INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Pós-Graduação em Oncologia Brunna Luiza Misael Alves PAPEL DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO HA-G NA INFECÇÃO E PERSISTÊNCIA DO HPV EM UMA COORTE DE GESTANTES HIV+ DO RIO DE JANEIRO Orientador: Dra. Esmeralda Augusta Jardim Machado Soares RIO DE JANEIRO 2014 Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
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Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer ... · virus in the host. ... 1.2.2. Partícula viral, genoma e ciclo replicativo ... Classificação do HPV quanto ao potencial
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INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
Brunna Luiza Misael Alves
PAPEL DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO HA-G NA INFECÇÃO E PERSISTÊNCIA DO HPV EM UMA COORTE DE GESTANTES HIV+ DO RIO DE
JANEIRO
Orientador: Dra. Esmeralda Augusta Jardim Machado Soares
RIO DE JANEIRO
2014
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
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INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
BRUNNA LUIZA MISAEL ALVES
Papel do antígeno leucocitário humano HLA-G na infecção e persistência do HPV
em uma coorte de gestantes HIV+ do Rio de Janeiro
Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Câncer como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Oncologia
Orientador: Dra. Esmeralda Augusta Jardim Machado Soares
RIO DE JANEIRO
2014
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INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
AUTOR: Brunna Luiza Misael Alves
PAPEL DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO HLA-G NA INFE CÇÃO E PERSISTÊNCIA DO HPV EM UMA COORTE DE GESTANTES HIV+ DO RIO DE
JANEIRO
ORIENTADOR: Dra. Esmeralda Augusta Jardim Machado S oares
Aprovada em: 26 / 03 / 2014
EXAMINADORES:
Prof. Dr. Miguel Angelo Martins Moreira
Prof. Dr. André Felipe Andrade dos Santos
Prof. Dra. Sheila Coelho Soares Lima
Prof. Dra. Claudia Esther Alicia Rocio Hassan – Suplente I
Prof. Dra. Anke Bergmann – Suplente II
RIO DE JANEIRO
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DEDICATÓRIA
À minha família e aos meus amigos por
sempre acreditarem e me incentivarem a
ir mais longe
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AGRADECIMENTOS
Aos pacientes que aceitaram participar do estudo;
Ao Dr. Hector Seuánez pelo espaço cedido no laboratório e aos pesquisadores e funcionários do laboratório de genética, por toda ajuda e pela manutenção da ordem no laboratório;
Ao CNPq, FAPERJ e INCT do Câncer pelo apoio financeiro;
À Dra. Esmeralda Soares, minha orientadora, pelos ensinamentos, pela confiança, por todas as oportunidades e principalmente por acreditar que somos capazes;
Ao Dr. Marcelo Soares por todos os conhecimentos transmitidos, pela atenção e cuidado e por nos incentivar a sermos sempre melhores no que fazemos;
À Dr. Anke Bergmann por todo o auxílio indispensável nas análises estatísticas, por toda a gentileza e disponibilidade durante todo o processo de finalização da dissertação, meus sinceros agradecimentos;
À Fabi Germano, Val, Mirela, Sabrina e Livinha por todo o carinho, por todas as aulas que recebemos e principalmente por ajudarem a transformar o INCA na nossa segunda casa;
À Adriana e Mariana por estarem sempre presentes e dispostas a ajudar, por permanecerem do meu lado na “semana mais corrida do século”, por todas as purificações, placas e por todo o consolo tão importantes em vários momentos;
À Juliana, por ser mãe e amiga, pela paciência de ensinar mil vezes o que precisasse desde a iniciação até hoje, por toda a ajuda e apoio, sempre cheios de carinho e atenção, enfim por estar ao meu lado em todos os momentos, sejam os de comemoração ou os de completa indecisão;
À Isabel, minha gêmea postiça, sempre cheia de carinho e compreensão, por tantas vezes me dar à mão e um ombro amigo, por confiar tanto em mim e por essa amizade tão bonita e sólida que construímos. Sei que a cada passo você estará lá para me apoiar e da mesma forma sempre te incentivarei a ir cada vez mais longe, enfim por ser a sempre querida Isabel Maria;
À Amannda por ser meu porto seguro carioca, por sempre me ensinar, me incentivar, me corrigir e principalmente estar ao meu lado. Todo o cuidado, todo o amor e toda a dedicação foram fundamentais nessa jornada.
À minha família, por serem meu alicerce, meu exemplo e minha força. Por todo o colo, por todas as palavras de conforto e por me darem a certeza de que tudo é possível, basta tentar. A confiança de que vocês estarão sempre comigo me faz ir muito mais longe. Estaremos sempre unidos independente de qualquer distância;
E a todos que, de alguma forma, contribuíram para que esta dissertação chegasse ao fim, muito obrigado.
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PAPEL DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO HLA-G NA INFE CÇÃO E
PERSISTÊNCIA DO HPV EM UMA COORTE DE GESTANTES HIV+ DO RIO DE JANEIRO
RESUMO -DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Brunna Luiza Misael Alves
Introdução: A persistência da infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é uma etapa intermediária na progressão para a neoplasia intraepitelial cervical de alto grau e para o consecutivo câncer invasivo. Acredita-se que o sistema imune, a genética do hospedeiro e do vírus estejam entre os fatores não-comportamentais que determinam a aquisição e a persistência da infecção. Pacientes com o sistema imune comprometido apresentam lesões intra-epiteliais mais graves, com progressão mais rápida e com elevada taxa de recorrência, além de um risco aumentado para o câncer cervical. Através da expressão de HLAs-C, -E e –G, capazes de atuar como ligantes inibitórios de células “natural killers”, o vírus consegue estabelecer a infecção evitando a erradicação de células infectadas pelo sistema imune. Devido ao seu potencial em modular a resposta imune contra o HPV, estudos recentes vêm investigando polimorfismos nestes loci que possam estar associados com a susceptibilidade e a com a persistência do vírus no hospedeiro. Objetivo: Caracterizar molecularmente os alelos do HLA-G e analisar sua associação com a aquisição e a persistência do HPV em uma população de gestantes HIV+ do Rio de Janeiro. Relacionar os dados da citologia oncótica, genótipos encontrados e fatores de risco demográficos e clínicos com os alelos encontrados; além de correlacionar os alelos com a infecção por diferentes tipos, espécies, múltiplas infecções e persistência da infecção pelo HPV. Material e Métodos: Foram convidadas a participar do estudo 140 gestantes HIV+ em acompanhamento no Ambulatório de HIV/aids do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira da UFRJ, Rio de Janeiro. A partir do DNA genômico já extraído, foi amplificado por PCR um fragmento compreendendo os éxons 2-4 do HLA-G. Esses produtos foram então sequenciados e analisados para a determinação dos alelos. Para a caracterização de alelos novos e determinação de certos casos de heterozigose foi realizada a clonagem, com posterior sequenciamento e análise dos produtos. Resultados: No total, 126 pacientes foram analisadas, totalizando 22 alelos que compõem 52 diferentes genótipos. A variedade de alelos observada é condizente com a alta diversidade genética associada à população brasileira. No total, encontramos 44% dos alelos já descritos na literatura. Foi possível evidenciar uma associação entre dos alelos G:01:03 e G:01:01:02 à proteção contra a infecção por espécies do grupo B e C, respectivamente. Os dados relativos à citologia oncótica permitiram observar um efeito protetor contra a ocorrência de lesões em pacientes com o alelo G:01:01:02. Além disso, pudemos evidenciar pela primeira vez a associação do alelo G:01:04 à persistência da lesão em pacientes com citologia alterada. Quanto aos parâmetros clínicos, foi possível correlacionar o alelo G:01:05N a contagem de cels CD4>=350 cels/mm3. Em conjunto, esses dados contribuem para uma melhor compreensão sobre o impacto dos alelos do HLA-G em mulheres HIV/HPV positivas a fim de esclarecer o papel desses alelos na susceptibilidade e persistência do vírus HPV, além do desfecho clinico e de parâmetros associados a ele.
