 10 минут при скорости 3000 оборотов в минуту.

Плазму замораживали при температуре минус 35°С и передавали в лабораторию

для проведения фармакокинетического анализа.

2.4 Программное обеспечение

Статистическую обработку полученных данных при разработке и валидации

методики количественного определения тиозонида проводили при помощи

программного обеспечения ChemStation (ver. B.03.01-SR1), Agilent

Technologies,США. Фармакокинетические параметры и описательную статистику

рассчитывали модельно-независимым методом при помощи пакета MS Excel с

расширением для проведения фармакокинетического анализа Boomer

36

(разработано JoelI. Usansky, Ph.D., AtulDesai, M.S. and DianeTang-Liu, Ph.D.;

Department of Pharmacokinetics and Drug Metabolism Allergan, Irvine, CA 92606,

США).

Были рассчитаны следующие фармакокинетические параметры:

1. Значения площади под кривыми «концентрация-время» (AUC);

2. Максимальная концентрация (Сmax);

3. Время достижения максимальной концентрации (Тmax);

4. Минимальная концентрация (Сmin);

5. Период полувыведения (Т ½);

6. Кажущийся общий клиренс при приеме препарата внутрь (CL/F);

7. Время удерживания вещества в плазме (MRT);

8. Показатель скорости всасывания (Сmax/AUC);

9. Константа элиминации (kel).

Статистический анализ результатов определения концентраций тиозонида в

плазме крови и параметров фармакокинетики заключался в расчете

среднеарифметических (Mean) и среднегеометрических (GMean) значений,

стандартного отклонения (SD), коэффициента вариации (CV, %), медианы

(Median) и их интервальной оценки (Доверит, L-90%, U-90%), а также были

выделены максимальное (Max) и минимальное (Min) значения для каждого

фармакокинетического параметра.

37

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ

КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОЗОНИДА В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Тиозонид является инновационным лекарственным средством, в литературе

отсутствуют данные по биоаналитическим методикам определения тиозонида в

плазме крови людей.

По химической структуре тиозонид представляет собой - {1R,2S + 1S,2R}-1-

(6-Бром-2-хлорхинолил-3-ил)-4-(диметиламино)-2-(нафталин-1-ил)-1-

фенилбутан-2-ол - порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета.

Препарат не растворим в воде, не растворим в изотоническом растворе, 1г/л

растворим в метаноле, 10 г/л в хлороформе (раствор облучают на ультразвуковой

бане в течение 10 минут). Структурная формула тиозонида представлена на

Рисунке 1:

Рисунок 1. Структурная формула тиозонида ({1R, 2S + 1S, 2R}-1-(6-Бром-2-

хлор-хинолин-3-ил)-4-диметиламино-2-(нафталин-1-ил)-1-фенилбутан-2-ол)

C31H28N2OClBr

Молекулярная масса: 559.93.

38

3.1 Методика пробоподготовки

На сегодняшний день при проведении исследований методом ВЭЖХ

выделяют следующие основные способы подготовки образцов перед их вводом в

прибор, а именно: жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ), твердофазная

экстракция (ТФЭ), осаждение белков.

Жидкостная экстракция (ЖЖЭ) – тип пробоподготовки, который отличается

селективностью извлечения, простотой исполнения и сравнительно невысокой

стоимостью. Анализируемый образец доводят до необходимого значения pH,

далее добавляют органический растворитель, перемешивают, отделяют

органический слой, затем удаляют экстрагент при нагревании под током азота

(или производиться упаривание под вакуумом). Далее перерастворяют сухой

остаток в подходящем растворителе.

Процедура ТФЭ состоит из нескольких стадий: нанесение пробы на

картридж с сорбентом, последовательное пропускание через картридж различных

растворителей, которые элюируют посторонние вещества, затем следует

финальная стадия элюирование аналита с сорбента. Далее производят упаривание

элюата с последующим перерастворением сухого остатка, если необходимо

концентрирование пробы. [49, 67]. При валидации биоаналитической методики

применение ТФЭ практически полностью обеспечивает соответствие

необходимым требованиям по повторяемости и правильности [67]. Вместе с тем,

у этой процедуры есть и ряд недостатков, основными из которых являются

трудоемкость и относительная дороговизна.

Метод осаждения белков – это процедура удаления белков из

биологической матрицы путем их осаждения различными реагентами.

Для анализа тиозонида был выбран метод осаждения белков. Данный

способ пробоподготовки является наиболее простой и быстрой процедурой

39

удаления белков биологической матрицы, а также экономичным в сравнении с

ЖЖЭ и ТФЭ.

Биологические матрицы (кровь, в данном случае плазма, моча)

представляют собой сложные смеси эндогенных соединений: белки (главным

образом), липиды, различные соли, которые могут взаимодействовать с

аналитами в процессе разделения и мешать хроматографическому определению

исследуемого вещества, создавая дополнительные пики на хроматограмме и

оказывая влияние на ионизацию молекул аналита. Белки, в значительных

количествах присутствующие в плазме крови, могут необратимо адсорбироваться

на хроматографической колонке, что приведет к ухудшению эффективности и

резкому сокращению срока службы колонки. Суть метода состоит в том, чтобы

достичь таких значений рН, при которых происходит коагуляция белка, например,

к пробе добавляют сильные органические кислоты (муравьиную,

трифторуксусную, трихлоруксусную) [68, 69], смешивающиеся с водой

органические растворители, в основном - метанол [70, 71], ацетонитрил [72, 73],

реже этанол или соли металлов: цинка, свинца и др. Методом осаждения белков

можно добиться удаления до 98 % белков плазмы [74].

Следует отметить, что необходимо учитывать возможность возникновения

реакций осаждающего реагента с определяемым ЛВ (гидролиз,

комплексообразование) и оценивать растворимость ЛВ в выбранных условиях.

Также следует учитывать процесс разбавления пробы и соотношение

компонентов осаждающий реагент - объем плазмы. Неадекватное разбавление

может привести к недостаточной чувствительности, а ввод в хроматографическую

колонку сильнокислой пробы или пробы с существенно большим содержанием

ацетонитрила или метанола, чем в подвижной фазе (зачастую осаждающий

реагент входит в состав подвижной фазы), может сопровождаться изменением

параметров пригодности хроматографической системы (времени удерживания

компонентов, симметрии пиков, снижении эффективности (числа теоретических

тарелок) и др.).

40

После процедуры осаждения белков их отделяют от надосадочной жидкости

центрифугированием, далее хроматографируют.

Опробовали различные осаждающие реагенты (метанол, ацетонитрил,

трихлоруксусная кислота) и соотношения объемов плазмы и осаждающего

реагента. Использование ацетонитрила позволило достичь максимальной степени

осаждения при использовании минимальных затрат осаждающего реагента. Таким

образом, в качестве осаждающего реагента был выбран – ацетонитрил в

соотношении (1:1).

Пробоподготовка

В микропробирки Eppendorf 1,5 мл помещали 500 мкл плазмы крови, затем

прибавляли 500 мкл ацетонитрила, встряхивали на вихревой мешалке в течение 1-

2 мин, центрифугировали при 13200 оборотов в минуту (об/мин) в течение 10

минут и отделяли надосадочную жидкость. Полученную надосадочную жидкость

переливали из в виалы на 2,0 мл и помещали в автосэмплер хроматографа.

Образцы чистой и исследуемой плазмы крови хранили в морозильнике при

температуре от минус 75 до минус 80 оС.

Приготовление стандартных растворов тиозонида

Для приготовления исходного стандартного раствора тиозонида точную

навеску стандартного образца тиозонида (0,001 г) помещали в мерную колбу

вместимостью 100 мл, добавляли 3 мл метанола до полного растворения, а затем

доводили объем раствора водой Milli-Q до метки и перемешивали. В полученном

растворе концентрация тиозонида составляла 10 мкг/мл. Рабочие стандартные

растворы готовили в мерных колбах разведением исходного стандартного

раствора тиозонида водой Milli-Q (Таблица 1). Стандартные растворы хранили в

холодильнике при температуре от 2 до 8 оС.

41

Таблица 1

Аликвота Доводили

объем раствора

водой Milli-Q

до, мл

Полученная

концентрация рабочего

стандартного раствора,

нг/мл

10 мл исходного стандартного

раствора тиозонида с

концентрацией 10 мкг/мл

100 1000 (раствор 1)

5 мл исходного стандартного

раствора тиозонида с

концентрацией 10 мкг/мл

100 500 (раствор 2)

10 мл раствора 2 20 250 (раствор 3)







Стандартные растворы хранили в холодильнике при температуре от 2 до 8

оС.

3.2 Разработка методики определения тиозонида в плазме крови

Количественное определение проводили на высокоэффективном

жидкостном хроматографе Agilent 1200 с масс-спектрометрическим детектором

42

MS 6120, Agilent Technologies, США. Выбор метода ВЭЖХ с масс-

спектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС) для количественного определения

тиозонида в плазме крови обусловлен рядом существенных преимуществ данного

метода: возможность анализа широкого спектра соединений даже в минорных

концентрациях, что позволяет проводить детектирование с высокой

чувствительностью и селективностью; малый объем биоматериала, требуемый

для анализа.

Подбор условий хроматографического разделения

Подвижная фаза

Растворители, применяемые в ВЭЖХ, должны удовлетворять следующим

основным требованиям: чистота, химическая инертность, совместимость с

детектором, достаточная растворяющая способность по отношению к

анализируемым веществам, низкая вязкость, безопасность, доступность [75].

Растворитель активно участвует в самом процессе разделения. При выборе

растворителей необходимо учитывать весь комплекс их свойств, в той или иной

степени влияющих на проведение хроматографического эксперимента. В

большинстве случаев используют смесь растворителей, что резко расширяет

возможности хроматографической системы (дает возможность оптимизировать

процесс, улучшить форму пиков и эффективность разделения).

В ходе исследования опробовали смеси растворителей: метанол-вода в

соотношении 80:20, при этом наблюдалось слишком быстрое элюирование

компонента. Затем перешли к соотношениям 60:40, 40:60, однако достаточно

хорошего элюирования с приемлемым временем удерживания достигнуть так и не

удалось. Далее опробовали ацетонитрил в тех же соотношениях, параллельно

подбирая реагент для регулирования рН.

рН подвижной фазы также является важным фактором при анализе, так как

он может изменить гидрофобный характер анализируемого вещества [75]. Для

создания оптимального значения рН многие методы используют буферный агент.

В качестве буферного агента чаще всего используют фосфатные буферные

растворы, однако в случае ВЭЖХ-МС использование фосфатных буферных

43

растворов не допустимо, так как они нелетучи и осаждаются в ионизационной

камере детектора. При работе с масс-спектрометрическим детектором можно

использовать летучие органические кислоты (муравьиная, уксусная,

трифторуксусная кислоты), ацетатно-аммонийный, формиатно-аммонийный или

трифторацетатно-аммонийный буферные растворы.

Тиозонид является по своей химической структуре органическим

основанием, поэтому для достижения лучшей чувствительности

предположительный диапазон значений pH - 2-4. В ходе эксперимента в качестве

подвижной фазы опробовали уксусную, муравьиную и трифторуксусную кислоты

для диапазона рН 2-3,5. По результатам эксперимента наиболее подходящей

фазой является 0,1 % раствор муравьиной кислоты. При использовании

муравьиной кислоты удалось снизить предел обнаружения, добиться лучшей

ионизации.

Таким образом, для анализа тиозонида в качестве подвижной фазы нами

была выбрана смесь растворителей 0,1 % раствор муравьиной кислоты в воде /

ацетонитрил в соотношении 40:60, что позволило достичь наиболее

симметричных и узких пиков.

Неподвижная фаза

Выбор условий масс-селективного детектирования осуществлялся в режиме

прямого ввода образца в масс-детектор без использования разделяющей колонки,

а также с использованием колонки с привитыми алкильными радикалами ( -С8, -

С18). Было установлено, что определение тиозонида может быть произведено на

любой из исследованных неподвижных фаз, однако наилучшие результаты

достигнуты при использовании колонки Agilent Eclipce XDB-C18, 4.6x50 мм; 1,8

мкм.

Использование короткой колонки позволило сократить общее время

хроматографирования до 4 мин.

Детектирование

При выборе условий опробовали как электрораспылительный вариант

(Electrospray Ionization, ESI), так и вариант химической ионизации при

44

атмосферном давлении (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI).

Исследовали возможность регистрации положительных и отрицательных ионов.

ESI происходит при взаимодействии сильного электростатического поля

(напряжение примерно 3-5 кВ) с поверхностью жидкости на конце капиллярной

трубки. В исследуемой жидкости должны быть ионы, для этого обычно

добавляют небольшие количества солей, кислот или другие соединения, которые

способны привести к образованию ионов [76, 77]. Элюент из

хроматографической колонки под воздействием поля распыляется с образованием

мелких заряженных капель. Лучшей ионизации способствовало добавление в

подвижную фазу хроматографической системы небольшого количества

муравьиной кислоты (~ 0,1 %). Процесс распыления происходит при атмосферном

давлении и усиливается при добавлении газа в ионизационную камеру (азота

высокой чистоты (99,999 %)). Азот способствует испарению растворителя из

капель. Капли уменьшаются, плотность поверхностного заряда увеличивается,

что приводит к образованию капель меньшего размера. В конечном итоге

происходит выделение ионов из ионных кластеров, которые поступают в масс-

анализатор.

ESI относится к «мягким» методам ионизации [76, 78]. В качестве ионов

(наряду с фрагментами) исследуемой молекулы образуются протонированный или

депротонированный ионы, наличие которых характеризует соответственно

положительную или отрицательную моды масс-спектрографии. Отрицательная

мода менее чувствительна, за исключением тех случаев, когда происходит

образование стабильных анионов, например, карбоксильных групп.

В результате экспериментов установлено, что наилучшее соотношение

сигнал/шум для тиозонида достигается при использовании

электрораспылительной ионизации при регистрации положительных ионов.

Время удерживания тиозонида составило около 2,0 мин.

Таким образом, резюмируя все вышесказанное, для анализа тиозонида были

подобраны следующие условия хроматографирования:

45

подвижная фаза: 0,1 % раствор муравьиной кислоты в воде/ацетонитрил (40:60),

предварительно дегазированная

скорость потока подвижной фазы: 1,1 мл/мин

неподвижная фаза: хроматографическая колонка Agilent Eclipce XDB-C18 4.6x50

мм; 1,8 мкм, при температуре 30 оС

объем вводимой пробы: 10 мкл

время удерживания: около 2,0 +- 0,04 мин

детектирование: масс-спектрометрический детектор, тип ионизации: ESI; режим

сканирования: режим индивидуальных масс (SIM) по положительному иону m/z

= 561,1 (тиозонид); высушивающий газ – азот: скорость потока и температура

осушающего газа 12 л/мин и 250°С, соответственно; напряжение на капилляре

4000 В, напряжение на фрагменторе 70 В

общее время хроматографирования: 4 мин.