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ROLE OF HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN HLA-G IN INFECTION AND PERSISTENCE OF HPV IN A COHORT OF HIV + PREGNANT WO MEN IN RIO
DE JANEIRO
ABSTRACT- MASTER THESIS Brunna Luiza Misael Alves
Introduction : Persistent infection with human papillomavirus (HPV) is an intermediate step in the progression to high grade cervical intraepithelial neoplasia and to invasive cancer. It is believed that the gene of HPV and the host immune system are among the non-behavioral factors that determine the acquisition and persistence of infection. Patients with compromised immune systems have more severe intraepithelial lesions, more rapidly progression and a high recurrence rate, beside an increased risk for cervical cancer. By expressing HLAs -C ,-E and –G, capable of acting as inhibitory ligands of "natural killers" cells, the virus can establish infection avoiding the elimination of infected cells by the immune system . Because of its potential to modulate the im4mune response against HPV, recent studies have investigated polymorphisms at these loci that may be associated with susceptibility and persistence of the virus in the host. Objective: To molecularly characterize the alleles of HLA-G and analyze its association with acquisition and persistence of HPV in a population of HIV + pregnant women in Rio de Janeiro. Relate data from cytology, genotypes found and demographic and clinical risk factors with alleles found, besides correlating alleles with infection with different types, species, multiple infections and persistence of HPV infection. Material and Methods: We invited to participate in the study 140 HIV+ pregnant women followed at the HIV/aids of the Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira-UFRJ, Rio de Janeiro. From already extracted genomic DNA, was amplified by PCR a fragment comprising exons 2-4 of HLA-G. These products were then sequenced and analyzed to determine the alleles. For characterization of novel alleles and determination of heterozygosis in certain cases the cloning was performed, with subsequent cloning and analysis of the product. Results: Altogether, 126 patients were analyzed, totaling 22 alleles that compound 52 different genotypes. The variety of alleles observed is consistent with the high genetic diversity associated with the Brazilian population. In total we found 44% of the alleles described in the literature. The results showed an association between alleles G:01:03 and G:01:01:02 to protection against infection by species of the group B and C, respectively. Data on cytology allowed to observe a protective effect against the occurrence of lesions in patients with the allele G:01:01:02. Additionally, we demonstrate for the first time the association of the allele G:01:04 and persistence of the lesion in patients with abnormal cytology. Regarding clinical parameters, it was possible to correlate the allele G:01:05N to cels CD4 count >=350 cels/mm3. Together, these data contribute to a better understanding of the impact of the alleles of HLA-G in HIV/HPV positive women in order to clarify the role of these alleles in susceptibility and persistence of HPV, in addition to clinical outcome and it associated parameters.
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SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS................................................................................................. XI
LISTA DE FIGURAS................................................................................................. XII
LISTA DE ABREVIATURAS..................................................................................... XIII
3.2.1. Amplificação por PCR dos genes que codificam os domínios α1, α2 e α3 do HLA-G................................................................................................................ 39
3.2.2. Purificação dos produtos de PCR.............................................................. 40
3.2.3. Sequenciamento das regiões genômicas de interesse............................. 41
x
3.2.4. Edição, Alinhamento das sequências e definição dos alelos.................... 42
3.2.5. Clonagem de heterozigotos e investigação de novos alelos..................... 42
8.1. Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva................................................................................. 79
8.2. Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira...................................................................................... 80
8.3. Questionário aplicado as pacientes.............................................................. 81
Tabela 1.2.2.1. Característica das regiões gênicas do Papilomavírus Humano e suas
principais funções no hospedeiro...............................................................................19
Tabela 3.1.1: Perfil clínico-epidemiológico da amostragem estudada (n=140).........38
Tabela 3.2.1.1: Descrição dos iniciadores utilizados ................................................40
Tabela 4.1 . Informações dos seis alelos novos de HLA-G encontrados no estudo ..47
Tabela 4.2. Genótipos encontrados nas pacientes do estudo (n=126).....................48
Tabela 4.3 . Correlação entre os alelos de HLA-G e a infecção por diferentes tipos de HPV...........................................................................................................................50
Tabela 4.4. Correlação entre os genótipos de HLA-G e a infecção pelo HPV..........52
Tabela 4.5: Correlação entre os alelos de HLA-G e a presença de alterações citológicas (LSIL e/ou HSIL) ......................................................................................54
Tabela 8.4.1: Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a persistência da infecção pelo HPV.....................................................................................................82
Tabela 8.4.2. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a infecção pelo HPV ..........................................................................................................................82
Tabela 8.4.3. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a ocorrência de casos de múltipla infecção pelo HPV ........................................................................83
Tabela 8.4.4. Correlação entre os alelos de HLA-G e os casos de melhora citológica..................................................................................................................................83
Tabela 8.4.5 . Correlação entre os alelos de HLA-G e pacientes com contagem de cels TCD4>= 350 cels/mm3.......................................................................................84
Tabela 8.4.6. Correlação entre os alelos de HLA-G e pacientes com carga viral do HIV indetectável durante o período de estudo ..........................................................84
Tabela 8.4.7. Correlação entre os alelos de HLA-G e infecção pelo HPV-16...........85
Tabela 8.4.8. Correlação entre os alelos de HLA-G e infecção persistente pelo HPV-16 ..............................................................................................................................85
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1.1 : Prevalência mundial do HPV em mulheres com citologia normal........15
Figura 1.2.1.1: Relação entre incidência da infecção cervical pelo HPV, pré-câncer e câncer. ......................................................................................................................17
Figura 1.2.2.1: Reconstrução de uma partícula semelhante a vírus (VLP) de HPV-11 e fotomicrografia eletrônica da estrutura do papilomavírus humano observado ao microscópio eletrônico de transmissão .....................................................................18
Figura 1.2.3.1: Árvore filogenética de 100 tipos de papilomavírus humano. ............21
Figura 1.2.5.1: Prevalência da infecção pelo HPV e prevalência dos cinco tipos de alto risco mais frequentes entre mulheres com citologia normal nas diferentes regiões do mundo......................................................................................................23
Figura 1.4.1: Mapa da região HLA ...........................................................................25
Figura 1.4.2.1: Processamento alternativo e isoformas do HLA-G...........................27
Figura 1.4.2.2: Nomenclatura dos alelos de HLA-G. ................................................28
Figura 1.4.2.3: Funções imunorreguladoras mediadas pelo HLA-G, células-alvo e receptores .................................................................................................................29
Figura 1.4.4.1: Polimorfismos do HLA-G associados à infecção pelo HPV..............33
Figura 3.2.1.1 : Organização genômica do HLA-G....................................................39
Figura 4.1. Alinhamento da sequência da paciente 110 com a referência do HLA-G, destacando o pico duplo na posição 1381 ................................................................45
Figura 4.2. Alinhamento contendo os clones obtidos de HLA-G da paciente 121....46
Figura 4.3 . Frequências alélicas dos variantes de HLA-G encontrados no estudo com valor superior a 3%............................................................................................49
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LISTA DE ABREVIATURAS
°C- graus Celsius
CD8+- do inglês cluster of direferentiation 8 (grupamento de diferenciação 8)
CDC – NPIN- Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos, do inglês Center for Disease Control and Prevention- National Prevention Information Network-
DNA- ácido desoxirribonucléico
dNTP- trifosfato de desoxirribonucleotídeo
DST- doenças sexualmente transmissíveis
GM-CSF - fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos
HAART- Terapia Antirretroviral Altamente Ativa, do inglês High Active Antiretroviral Therapy
HIV- vírus da imunodeficiência humana
HLA – Antígeno Leucocitário Humano
HPV- Papiloma Vírus Humano (do inglês Human Papillomavirus)
HR-HPV- HPV de alto risco oncogênico (do inglês High Risk)
HSIL- lesões escamosas intraepiteliais de alto grau
HWV- do inglês human wart vírus
IARC- Internacional Agency for Research on Cancer
ICO- Institut Català d'Oncologia
ICTV- Comitê Internacional para a Taxonomia dos Vírus
IFN- Interferon
IL- Interleucina
ILT-2- Immunoglobuline-Like Transcripts
INCA- Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva
IPPMG- Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira
Kb- Quilobase
KV- Quilovolt
LB- Meio de cultura Luria-Bertani Broth
LIF- Fator inibitório de leucócitos
LR-HPV- HPV de baixo risco oncogênico (do inglês Low Risk)
xiv
LSIL- Lesões escamosas intraepiteliais de baixo grau
LT-α- Linfotoxina alfa
LT-β- Linfotoxina beta
MgCl2- cloreto de magnésio
Min- minuto
ml- mililitro
NaOH- hidróxido de sódio
NK- do ingles Natural Killer
OMS- Organização Mundial da Saúde
pb- pares de base
PBS- tampão fosfato salina
PCR- reação em cadeia da polimerase
rpm- rotação por minuto
seg- segundo
TCD4+- linfócitos T CD4 positivos
TCD8+- linfócitos T CD8 positivos
TH1- Linfócitos T helper perfil 1
Th2- Linfócitos T helper perfil 2
TNF-α- Fator de Necrose Tumoral α
UFRJ- Universidade Federal do Rio de Janeiro
WHO- World Health Organization
ηg- nanograma
µg- micrograma
µL- microlitro
µFD- Microfarad
ρmol- picomol
Ω- Ohm
15
1. INTRODUÇÃO
1.1. Epidemiologia do Câncer de colo uterino e do P apilomavírus Humano
O papilomavírus humano (HPV, do inglês Human Papillomavirus) é
atualmente uma das infecções virais sexualmente transmitida mais comuns em todo
o mundo. Estima-se que 11,4% das mulheres na população geral mundial estejam
infectadas pelo vírus (WHO/ICO, 2010) (Fig. 1.1.1). Estudos realizados com
mulheres com câncer cervical apontaram a presença do vírus em praticamente
100% dos casos (WALBOOMERS et al., 1999).
Figura 1.1.1: Prevalência mundial do HPV em mulheres com citologia normal (Modificado de
WHO/ICO, 2010).
O câncer do colo do útero é o segundo tipo de câncer mais comum na
população feminina mundial. Estima-se que em 2008, mais de 530 mil novos casos
(aproximadamente 86% desses em regiões menos desenvolvidas) e mais de 275 mil
óbitos ocorreram em todo o mundo devido a esse tipo de câncer (WHO/ICO, 2010).
Projeções globais estimam que em 2030 os novos casos de câncer cervical irão
aumentar para 770 mil (BOSCH et al., 2013).
No Brasil, esperam-se 15.590 novos casos para o ano de 2014, o que o torna
o terceiro em prevalência dos casos de câncer no país. Entretanto, tal distribuição é
bastante heterogênea: enquanto a taxa de incidência estimada para a região
Sudeste é de aproximadamente 10 casos para cada 100.000 mulheres no ano de
16
2014, na região Norte estimam-se 24 casos para cada 100.000 mulheres (INCA,
2014).
Diversos estudos têm mostrado que a infecção por HPV é significativamente
mais comum em mulheres infectadas pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV).
A prevalência da infecção pelo HPV nesta população varia de 44 a 98%
(GONCALVES et al., 1999; LEVI et al., 2002a; LEVI et al., 2004; CAMPOS et al.,
2005; LEIBENSON et al., 2011; LUZ et al., 2012; GARBUGLIA et al., 2012).
1.2. O papilomavírus humano
1.2.1. Descrição, história natural e aspectos clíni cos
A utilização da microscopia eletrônica – a partir da década de 1930 – e do
cultivo de células – na década de 1940 – possibilitou um grande avanço na virologia.
Em 1949, Maurice Strauss e outros pesquisadores da Escola de Medicina da
Universidade de Yale, usando um microscópio eletrônico, observaram partículas
semelhantes aos vírus em amostras retiradas de papilomas da pele (STRAUSS et al.,
1949). O vírus então foi denominado de HWV (do inglês human wart virus), mas
apenas em 1965 dois grupos caracterizaram o material genético viral (CRAWFORD,
1965; KLUG e FINCH, 1965). Em 1975, o Comitê Internacional para a Taxonomia
dos Vírus (ICTV – International Committee on Taxonomy of Viruses) decidiu chamá-
lo de HPV – papillomavírus humano. Em 1983, foram isolados, pelo grupo do
pesquisador Harald zur Hausen, dois importantes genótipos do HPV, a partir de
tecido de biopsias de câncer cervical (DURST et al., 1983; BOSHART et al., 1984).