3.3 Валидация методики определения тиозонида в плазме крови

Валидацию методики проводили, ориентируясь на требования «Руководства

по экспертизе лекарственных средств» под редакцией профессора А.Н. Миронова.

Том I [57], а также на основании руководств по валидации биоаналитических

методик Food and Drug Administration (FDA) [79] и European Medicines Agency

(EMA) [80] по следующим характеристикам:

- селективность;

- линейность;

- правильность (на уровнях inter-day и intra-day);

- прецизионность (на уровнях inter-day и intra-day);

46

- предел количественного определения;

- перенос пробы;

- стабильность растворов.

Селективность

Выбранный аналитический метод должен иметь достаточное разрешение

пиков аналита и внутреннего стандарта с пиками эндогенных компонентов

матрицы или других компонентов образца.

Для определения селективности проводили анализ 6 образцов чистой

плазмы, образца чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора тиозонида

в диапазоне концентраций 1нг/мл – 1000 нг/мл. На хроматограммах образцов

чистой плазмы не наблюдалось пиков со временем удерживания,

соответствующим времени удерживания тиозонида. Хроматограмма образца

чистой плазмы, не содержащей стандартного образца тиозонида, представлена на

Рисунке 2. Хроматограмма образца плазмы, содержащей раствор стандартного

образца тиозонида с концентрацией 50 нг/мл, представлена на Рисунке 3.

Рисунок 2. Хроматограмма чистой плазмы, не содержащей раствор стандартного

образца тиозонида.

47

Рисунок 3. Хроматограмма плазмы, содержащей раствор стандартного образца

тиозонида с концентрацией 50 нг/мл.

Разрешение между пиком бланка и пиком аналита (RS) рассчитывали по формуле:

RS = 2*(TR2- TR1) / (W1+W2), где

TR1 – время удерживания пика аналита;

TR2 – время удерживания пика бланка;

W1 – ширина пика аналита у основания;

W2 – ширина пика бланка у основания.

Разрешение между пиком бланка и пиком аналита имеет величину 3,149,

что соответствует нормам, критерий пригодности – разрешение не менее 3.

Линейность

Для определения линейности проводили анализ 9 образцов чистой плазмы с

прибавлением раствора стандартного образца тиозонида до получения

концентраций: 1 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл, 250 нг/мл,

500 нг/мл и 1000 нг/мл. Каждая модельная смесь анализировалась 3 раза.

Полученные значения площадей пиков и концентраций тиозонида представлены в

Таблице 2.

48

Таблица 2

№ модельной

смеси

Площадь

пика C

фактическая,

нг/мл

С

рассчитанная,

нг/мл

ε, %

1

1100 1 0,998227 0,18%

1103 1 1,008436 -0,84%

1107 1 1,022048 -2,20%

2

2156 5 4,591795 8,16%

2178 5 4,666661 6,67%

2118 5 4,462481 10,75%

3

3475 10 9,080352 9,20%

3536 10 9,287935 7,12%

3505 10 9,182442 8,18%

4

7654 25 23,30149 6,79%

7701 25 23,46143 6,15%

7491 25 22,7468 9,01%

5

14590 50 46,9047 6,19%

14480 50 46,53037 6,94%

14769 50 47,51383 4,97%

6

29880 100 98,93657 1,06%

30728 100 101,8223 -1,82%

30931 100 102,5131 -2,51%

49

7

70002 250 235,4717 5,81%

72261 250 243,1591 2,74%

69315 250 233,1339 6,75%

8

157594 500 533,5473 -6,71%

160873 500 544,7057 -8,94%

153633 500 520,068 -4,01%

9

288010 1000 977,353 2,26%

285128 1000 967,5455 3,25%

297618 1000 1010,049 -1,00%

По полученным значениям был построен калибровочный график совместно

с уравнением калибровочной кривой (y = 0,0034030x - 2,745), приведены на

Рисунке 4.

Рисунок 4. Калибровочный график зависимости площади пика тиозонида от его

концентрации в плазме (нг/мл).

50

Критериями приемлемости являются как коэффициент корреляции (R2>

0,998), так и свободный член a в уравнении полученной прямой y=bx+a, который

не должен превышать 5% от площади пика в модельной смеси с ожидаемой

концентрацией. В данном случае как видно по полученному уравнению

калибровочной кривой y = 0,0034030x - 2,745 свободный член имеет величину по

модулю 2,745 и не превышает 5% от площади пика аналита с концентрацией 1

нг/мл.

Концентрационный диапазон подбирают таким образом, чтобы обеспечить

адекватное описание фармакокинетики определяемого вещества. Примеры

соответствующих хроматограмм представлены на Рисунках 5-13.


тиозонида с концентрацией 1 нг/мл

51





52





53





54




тиозонида с концентрацией 1000 нг/мл.

Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных по

уравнению линейной зависимости, от фактических значений, приведены в

Таблице 3.

55

Таблица 3

Отклонения концентраций калибровочных растворов тиозонида от

фактических значений

C

фактическая,

нг/мл

С

рассчитанная,

нг/мл

ε, % Норма

1 0,86 -14,01 Не более 20%

5 4,50 -10,10

Не более 15%

10 9,04 -9,65

25 23,42 -6,32

50 47,29 -5,41

100 99,93 -0,07

250 238,04 -4,79

500 539,55 5,91

1000 988,47 -1,15

Полученные отклонения соответствуют нормам (не более 20 % для нижнего

диапазона линейности, не более 15 % - для остальных точек). Исходя из

полученных данных, методику можно считать линейной в пределах от 1 нг/мл до

1000 нг/мл.

Правильность и прецизионность

Проводили анализ 4 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного

раствора тиозонида до получения концентраций: 1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл,

1000 нг/мл. Каждый раствор хроматографировали 5 раз. Исследование проводили

в течение 1-го дня (intra - day) и 2-го дня (inter-day). Для полученных значений

концентраций были рассчитаны величины относительного стандартного

отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (ε, %), которые приведены в

Таблицах 4 и 5.

56

Таблица 4

Правильность и прецизионность методики (intra-day)

Введено

(нг/мл)

Площадь

пика

Найдено

(нг/мл)

Найдено

(нг/мл),

среднее

значение

(n=5)

RSD, %

(n=5)

ε, %

1

1179 1,13

1,126

8,1

12,60

1184 1,15

1199 1,20

1132 0,97

1193 1,18

10

3918 10,56

10,496

4,3

4,96

3691 9,78

4049 11,01

3886 10,45

3953 10,68

100

31255 104,66

101,13

3,3

1,13

29486 98,57

30613 102,45

30834 103,21

28960 96,76

1000

288025 988,52

1005,5 2,5 0,555

282947 971,04

295378 1013,83

297908 1022,54

300601 1031,81

57

Таблица 5

Правильность и прецизионность методики (inter-day)

Введено

(нг/мл)

Площадь

пика

Найдено

(нг/мл)

Найдено

(нг/мл),

среднее

значение

(n=5)

RSD, %

(n=5)

ε, %

1

1190 1,17

1,027 16,125 2,700

1152 1,04

1074 0,77

1094 0,84

1088 0,82

10

4415 12,27

10,525 10,223 5,250

3854 10,34

3965 10,72

4142 11,33

3206 8,11

100

29468 98,51

100,326 5,741 0,326

29660 99,17

26244 87,41

32344 108,41

31095 104,11

1000

298478 1024,5

1002,116 2,026 0,212

292813 1005

287703 987,41

288757 991,04

287151 985,51

58

Полученные величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) и

относительной погрешности (ε, %) соответствуют нормам FDA [79] и EMA [80]

(не более 20 % для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных

концентраций).

Также были рассчитаны величины средних значений времени удерживания

для каждого стандартного раствора с рассчитанным значением величины

относительного стандартного отклонения и относительной погрешности, которые

приведены в Таблице 6.

Таблица 6

Введено, (нг/мл) Время удерживания

(мин), среднее

значение (n=5)

RSD, % ε, %

1 1,995

0,272

-0,162

10 2,004

100 1,997

1000 1,991

Предел количественного определения

Предел количественного определения (ПКО) методики определяется по

соотношению сигнал/шум не менее 10. Для того чтобы подтвердить не случайный

характер полученной величины рассчитываются значения RSD и ε, значения

которых не должны превышать более 20 %. Предел количественного определения

методики составил 1 нг/мл. Величина соотношения сигнал/шум составила 10:1.

Хроматограмма, демонстрирующая ПКО методики, приведена на рисунке 14.

59

Рисунок 14. Хроматограмма плазмы, содержащей тиозонид на уровне ПКО

Стабильность

Стабильность была подтверждена для стандартных растворов тиозонида

(при хранении раствора в течение 14 дней при температуре от 2 до 8 оС),

кратковременная стабильность (для приготовленных проб в течение 24 и 48 часов

при анализе на следующий день при температуре 15 оС) на уровнях концентраций

1нг/мл и 1000 нг/мл. Образцы выдерживали 3 цикла заморозки-разморозки.

Площадь пика при повторных анализах не менялась более чем на 10 %.

Для исследования долговременной стабильности образцы плазмы на уровне

концентрации 100 нг/мл были помещены в морозильник при температуре от

минус 75 до минус 80 оС для последующего анализа спустя 1 месяц после

заморозки. Площадь пика при повторных анализах не менялась более чем на 10

%.

Перенос пробы

При последовательном вводе пробы с концентрацией тиозонида 100 нг/мл и

чистой плазмы на хроматограмме чистой плазмы отсутствовали пики,

соответствующие тиозониду. Перенос пробы отсутствовал. Соответствующая

хроматограмма приведена на Рисунке 15.

60

Рисунок 15. Хроматограмма образца чистой плазмы, полученная после анализа

пробы с концентрацией тиозонида 100 нг/мл

Таким образом, разработана и валидирована методика количественного

определения инновационного противотуберкулезного препарата тиозонида в

плазме крови человека методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором.

Полученные данные демонстрируют, что разработанная методика является

селективной, точной, прецизионной и линейной, соответствует по всем

параметрам требованиям руководств FDA [79] и EMA [80] по валидации

биоаналитических методик. Аналитический диапазон методики составил 1 нг/мл

–1000 нг/мл тиозонида в плазме крови. Полученный аналитический диапазон

позволяет применять разработанную методику для количественного определения

тиозонида в плазме крови на стадии клинических и фармакокинетических

исследований данного препарата.

61

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКОГО

ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработанная методика количественного определения инновационного

противотуберкулезного лекарственного средства тиозонида была применена для

изучения фармакокинетики препарата Тиозонид, капсулы, 100 мг (ЗАО «Фарм-

Синтез») при однократном пероральном приеме возрастающих доз различными

группами здоровых добровольцев в рамках клинического исследования I фазы.

Дизайн исследования изложен в ГЛАВЕ 2, разделе 2.3 «Дизайн

фармакокинетического исследования».

4.1 Динамика концентраций тиозонида в плазме крови здоровых

добровольцев

В ходе исследования были получены индивидуальные значения

концентраций тиозонида в плазме крови во времени, а также рассчитаны

индивидуальные и усредненные фармакокинетические профили тиозонида.

Статистический анализ результатов определения концентраций тиозонида в

плазме крови заключался в расчете среднеарифметических (Mean) и

среднегеометрических (GMean) значений, стандартного отклонения (SD),

коэффициента вариации (CV, %), медианы (Median) и их интервальной оценки (L-

90%, U-90%). Данные перечислены и суммированы в таблицах в зависимости от

полученной дозы препарата. Эти таблицы включают число наблюдений, среднее

значение, стандартное отклонение, медиану, минимальное и максимальное

62

значение. Интервальные значения фармакокинетических параметров

рассчитывали по формулам: L-90 = Mean - ΔX; U-90 = Mean + ΔX. Коэффициенты

вариации рассчитывали по формуле: CV = (SD * 100)/Mean.

Индивидуальные фармакокинетические профили тиозонида приведены на

Рисунках 16-23.

Индивидуальные значения концентраций (C, нг/мл) тиозонида в плазме

крови во времени приведены в Таблицах 7-10.

63

Таблица 7

Индивидуальные уровни концентраций тиозонида после приема препарата в дозировке 25 мг Время, ч

№ добр. 0 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 24 36 48 72 96 120 144 168

1 0,0 1,1 14,9 22,0 29,9 54,1 53,1 53,5 41,4 24,0 18,0 18,0 7,5 5,0 3,3 2,5 1,4 1,4 0,0 0,0 0,0

2 0,0 1,1 7,2 13,2 23,8 47,1 52,8 34,1 31,8 24,0 14,9 14,9 9,2 5,9 3,3 3,0 1,2 1,3 0,0 0,0 0,0

3 0,0 2,4 6,4 19,1 48,0 78,8 66,3 69,0 53,9 41,9 35,4 35,4 8,9 9,0 4,3 2,6 2,1 1,7 2,1 1,9 0,0

4 0,0 6,5 35,2 36,8 52,7 58,2 96,0 65,0 68,1 50,5 41,3 41,3 30,1 9,5 6,0 2,5 1,5 3,1 2,6 1,9 0,0

5 0,0 9,2 18,0 42,9 73,0 66,7 75,1 77,3 70,6 60,2 45,9 36,3 24,8 22,1 15,3 12,9 8,4 6,1 8,0 7,8 0,0

6 0,0 0,0 3,0 28,4 48,2 42,6 45,5 71,9 58,3 46,8 35,2 29,1 22,4 8,0 9,7 13,2 6,0 5,6 0,0 0,0 0,0

7 0,0 0,0 16,9 60,1 69,7 69,6 66,0 59,6 64,5 62,0 42,4 43,7 28,2 19,6 11,6 4,9 6,2 9,9 7,1 0,0 0,0

8 0,0 0,0 29,1 56,6 71,4 82,3 80,4 77,0 81,7 63,1 53,9 43,9 30,4 12,6 3,6 3,9 2,5 1,2 0,0 0,0 0,0

9 0,0 1,3 5,4 27,6 39,4 51,8 60,4 58,6 49,0 52,7 44,0 43,9 42,8 31,3 14,2 8,6 4,5 3,0 2,3 0,0 0,0

10 0,0 4,0 20,9 45,6 52,7 49,8 46,1 41,4 38,3 42,4 33,6 29,9 24,7 9,5 9,2 7,8 3,0 4,5 2,5 0,0 0,0