O pico de infecção em homens e mulheres ocorre logo após a primeira
exposição sexual, o que faz com que as maiores taxas de prevalência da infecção
sejam associadas a indivíduos com menos de 25 anos, diminuindo ao longo do
tempo em diversas populações. Estima-se que aproximadamente 75% da população
sexualmente ativa entrará em contato com um ou mais tipos de HPV durante sua
vida (KOUTSKY, 1997; TROTTIER e FRANCO, 2006).
A transmissão do vírus ocorre através do contato do epitélio ou da mucosa
infectada com outra região mucosa ou epitelial. Além da transmissão sexual, pode
ocorrer a transmissão perinatal da infecção (BURCHELL et al., 2006). O HPV possui
17
um tropismo por células epiteliais cutâneas ou mucosas da camada basal, na qual
penetra através de microlesões presentes nessa região.
Diferente da maioria das infecções genito-urinárias, a infecção pelo HPV não
está usualmente associada a sintomas imediatos como dor, prurido, queimação e
corrimento vaginal (MAO et al., 2003). A maioria dos casos permanece sem
sintomas clínicos ou produzem lesões não aparentes (ZUR HAUSEN, 1996). A
forma clínica da infecção apresenta verrugas genitais, caracterizadas por sua
elevada transmissibilidade e recorrência comum (FERENCZY et al., 1985).
Estudos revelam que até 90% das infecções pelo HPV são eliminadas ou
suprimidas a níveis indetectáveis após 12 a 24 meses, enquanto os outros 10%
serão infecções persistentes, com um risco aumentado de desenvolvimento do
câncer cervical. Apenas 1,5% dos indivíduos com infecção persistente irão
desenvolver câncer cervical após vários anos da infecção (HO et al., 1998; FRANCO
et al., 1999; SCHIFFMAN et al., 2011) (Fig. 1.2.1.1).
Figura 1.2.1.1: Relação entre incidência da infecção cervical pelo HPV, pré-câncer e câncer. A curva
azul representa o pico de prevalência de infecções transitórias pelo HPV, que ocorre entre as
mulheres após o início da atividade sexual. O pico de prevalência das lesões pré-cancerosas (curva
verde) ocorre cerca de dez anos depois. O pico de prevalência do câncer do colo do útero (curva
vermelha) reflete o intervalo relativamente longo entre a lesão pré-cancerosa e o câncer (Modificado
de SCHIFFMAN et al., 2005).
As lesões escamosas intraepiteliais associadas ao vírus vêm sendo
18
classificadas desde 1988 pelo sistema de Bethesda, o qual introduziu duas
terminologias, LSIL (lesões escamosas intraepiteliais de baixo grau) e HSIL (lesões
escamosas intraepiteliais de alto grau), para classificar a diversidade de
anormalidades escamosas cervicais não-invasivas. A classificação foi mantida após
o Workshop de Bethesda de 2001. Essa divisão reflete evidências virológicas,
moleculares e clínicas de que LSIL é uma infecção pelo HPV geralmente eliminada
de 6 a 12 meses após o aparecimento, enquanto HSIL está mais frequentemente
associado à persistência viral e a um maior risco de progressão (ZUR HAUSEN,
2000).
Cabe destacar que a persistência de tipos de HPV de alto risco é necessária,
mas não suficiente para a progressão para o câncer (WALBOOMERS et al., 1999).
A persistência é definida como infecções detectadas mais de uma vez em um
intervalo de seis meses ou mais. Além dela, outros fatores estão envolvidos na
progressão da doença, como a variabilidade tanto do genoma do hospedeiro quanto
do DNA viral e co-fatores como o estilo de vida do indivíduo, o DNA viral circulante,
co-infecções por múltiplos tipos de HPV e co-infecções por outros agentes.
1.2.2. Partícula viral, genoma e ciclo replicativo
O papilomavírus pertence à família Papillomaviridae, composta por vírus não
envelopados, com cerca de 50-55 nm de diâmetro e capsídeo formado por duas
proteínas, L1 e L2, que se organizam em 72 subunidades (capsômeros) num arranjo
icosaédrico (Fig. 1.2.2.1).
Figura 1.2.2.1: Reconstrução de uma partícula semelhante a vírus (VLP) de HPV-11 feito em
colaboração com Merck & Co. disponível em http://nramm.scripps.edu/hpv-type-11-vlp/ (esquerda) e
fotomicrografia eletrônica da estrutura do papilomavírus humano observado ao microscópio eletrônico
de transmissão (direita), disponível em www.cdcnpin.org/scripts/std/std.asp#1e.
19
O HPV possui um DNA genômico circular de dupla fita de aproximadamente
8000 pb, que pode ser divido em três regiões: precoce ou E (early), responsável pela
patogenicidade (E1-E8); tardia ou L (late), que codifica as proteínas estruturais L1 e
L2; e uma região não-codificante, contendo elementos genéticos para replicação e
transcrição do genoma viral (Tabela 1.2.2.1) (SCHEFFNER et al., 1994; ZUR
HAUSEN, 2002; HOORY et al., 2008).
Tabela 1.2.2.1. Característica das regiões gênicas do Papilomavírus Humano e suas principais
funções no hospedeiro. Adaptado STANLEY et al., 2007.
Genes Função Principal E6 Ligação e degradação de p53, transformação celular
E7 Ligação a proteína retinoblastoma (pRB), desregulação da checagem do
ciclo em G1/S, transformação celular; coopera com E6 para imortalização celular
E1 Helicase, ATPase, essencial para replicação do DNA viral
E2 Regulação da transcrição viral. Liga-se a E1 para facilitar início da
replicação do DNA E3/E8 Função desconhecida
E4 Ligação e desarranjo da citoqueratina E5 Transformação celular, interação com receptores do fator de crescimento L1 L2
Proteína primária do capsídeo viral Proteína secundária do capsídeo viral
O genoma viral pode permanecer de duas formas dentro da célula, epissomal
e linear. A forma epissomal está presente nos estágios precoces da infecção, se
localiza dentro do núcleo da célula, sob a forma circular, e não está integrada ao
genoma. Já a forma linear é observada com frequência nas infecções por tipos de
HPV associados ao câncer cervical e representa o DNA do vírus integrado a um
cromossomo do hospedeiro (VILLA, 1997), através de uma quebra na região de E2
(DOORBAR, 2006).
O vírus infecta exclusivamente células epiteliais indiferenciadas da camada
basal (por serem as únicas células em divisão ativa) após essa ter sido exposta
através de feridas ou abrasões. O DNA viral é mantido na forma epissomal no
núcleo das células epiteliais basais com baixo número de cópias, variando de 50 a
100 cópias por célula (HEBNER e LAIMINS, 2006). Nessa fase inicial da infecção as
proteínas virais são expressas em baixos níveis e confinadas principalmente ao
núcleo (DOORBAR, 2005). A expressão desses genes é fortemente controlada
durante a diferenciação dos queratinócitos e aumenta apenas quando esses migram
20
para as camadas superiores do epitélio. Nessa etapa, a expressão de todos os
genes virais é induzida a fim de acelerar a replicação do genoma viral, aumentando
o número de cópias virais para milhares de cópias por célula (DOORBAR, 2006;
HEBNER e LAIMINS, 2006). O estágio final da infecção leva ao empacotamento dos
genomas amplificados em partículas infecciosas formadas pelas proteínas virais L1
e L2, que são liberadas na forma de capsídeos icosaédricos. Novas partículas virais
são produzidas dentro da camada superior do epitélio e eliminadas através do
processo natural de liberação das células epiteliais que ocorre ao fim do seu ciclo de
vida (DOORBAR, 2006).
1.2.3. Classificação molecular do HPV
Variações na sequência genômica do HPV permitem a classificação dos vírus
em diferentes níveis taxonômicos: gêneros, espécies e tipos; além disso, variações
no genoma completo ainda diferenciam os tipos em subtipos e variantes (DE
VILLIERS et al., 2004). O HPV é dividido em cinco gêneros: Alfapapillomavirus,
Betapapillomavirus, Gamapapillomavirus, Mupapillomavirus e Nupapillomavirus (Fig.
1.2.3.1). Diferentes gêneros possuem identidade menor que 60% entre as
sequências nucleotídicas do gene L1. O gênero Alfapapillomavirus é o principal
responsável pelas lesões em mucosas, incluindo as anogenitais, enquanto os
demais infectam principalmente regiões cutâneas (BERNARD et al., 2010).
Os gêneros ainda são divididos em espécies, que apresentam de 60 a 70%
de identidade no gene L1 (DE VILLIERS et al., 2004). Dois tipos diferem entre si
quando a sequência do gene L1, que é a mais conservada do genoma viral, possui
mais de 10% de divergência nessa região ( DE VILLIERS et al., 2004; BERNARD et
al., 2010). Atualmente, os vírus estão agrupados em 189 tipos identificados por
números de acordo com a ordem de sua descoberta, dos quais 151 afetam humanos
(BERNARD et al., 2010). Por sua vez, os subtipos são definidos considerando o
genoma completo com 2 a 10% de diferenças em relação a outro tipo. Por fim, o
HPV é dividido em variantes, que possuem menos de 2% de diferença no genoma
completo (DE VILLIERS et al., 2004). Poucos tipos são classificados em variantes, e
cada tipo possui uma nomenclatura de variantes diferente (CHEN et al., 2011).
21
Figura 1.2.3.1: Árvore filogenética de 100 tipos de papilomavírus humano. Em laranja estão
destacados os tipos de alto risco do gênero alfa (IARC, 2012)
1.2.4. Classificação do HPV quanto ao potencial onc ogênico
Uma outra forma de classificação do vírus se baseia no potencial oncogênico,
sendo este estabelecido considerando a frequência em diversos estudos
epidemiológicos dos diferentes tipos do HPV envolvidos no desenvolvimento do
câncer cervical. Foram definidos os grupos de HPV de alto risco ou HR-HPV (High
Risk) e de baixo risco ou LR-HPV (Low Risk).
Em 2003, Muñoz e colaboradores dividiram os vírus em alto risco (HPV 16,
seguindo o protocolo do fabricante. Para cada reação utilizou-se de 5 a 20 ng de
DNA purificado, 1 µL (5 ρmol/mL) de cada iniciador, 1 µL de Big Dye, 1,5 µL de
tampão de sequenciamento 5x e água ultrapura para um volume final de 10 µL por
reação. As reações foram feitas em termociclador nas seguintes condições: 35 ciclos
de 96ºC por 10 segundos (desnaturação), 50º C por 5 segundos (anelamento) e
60ºC por quatro minutos (extensão).
A precipitação foi feita adicionando-se 80 µL de isopropanol a 75%, seguida
da incubação por 15 minutos a temperatura ambiente e posterior centrifugação por
45 minutos a 4ºC. Após o sobrenadante ser eliminado, foi realizada uma lavagem
com etanol a 70% e centrifugação por 5 minutos a temperatura ambiente.
Desprezou-se cuidadosamente o sobrenadante e o DNA foi ressuspendido em 10 µL
de formamida. As amostras foram sequenciadas em um aparelho ABI3130xl (Life
Technologies, Carlsbad, EUA).
42
3.2.4. Edição, Alinhamento das sequências e definiç ão dos alelos
Os eletroferogramas obtidos a partir de cada iniciador foram agrupados e
editados manualmente no programa “DNASTAR Lasergene 7” (DNAstar, Wisconsin,
EUA), com a ferramenta “SeqMan”, gerando uma sequência-consenso. Os
consensos gerados e as sequências-referência para todos os alelos descritos
retiradas do banco de dados IMGT/HLA
(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/ipd/imgt/hla/G_gen.fasta) foram alinhados no
programa Bioedit (HALL et al., 1999) para definição dos alelos. O site especifica
todas as sequências utilizadas como referência, sendo única para cada alelo, com
seus respectivos números de acesso, nome do alelo e tamanho do fragmento. A
definição foi baseada em análises de similaridade das sequências com as
referências através de uma inspeção visual.
Amostras heterozigotas que não puderam ser definidas seja por suspeita de
novos alelos quanto pela presença de picos duplos em posições definidoras de
alelos, foram submetidas à clonagem a fim de definir os alelos presentes.
3.2.5. Clonagem de heterozigotos e investigação de novos alelos
As reações de clonagem usaram o conjunto de reagentes do “TOPO® TA
Cloning® Kit for Sequencing” (Life Technologies, Estados Unidos) seguindo
instruções do protocolo do fabricante. Este se baseia no fato de que os produtos de
PCR amplificados com a enzima Taq® frequentemente possuem uma adenosina
projetada nas extremidades 3’, dessa forma o sistema de clonagem T-A possui uma
sequencia com timinas complementares projetadas para se ligarem ao fragmento de
interesse amplificado pela PCR.
Como o tamanho do inserto (aproximadamente 1800 pb) dificultou a
realização da clonagem da sequência completa em um único experimento, optamos
por dividir nossa região de interesse em dois fragmentos com cerca de 1300 pb
cada, o que confere uma região de sobreposição entre esses fragmentos de cerca
de 600 pb. Dessa forma cada amostra teve de ser clonada em duas reações
diferentes. Os produtos utilizados nessas reações foram obtidos através de uma
reação de PCR semi-aninhada a partir do produto de PCR obtido inicialmente para
ser utilizado no sequenciamento direto. Nessas novas reações foram utilizados os
iniciadores G25 e G3R em uma reação e G26 e G4R em outra. As condições da
PCR foram semelhantes as já descritas.