Mean 0,0 2,6 15,7 35,2 50,9 60,1 64,2 60,7 55,8 46,7 36,5 33,6 22,9 13,2 8,0 6,2 3,7 3,8 2,5 1,2 0,0

GMean --- --- 12,2 31,8 48,1 58,8 62,4 58,9 53,6 44,4 34,1 31,7 19,8 11,2 6,8 5,0 3,0 3,0 --- --- ---

SD 0,0 3,0 10,1 15,1 16,1 12,9 15,3 13,8 15,0 13,4 11,5 10,1 10,8 8,0 4,4 4,0 2,4 2,7 2,8 2,3 0,0

CV --- 115,2 64,5 42,8 31,6 21,5 23,9 22,7 26,9 28,8 31,6 30,0 47,1 60,5 54,1 64,5 63,9 70,4 112,3 201,8 ---

Median 0,0 1,3 15,7 35,2 50,9 58,2 64,2 60,7 55,8 46,8 36,5 35,4 24,7 9,5 8,0 4,9 3,0 3,1 2,3 0,0 0,0

L-90 % 0,0 1,0 10,4 27,4 42,5 53,4 56,2 53,6 48,0 39,7 30,5 28,4 17,3 9,1 5,8 4,1 2,5 2,4 1,0 0,0 ---

U - 90 % 0,0 4,1 21,0 43,1 59,3 66,8 72,1 67,9 63,6 53,7 42,4 38,9 28,5 17,4 10,3 8,3 4,9 5,2 3,9 2,4 ---

64

Таблица 8


№ добр. 0 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 24 36 48 72 96 120 144 168

1 0,0 49,9 111,5 168,7 191,5 514,6 601,0 742,8 628,2 547,4 435,7 348,0 272,5 96,9 45,5 23,8 12,7 11,6 9,1 7,9 11,0

2 0,0 57,7 122,9 188,3 216,0 269,6 315,7 340,6 355,1 296,0 244,4 264,8 181,3 85,6 67,1 53,1 36,3 23,9 24,2 18,7 14,6

3 0,0 41,3 90,6 120,7 335,6 286,4 476,3 402,9 443,8 325,9 316,5 229,5 186,5 86,9 64,0 39,7 30,5 24,9 26,4 16,2 7,7

4 0,0 0,0 18,8 77,6 129,3 205,8 315,0 312,5 261,0 263,5 256,3 169,8 124,8 56,6 31,7 14,9 11,2 7,3 2,8 3,0 0,0

5 0,0 6,4 13,2 20,9 45,1 126,7 419,7 599,4 520,9 569,4 566,9 601,7 508,1 284,9 169,8 71,1 45,4 26,8 25,5 22,6 25,0

6 0,0 8,6 60,7 160,8 305,8 232,8 296,1 259,8 215,8 299,0 182,7 161,8 145,1 107,5 63,4 45,0 24,3 17,3 15,4 11,3 10,2

7 0,0 31,5 93,3 150,5 173,3 496,4 582,8 724,5 610,0 529,2 417,5 329,8 254,3 78,7 40,3 35,2 22,6 17,3 15,2 12,7 9,0

8 0,0 53,0 110,3 201,4 256,3 301,8 318,3 359,8 351,0 312,5 285,7 252,8 169,3 73,6 55,1 41,1 24,3 11,9 12,2 7,7 0,0

9 0,0 7,5 15,6 23,3 47,5 129,1 422,1 601,8 523,4 571,8 569,3 604,1 510,6 287,3 172,2 73,5 47,8 29,3 27,9 25,0 27,4

10 0,0 23,8 102,4 159,6 182,4 505,5 591,9 733,7 619,1 538,3 426,6 338,9 263,4 87,8 49,4 44,3 31,7 26,4 24,3 21,8 18,1

Mean 0,0 28,0 73,9 127,2 188,3 306,9 433,9 507,8 452,8 425,3 370,2 330,1 261,6 124,6 75,9 44,2 28,7 19,7 18,3 14,7 12,3

GMean --- --- 56,1 101,2 157,7 273,7 418,3 473,8 427,0 405,6 347,8 300,3 233,9 106,2 64,6 40,3 26,1 18,1 15,5 12,6 ---

SD 0,0 20,6 41,1 61,9 92,2 141,5 117,3 181,9 143,4 127,3 127,3 149,5 132,6 81,8 48,7 17,5 11,6 7,2 8,1 7,0 8,8

CV --- 73,7 55,6 48,7 49,0 46,1 27,0 35,8 31,7 29,9 34,4 45,3 50,7 65,6 64,2 39,5 40,6 36,8 44,4 47,5 71,4

Median 0,0 28,0 90,6 150,5 188,3 286,4 422,1 507,8 452,8 425,3 370,2 329,8 254,3 87,8 63,4 44,2 28,7 19,7 18,3 14,7 11,0

L-90 % 0,0 17,2 52,5 95,0 140,3 233,3 372,9 413,1 378,2 359,1 303,9 252,3 192,6 82,0 50,5 35,1 22,6 15,9 14,1 11,1 7,7

U - 90 % 0,0 38,7 95,3 159,4 236,2 380,5 494,9 602,4 527,4 491,5 436,4 407,9 330,6 167,1 101,2 53,3 34,7 23,4 22,5 18,3 16,9

65

Таблица 9


№ добр. 0 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 24 36 48 72 96 120 144 168

1 0,0 0,0 27,9 71,9 120,0 131,9 191,2 230,8 197,1 184,1 151,8 134,8 115,5 58,2 90,2 54,5 39,6 34,1 19,1 12,2 0,0

2 0,0 0,0 19,0 467,4 840,0 729,4 834,9 1122,6 1036,7 780,5 676,4 592,4 461,3 225,1 146,5 85,0 31,3 23,6 17,8 16,0 0,0

3 0,0 0,0 110,6 520,5 660,9 714,1 760,2 829,0 703,2 704,9 658,9 531,0 358,2 219,0 152,7 80,2 51,3 38,6 31,5 23,5 16,0

4 0,0 0,0 25,4 513,8 578,8 652,2 732,2 863,1 762,4 698,3 607,2 559,1 377,0 214,6 119,2 94,1 54,2 21,4 16,8 0,0 0,0

5 0,0 0,0 47,0 461,1 657,9 680,1 808,6 1051,4 927,2 856,7 660,3 551,7 350,8 188,5 106,7 82,9 33,4 27,4 23,5 12,5 0,0

6 0,0 0,0 19,1 474,7 614,3 699,9 814,4 995,2 810,6 760,4 608,1 467,5 434,2 216,6 139,3 76,9 31,9 28,1 19,5 13,0 0,0

7 0,0 0,0 32,6 408,6 568,7 723,5 792,0 881,1 808,0 740,8 586,5 571,9 433,8 189,2 153,5 65,2 56,4 40,3 17,7 14,6 0,0

8 0,0 0,0 103,6 341,9 716,2 716,2 793,7 947,9 881,1 709,4 637,9 470,6 420,6 289,4 105,6 74,9 54,2 33,2 21,4 16,3 0,0

9 0,0 0,0 47,9 533,8 804,3 818,2 830,0 1081,2 839,4 776,7 613,2 545,3 361,3 214,5 99,1 80,7 48,8 35,4 18,4 17,4 13,2

10 0,0 0,0 32,0 330,0 631,8 671,3 820,8 920,9 791,3 755,1 686,2 576,5 444,9 224,1 126,7 81,2 34,3 22,8 17,4 15,2 0,0

Mean 0,0 0,0 46,5 412,4 619,3 653,7 737,8 892,3 775,7 696,7 588,6 500,1 375,7 203,9 124,0 77,6 43,5 30,5 20,3 14,1 2,9

GMean --- 38,4 370,2 563,4 600,2 691,7 833,2 722,8 653,5 551,3 469,2 355,4 191,5 122,0 76,8 42,4 29,8 19,9 --- ---

SD 0,0 0,0 31,7 131,8 186,9 179,1 184,7 239,0 211,9 176,5 149,0 128,1 94,7 55,2 22,1 10,4 9,8 6,4 4,2 5,6 5,9

CV --- 68,3 32,0 30,2 27,4 25,0 26,8 27,3 25,3 25,3 25,6 25,2 27,1 17,8 13,4 22,6 21,0 20,7 39,9 201,1

Median 0,0 0,0 32,6 461,1 631,8 699,9 793,7 920,9 808,0 740,8 613,2 545,3 377,0 214,6 124,0 80,2 43,5 30,5 19,1 14,6 0,0

L-90 % 0,0 --- 30,0 343,8 522,1 560,5 641,7 768,0 665,5 604,9 511,1 433,5 326,5 175,2 112,5 72,2 38,4 27,2 18,1 11,2 0,0

U - 90 % 0,0 --- 63,0 480,9 716,5 746,8 833,9 1016,6 885,9 788,5 666,1 566,7 425,0 232,6 135,4 83,0 48,7 33,8 22,5 17,0 6,0

66

Таблица 10


№ добр. 0 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 24 36 48 72 96 120 144 168

1 14,5 60,3 151,5 713,1 905,5 978,3 1041,5 1135,7 963,4 965,7 902,6 727,5 490,7 300,0 209,3 109,9 70,2 52,9 43,1 32,2 21,9

2 0,0 87,5 163,7 540,2 1131,5 1131,6 1254,0 1497,6 1392,1 1120,8 1007,9 743,6 664,5 457,3 166,9 118,3 85,7 52,4 33,8 25,8 0,0

3 0,0 16,3 66,3 650,2 927,7 958,9 1140,2 1482,4 1307,3 1208,0 931,0 777,9 494,6 265,8 150,4 116,9 47,1 38,7 33,2 17,7 0,0

4 0,0 29,5 46,0 475,1 909,8 966,6 1182,0 1326,2 1139,5 1087,4 988,1 830,1 640,7 322,8 182,5 116,9 49,4 32,8 25,0 0,0 0,0

5 0,0 0,0 0,0 710,5 1276,8 1108,7 1269,1 1706,3 1575,8 1186,4 1028,1 900,4 701,1 342,2 222,7 129,2 47,6 35,9 27,0 24,2 11,9

6 21,9 67,3 190,4 709,9 1069,8 1088,2 1103,9 1438,0 1116,3 1033,0 815,5 725,3 480,5 285,3 131,9 107,4 65,0 47,1 24,4 23,2 17,6

7 0,0 0,0 65,0 167,4 279,5 307,3 445,5 537,8 459,2 428,8 353,6 314,0 269,1 135,6 210,2 126,9 92,2 79,4 44,5 0,0 0,0

8 11,7 66,0 265,8 778,4 1007,5 1147,8 1335,6 1932,1 1329,4 1247,0 997,3 766,7 712,0 355,2 228,5 126,1 52,4 46,1 32,0 21,4 0,0

9 0,0 0,0 38,4 775,9 874,0 984,8 1105,6 1303,3 1251,2 1054,4 916,9 844,2 569,2 324,0 180,0 142,1 81,8 32,3 25,4 0,0 0,0

10 0,0 0,0 45,6 572,0 796,2 1012,9 1108,7 1233,5 1131,1 1037,1 1001,0 800,7 607,3 264,9 214,9 91,3 78,9 56,4 24,8 20,5 0,0

Mean 4,8 32,7 103,3 609,3 917,8 968,5 1098,6 1359,3 1166,5 1036,9 894,2 743,0 563,0 305,3 189,7 118,5 67,0 47,4 31,3 16,5 5,1

GMean --- --- --- 567,6 863,9 920,3 1060,5 1299,2 1117,5 1001,9 862,2 719,4 544,9 293,6 187,0 117,7 65,0 45,7 30,6 --- ---

SD 8,1 32,6 80,2 175,7 251,0 230,7 234,1 351,3 286,0 219,2 190,3 152,4 127,6 77,5 31,0 13,2 16,3 13,5 7,1 11,4 8,2

CV 169,1 99,7 77,6 28,8 27,3 23,8 21,3 25,8 24,5 21,1 21,3 20,5 22,7 25,4 16,3 11,1 24,3 28,4 22,8 69,0 158,8

Median 0,0 29,5 66,3 650,2 917,8 984,8 1108,7 1359,3 1166,5 1054,4 931,0 766,7 569,2 305,3 189,7 118,3 67,0 47,1 31,3 20,5 0,0

L-90 % 0,0 15,7 61,6 517,9 787,3 848,5 976,8 1176,6 1017,8 922,9 795,2 663,7 496,6 265,0 173,6 111,6 58,6 40,4 27,6 10,6 0,9

U - 90 % 0,0 49,7 145,0 700,6 1048,4 1088,5 1220,4 1542,0 1315,3 1150,9 993,2 822,3 629,3 345,6 205,8 125,4 75,5 54,4 35,0 22,4 9,4

*0,0 – менее предела количественного определения; «---» - параметр не может быть рассчитан

67

Рисунок 16. Индивидуальные фармакокинетические профили препарата

Тиозонид после однократного перорального приема 25 мг


Тиозонид после однократного перорального приема 25 мг (полулогарифмическая

шкала)

68





(полулогарифмическая шкала)

69






70






Усредненные фармакокинетические профили тиозонида приведены на

Рисунках 24-33.

71

Рисунок 24. Усредненные фармакокинетические профили тиозонида после

однократного перорального приема 25 мг



72





73


однократного перорального приема 25 мг (полулогарифмическая шкала)



74





75

Рисунок 32. Усредненные фармакокинетические профили тиозонида (после

однократного перорального приема 25 мг, 200 мг, 400 мг, 600 мг)

Рисунок 33. Усредненные фармакокинетические профили тиозонида (после

однократного перорального приема 25 мг, 200 мг, 400 мг, 600 мг),


76

Фармакокинетика в диапазоне доз 25 мг – 600 мг является линейной по

Сmax (R2 > 0,99), график линейности приведен на рисунке 34.

Рисунок 34. Линейность фармакокинетики тиозонида по параметру Cmax.

Для подтверждения линейности проводили F-тест для линейной

регрессии. Значимость критерия Фишера не превышала 0,05, а значит, данные

параметры линейно зависят от дозы с 95 % вероятностью. Расчетные данные

приведены в таблицах 11-13.