43
Na primeira etapa da clonagem, a 4 µl produto de PCR foi adicionado 1 µl de
TOPO Cloning Vector e 1 µl de Salt Solution diluído quatro vezes. Essa reação foi
incubada por 30 minutos em temperatura ambiente. As reações de ligação (2 µl)
foram adicionadas em 50 µL de células eletrocompetentes “Gene Hogs” (Life
Technologies, EUA). Em seguida, as amostras foram transferidas para uma cubeta
de eletroporação de 0,2 cm e submetidas a um choque elétrico (Capacitância 25
µFD, resistência 200Ω-500 Ω, voltagem 2,5 KV). Após o choque, em cada tubo
foram adicionados 400 µl de meio SOC (contido no kit). Posteriormente as bactérias
incubadas foram incubadas para recuperação a 37°C por 1 hora no agitador (LAB-
LINE Incubator-Shaker, ORBIT, modelo 3525, EUA). Após o período de recuperação
das bactérias, a cultura líquida foi plaqueada em meio LB ágar contendo o antibiótico
de seleção.
A reação de transformação foi dividida em duas partes iguais e cada metade
foi colocada em uma placa com meio sólido contendo ampicilina, totalizando duas
placas por vírus clonado. Usando uma alça de vidro previamente flambada em
álcool, a transformação foi espalhada em ambas às placas que foram incubadas na
estufa (REVCO\Lindberg, modelo RCO3000TABA, EUA) a 37°C por 12-16 horas.
Para cada placa foram selecionadas aleatoriamente no mínimo 20 colônias. A
confirmação de que os clones continham o inserto de interesse foi feita através de
PCR de colônia ajustados para um volume final de 25 µL, utilizando-se os
iniciadores M13 senso (5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’) e anti-senso (5’-
CAGGAAACAGCTATGAC-3’) fornecidos pelo kit. Cada colônia foi tocada com uma
ponteira de micropipeta estéril e colocada na mistura da PCR. A ciclagem utilizada
foi similar a da PCR aninhada, descrita anteriormente, somente alterando a
temperatura de anelamento para 55°C por trinta segundos. Para cada amostra,
foram incluídos controles negativos contendo apenas os reagentes utilizados na
PCR para verificar a presença de contaminantes. Posteriormente, foi verificada a
existência do inserto desejado em gel de agarose 1%. Confirmada a presença do
inserto, o produto foi purificado, sequenciado, editado e analisado como descrito
anteriormente.
3.3. Análises Estatísticas
Para as análises de correlação dos alelos do HLA-G com a susceptibilidade à
44
infecção e à persistência do HPV, foram utilizados os conjuntos HLA G:01:01:01
(que abrange os alelos G:01:01:01:01/02 e G:01:01:01:03/04/05), G:01:01:02 (com
os alelos G:01:01:02:01 e G:01:01:02:02), G:01:03 (G:01:03:01:02) e G:01:04 (que
inclui os alelos G:01:04:01, G:01:04:04 e G:01:04:05). A estimativa do efeito de cada
alelo na infecção foi feita comparando os indivíduos testados positivamente para a
presença de um determinado alelo com indivíduos que não o possuem. Foram feitos
testes para inúmeros desfechos clínicos e características da infecção.
Além disso, as espécies do HPV foram compiladas em três grupos baseados
nas análises filogenéticas feitas por de Villiers e colaboradores, 2004, como
proposto por Ferguson e colaboradores, 2012. O grupo A incluiu as espécies 1, 8, 10
e 13; o grupo B incluiu as espécies 5, 6, 7, 9 e 11; e o grupo C incluiu as espécies 2,
3, 4 e 15. O grupo B compreende os tipos de HPV com alto risco oncogênico,
enquanto os grupos A e C são formados por tipos de baixo risco.
A frequência dos alelos presentes na casuística foi determinada por contagem
direta. As associações entre os alelos e os diferentes desfechos foram investigados
através do valor de odds ratio (OR) e 95% de Intervalo de Confiança (IC) obtido
através da análise de regressão logística ajustada por diferentes fatores no
programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, Armonk, NY: IBM
Corp).
Os ajustes foram feitos testando-se a influência dos fatores de risco
associados ao HPV como o número de parceiros sexuais ao longo da vida,
tabagismo, número de gestações, uso de anticoncepcional, múltipla infecção e idade
da primeira relação sexual com o desfecho final a ser considerado na análise.
O teste Qui-quadrado com distribuição de Poisson foi usado para avaliar
associações entre as variáveis categóricas. Um valor de p ≤ 0,05 foi considerado
como estatisticamente significativo e os valores menores que 0,1 foram
considerados como uma tendência de associação. Todas as análises estatísticas
foram feitas em colaboração com a Profa. Dra. Anke Bergmann.
45
4. RESULTADOS
Todas as 140 pacientes arroladas no estudo tiveram a região genômica do
HLA-G amplificada e sequenciada. Dessas, apenas 14 não puderam ter o seu alelo
definido devido ao tamanho insuficiente do fragmento sequenciado. As outras 126
pacientes foram analisadas e tiveram seu alelo definido através da similaridade entre
as sequências obtidas e sequências-referência de cada alelo retiradas do banco de
dados IMGT/HLA. Cabe destacar que durante as análises dos eletroferogramas
foram observados picos duplos nas sequências, indicativo de heterozigose de
determinadas amostras (Fig. 4.1).
Figura 4.3.3.1. Alinhamento da sequência obtida com o iniciador G4R da paciente 110 com a
referência do HLA-G, destacando o pico duplo na posição 1381 (cujo nucleotídeo está destacado em
vermelho na sequência consenso gerada). A visualização do alinhamento foi feita no programa
Seqman (DNA Star).
Para serem classificadas, as sequências obtidas das pacientes deveriam
possuir total similaridade à sequência-referência de determinado alelo, caso
contrário levantou-se a possibilidade da presença de um novo alelo, fato confirmado
apenas após a realização da clonagem. Das quatorze amostras clonadas, foram
identificados seis alelos novos (não descritos na base de dados) (Tabela 4.1),
presentes em sete indivíduos, e esclarecidos sete genótipos heterozigotos que não
puderam ser definidos através do sequenciamento direto das amostras.
As amostras foram clonadas em dois fragmentos, totalizando 28 reações de
clonagem. De cada reação foram selecionadas em média 15 colônias (6-20). Para a
determinação dos alelos presentes nesses indivíduos foram feitos alinhamentos
contendo as sequências obtidas a partir dos clones de ambos os fragmentos, as
sequências utilizadas como referência para cada alelo e a sequência obtida através
do sequenciamento direto da amostra, permitindo assim a verificação da presença
46
de clones contendo os dois nucleotídeos presentes nos picos duplos, como pode ser
visualizado na figura 4.2.
Figura 4.3.3.2. Alinhamento contendo os clones obtidos de HLA-G da paciente 121. Destacado pela
seta vermelha está a troca G para C na posição 1249, definidora do novo alelo por distingui-lo do
HLA:G*:01:01:02:01. As referências iniciam com HLA:G*, a sequência obtida através do
sequenciamento direto está identificada como 121HLA-G e os demais representam os clones obtidos.
A sequência definida como modelo do novo alelo está nomeada como AN121-5 HLA-G F1.
A localização das mudanças nucleotídicas identificadas nos seis novos alelos
encontrados no estudo estão especificadas na Tabela 4.1.
47
Tabela 4.1 . Informações dos seis alelos novos de HLA-G encontrados em heterozigose no estudo
Número de
pacientes
contendo o
novo alelo
Denominação
utilizada no
estudo
ID das pacientes
Troca
nucleotídica
(Posição)*
Localização
Genômica no
gene HLA-G
4 A 2, 114, 121, 125 G1249C Íntron 3
1 B 28
G294A;
C503T
C901G
Íntron 2
Éxon 3
Íntron 3
1 C 91 C89T Éxon 2
1 D 98 G707A Éxon 2
1 E 54 C278T Íntron 2
1 F 54 A76T Éxon 2
*A posição foi definida com base na classificação do banco de dados IMGT/HLA. A paciente 54 é um
heterozigoto com 2 alelos novos.
Os novos alelos encontrados ainda serão submetidos ao Comitê de
Nomenclatura da Organização Mundial da Saúde a fim de validar os novos alelos e
incorporá-los ao banco de dados mundial IMGT/HLA.
Foi possível identificar 52 genótipos nessa casuística, todos representados na
Tabela 4.2. Além disso, 41 pacientes foram identificadas como homozigotos no gene
HLA-G, abrangendo um total de oito genótipos. Cabe destacar a presença de um
alelo novo em específico que foi observado em quatro indivíduos compondo três
diferentes genótipos.
48
Tabela 4.2. Genótipos encontrados nas pacientes do estudo ordenados por ocorrência (n=126)
As letras de A-F presentes na tabela representam os novos alelos encontrados como definido na tabela 4.1; em roxo está destacado o novo alelo que pode ser encontrado em três genótipos diferentes. Os demais novos alelos foram encontrados em apenas um individuo e, portanto, cada um representa um novo alelo único.
Os genótipos encontrados na casuística compreendem vinte e dois diferentes
alelos de HLA-G dos cinquenta descritos até o momento. Aqueles com frequência
Figura 4.3.3.3 . Frequências alélicas dos variantes de HLA-G encontrados no estudo com valor
superior a 3%. A classe “Novos” abrange todos os seis novos alelos identificados. A classe “Outros”
se refere à soma da frequência dos alelos G:01:01:02:02, G:01:01:05, G:01:01:06, G:01:03:01:02,
G:01:04:05 e G:01:06 (Com freqüência individual abaixo de 3%).
Para as análises de correlação dos alelos do HLA-G com a susceptibilidade à
infecção e à persistência do HPV, foram utilizados os alelos HLA G:01:01:01,
G:01:01:02, G:01:03, G:01:04 e G:01:05N, descritos como os mais frequentes
mundialmente e encontrados nesse estudo com frequência acima de 4%. As
análises de regressão logística indicaram que os principais fatores de ajuste a serem
considerados foram a idade e pertencer ou não ao grupo previamente definido de
mulheres com alto risco de exposição ao vírus.
A Tabela 4.3 representa a relação entre a presença/ausência dos alelos e a
infecção pelos respectivos grupos de HPV definidos previamente (vide seção
“Análises estatísticas” em Material e Métodos), destacando-se o efeito protetor
exercido por dois diferentes alelos. O estudo mostrou que o alelo G:01:03 pôde ser
associado à proteção contra a infecção por espécies de HPV do grupo B (alto risco
oncogênico) e o alelo G:01:01:02 pôde ser associado à proteção contra a infecção
por espécies do grupo C (baixo risco oncogênico).
50
Tabela 4.3 . Resultados obtidos através de análises de regressão logística ajustada por idade mostrando a correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a infecção por diferentes tipos de HPV durante o período de estudo.
Grupo A: espécies de HPV 1, 8, 10 e 13; Grupo B: espécies de HPV 5, 6, 7, 9, 11; Grupo C: espécies de HPV 2, 3, 4 e 15. As associações significativas estão destacadas em vermelho. A presença do alelo se refere à soma de indivíduos homozigotos e heterozigotos (quando aplicável). A positividade para a infecção em um determinado grupo representa a presença de ao menos um tipo de HPV pertencente a alguma das espécies abrangidas no respectivo grupo.
51
A fim de melhor investigar as associações encontradas relacionando os alelos
com a infecção pelo HPV, fizemos novas análises considerando o genótipo de HLA-
G das amostras. Além disso, essa nova análise foi dividida em duas etapas: uma
onde foi feito apenas o ajuste da idade e outra ajustada para a idade e o alto risco
de exposição ao vírus. Dessa forma, foi analisada a ausência do alelo versus casos
de pacientes homozigotos com o alelo versus casos de pacientes heterozigotos com
o alelo. Cabe destacar que o alelo G:01:03 foi encontrado na nossa casuística
apenas na forma heterozigota, o que impossibilitou sua subdivisão. Nessa nova
análise não tivemos nenhuma significância estatística, entretanto encontramos uma
tendência de associação do genótipo homozigoto G:01:05N com o aumento do risco
de infecção por espécies de HPV do grupo C (Tabela 4.4).
52
Tabela 4.4. Resultados obtidos através de análises de regressão logística ajustada por idade e por alto risco de exposição ao vírus HPV evidenciando a
correlação entre os genótipos de HLA-G encontrados e a infecção durante o período de estudo.
Grupo A Grupo B Grupo C
Alelo
p OR* p ARE OR ARE p OR p ARE OR ARE p OR p ARE OR ARE
G:01:01:01
Heterozigoto 0,294 0,465 (0,111-1,946)
0,302 0,472 (0,113-1,968)
0,155 0,541 (0,232-1,261)
0,149 0,535 (0,229-1,252)
0,191 1,964 (0,715-5,398)
0,193 1,957 (0,713-5,375)
Homozigoto 0,408 1,881 (0,421-8,396)
0,435 1,819 (0,404-8,183)
0,468 0,638 (0,189-2,149)
0,436 0,615 (0,181-2,088)
0,236 2,267 (0,585-8,788)
0,249 2,226 (0,571-8,680)
G:01:01:02
Heterozigoto 0,290 0,321 (0,039-2,631)
0,301 0,329 (0,040-2,706)
0,683 0,817 (0,311-2,148)
0,701 0,828 (0,314-2,179)
0,118 0,295 (0,064-1,362)
0,121 0,298 (0,064-1,377)
Homozigoto 0,731 0,684 (0,078-5,996)
0,722 0,673 (0,076-5,931)
0,333 2,193 (0,448-10,745)
0,335 2,186 (0,445-10,726)
0,999 0 0,999 0
G:01:04
Heterozigoto 0,977 1,021 (0,250-4,166)
0,937 1,059 (0,254-4,419)
0,386 1,530 (0,585-4,000)
0,328 1,622 (0,615-4,280)
0,898 1,071 (0,376-3,055)
0,836 1,120 (0,385-3,261)
Homozigoto 0,097 4,820 (0,753-30,853)
0,124 4,491 (0,662-30,472)
0,901 0,894 (0,154-5,201)
0,806 0,799 (0,134-4,778)
0,918 0,890 (0,097-8,176)
0,862 0,818 (0,086-7,832)
G:01:05N
Heterozigoto 0,949 0,931 (0,106-8,165)
0,938 0,917 (0,103-8,127)
0,471 0,612 (0,161-2,328)
0,470 0,611 (0,160-2,328)
0,297 2,164 (0,507-9,233)
0,298 2,166 (0,506-9,276)
Homozigoto 0,306 3,464 (0,321-37,316)
0,270 3,861 (0,349-42,645)
0,999 - 0,999 - 0,103 5,443 (0,711-1,657)
0,094 5,761 (0,742-44,695)
Grupo A: espécies de HPV 1, 8, 10 e 13; Grupo B: espécies de HPV 5, 6, 7, 9, 11; Grupo C: espécies de HPV 2, 3, 4 e 15. ARE- refere-se a um grupo apenas com mulheres sob Alto Risco de Exposição ao Vírus HPV * A OR é definida em relação às pacientes negativas para o alelo em questão, definida como = 1.