Таблица 11

Описание модели

Модель R R2 Скорректированный R

2

Стандартная ошибка

оценки

1 0,998 0,997 0,995 39,60810

R2 – коэффициент корреляции, описывает степень точности описания моделью

процесса

77

Таблица 12

Дисперсионный анализ по параметру Cmax

ANOVAa

Модель 1

Сумма

квадратов

Степень

свободы

Средний

квадрат

Критерий

Фишера, F Значимость

Регрессия 897305,787 1

897305,7

87

571,969 0,002b

Остаток 3137,603 2 1568,802

Всего 900443,390 3

a. Зависимая переменная: Cmax

b. Предикторы: (константа), dose

Таблица 13

Значения коэффициентов модели по параметру Cmax

Модель

Нестандартизованные

коэффициенты

Стандартизованные


т Значимость B

Стандартная

ошибка β

1 dose 37,136 34,431 0,998

1,079 0,394

Cmax 2,200 0,092 23,916 0,002

a. Зависимая переменная: Cmax

Как видно из представленных данных Сmax тиозонида составила 70 ± 8

нг/мл; 522 ± 94 нг/мл; 892 ± 131 нг/мл; 1359 ± 193 нг/мл для дозировок 25 мг, 200

мг, 400 мг и 600 мг, соответственно. Фармакокинетика в диапазоне доз 25 мг –

600 мг является линейной по Сmax (R2 > 0,99, значимость критерия Фишера имеет

величину 0,002 << 0,05). По представленным данным видно, что разброс значений

для основных фармакокинетических параметров является умеренным

(коэффициент вариации не превышает 38 %). Значения концентраций тиозонида в

каждой временной точке для высших дозировок (400-600 мг) колебались не

значительно (значение CV не превышало 30%). Для дозировок 25-200 мг разброс

78

значений концентраций тиозонида был умеренным (CV в диапазоне 20-50 %), за

исключением крайних точек, где значение коэффициента вариации колебалось в

значительных пределах (значение CV доходило до 201 % (временная точка 168 ч,

для дозировки 25 мг).

4.2 Описательная статистика и расчет фармакокинетических

параметров

Исследование фармакокинетики тиозонида проводилось путем определения

концентраций активного вещества тиозонида в плазме крови каждого

добровольца, получавшего исследуемый препарат. Данные перечислены и

суммированы в таблицах в зависимости от полученной дозы препарата. Эти

таблицы включают число наблюдений, среднее значение, стандартное

отклонение, медиану, минимальное и максимальное значение.

Для каждого добровольца были рассчитаны основные фармакокинетические

параметры.

Статистический анализ результатов определения параметров

фармакокинетики заключался в расчете среднеарифметических (Mean) и

среднегеометрических (GMean) значений, стандартного отклонения (SD),

коэффициента вариации (CV, %), медианы (Median) и их интервальной оценки

(Доверит, L-90%, U-90%).

Интервальные значения фармакокинетических параметров рассчитывали по

формулам: L-90 = Mean - ΔX; U-90 = Mean + ΔX. Коэффициенты вариации

рассчитывали по формуле: CV = (SD * 100)/Mean.

Для расчета основных фармакокинетических параметров в используемом

программном обеспечении были применены следующие расчетные формулы:

79

, где

AUC0-t - площадь под кривой «концентрация – время» в пределах от нуля до

момента отбора последней пробы крови (168 ч)

Ci – значение концентрации тиозонида в момент времени t

t – время отбора пробы

n – общее количество временных точек отбора проб

i – порядковый номер временной точки отбора проб.

AUC0- = AUC0-t + Ct/kel, где

Ct - концентрация в последней временной точке отбора проб

T1/2 = ln2/kel

Константу элиминации рассчитывали в соответствии с кинетическим

уравнением 1-го порядка:

dC/dt = - kel С,

nC0/Ct = kel , где

C0 - исходная концентрация вещества;

Ct - концентрация вещества в момент времени t;

t - время после введения вещества;

kel - константа скорости процесса элиминации;

Для расчета константы элиминации принимали во внимание весь

нисходящий участок фармакокинетической кривой с ненулевыми значениями

концентраций.

Значения индивидуальных фармакокинетических параметров Тиозонида

после приема препарата приведены в Таблицах 13-16.

80

Таблица 13

Индивидуальные фармакокинетические параметры тиозонида после

приема препарата в дозировке 25 мг

№ добр.

Cmax,

нг/мл

Tmax,

ч

AUC(0-

168),

нг*ч/мл kel, ч-1

AUC(0-

∞),

нг*ч/мл

Т 1/2,

ч

Сmax/AU

C,

ч-1

AUC(0-168)/AUC(0-

∞)

1 53,5 4 599 0,038 599 18 0,090 1

2 52,8 5 557 0,037 557 19 0,095 1

3 78,8 4 929 0,031 929 22 0,085 1

4 96,0 5 1221 0,032 1221 22 0,079 1

5 77,3 6 2167 0,020 2167 34 0,036 1

6 71,9 6 1310 0,025 1310 27 0,055 1

7 69,7 3 1789 0,020 1789 35 0,039 1

8 82,3 4 1221 0,048 1221 14 0,067 1

9 60,4 5 1687 0,030 1687 23 0,036 1

10 52,7 3 1189 0,025 1189 28 0,044 1

Min значение

парамтра

52,7 3 557 0,020 557 14 0,036 1

Max значение

параметра

96,0 6 2167 0,048 2167 34 0,095 1

Mean 69,5 5 1267 0,031 1267 24 0,063 1

GMean 68,17 4 1168 0,030 1168 23 0,058 1

SD 14,6 1 509 0,009 509 7 0,023 0

CV, % 21 24 40 28 40 27 38 0

Median 70,8 4,50 1221 0,031 1221 23 0,061 1

L-90 % 61,5 4,6 1002 0,026 1002 20,5 0,050 1

U - 90 % 77,5 5,6 1532 0,035 1532 27,5 0,075 1

81

Таблица 14



№ добр.

Cmax,

нг/м

л

Tmax,

ч

AUC(0-

168),

нг*ч/мл

kel, ч-

1

AUC(0-

∞),

нг*ч/мл

Т 1/2,

ч

Сmax/AU

C,

ч-1

AUC(0-168)/AUC(0-

∞)

1 742,8 6 9626 0,034 9946 20 0,077 0,97

2 355,1 7 9451 0,022 9958 32 0,038 0,95

3 476,3 5 9415 0,023 10051 30 0,051 0,94

4 315,0 5 4876 0,035 5093 20 0,065 0,96

5 601,7 10 17265 0,027 17265 25 0,035 1

6 305,8 3 7882 0,023 8947 30 0,039 0,88

7 724,5 6 9840 0,029 10187 24 0,074 0,97

8 359,8 6 7691 0,028 8006 24 0,047 0,96

9 604,1 10 17672 0,027 17672 26 0,034 1

10 733,7 6 11360 0,025 12448 27 0,065 0,91


парамтра

305,8 3 4876 0,022 5093 20 0,034 0,88


параметра

742,8 10 11360 0,035 17672 30 0,077 1

Mean 521,9 6 10508 0,027 10957 26 0,052 0,95

GMean 492,6 6 9854 0,027 10346 26 0,050 0,95

SD 180,6 2 4052 0,005 3911 4 0,016 0,04

CV, % 35 34 39 17 36 16 31,5 4

Median 539 6 9538 0,027 10004 26 0,049 0,96

L-90 % 427,9 5 8400 0,025 8923 24 0,044 0,93

U - 90 % 615,9 7 12615 0,030 12992 28 0,061 0,97

82

Таблица 15



№ добр.

Cmax,

нг/мл

Tmax,

ч

AUC(0-

168),

нг*ч/м

л kel, ч-1

AUC(0-

∞),

нг*ч/мл

Т 1/2,

ч

Сmax/AUC

,

ч-1

AUC(0-168)/AUC(0-

∞)

1 230,8 6 7591 0,019 7591 37 0,030 1,00

2 1122,6 6 18738 0,032 18738 21 0,060 1,00

3 829,0 6 18512 0,026 18512 26 0,045 1,00

4 863,1 6 16820 0,035 17274 20 0,051 0,97

5 1051,4 6 16782 0,031 16782 22 0,063 1,00

6 995,2 6 17408 0,031 17408 22 0,057 1,00

7 881,1 6 17812 0,030 17812 23 0,049 1,00

8 947,9 6 18563 0,030 18563 23 0,051 1,00

9 1081,2 6 17937 0,030 17937 23 0,060 1,00

10 920,9 6 17433 0,032 17850 22 0,053 0,98


парамтра

230,8 6 7591 0,019 7591 20 0,030 0,97


параметра

1122,6 6 18738 0,035 18738 37 0,063 1

Mean 892,3 6 16760 0,030 16847 24 0,052 1,00

GMean 833 6 16317 0,029 16399 23,5 0,051 0,99

SD 251,9 0 3294 0,004 3310 5 0,009 0,01

CV, % 28 0 20 15 20 20 18 1

Median 934,4 6 17623 0,031 17831 22,5 0,052 1,00

L-90 % 761,3 6 15046 0,027 15125 21,5 0,047 0,99

U - 90 % 1023,3 6 18473 0,032 18568 26,5 0,057 1,00

83

Таблица 16



№ добр.

Cmax,

нг/мл

Tmax,

ч

AUC(0-

168),

нг*ч/м

л kel, ч-1

AUC(0-

∞),

нг*ч/мл

Т 1/2,

ч

Сmax/AUC

,

ч-1

AUC(0-168)/AUC(0-

∞)

1 1135,7 6 25395 0,026 26223 26 0,045 0,97

2 1497,6 6 29373 0,030 30111 23 0,051 0,98

3 1482,4 6 23670 0,031 23670 22 0,063 1

4 1326,2 6 24593 0,037 24593 19 0,054 1

5 1706,3 6 28603 0,032 28603 21 0,060 1

6 1438,0 6 23990 0,030 24391 23 0,060 0,98

7 537,8 6 17006 0,019 17928 36 0,032 0,95

8 1932,1 6 29061 0,032 29061 22 0,066 1

9 1303,3 6 25499 0,035 25499 20 0,051 1

10 1233,5 6 25117 0,030 25117 23 0,049 1


парамтра

537,8 6 17006 0,019 17928 19 0,032 0,95


параметра

1932,1 6 29373 0,037 30111 36 0,066 1

Mean 1359,3 6 25231 0,030 25520 24 0,053 0,99

GMean 1299,2 6 24972 0,030 25290 23 0,052 0,99

SD 370,3 0 3580 0,005 3447 5 0,010 0,02

CV 27 0 14 16 14 21 19 1,84

Median 1382,1 6 25256 0,031 25308 22,5 0,053 1

L-90 % 1167,3 6 23369 0,028 23726 21,5 0,048 0,98

U - 90 % 1552,3 6 27093 0,033 27313 26,5 0,058 1

84

Как видно из представленных данных тиозонид постепенно всасывался в

системный кровоток при пероральном приеме (Tmax около 6 ч) и медленно

выводился из плазмы крови. Период полувыведения Тиозонида составил около 25

ч. Тиозонид практически не обнаруживался в плазме крови спустя 168 ч после

однократного применения для дозировки 25 мг, либо обнаруживался на низких

уровнях для дозировкок 200, 400, 600 мг.

Сmax тиозонида составила 70 ± 8 нг/мл; 522 ± 94 нг/мл; 892 ± 131 нг/мл; 1359

± 193 нг/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг, соответственно.

AUC0-168 тиозонида составила 1267 ± 265 нг*ч/мл; 10508 ± 2108 нг*ч/мл;

16760 ± 1713 нг*ч/мл; 25231 ± 1862 нг*ч/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и

600 мг, соответственно.


AUC0-168 (R2 > 0,99), график линейности приведен на Рисунке 35.

Рисунок 35. Линейность фармакокинетики тиозонида по параметру AUC.

Для подтверждения линейности проводили F-тест для линейной

регрессии. Значимость критерия Фишера не превышала 0,05, а значит, данные

параметры линейно зависят от дозы с 95 % вероятностью. Расчетные данные

приведены в таблицах 17-19.

85

Таблица 17

Описание модели

Модель R R2 Скорректированный R

2

Стандартная ошибка

оценки

1 0,996 0,991 0,987 1168,48051

R2 – коэффициент корреляции, описывает степень точности описания моделью

процесса

Таблица 18

Дисперсионный анализ по параметру AUC0-168

ANOVAa

Модель 1

Сумма

квадратов

Степень

свободы

Средний

квадрат

Критерий

Фишера, F Значимость

Регрессия 304097931,6 1

304097931,

6

222,726 0,004b

Остаток 2730693,4 2 1365346,7

Всего 306828625,0 3

a. Зависимая переменная: AUC0-168

b. Предикторы: (константа), dose

Таблица 19

Значения коэффициентов модели по параметру AUC0-168

Модель

Нестандартизованные


Стандартизованные


т Значимость B

Стандартная

ошибка β

1 dose 1040,764 1015,763 0,996

1,025 0,413

AUC0-168 40,492 2,713 14,924 0,004

a. Зависимая переменная: AUC0-168

86


AUC0-168 (R2 > 0,99, значимость критерия Фишера имеет величину 0,004 << 0,05).

Сопоставление значений AUC0-168 с общим AUC0-∞ (их отношение составляло

значительно больше 80%) свидетельствовало о том, что выбранный регламент

фармакокинетического исследования обеспечивает необходимую надежность

оценки фармакокинетических параметров тиозонида.

Таким образом, в результате фармакокинетического исследования

оригинального противотуберкулезного препарата Тиозонид, капсулы 100 мг были

определены основные фармакокинетические параметры. По результатам

исследования Сmax тиозонида составила 70 ± 8 нг/мл для дозировки 25 мг, 522 ± 94

нг/мл для дозировки 200 мг, 892 ± 131 нг/мл для дозировки 400 мг и 1359 ± 193

нг/мл для дозировки 600 мг, соответственно. Была доказана линейность

фармакокинетики препарата по AUC0-168 (R2 > 0,99, значимость критерия Фишера

имеет величину 0,002 << 0,05) и по Cmax (R2 > 0,99, значимость критерия Фишера

имеет величину 0,002 << 0,05) в интервале доз 25-600 мг. Скорость процесса

элиминации препарата характеризовалась константой элиминации (kel), для

расчета которой принимали во внимание весь нисходящий участок

фармакокинетической кривой с ненулевыми значениями концентраций.

Выбранный регламент фармакокинетического исследования обеспечивает

необходимую надежность оценки фармакокинетических параметров тиозонида.

Период полувыведения составил 25 часов, что показывает медленное выведение

препарата из плазмы крови.

87

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Туберкулез остается одной из основных проблем здравоохранения, является

социально-значимым заболеванием, не смотря на наличие эффективных методов

противотуберкулезной терапии [81]. Мероприятия по борьбе с туберкулезом в

Российской Федерации на протяжении многих лет осуществляются на основе

научно обоснованных методик с использованием достижений российского и

зарубежного опыта, имеют государственную поддержку на всех уровнях власти,

включая Правительство Российской Федерации, руководства субъектов

Российской Федерации и муниципальных образований [82, 83].

Ключевыми барьерами на пути к улучшению исходов заболевания

являются: главным образом множественная лекарственная устойчивость, сложные

схемы лечения, которые включают дорогостоящие, токсичные препараты и

выраженные токсические побочные эффекты при введении антиретровирусной

терапии [84, 85]. Наличие других сопутствующих туберкулезу заболеваний, а

именно: ВИЧ, сахарный диабет, заболевания желудочно-кишечного тракта и

печени также оказывают существенное влияние на эффективность лечения [86,

87]. Чаще всего имеет место сочетание нескольких неблагоприятных факторов:

сопутствующие заболевания и побочные реакции на химиопрепараты.

Прекращение терапии и несоблюдение схемы лечения способствуют

появлению штаммов с множественной и широкой лекарственной устойчивостью.

Устойчивость к наиболее эффективным ПТП приводит к тому, что почти в 30%

случаев лечение заканчивается неудачей. Варианты лечения ШЛУ-туберкулеза

крайне ограничены, что ведет к высокому уровню смертности.

Примерно 1/3 мирового населения является бессимптомными носителями

туберкулеза с пожизненным риском развития активной формы заболевания при

любом ослаблении организма, что связано со способностью МБТ к анабиозу [88].

В настоящее время созданы модификации существующих ПТП с

улучшенными фармакокинетическими свойствами, обладающие меньшей

88

токсичностью и более высокой активностью. Так, например, в статье группы

авторов [89] доказано, что производное рифампицина – рифабутин, в 4–8 раз

обладает большей активностью против МБТ, чем рифампицин, имеет более

длительный период полувыведения, способно лучше проникать в ткани. Группа

фторхинолонов относится к ПТП резервного ряда. Эта группа препаратов имеет

хорошую фармакокинетику, а также хорошую способность проникать в ткани и в

макрофаги. Существует ряд статей, где была показана более высокая

эффективность против МБТ у инновационных ЛС группы фторхинолона

(гатифлоксацин, моксифлоксацин, левофлоксацин), что позволяет часто

применять их вместо традиционно используемого офлоксацина [90, 91]. Однако

подход к синтезу ПТП, ориентированный на совершенствование существующих

ПТП и других классов антибактериальных соединений с хорошей

антибактериальной активностью не решает проблему возникновения

перекрестной резистентности, возникающей вследствие воздействия на одни и те

же мишени.

На основе всего вышесказанного, с учетом особенностей возбудителя и

приведенных данных статистики, демонстрирующих увеличение случаев

туберкулеза, вызванного устойчивыми штаммами МБТ, становится очевидной

актуальность разработки новых ПТП.

В ходе диссертационного исследования была изучена фармакокинетика

инновационного противотуберкулезного препарата Тиозонид.

Тиозонид - {1R,2S + 1S,2R}-1-(6-Бром-2-хлорхинолил-3-ил)-4-

(диметиламино)-2-(нафталин-1-ил)-1-фенилбутан-2-ол - представляет собой

инновационное лекарственное средство. Нами была разработана и валидирована

методика количественного определения тиозонида в плазме крови человека.

В качестве метода определения тиозонида в плазме крови добровольцев с

учетом особенностей структуры соединения, а также оптимизации процесса

анализа был выбран метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором (SIM

режим по иону с m/z = 561,1(тиозонид)). В качестве способа ионизации был

89

выбран электрораспылительный (ESI) метод ионизации, который считается

«мягким» методом ионизации [76, 78, 92].

Для решения аналитических задач, стоящих при исследовании

фарамкокинетиких свойств лекарственных средств, требуется использование

методов быстрого и надежного анализа на молекулярном уровне, как

индивидуальных веществ, так и сложных многокомпонентных смесей. В научной

литературе обсуждаются различные подходы и методы определения

концентраций лекарственных средств в биологических объектах. Исходя из

литературных данных в настоящее время в России, как и во всем мире, для

анализа лекарственных соединений все большее распространение получает метод

ВЭЖХ-МС, благодаря надежности и универсальности этого метода [76, 93-97].

Метод ВЭЖХ-МС применим для анализа любых классов веществ (при

необходимости с дериватизацией), позволяя осуществлять идентификацию и

количественное определение органических соединений в широком интервале

концентраций. Он обладает высокой чувствительностью и незаменим при

скрининговом и многокомпонентном анализе, а также следовом органическом

анализе, где требуется подтверждение структуры определяемых веществ или

определение структуры неизвестных соединений.

Так, например, для количественного анализа азитромицина в [98] метод

ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием оказался наиболее

целесообразным и предпочтительным на фоне имеющихся в литературе данных

исследований азитромицина альтернативными методами. В [98] указано, что

ранее анализ азитромицина проводили методом ВЭЖХ с электрохимическим

детектором, при этом чувствительность обнаружения препарата в плазме крови

составила 10 нг/мл. Также приведены научные статьи, где описаны условия

определения азитромицина методом ВЭЖХ с флюоресцентным детектором,

чувствительность в этом случае составила 98,8 нг/мл. Вместе с тем в [98]

приведены результаты анализа азитромицина методом ВЭЖХ с масс-

спекрометрическим детектированием c ионизацией при атмосферном давлении в

электроспрее (API-ES). Предел обнаружения препарата составил 0,5 нг/мл.

90

Подготовку проб проводили методом твердофазной экстракции.

Хроматографическое разделение осуществляли на колонке Eсlipse SB-C18, 5 мкм,

4,6 х 150 мм (США) при температуре 70°С. Элюирование проводили в

изократическом режиме. Состав подвижной фазы: ацетонитрил - 0,1 M ацетат

аммония – 0,002 M ацетат натрия (60:20:20). В масс-спектре азитромицина,

полученном при ионизации вещества в электроспрее, на приборе наблюдался

интенсивный пик с m/z 749,1 соответствующий протонированному

молекулярному иону [М+H]

+ и с m/z 771,5 - иону аддукта [М

+Nа]

+. Метод был

применен для изучения фармакокинетики и биоэквивалентности препарата

Азитромицин (капсулы по 250 мг отечественного производства) в сравнении с

препаратом Сумамед® (аналогичная лекарственная форма производства компании

«Плива», Хорватия). Были рассчитаны фармакокинетические параметры,

необходимые для оценки биоэквивалентности изучаемого препарата.

Максимальная концентрация препарата составляла для Азитромицина –

0,214+0,089 мкг/мл и для Сумамеда - 0,220 + 0,105 мкг/мл, время достижения

максимальной концентрации для обоих препаратов было одинаковым - 2,5 часа,

значения всех рассчитанных параметров фармакокинетики статистически

достоверно не отличаются. Так, площадь под фармакокинетической кривой (от

нуля до последней точки забора крови) для препарата Азитромицин составляла –

1,84+0,4 мкг ч/мл, а для препарата Сумамед – 1,94+0,49 мкг ч/мл. Остальные

параметры фармакокинетики также были близкими. Статистический анализ

параметров фармакокинетики показал биоэквивалентность препаратов

Азитромицин и Сумамед® [98].

Примером применения ВЭЖХ-МС в исследованиях биоэквивалентности

также может служить работа коллектива авторов [99], где в рамках перекрёстного,

открытого, рандомизированного исследования с недельным периодом отмывки, с

двумя последовательностями была изучена биоэквивалентность двух

таблетированных форм ондансетрона на 18 добровольцах (дозировка 8 мг).

Образцы плазмы крови анализировали валидированным методом ВЭЖХ-МС, с

внутренним стандартом — трописетроном.

91

Для анализа использовалась колонка XDB-С18 5 мкм 4,6×150 мм; в качестве

подвижной фазы использовали - раствор 0,05% муравьиной кислоты и

ацетонитрил (25:75); ионизация электрораспылением, регистрация

положительных ионов, целевой ион ондансетрона с m/z =294,15±0,1 и

трописетрона с m/z =285,15±0,1. Предел количественного определения составил 1

нг/мл. Для анализируемых препаратов были рассчитаны основные

фармакокинетические параметры: значения площади под кривыми

«концентрация-время» (AUC0-t); максимальная концентрация в плазме и время её

достижения, общая площадь под кривой AUC0-∞, период полувыведения,

соотношение AUC0-t и AUC0-∞, показатель скорости всасывания, константа

элиминации. По результатам исследования сделан вывод о биоэквивалентности

сравниваемых препаратов ондансетрона.

Широкие возможности метода ВЭЖХ-МС также позволяют определять

сразу несколько соединений в биоматериале. В качестве примера в статье

коллектива авторов [100] проведено определение одновременно четырех

препаратов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-

спектрометрическим детектированием, ионизация электрораспылением (ВЭЖХ–

МС/ESI). Анализировали четыре наиболее часто назначаемых лекарственных

средства при лечении депрессии: флуоксетин, циталопрам, пароксетин и

венлафаксин в плазме крови человека. Пробоподготовку проводили методом

твердофазной экстракции с последующим подщелачиванием. Пределы

обнаружения для флуоксетина, циталопрама, пароксетина и венлафаксина

составили 0,5, 0,3, 0,3 и 0,1 нг / мл, соответственно. Исследуемые вещества были

идентифицированы в виде аддуктов Н+ - флуоксетин, m/z = +, 310.1; циталопрам,

m/z = +, 325.1; пароксетин, m/z = +, 330.1; венлафаксин, , m/z = +, 278.1. Ранее

проводились исследования некоторых из этих препаратов методами ВЭЖХ с УФ

детектированием [101], ГЖХ [102]. Тем не менее, не один из этих методов не

обеспечивал быстрой одновременной количественной оценки и идентификации

данных препаратов.

92

Безусловно, метод ВЭЖХ с УФ детектированием также является одним из

наиболее распространенных и широко используемых при анализе ЛС, что

объясняется достаточно высокой чувствительностью, простотой, доступностью с

экономической точки зрения [103]. Однако, УФ-детектор является менее

чувствительным, чем масс-спектрометрический, что ограничивает его

использование при определении минорных концентраций лекарственных средств

в сложной многокомпонентной матрице.

Так, например, в литературе имеются данные фармакокинетичсеких

исследований инновационного противотуберкулезного препарата перхлозон

методами ВЭЖХ с УФ детектором и ВЭЖХ с масс-спектрометрическим

детектором [104]. Полученные результаты исследований свидетельствовали о

том, что последний является наиболее чувствительным.

В обоих исследованиях подготовку проб проводили методом осаждения

белков. В качестве неподвижной фазы использовалась хроматографическая

колонка Agilent «Z ORBAX SB C18 5мкм, 150*2,1мм» c предколонкой «ZORBAX

SB C18 5мкм, 35*2,1мм». В качестве подвижной фазы использовали смесь

ацетонитрила и 0,1% раствора трифторуксусной кислоты (рН=2,6) в соотношении

85:15. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Для детектирования использовали

спектрофотометрический (длина волны - 317 нм) и масс-спектрометрический

детекторы. В случае последнего ионизацию проводили с помощью электроспрея

при атмосферном давлении, детектирование проводили в SIM режиме по

молекулярному иону 183,4 m/z. Время удерживания перхлозона в указанных

условиях — 3,05 мин.

Аналитический диапазон методики для УФ-детектирования составил 250-

10000 нг/мл, в то время как для масс-спектрометрического детектирования -10-

10000 нг/мл. Таким образом, определение перхлозона с использованием

спектрофотометрического детектирования являлось возможным, в виду высоких

концентраций препарата в крови, однако, данная методика не позволяла

проводить определение концентрации перхлозона в плазме крови пациентов на

фоне сопутствующей противотуберкулезной терапии.

93

На основании полученных данных была разработана и валидирована новая

методика определения перхлозона в плазме крови человека, которая нашла

практическое применение как для фармакокинетических исследований, так и для

терапевтического мониторинга на фоне сопутствующей терапии.

Пробоподготовку проводили осаждением белков плазмы с помощью

трифторуксусной кислоты. Были подобраны следующие условия

хроматографирования: неподвижная фаза – Колонка ZORBAX Eclipse Plus C18

150 x 4,6 мм 5 мкм, предколонка ZORBAX Eclipse Plus C18 12,5 x 4,6 мм 5 мкм,

температура колонки 25 оС; подвижная фаза - 50 мМ фосфатный буфер с 5 мМ

октансульфонатом натрия рН 2,50 – ацетонитрил (85:15); скорость потока - 1

мл/мин; объем вводимой пробы - 50 мкл; детектирование - длина волны 347±4 нм

с записью спектра в диапазоне 220-400 нм; время удерживания 5 – 6 мин. Предел

количественного определения методики составил 200-20000 нг/мл [104].

Методика показала достаточную чувствительность, правильность и

воспроизводимость, однако достичь такой же высокой чувствительности как при

анализе методом ВЭЖХ-МС так и не удалось, что ограничивает совместное

определение перхлозона совокупно с другими препаратами, когда в связи с

большим количеством мешающих соединений возможно падение уровня

концентраций перхлозона в плазме крови ниже терапевтического. Этот факт

приобретает особую важность с учетом того, что немалый % составляет доля

больных туберкулезом, ассоциированным со спектром сопутствующих

заболеваний.

Еще один пример сравнения ультрафиолетовой (УФ) и масс-детекции

представлен в [105]. Проводили анализ содержания в плазме крови крыс

потенциального лекарственного вещества с помощью УФ и масс-детектирования.

Существенно, что невысокая чувствительность определения концентрации

вещества при УФ детектировании, приводит к недопустимому искажению

значений таких важных для высокопроизводительного фармакокинетического

скрининга параметров, как период полувыведения (T1/2) и площадь под

фармакокинетической кривой (AUC), таким образом, при УФ детектировании -

94

T1/2=1,63 ч, AUC=648 нг/мл*ч, предел количественного определения методики

составил 100 нг/мл; при МС детектировании - T1/2 =4,53 ч, AUC=1091 нг/мл*ч,

предел количественного определения методики составил 10 нг/мл.

Таким образом, несмотря на то, что основным недостатком метода ВЭЖХ-

МС является достаточно высокая стоимость оборудования, хромато-масс-

спектрометрия является мощным аналитическим инструментом в исследованиях

лекарственных средств. Такое преобладание существенных достоинств, как

высокая производительность и чувствительность, универсальность,

экспрессность, толерантность к присутствию примесей, а также возможность

быстрого перехода от одной методики к другой без сложных предварительных

действий, что особенно важно, если речь идет об инновационной молекуле,

позволяет компенсировать этот недостаток.

Применение того или иного метода анализа при оценке

фармакокинетических свойств лекарственных средств в каждом конкретном

случае определяется структурой исследуемого соединения и оснащенностью

лаборатории. Таким образом, нами был выбран метод ВЭЖХ-МС с

электрораспылительным вариантом ионизации, который позволил по

возможности упростить и ускорить процедуру анализа.

Выбранный аналитический метод должен позволять отделять

анализируемое вещество от других компонентов образца. Однако при наличии

даже самой современной аналитической аппаратуры невозможно достичь

достаточно достоверного отделения аналита без грамотного выбора процедуры

пробоподготовки в связи с многокомпонентностью биологических матриц.

Основными сопутствующими веществами, мешающими проведению анализа

методом ВЭЖХ с любым видом детектирования, являются белки (также

присутствуют липиды, биогенные амины, клеточные структуры, некачественно

отделенные форменные элементы и пр.) [49, 105]. Как упоминалось в Главе 3, при

проведении исследований методом ВЭЖХ выделяют три основных способа

подготовки проб к анализу: осаждение белков, ЖЖЭ и сорбционное

концентрирование (ТФЭ).

95

Метод осаждения белков является наиболее простым, быстрым, недорогим

в исполнении, однако не всегда способен обеспечить достаточную степень

очистки аналита. Основная задача при использовании данного метода - подобрать

осаждающий реактив, необходимый для обеспечения достаточной эффективности

осаждения белков из плазмы. Недостаточная эффективность осаждения – является

основным фактором, ограничивающим использование процедуры осаждения

белков при разработке методик определения лекарственных средств, что связано с

соосаждением аналита с белками плазмы крови и сложностью биологической

матрицы. Эффекты влияния остаточных компонентов после осаждения белков

(матричные эффекты) выявлены в ряде масс-спектрометрических исследований.

Главным образом наблюдается подавление сигнала аналита, приводящее к

недостаточной чувствительности и несоответствию значений таких

валидационных параметров, как повторяемость и правильность [106].

Процедура ЖЖЭ гораздо более селективна в сравнении с осаждением

белков и позволяет достигать высоких степеней извлечения [67, 107], однако

процесс проведения является достаточно трудоемким и времязатратным,

включает довольно большое количество манипуляций с образцом, что

ограничивает использование данного метода.

Метод ТФЭ основан на специфических взаимодействиях выделяемого

соединения (или мешающих компонентов матрицы) с сорбентом. ТФЭ позволяет

получать высокоочищенные пробы, содержащие малое количество посторонних

веществ. Для ТФЭ характерны более широкие возможности типов

взаимодействий образца с сорбентом и элюентом, чем для жидкостной

экстракции, что обеспечивает наиболее селективное и количественное

концентрирование и/или извлечения аналитов (ионообменные механизмы,

сродство к органической фазе). По трудоемкости ТФЭ сопоставима с ЖЖЭ, а

часто сопровождается большим количеством этапов пробоподготовки, чем ЖЖЭ.

Для анализа тиозонида применим любой из перечисленных методов. С

учетом всех факторов, таких как надежность и точность, простота эксплуатации,

время, необходимое для выполнения процедуры в качестве метода

96

пробоподготовки был выбран метод осаждения белков, как весьма быстрый и

простой. Данный способ обеспечивал достаточную чистоту исследуемого

компонента для проведения анализа выбранным нами методом.

Разработанная биоаналитическая методика была валидирована по

следующим основным характеристикам: селективность, линейность,

правильность (на уровнях inter-day и intra-day), прецизионность (на уровнях inter-

day и intra-day), предел количественного определения, стабильность растворов,

перенос пробы.

Селективность определения была подтверждена использованием 6 образцов

чистой плазмы, образца чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора

тиозонида в диапазоне концентраций 1нг/мл – 1000 нг/мл. Методика была

признана селективной, поскольку на хроматограммах образцов чистой плазмы не

наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени

удерживания тиозонида.

Отклик прибора на концентрацию определяемого вещества должен быть

известен и оценен в определенном концентрационном диапазоне. Исходя из

полученных данных доклинических исследований тиозонида, дизайн

клинического исследования предполагал достаточно широкий интервал доз

препарата (25-600 мг) в широком временном интервале (0-168 ч). В связи с этим

стояла задача выбрать достаточно широкий концентрационный диапазон, чтобы

обеспечить адекватное описание фармакокинетики определяемого вещества.

Линейность методики была подтверждена путем анализа 9 образцов чистой

плазмы с прибавлением раствора стандартного образца тиозонида до получения

концентраций: 1 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл, 250 нг/мл,

500 нг/мл и 1000 нг/мл. По полученным значениям был построен калибровочный

график зависимости площади пика тиозонида от его концентрации в плазме (r2>

0,998) совместно с уравнением калибровочной кривой. Полученные отклонения

концентраций калибровочных растворов тиозонида от фактических значений

соответствовали нормам (не более 20 % для нижнего диапазона линейности, не

более 15 % - для остальных точек). Таким образом, разработанная методика была

97

признана линейной в пределах от 1 нг/мл до 1000 нг/мл. Как видно из данных

предыдущей главы, Сmax тиозонида составила 70 ± 8 нг/мл; 522 ± 94 нг/мл; 892 ±

131 нг/мл; 1359 ± 193 нг/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг,

соответственно, поэтому данный диапазон концентраций обеспечивал адекватное

описание фармакокинетики определяемого вещества.

Правильность и прецизионность аналитической методики оценивались

путем анализа четырех образцов чистой плазмы с прибавлением стандартного

раствора тиозонида до получения концентраций: 1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл,

1000 нг/мл, каждый из которых хроматографировали по 5 раз. Исследование

проводили в течение 1-го дня (intra - day) и 2-го дня (inter-day). Полученные

величины RSD (%) и ε (%) соответствовали нормам FDA и EMA (не более 20 %

для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных концентраций),

что позволило считать методику точной и прецизионной.

В литературе имеется немало примеров, где оценку правильности и

прецизионности проводят путем анализа трех образцов. Так в [100] правильность

и прецизионность также были доказаны внутри аналитического цикла и между

аналитическим циклами, однако с использованием трех образцов чистой плазмы с

прибавлением стандартных растворов флуоксетина, циталопрама, пароксетина и

венлафаксина соответственно до получения концентраций 10, 70 и 400 нг/мл.

Каждый раствор хроматографировали по 5 раз, величины RSD (%) и ε (%)

соответствовали нормам FDA и EMA (не более 20 % для минимальной

концентрации, не более 15 % - для остальных концентраций). Это допустимо,

поскольку согласно требованиям FDA при оценке правильности и

прецизионности методики рекомендуется анализировать не менее трех уровней

концентраций, в то время как драфт-руководство ЕМА имеет более высокие

требования к определению правильности и прецизионности и рекомендует

анализировать не менее четырех уровней концентраций [79, 80].

В Руководстве ЕМА указано, что прецизионность и правильность должны

определяться как минимум на четырех уровнях концентрации: для ПКО, для

точки, в 3 раза большей ПКО, около 50% от диапазона калибровочной кривой и

98

около 75% от максимального значения на калибровочной кривой. Регламентируя

определение данных характеристик при концентрации, равной ПКО, данная схема

гарантирует высокое качество количественного анализа при низких

концентрациях, например в случае изучения кинетики выведения лекарственного

препарата. Принимая во внимание всё вышесказанное, а также с учетом широкого

аналитического диапазона концентраций тиозонида в плазме крови было принято

решение проводить анализ прецизионности и правильности на 4 стандартных

растворах.

На основании данных линейности, правильности и прецизионности был

определен ПКО методики. Минимальное значение концентрации тиозонида в

плазме, для которой возможно определение тиозонида со значениями RSD и ε не

более 20 % в диапазоне линейной зависимости составило 1 нг/мл, что адекватно

соотноситься с ожидаемым нижним уровнем концентраций лекарственного

препарата в реальных образцах клинического исследования. Как видно из

поученных результатов, достигнутое значение ПКО на уровне 1 нг/мл позволило

определить следовые концентрации тиозонида уже через 30 мин после приема

препарата в дозировке 25 мг (Cmin тиозонида после приема препарата в дозировке

25 мг составляет 1,1 нг/мл). Как отмечалось выше, метод ВЭЖХ-МС обладает

высокой чувствительностью. Так в [100] предел обнаружения составил 0,5 нг/мл

для флуоксетина, 0,3 нг/мл для циталопрама, 0,3 нг/мл для пароксетина и 0,1

нг/мл для венлафаксина, соответственно. Для перхлозона чувствительность

методики для масс-спектрометрического детектирования составила 10 нг/мл

[104].

Таким образом, было доказано, что разработанная методика является

селективной, точной, прецизионной и линейной в диапазоне концентраций

тиозонида от 1 нг/мл до 1000 нг/мл, соответствует по всем параметрам

требованиям руководств FDA [79] и EMA [80] по валидации биоаналитических

методик.

Туберкулез является сложным инфекционным заболеванием. Лечение

больных туберкулёзом длительное (6-18 месяцев) и включает

99

многокомпонентную терапию, которая зачастую насчитывает десятки

антибактериальных препаратов. Резюмируя данные Главы 1, это связано главным

образом с тем, что сегодня можно выделить три основные составляющие

распространенности туберкулезной инфекции. Первая составляющая - это

возрастание заболеваемости типичным туберкулезом; вторая составляющая

обусловлена химиорезистентным туберкулезом, который распространяется очень

быстрыми темпами и создает большую опасность; третья составляющая — это

туберкулез на фоне СПИДа и у ВИЧ-инфицированных больных. Кроме того

проводят комплекс неспецифических мероприятий, направленных на укрепление

защитных сил организма (витаминотерапию, лечебное питание и др.). Поэтому

цель данного исследования заключалась в разработке и валидации такой

методики определения тиозонида в плазме крови человека, которая могла бы быть

применима как для фармакокинетических исследований, так и в дальнейшем для

терапевтического мониторинга на фоне сопутствующей терапии.

Разработанная методика количественного определения тиозонида в плазме

крови имеет реальную практическую значимость, так как в достаточной степени

решает весь спектр аналитических задач, связанных с данным объектом

исследования.

Разработанная нами методика была успешно применена в рамках I фазы

клинического исследования по изучению фармакокинетики препарата Тиозонид.

Исследование проводилось с участием 40 здоровых добровольцев (здоровые

добровольцы мужского пола от 18 до 45 лет включительно), которые были

разделены на 4 группы (когорты), при однократном приеме возрастающих доз

препарата: 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг. Включение добровольцев по 10 человек

в когорту с последовательным повышением дозы позволило описать

фармакокинетические свойства препарата для проведения клинических

исследований II и III фазы.

Оценка ФК проводилась по концентрации тиозонида в плазме каждого

добровольца, получавшего исследуемый препарат.

100

Индивидуальные профили изменения концентpаций тиозонида в плазме

крови во времени, зарегистрированные после проведения клинического

исследования количественно оценивали определив максимальную концентрацию

лекарственного вещества (Cmax) и время ее достижения (Tmax), площадь под

кривой «концентрация – время» в пределах от нуля до момента отбора последней

пробы крови (AUC0-168), рассчитанной методом трапеций, общую площадь под

фармакокинетической кривой (AUC0-∞) и соотношением Cmax к AUC0-168.

Дополнительно определяли константу элиминации (kel), период полувыведения

(T1/2), среднее время удерживания (MRT) , отношение значений AUC0-168 с общим

AUC0-∞ (AUC0-168 / AUC0-).

При поступлении в системный кровоток Тиозонид постепенно всасывался

(среднее значение Tmax около 6 часов), его концентрация постепенно возрастала,

достигая значений Сmax 70 ± 8 нг/мл; 522 ± 94 нг/мл; 892 ± 131 нг/мл; 1359 ± 193

нг/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг, соответственно, а затем

начинала снижаться.

AUC0-168 тиозонида составила 1267 ± 265 нг*ч/мл; 10508 ± 2108 нг*ч/мл;

16760 ± 1713 нг*ч/мл; 25231 ± 1862 нг*ч/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и

600 мг, соответственно.

В ходе исследования на основе полученных данных была показана

линейность фармакокинетики препарата в интервале доз 25-600 мг по Сmax и

AUC0-168 (R2 > 0,99). Увеличение вводимой дозы пропорционально влияло на

увеличение концентрации тиозонида в плазме крови и площади под

фармакокинетической кривой.

При пероральном приеме препарата среднее значение времени достижения

максимальной концентрации ЛВ (Tmax) для дозировки 25 мг составило около 5

часов, для дозировок 200 мг, 400 мг и 600 мг среднее значение Tmax составило

около 6 ч. Период полувыведения для дозировок 25 мг , 400 мг и 600 мг составил

24 часа, для дозировки 200 мг – 26 часов, что показывает медленное выведение

препарата из плазмы крови. Скорость процесса элиминации препарата

характеризовалась константой элиминации (kel), для расчета которой принимали

101

во внимание весь нисходящий участок фармакокинетической кривой с

ненулевыми значениями концентраций. Тиозонид практически не обнаруживался

в плазме крови спустя 168 ч после однократного применения для всего

анализируемого диапазона дозировок, либо обнаруживался на очень низких

уровнях для дозировок 200-600 мг.

Было доказано, что выбранный регламент фармакокинетического

исследования обеспечивает необходимую надежность оценки

фармакокинетических параметров тиозонида, о чем свидетельствуют

рассчитанные данные соотношений значения площади под кривой «концентрация

– время» в пределах от нуля до момента отбора последней пробы крови (AUC0-168)

со значением общей площади под фармакокинетической кривой (AUC0-∞)..

Отношение AUC0-168/AUC0-∞ составляло значительно больше 80% для каждой

анализируемой дозировки: для дозировки 25 мг усредненное значение отношения

AUC0-168/ AUC0-∞ составило 100%, для дозировки 200 мг – 95%, для дозировки 400

мг – 100%, для дозировки 600 мг – 99 %.

Первая фаза клинических исследований – это связующее звено между

научными исследованиями и клинической практикой [108]. Результаты

фармакокинетического исследования используются в обосновании схем

дозирования разрабатываемых лекарственных средств, которые в последующем

уточняются в клинических исследованиях.

Таким образом, на основе представленных данных и всего вышесказанного,

можно сделать вывод о том, что в рамках диссертационной работы поставленные

задачи выполнены и цель достигнута.

102

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведен аналитический обзор современной научной, нормативной,

методической литературы по изучению чувствительных и специфичных

аналитических методов, применяемых при изучении фармакокинетики

лекарственных средств. С учетом особенностей структуры соединения и

оптимизации процесса анализа был выбран метод ВЭЖХ с масс-

спектрометрическим детектором.

2. Разработана методика количественного определения инновационного

противотуберкулезного препарата Тиозонид в плазме крови человека методом

ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором (SIM режим по иону с m/z =

561,1(тиозонид)). Исходя из химических свойств тиозонида, экспериментально

были подобраны хроматографические условия анализа тиозонида.

Аналитический диапазон методики составил 1 нг/мл –1000 нг/мл тиозонида в

плазме крови.

3. Проведена валидация разработанной методики определения тиозонида в

плазме крови человека. Полученные данные демонстрируют, что

разработанная методика является селективной, точной, прецизионной и

линейной, соответствует современным требованиям руководств НЦЭСМП

Минздрава России, FDA и EMA по валидации биоаналитических методик.

Предел количественного определения методики составил 1 нг/мл. Полученные

величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной

погрешности (ε, %) соответствуют принятым нормам и составляют не более 20

% для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных

концентраций.

4. Изучена динамика концентраций тиозонида после однократного перорального

приема возрастающих доз у здоровых добровольцев. Максимальная

концентрация тиозонида составила 70 ± 8 нг/мл; 522 ± 94 нг/мл; 892 ± 131

нг/мл; 1359 ± 193 нг/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг,

103

соответственно и достигалась через 6 часов после приема препарата.

Фармакокинетика тиозонида в диапазоне доз 25-600 мг была признана

линейной по параметру Сmax (R2 > 0,99, значимость критерия Фишера не

превышает 0,05).

5. По результатам фармакокинетического исследования оригинального

противотуберкулезного препарата Тиозонид получены и статистически

обработаны значения индивидуальных фармакокинетических параметров

препарата после приема в изучаемых дозировках. Показана линейность

фармакокинетики препарата в интервале доз 25-600 мг по параметру AUC0-168

(R2 > 0,99, значимость критерия Фишера не превышает 0,05). Установлено, что

тиозонид постепенно всасывается в системный кровоток, достигает

максимальной концентрации через 6 часов после приема препарата в

изучаемых дозировках и медленно выводится из плазмы крови (константа

элиминации имела постоянное значение (kel около 0,030 ч-1

), период

полувыведения около 25 часов).

104

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ANOVA – analysis of variance, дисперсионный анализ

APCI – atmospheric pressure chemical ionization, химическая ионизация при

атмосферном давлении

AUC – area under curve, площадь под кривой

CV – coefficient of variation, коэффициент вариации

DOTS – directly observed treatment, short course, короткие курсы терапии под

непосредственным наблюдением

ε - относительная погрешность

EMA – European Medicines Agency, Европейское Медицинское Агентство

ESI – electrospray Ionization, электрораспылительный вариант ионизации

FDA – Food and Drug Administration, Американский комитет по контролю за

пищевыми продуктами и средствами медицинского назначения

m/z – отношение массы к заряду

MRM – multiple reaction monitoring, мониторинг множественных реакций

SIM – single ion mode, режим выбранного иона

TIC – total ion current, анализ полного ионного тока

RSD – relative standard deviation, относительное стандартное отклонение

XDR – еxtreme drug resistance, суперустойчивость

ВИЧ – Вирус иммунодефицита человека

ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ-МС – ВЭЖХ с масс-спектрометрическим (масс-селективным)

детектированием

ВЭЖХ-МС/МС – ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометрическим

детектированием

ВЭЖХ-УФ – ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием

105

ГЖХ – газовая хроматография

ДИ – доклинические исследования

ЖЖЭ – жидкостно-жидкостная экстракция

ИФА – иммуноферментный анализ

КОЕ – колониеобразующая единица

ЛВ – лекарственное вещество

ЛП – лекарственный препарат

ЛС – лекарственное средство

МБТ – микобактерии туберкулеза

МЛУ – множественная лекарственная устойчивость

ПАСК – парааминосалициловая кислота

ПКО – предел количественного определения

ПТП – противотуберкулезные лекарственные препараты

СВЭЖХ – сверхвысокопроизводительная высокоэффективная жидкостная

хроматография

ТФЭ – твердофазная экстракция

ШЛУ – широкая лекарственная устойчивость

106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Нечаева, О.Б. Туберкулез в Российской Федерации: заболеваемость и

смертность / О.Б. Нечаева // Медицинский алфавит. - 2013. - Т. 4, № 24. - С.

7-12.

2. Доклад ВОЗ о глобальной борьбе с туберкулезом, 2013 г. [Электронный

ресурс]

Режим доступа: http://www.who.int/tb/publications/global_report/ru/. (дата

обращения: 22.01.2016)

3. Скорняков, С.Н. Эпидемическая ситуация по туберкулезу и результаты

деятельности противотуберкулезной службы на Урале в 2013 году / С.Н.

Скорняков, В.А. Подгаева, Н.В. Канавина, П.Л. Шулев // Фтизиатрия и

пульмонология. – 2014. - № 1 (8). – С. 7-18.

4. Туберкулез в Российской Федерации 2011 г. Аналитический обзор

статистических показателей, используемых в Российской Федерации и в

мире. Москва: М., 2013. – 280 с.

5. Barry, C.E. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and

intervention strategies/ C.E. Barry, H. I. Boshoff, V.Dartois, T. Dick et al. //

Nature Reviews Microbiology. - 2009. - Vol.7 - N12. P. 845-855.

6. Шевченко, Ю.Л. Борьба с туберкулезом в России на пороге ХХI века / Ю.Л.

Шевченко // Проблемы туберкулеза. – 2000. – № 3. – С. 2–6.

7. Хоменко, А.Г. Химиотерапия туберкулеза – история и современность /

Хоменко А.Г. // Проблемы туберкулеза. – 1996. – № 3. – С. 2–6.

8. Мишин, В.Ю. Диагностика и химиотерапия туберкулёза органов дыхания /

В.Ю. Мишин // Проблемы туберкулеза. - 2005. - № 3. - С. 47–64.

9. Страчунский, Л.С. Практическое руководство по антиинфекционной

химиотерапии / Л.С. Страчунский, Ю.Б. Белоусов, С.Н. Козлов. - Изд.:

НИИАХ СГМА, 2007. С. 586.

http://www.who.int/tb/publications/global_report/ru/

107

10. Приказ МЗ РФ № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных

мероприятий в Российской Федерации» от 21 марта 2003 г.

11. Мишин, В.Ю. Лечение больных туберкулёзом лёгких: учебное

методическое пособие для врачей / В.Ю. Мишин. - М.:МГМСУ, 2005.

12. Хоменко, А.Г. Химиотерапия туберкулеза легких / А.Г. Хоменко. - М.,

1980. - 278 с.

13. Хоменко, А.Г. Клинические и эпидемиологические аспекты

контролируемой химиотерапии укороченной длительности / А.Г. Хоменко //

Проблемы туберкулеза. - 1998. - № 4. - С. 16–20.

14. Самойлова, А.Г. Лечение туберкулеза легких с лекарственной

устойчивостью микобактерий в современных условиях / А. Г. Самойлова //

Экология человека. – 2005. - № 12. - С. 3-8.

15. Raviglione, M. The global epidemiology of tuberculosis II / M. Raviglione et al.

// Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2001.-Vol. 5. - N. 11. - P. 7-8.

16. Богородская, Е.М. Проблемы формирования эпидемиологических

показателей по туберкулезу / Е.М. Богородская, С.А. Стерликов, С.А Попов

// Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2008. - № 7. – C. 8-14.

17. Heymann, S.J. The need for global action against multidrug-resistant

tuberculosis / S.J. Heymann, T.F. Brewer, M.E. Wilson, H.V. Fineberg // JAMA.

– 1991. – Vol. 281. – P. 2138-2140.

18. Коровкин, В.С. Значение критериев лекарственной устойчивости

микобактерий туберкулеза во фтизиатрической клинике / В.С. Коровкин,

О.Л. Горенюк // Медицинские новости. – 2005. -№ 4. - С. 16-20.

19. Мишин, В.Ю. Современные режимы химиотерапии туберкулеза легких,

вызванного лекарственно-чувствительными и лекарственно-резистентными

микобактериями / В.Ю. Мишин // Русский медицинский журнал. - 2003. - Т.

11, №21. - С. 1163-1167.

20. Мишин, В.Ю. Современная стратегия лечения лекарственно–устойчивого

туберкулеза легких. / В.Ю. Мишин // Лечащий врач. – 2000. – № 3. – С.4–9.

108

21. Рекомендации по лечению резистентных форм туберкулеза легких. – ВОЗ.

– Женева. – 1998. – Перевод с английского. – 47 с.

22. Марьяндышев, А.О. Лекарственная устойчивость микобактерий

туберкулеза – актуальная проблема фтизиатрии / А.О. Марьяндышев, А.Г.

Самойлова // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2005. -№7. – С. 3-

9.

23. Черноусова, Л.Н. Современные тенденции и возможности

микробиологической диагностики туберкулеза / Л.Н. Черноусова // Русский

медицинский журнал. – 2002. - № 16.- C. 697-698.

24. Исакова, Ж.Т. Молекулярно-генетическая характеристика рифампицин- и

изониазидустойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis циркулирующих

в различных регионах Кыргызской республики / Ж.Т. Исакова // Вестник

Кыргызско-Российского Славянского Университета. – 2008. – Т. 8., №4.

25. Ramaswamy, S. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in

Mycobacterium tuberculosis / S. Ramaswamy, J.M. Musser // Tubercle and Lung

Disease. –1998. – №1. – P. 3–29.

26. Соколова, Г.Б. Разработка современных протоколов диагностики и лечения

туберкулёза органов дыхания / Г.Б. Соколова и др. // Consilium medicum. –

2001. – Т. 3, № 3. – С. 148-154.

27. Raviglione, M.C. Who’s new stop TB Strategy / M.C. Raviglione, W.Uplekar

Mukund // The Lancet. – 2006. - Vol. 367. – Р. 952-955.

28. Perkins, M. Progress towards improved tuberculosis diagnostics for developing

countries / M. Perkins., G. Roscigno, A. Zumla // The Lancet. – 2006. - Vol. 367.

– Р. 942-943.

29. Doherty, M. Prigress and hindrances in tuberculosisn vaccine development / M.

Doherty, G. Rook // The Lancet. – 2006. - Vol. 367. – Р. 947-949.

30. Бастиан, И. Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью /

перевод с англ. / Под ред. И. Бастиан, Ф.Порталс.- М.: Медицина и жизнь,

2003, 368 с.

109

31. Iseman, M.D. Directly observed treatment of tuberculosis / M.D. Iseman, D.L

Cohn, J.A. Swarbaro // N. Engl. J. Med. -1993. -Vol.328.- № 8,- P.576- 578.

32. Harkin, T.I. Treatment of the multidrug-resistant tuberculosis / T.I. Harkin, H.W.

Harris // Tuberculosis. - 1996. - P. 843-850.

33. Репин, Ю.М. Современное состояние фтизиохирургии / Ю.М.Репин. //

Туберкулез: проблемы диагностики, лечения и профилактики. - Новая

волна, 2003. - 528 с.

34. Мишин, В.Ю. Медикаментозные осложнения комбинированной

химиотерапии туберкулёза лёгких / В.Ю. Мишин. - М., 2007. -245с.

35. Мишин, В.Ю.К вопросу об оптимизации химиотерапии больных с впервые

выявленным туберкулезом легких / В.Ю. Мишин // Клиническая

микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2002. – Т. 4, №1.

36. Хабиб, О. Новая стратегия ВОЗ в лечении туберкулеза – использование

комбинированных препаратов / О. Хабиб // Consilium medicum. - 2000. – T.

2, № 1. – с. 9-10.

37. Хабриев, Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому)

изучению новых фармакологических веществ / Р.У. Хабриев. – 2-е изд.,

перераб. и доп. – М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. – 832 с.

38. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития

Российской Федерации №708н «Об утверждении правил лабораторной

практики» от 23.08.2010 г.

39. ГОСТ Р-53434-2009 Принципы надлежащей лабораторной практики

(Рrinciples of Good Laboratory Practice). – М.: Стандартинформ, 2009. – 10 с.

40. Миронов, А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований

лекарственных средств. Часть I / А.Н. Миронов. - М.: Гриф и К, 2013. — 328

с.

41. Tanswell, P. Nonlinear pharmacokinetics of tissue-type plasminogen activator in

three animal species and isolated perfused rat liver / P.Tanswell, G Heinzel, A

Greischel, J. Krause // J Pharmacology and Experimental Therapeutics. - 1990. -

Vol. 255, N 3. - P. 318-24.

110

42. Bourdet, David L. Prediction of Human Serotonin and Norepinephrine

Transporter Occupancy of Duloxetine by Pharmacokinetic / Pharmacodynamic

Modeling in the Rat / L. David Bourdet, Pamela R. Tsuruda, P. Obedencio

Glenmar, Jacqueline A. M. Smith // J Pharmacology and Experimental

Therapeutics. - 2012. - Vol. 341, N 2. - P.137-145.

43. Sohlberg, E. The impact of the site of blood sampling on pharmacokinetic

parameters following sublingual dosing to dogs/ E. Sohlberg, M.M. Halldin, A.

Annas, K. Königsson et al. // J Pharmacol Toxicol Methods. - 2012. - Vol. 63,

N1. - P. 1-4.

44. Preclinical Development Handbook: Toxicology. 1st edition. Pharmaceutical

Development Series / S. C.Gad. - USA, 2008.

45. Федеральный закон Российской Федерации N 61 «Об обращении

лекарственных средств» от 12 апреля 2010 г. (ред. от 29.12.2015)

46. Приказ Министерства промышленности и торговли Российской Федерации

от 31 января 2013 №118 «Об утверждении стратегии развития

фармацевтической промышленности на период до 2020 года». – М., 2013 г.

47. Рейхарт, Д.В. Анализ лекарственных веществ при фармакокинетических

исследованиях / Д.В. Рейхарт, В.В.Чистяков и др. // Казанский медицинский

журнал. - 2010 г. – Т. 91, №4 - С. 532-536.

48. Мирошниченко, И.И. Хроматомасс-спектрометрия в фармакокинетических

исследованиях / И.И Мирошниченко, Ю.А. Федотов, Е.В. Горшкова, А.А.

Иващенко // Качественная клиническая практика. – 2008 г. - №3. – С. 29-36.

49. Медведев, Ю.В. ВЭЖХ и СВЭЖХ как методы для определения

лекарственных веществ в крови (обзор) / Ю.В. Медведев, Г.В. Раменская

И.Е. Шохин, Т.А. Ярушок // Химико-фармацевтический журнал. - 2013 г., Т.

47, № 4 - С. 45-51.

50. Muntoni, E. Determination of disodium clodronate in human plasma and urine

using gas-chromatography–nitrogen-phosphorous detections: validation and

application in pharmacokinetic study / E. Muntoni, R. Canaparo, C. Della Pepa,

111

L. Serpe et al. // Journal of Chromatography B. – 2004. - Vol. 799, Issue 1. - P.

133-139.

51. Pastera, J. Simultaneous determination of nitrendipine and one of its metabolites

in plasma samples by gas chromatography with electron-capture detection / J.

Pastera, L. Mejstříková, J. Zoulová, K. Macek, J. Květina et al. // Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2007. - Vol. 44, Issue 3. - P. 674-679.

52. Riepe, F.G. Chromatographic system for the simultaneous measurement of

plasma 18-hydroxy-11-deoxycorticosterone and 18-hydroxycorticosterone by

radioimmunoassay: reference data for neonates and infants and its application in

aldosterone-synthase deficiency / F.G .Riepe, N. Krone, M. Peter, W.G. Sippell,

C.-J. Partsch // J. Chromatogr. B. - 2003. - V. 785. - P. 293-301.

53. Maurice, W. The determination of dimethindene in human serum by enzyme-

linked immunosorbent assay (EIA) / W. Maurice, M. Etienne, J.-P. Siest et al. //

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 1993. - Vol. 11, Issue 7. -

P. 619-623.

54. Жердев, В.П. Роль и организация фармакокинетических исследований /

В.П. Жердев, А.А. Литвин // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2005 г.

-№2 (3). - С.1-3.

55. Приказ МЗ РФ №266 «Правила клинической практики в РФ» от 19.06.2003

г.

56. Приказ МЗ РФ №267 «Правила лабораторной практики в РФ» от 19.06.2003

г.

57. Миронов, А.Н. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Часть I /

А.Н. Миронов. - М.: Гриф и К, 2013. — 328 с.

58. Westhouse, Richard A. Pharmacokinetics and Safety Assessment / A. Westhouse

Richard, D. Bruce Car // Cancer Immunotherapy (Second Edition). Immune

Suppression and Tumor Growth. – 2013. - P. 187–206.

59. ГОСТР 52379 - 2005 Надлежащая клиническая практика. – М.:

Стандартинформ, 2005. – 16 с.

112

60. Горьков, В.А. Введение в фармакокинетику / В.А. Горьков, Е.И

Карамышева // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2004. - №1. - C. 2-5.

61. Белоусов, Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия: руководство

для врачей // Ю.Б Белоусов, В.С. Моисеев,. В.К. Лепахин.- 2-е изд. испр. и

доп. - М.: Универсум паблишинг, 1997. - 531 с.

62. Методические Указания Министерства здравоохранения и социального

развития РФ от 10.08.2004 г. «Проведение качественных исследований

биоэквивалентности лекарственных средств» – М., 2004

63. Grippo, J.F. A phase I, randomized, open-label study of the multiple-dose

pharmacokinetics of vemurafenib in patients with BRAF V600E mutation-

positive metastatic melanoma / J.F. Grippo, W. Zhang, D. Heinzmann, K.H.

Yang, J. Wong et al. // Cancer Chemother Pharmacol. - 2013.

64. Белоусова, Ю.Б. Основы клинической фармакологии и рациональной

фармакотерапии / Ю.Б. Белоусова, М.В. Леонова. - М. Литтерра. 2002. -

356с.

65. Бочарова, И.В. Доклинические исследования специфической активности

нового противотуберкулезного препарата тиозонид / И.В. Бочарова, М.С.

Буренков, Л.Н. Лепеха, Т.Г. Смирнова и др. // Туберкулез и болезни легких.

- 2014. -№ 6. - С. 46-50.

66. Капанадзе, Г.Д. Биологические и зоотехнические особенности

светлогорских мини-свиней, их совершенствование и рациональное

использование: дис. д. биол. н.: 06.02.10 / Капанадзе Гия Джималиевич. –

М., 2011. – 299 с.

67. Yadav, M. Comparison of extraction procedures for assessment of matrix effect

for selective and reliable determination of atazanavir in human plasma by LC–

ESIMS/MS / M. Yadav, V. Trivedi, V. Upadhyay, G. Shah et al. // Chromatogr.

B. - 2012. - V. 885. - P. 138-149.

68. Perrottet, N. Determination of aciclovir and ganciclovir in human plasma by

liquid chromatography-spectrofluorimetric detection and stability studies in blood

113

samples / N. Perrottet, A. Beguin, P. Meylan et al. // Journal of Chromatography

B. - 2007. - vol. 852, № 1-2. - Р. 420–429.

69. Szultka, M. A new approach for antibiotic drugs determination in human plasma

by liquid chromatography–mass spectrometry / M.J. Szultka, R. Krzeminski, J.

Szeliga, M. Jackowski, B. Buszewski // Chromatogr.A. - 2013. V. 1272. - P. 41–

49.

70. Delavenne, X. UPLC MS/MS assay for routine quantification of dabigatran – a

direct thrombin inhibitor – in human plasma / X. Delavenne, J Moracchini, S.

Laporte // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. -2012. –V.58. -

P.152–156.

71. Veeraraghavan, S. Simultaneous quantification of ruxolitinib and nilotinib in rat

plasmaby LC–MS/MS: Application to a pharmacokinetic study / S.

Veeraraghavan, S. Thappali, S. Viswanadha, S. Chennupati et al. //

J.Pharm.Biomed.Anal. - 2014. - V. 94. - P. 125–131.

72. Gradinaru, J. Quantification of typical antipsychotics in human plasma by ultra-

high performance liquid chromatography tandem mass-spectrometry for

therapeutic drug monitoring / J. Gradinaru, A. Vullioud, C. Eap, N. Ansermot et

al. // J.Pharm.Biomed.Anal. - 2014. - V. 88. - P. 36 - 44.

73. Luthi, G. Buprenorphine and norbuprenorphine quantification in human plasma

by simple protein precipitation and ultra-high performance liquid

chromatography tandem mass spectrometry / G. Luthi, V. Blangy, C. Eap, N.

Ansermot // J.Pharm.Biomed.Anal. - 2013. - V. 77. - P. 1–8.

74. Polson, C. Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of

protein removal and ionization effect in liquid chromatography-tandem mass

spectrometry / C. Polson, P. Sarkar, B. Incledon // Journal of Chromatography B.

– 2003. – Vol. 785. – P. 263-275.

75. Стыскин, Е.Л. Практическая высокоэффективная жидкостная

хроматография / Е.Л. Стыскин, Л.Б. Ициксон, Е.В. Брауде. – М., 1986. – 213

с.

114

76. Banerjee, S. Electrospray ionization mass spectrometry: a technique to access the

information beyond the molecular weight of the analyte / S. Banerjee, S.

Mazumdar // International Journal of Analytical Chemistry/ - 2012. - Vol. 8. - P.

1-40.

77. Борисов, Р.С. Методы ионизации и разделения ионов в масс-спектрометрии

/ Р.С. Борисов, В.Г. Заикин, А.В. Варламов, Л.Н. Куликова. - М.: РУДН,

2011.

78. Cole, R.B. Electrospray Ionization Mass Spectrometry / R.B. Cole (ed.). - Wiley,

New York, 1997.

79. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of

Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug

Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington,

DC, 2001.

80. Guideline on validation of bioanalytical methods (draft). European Medicines

Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 2009.

81. Постановление Правительства Российской Федерации № 715 «Об

утверждении перечня социально-значимых заболеваний и перечня

заболеваний, представляющих опасность для окружающих» от 1 декабря

2004 г.

82. Кривонос, О.В. Туберкулез в Российской Федерации 2009 г.

Аналитический обзор статистических показателей по туберкулезу,

используемых в Российской Федерации / О.В. Кривонос – М., 2010. – 224 с.

83. Приказ Минздрава РФ от 13 февраля 2004 г. «О введении в действие

учетной и отчетной документации мониторинга туберкулеза ». - М.: 2004. -

с.-51.

84. Васильева, И.А. Эффективность химиотерапии больных лекарственно-

устойчивым туберкулёзом лёгких: дис. докт. мед. наук: 14.00.26 / Ирина

Анатольевна Васильева. -М., 2002. - 263с.

115

85. Чуканов, В.И. Особенности лечения лекарственно-устойчивого туберкулёза

лёгких / В.И. Чуканов, В.Ю. Мишин, В.Н. Наумов // Кубанский науч. мед.

Вестник. - 2001. - № 4. - С. 23-25.

86. Кошечкин, В.А., Иванова З.А. Туберкулёз: учебное пособие /

В.А.Кошечкин, З.А. Иванова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 304 с.

87. Sutherland, I. The epidemiology of tuberculosis and AIDS. / I. Sutherland //

British Communicable Disease Report – 1990.Vol. 90. - P. 3–4.

88. Barry, C.E. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and

intervention strategies / C.E. Barry, H.I. Boshoff, V. Dartois, T. Dick et al. // Nat

Rev Microbiol. - 2009. - Vol.7 - N12. P. 845-855.

89. Brogden, R.N. A review of its antimicrobial activity, pharmacokinetic properties

and therapeutic efficacy / R.N. Brogden, A. Fitton Rifabutin // Drugs. - 1994. -

Vol. 47. - P. 983-1009.

90. Alangaden, G.J. The clinical use of fluoroquinolones for the treatment of

mycobacterial diseases / Alangaden G.J., S.A. Lerner et al. //Clin Infect Dise, -

1997.- Vol. 25. - P. 1213- 1221.

91. Hooper, D.C., The fluoroquinolonones: pharmacology, clinical uses and

toxicities in humans / D.C. Hooper, J.S. Wolfson // Antimicro Agents Chemother.

- 1985. - Vol. 28. - P. 716-721.

92. Лебедев, А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии / А.Т. Лебедев. –

Москва: Бином. Лаборатория знаний, 2003. – 493 с.

93. Covey, T.R. High-speed liquid chromatography /tandem mass spectrometry for

the determination of drugs in biological samples / T.R. Covey, E.D. Lee, J.D.

Henion // Chem. - 1986. - Vol. 58 (12). - P.2453 - 2460.

94. Stokvis, E. Liquid chromatography-mass spectrometry for the quantitative

bioanalysis of anticancer drugs / E. Stokvis, H. Rosing, J.H. Beijnen // Mass

Spectrom. Rev. — 2005. — Vol.24., №6. — P.887-917.

95. Лохов, П.Г. Масс-спектрометрический анализ низкомолекулярных фракций

крови как способ унификации терапевтического лекарственного

116

мониторинга / П.Г. Лохов, Д.Л. Маслов, О.П. Трифонова, Е.Е. Балашова,

А.И. Арчаков // Биомедицинская химия. - 2014. - Т. 60, № 2. - С. 201-216.

96. Rezk, N.L. A novel LC–ESI-MS method for the simultaneous determination of

etravirine, darunavir and ritonavir in human blood plasma / N.L. Rezk, N.R.

White, S.H. Jennings, A.D. Kashuba // Talanta. - 2009. - V.79. - P. 1372-1378.

97. Łowicki, D. J. 1H, 13C NMR, FT-IR, ESI MS and PM5 studies of a new 3,6,9-

trioxadecylamide of monensin A and its complexes with Li+, Na

+and K

+cations /

D.J. Łowicki, A. Huczynski, B. Brzezinski, F. Bartl // Mol. Struct. - 2011. - V.

990. - P. 121-131

98. Писарев, В.В.Определение азитромицина в плазме крови методом ВЭЖХ с

масс-спектрометрическим детектированием. / В.В. Писарев, Л.Б. Смирнова,

Н.Е. Москалева и др. // Клиническая фармакокинетика - 2004. - №1. - С.23-

26.

99. Барсегян, С.С. Исследование биоэквивалентности препаратов ондансетрона

с использованием метода ВЭЖХ-МС / С.С. Барсегян, С.М. Никонова, М.В.

Овчаров, Е.С. Степанова, В.В. Чистяков, В.В. Шилов // Фармакокинетика и

фармакодинамика. - 2015. - №1.- С. 21-26.

100. He, J. Simultaneous determination of fluoxetine, citalopram,

paroxetine,venlafaxine in plasma by high performance liquidchromatography–

electrospray ionization mass spectrometry (HPLC–MS/ESI) / J. He, Z. Zhiling,

H. Li // Journal of Chromatography B. – Vol. 820. – 2005. – P. 33–39

101. Hosseini, M. Application of UV-Spectrophotometry and HPLC for

determination of Venlafaxine and its four related substances in pharmaceutical

dosage forms / M. Hosseini // Turk J. Pharm. Sci. – Vol. 8 (2). - 2011. – P. 91-

104.

102. Кнауб, Н.Н. Определение флуоксетина в биологических объектах / Н.

Н. Кнауб, В.А Кнауб, Д.Д. Даутова // Актуальные вопросы судебной

медицины и экспертной практики.– 2009. - № 15. – С. 21-22.

103. Иванникова, Е.В. Исследование фармакокинетики и биодоступности в

создании новых оригинальных лекарственных средств пептидной

117

структуры и их оптимальных лекарственных форм / Е.В. Иванникова, В.П.

Жердев, С.С. Бойко, Е.В. Блынская и др. // Фармакокинетика и

фармакодинамика. – 2013. - №2. – С. 1-26.

104. Власов, А.М. Определение перхлозона в плазме крови с

использованием ВЭЖХ масс-спектрометрическим детектированием / А.М.

Власов, Ю.Н. Башкатова, А.Ю. Савченко, М.Р. Хаитов, Г.В. Раменская //

Биомедицина. - 2011. - № 2. - C. 73-78.

105. Мирошниченко, И.И. Хроматомасс-спектрометрия в

фармакокинетических исследованиях / И.И. Мирошниченко, Ю.А. Федотов,

Е.В. Горшкова, А.А. Иващенко // Качественная клиническая практика. –

2008. - №3. - С. 29-36.

106. Peters, F.T. Recent advances of liquid chromatography–(tandem) mass

spectrometry in clinical and forensic toxicology / F.T. Peters // Clin. Biochem. -

2011. - V. 44. - P. 54-65.

107. Hendrikx, J.J.M.A. A sensitive combined assay for the quantification of

paclitaxel, docetaxel and ritonavir in human plasma using liquid chromatography

coupled with tandem mass spectrometry / J.J.M.A. Hendrikx, M.J.X. Hillebrand,

B. Thijssen, H. Rosing et al. // J.Chromatogr.B. - 2011. - V. 879. - P. 2984– 2990.

108. Савченко, А.Ю. Оригинальное лекарственное средство: первый опыт

клинического применения (I фаза). Современные требования / А.Ю.

Савченко, К.С. Давыдова, Г.В. Раменская, В.Г. Кукес // Ремедиум. – 2011. -

№9. – С. 1-3.

Министерство здравоохранения Российской Федерации

Documents