53
Como não foi encontrada associação entre a família G:01:01:01 e a infecção pelo
HPV em nenhum dos três grupos, a análise foi repetida considerando-se apenas o alelo
G:01:01:01:01/02 (presente em 25% da casuística), que codifica para a mesma proteína
que o alelo G:01:01:01:03/04/05, já que os últimos dígitos separados pelas barras
representam apenas alterações nucleotídicas presentes em uma região de íntron não
incluída no nosso estudo, o que prejudica a definição do alelo com oito dígitos. A
análise mostrou a associação do alelo G:01:01:01:01/02 com a proteção contra a
infecção por espécies do grupo C (p= 0,033; OR 2,729 (IC 95% 1,082-6,887)).
Em vista do fato de que o HPV 16 foi o mais frequentemente encontrado em
nossa casuística (n = 44, 35%), analisamos também a associação de alelos de HLA-G
com a infecção por este tipo viral. Entretanto, os resultados não apontaram nenhuma
N° de parceiros sexuais: ( ) 1 até 3 ( ) 4 ou mais ( ) Profissionais do sexo
Gesta - Para - Aborto -
DST prévia: ( ) Ausente ( ) Presente
( ) Condom pregresso ( ) Condom atual
( ) Anticoncepcional atual ( ) Anticoncepcional pregresso
( ) Diu atual ( ) Diu pregresso Método contraceptivo:
( ) Outro método -___________________
82
8.4. Tabelas estatísticas
Tabela 8.4.1: Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a persistência da infecção pelo vírus HPV durante o período de estudo, obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus (ARE). Destacado em negrito está a tendência de significância observada na análise.
Persistência Persistência ARE Alelo
OR (IC 95%) P OR (IC 95%) P
G:01:01:01 0,751
(0,308-1,831) 0,529
0,704
(0,285-1,739) 0,447
G:01:01:02 0,485
(0,165-1,429) 0,190
0,486
(0,164-1,444) 0,194
G:01:03 0,966
(0,191-4,872) 0,967
1,077
(0,211-5,494) 0,929
G:01:04 2,041
(0,799-5,216) 0,136
2,299
(0,877-6,028) 0,091
G:01:05N 1,863
(0,521-1,155) 0,338
1,967
(0,547-7,075) 0,300
Tabela 8.4.2. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a infecção pelo vírus HPV durante o período de estudo, valores de OR obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus.
Eliminação viral Eliminação viral ARE Alelo
OR (IC 95%) P OR (IC 95%) P
G:01:01:01 0,971
(0,461-2,046) 0,939
0,984
(0,466-2,078) 0,966
G:01:01:02 1,296
(0,578-2,906) 0,529
1,290
(0,575-2,895) 0,537
G:01:03 1,592
(0,464-5,467) 0,46
1,552
(0,449-5,358) 0,487
G:01:04 0,807
(0,351-1,858) 0,615
0,788
(0,340-1,822) 0,577
G:01:05N 0,789
(0,232-2,688) 0,705
0,779
(0,228-2,659) 0,690
83
Tabela 8.4.3. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a ocorrência de casos de múltipla infecção pelo vírus HPV durante o período de estudo, os valores de OR foram obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus (ARE).
Tabela 8.4.4. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e os casos de melhora identificados por colposcopia durante o período de estudo, valores de OR obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade.
Múltipla Infecção
Alelo OR
(IC 95%) P
OR ARE
(IC 95%) P ARE
G:01:01:01 0,789
(0,293-2,128) 0,640
0,790
(0,291-2,144) 0,643
G:01:01:02 0,927
(0,302-2,848) 0,895
0,914
(0,297-2,813) 0,876
G:01:03 0,394
(0,046-3,350) 0,394
0,374
(0,044-3,172) 0,367
G:01:04 1,055
(0,363-3,063) 0,922
1,026
(0,353-2,979) 0,963
G:01:05N 2,524
(0,694-9,178) 0,160
2,496
(0,685-9,091) 0,165
Melhora citológica Alelo
OR (IC 95%) P
G:01:01:01 1,065
(0,332-3,415) 0,915
G:01:01:02 0,193
(0,024-1,559) 0,123
G:01:03 3,018
(0,678-13,434) 0,147
G:01:04 0,639
(0,163-2,506) 0,521
G:01:05N 1,478
(0,289-7,553) 0,639
84
Tabela 8.4.5 . Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e pacientes com contagem de cels TCD4>= 350 cels/mm3 durante o período de estudo. Valores de OR obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade. Destacado em negrito está a tendência de significância observada na análise.
Tabela 8.4.6. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e pacientes com carga viral do HIV
indetectável durante o período de estudo. Valores de OR obtidos através da análise de regressão
logística ajustada por idade. Destacado em negrito está a tendência de significância observada na
análise.
CD4>=350 cels/mm3 Alelo
OR (IC 95%) P
G:01:01:01 1,177
(0,486-2,851) 0,717
G:01:01:02 1,311
(0,489-3,515) 0,590
G:01:03 2,446
(0,293-20,415) 0,409
G:01:04 1,361
(0,488-3,799) 0,556
G:01:05N 0,249 (0,74-0,835) 0,024
CV Indetectável Alelo
OR (IC 95%) P
G:01:01:01 0,547
(0,262-1,141) 0,108
G:01:01:02 2,269
(0,969-5,313) 0,059
G:01:03 1,180
(0,329-4,229) 0,800
G:01:04 1,205
(0,540-2,690) 0,649
G:01:05N 0,581
(0,189-1,784) 0,343
85
Tabela 8.4.7. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e infecção pelo HPV-16. Valores de OR foram obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade.
Tabela 8.4.8. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e infecção persistente pelo HPV-16 durante o período do estudo. Os valores de OR foram obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus.