JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA CARACTERIZAÇÃO GENÉTICO-MOLECULAR DAS NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS BCR-ABL NEGATIVAS Orientador (es): Prof. Dra. Ilana Zalcberg Renault Dr. Martin Hernan Bonamino RIO DE JANEIRO 2014 Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
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Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer ... · diagnóstico e da fase leucêmica, foram encontradas alterações cromossômicas identificadas por aCGH; Duas alterações
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JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICO-MOLECULAR DAS NEOPLASIAS
MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS BCR-ABL NEGATIVAS
Orientador (es): Prof. Dra. Ilana Zalcberg Renault
Dr. Martin Hernan Bonamino
RIO DE JANEIRO
2014
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
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INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICO-MOLECULAR DAS NEOPLASIAS
MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS BCR-ABL NEGATIVAS
Tese apresentada ao Instituto Nacional de Câncer
como parte do requisito para obtenção do título de
Doutor em Oncologia
Orientador (es): Dra. Ilana Zalcberg Renault
Dr.Martin Hernan Bonamino
RIO DE JANEIRO
2014
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FICHA CATALOGRÁFICA SERÁ ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INCA PARA A VERSÃO
FINAL DA TESE
(A ser impressa no verso da primeira folha de rosto)
INDICAR APENAS AS PALAVRAS-CHAVE NA VERSÃO APRESENTADA PARA A DEFESA
Hibridização genômica comparativa (aCGH); 4. Sequenciamento completo de Exoma (WES).
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Pós-Graduação em Oncologia
JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA
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ORIENTADOR (ES): Prof. Dra. Ilana Zalcberg Renault
Dr. Martin Hernan Bonamino
Aprovada em: _____/_____/_____
EXAMINADORES:
Prof. Dr. João Paulo de Biaso Viola - Presidente
Prof. Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira
Prof. Dr. Katia Borgia Barbosa Pagnano
Prof. Dr. Lorena Lôbo de Figueiredo Pontes
Prof. Dr. Marcelo Alex de Carvalho – Suplente I
Prof. Dr. Adriana Cesar Bonomo – Suplente II
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RESUMO
TESE DE DOUTORADO
JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA
As neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMP) clássicas são caracterizadas por proliferação hematopoética
mielóide anormal e presença da mutação p.Val617Phe no gene JAK2 (JAK2V617F) em diferentes frequências
(Policitemia Vera-PV-95%, Trombocitemia Essencial-TE- e Mielofibrose-MF-50%). Aproximadamente 85% dos
pacientes JAK2V617F negativos apresentam inserções e deleções (INDELs) no gene da calreticulina (CALR). As
NMP podem evoluir para MF secundária (30%) ou para leucemia aguda (7%). Não existem, até o momento,
marcadores preditivos da progressão para LA. Técnicas genômicas de alta resolução representam as
ferramentas ideais possibilitam sequenciar (WES - whole exome sequencing) e avaliar a variação no número de
cópias (aCGH - array comparative genomic hybridization) de vários genes em centenas de pacientes ao mesmo
tempo, o que vai de encontro aos objetivos deste trabalho. Os objetivos deste trabalho foram: a) buscar
compreender a relação entre os biomarcadores (JAK2 e CALR) de interesse e seu papel na resposta terapêutica
dos pacientes com NMP submetidos ao tratamento com hidroxiureia (HU) e ao Ruxolitinib a partir da
implementação das técnicas para análise e quantificação destes biomarcadores; b) investigar o papel de novos
biomarcadores na progressão leucêmica secundária à NMP, utilizando técnicas genômicas de alta resolução
(aCGH e WES). Pacientes e Métodos: A partir de uma coorte central de 1236 pacientes referidos para o
diagnóstico de NMP, uma subcoorte de 162 pacientes foi utilizada neste trabalho, cujas amostras foram triadas
por PCR alelo específico para detecção da mutação p.Val617Phe. Além disso, a determinação da carga alélica
foi realizada por PCR-C (análise de fragmentos) e uma nova abordagem por q-PCR foi implementada e
comparada aos resultados obtidos por PCR-C (R²=0,9916). As amostras de 5 pacientes com TE foram
analisadas por aCGH e WES ao diagnóstico e na progressão leucêmica. Resultados: A partir da subcoorte de
162 pacientes caracterizamos que 92% PV, 46% TE e 48% MF apresentaram a mutação JAK2V617F. Em
pacientes com PV e negativos para JAK2V617F não foram encontradas mutações nos éxons 12 e 14 de JAK2.
Em contraste, em 3/45 pacientes com TE e negativos para JAK2V617F, foi detectada a mutação (p.Trp515Leu)
em MPL. Em 46% (31/68) dos pacientes V617F negativos e não PV apresentaram mutações em CALR. A
variação da carga alélica ao longo do acompanhamento mostrou dois padrões frente ao tratamento com HU:
oscilações, que não se correlacionavam com a dose de HU administrada e outro de estabilidade, também
observado nos pacientes com MF submetidos ao tratamento com Ruxolitinib. Em 3/5 pacientes com amostras ao
diagnóstico e da fase leucêmica, foram encontradas alterações cromossômicas identificadas por aCGH; Duas
alterações (+2p e del(5q)) foram recorrentes (2/3 pacientes) somente na progressão leucêmica, sugerindo que
estas alterações sejam específicas desta fase. A análise das alterações localizadas em regiões gênicas
específicas mostrou que na região da del5q estão localizados genes envolvidos na via de sinalização JAK-STAT
e na hematopoese. No chr 2, com ganho de cópia, estão posicionados genes de regulação epigenética. Dos
pacientes analisados por WES, um paciente foi positivo para a mutação JAK2V617F, outro para SF3B1
(p.Lys700Glu) (ARSA-t), e o terceiro para Ins de 5pb em CALR (p.Lys385fs*47) e com perda monoalélica de
TP53 não associada à mutação no alelo remanescente. Alterações em TP53, específicas da fase de progressão
leucêmica, foram reveladas por WES em 2/3 pacientes. A extensão deste trabalho piloto para uma coorte
JAK2V617F negativa em amostras da fase MPN mostrou que 7% (3/45) dos pacientes apresentaram mutações
em TP53, nenhuma mutação foi observada em SF3B1 e foram observados alguns polimorfismos nos éxons 11 e
12 de MAPK15. Conclusão: A redução da carga alélica de JAK2V617F é mais evidente no inicio do tratamento
com HU; O uso do inibidor de JAK2 não impacta a carga alélica, apesar da melhoria dos sintomas clínicos; Mutações em CALR foram encontradas respectivamente em 62% e 67% de pacientes com TE e MF; O evento
de transformação leucêmica mostrou-se bastante heterogêneo do ponto de vista molecular, devido à quantidade
de alterações cromossômicas e mutações encontradas por paciente, sendo a +2p e del(5q) as únicas alterações
recorrentes entre os pacientes e especificamente observadas nas amostras da fase aguda. Mutações em TP53
foram observadas preferencialmente associadas à transformação leucêmica, mas também ocorreram desde a
fase crônica.
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ABSTRACT
TESE DE DOUTORADO
JACKLINE DE PAULA AYRES DA SILVA
Myeloproliferative neoplasms (MPN) are characterized by abnormal myeloid proliferation and the presence of the
JAK2 mutation, p.Val617Phe, in 95% of Polycythemia Vera-PV, and 50% Essential Thrombocythaemia–ET and
Myelofibrosis–MF. Around 85% JAK2V617F negative patients have insertions-deletions (indels) in calreticulin
gene (CALR). MPN diseases could progress to secondary myelofibrosis (30%) or to acute leukemia (AL-7%)
although there are no predictive markers identified so far. High throughput genomic technologies are important
discovery tools because they enable whole exome sequencing (WES) and chromosome copy number variation
analysis (by SNP array or aCGH-array comparative genomic hybridization) from many patients at the same time.
Our aim was: a) study the relationship between diagnostic biomarkers (JAK2 and CALR) and their role in
monitoring therapeutic responses to hydroxyurea and Ruxolitinib and implement an analysis and quantification
assay for those MPN diagnostic biomarkers; b) investigate progression to acute leukemia secondary to MPN
using WES and aCGH. Patients and Methods: A subset group of 162 patients from a central cohort with 1236
patients referred to BioMol laboratory for MPN diagnosis was investigated in this work. First, those patients
samples were characterized by JAK2V617F mutation with allelic-specific PCR (AS-PCR) and the allelic burden
determined by fluorescent AS-PCR followed by fragment analysis (C-PCR). A q-PCR was also implemented for
comparing C-PCR results (R²=0,9916). We analyzed a subset of 5 patients that progressed from ET to AL by
aCGH and WES. Results: A 162 MPN coohort showed 92% PV, 46% ET and 48% MF patients bearing the
JAK2V617F mutation. PV JAK2V617F negative patients showed no mutations in exons 12 and 14 of JAK2 gene.
In contrast, 3/45 ET JAK2V617F negative patients showed mutations in the MPL gene (p.Trp515Leu) and 46%
(31/68) patients showed CALR indels. Allelic burden variation during follow up showed two patterns in patients
with HU use: oscillations that did not correlate with HU dose and stability, also observed in MF patients treated
with Ruxolitinib. We identified some chromosome abnormalities by aCGH in 3/5 MPN patients that progressed to
AL. Specific and recurrent AL alterations included +2p e del5q, indicating these can be specific markers. Gene
ontology analysis showed that del5q region includes some genes enrolled in JAK-STAT signaling and
hematopoietic cell lineage differentiation/proliferation while epigenetic regulator genes were mapped on the region
involved in +2p. WES results showed one patient positive to the JAK2V617F mutation while the other two tested
were negative, but one of the negative patients had a SF3B1 mutation with anemia in diagnosis, suggesting a
RARS-t. The other JAK2V617F negative patient showed a 5bp insertion in CALR (p.Lys385fs*47) and also a
monoalelic loss of TP53 without mutation in the reminiscent allele. The first two patients described had TP53
mutations specific to AL phase. An extension screening comprising JAK2V617F negative patients (ET, MF, MPN-
U and MDS) to look for TP53 mutations in chronic phase samples showed 7% (3/45) patients point mutations. We
also analyzed SF3B1 gene and did not find mutations. In MAPK15 gene we found some polymorphisms in exons
11 and 12. Conclusion: Allele burden decrease is more evident just after HU treatment; JAK2 inhibitor do not
have impact in allelic burden although improve clinical symptoms; CALR mutations are present in 62% and 67%
ET and MF patients, respectively; Acute leukemia progression is a heterogeneous molecular event with more
chromosome abnormalities and mutations in AL than MPN phase; We also found that +2p and del5q
chromosomes abnormalities are recurrent and specifically associated to AL progression. TP53 mutations were
observed preferentially associated to AL progression, but also occurred in the chronic MPN phase.
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Em memória aos meus
pais, meus grandes
incentivadores.
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Agradecimentos
À minha orientadora Ilana Zalcberg Renault por todo apoio e incentivo nestes
cinco anos de convivência; Obrigada por ter acreditado nesta morfologista e ter
proporcionado a chance de conhecer o mundo “genômico-molecular”; Todo o
estímulo dado foi importante em cada passo desta imensa avenida molecular que fui
apresentada, inclusive quando fui desafiada ao doutorado sanduíche; pelo incentivo
a resgatar a bioinformata que existia dentro de mim; O aprendizado advindo das
discussões foram peças importantes para meu amadurecimento profissional. E
principalmente, por toda a compreensão nos momentos mais difíceis.
Ao meu orientador Martin Hernan Bonamino que desde o primeiro contato se
mostrou um pesquisador bastante entusiasmado pela ciência, pelo incentivo
constante, pela ajuda e frutíferas discussões científicas; Por ter acompanhando este
trabalho com tanto carinho e zelo, estando sempre presente, mesmo quando
fisicamente distante. Este apoio foi de fundamental importância para minha
perseverança. E claro, obrigada por ter depositado sua confiança e me apresentado
à Dra Ilana Zalcberg.
Ao meu orientador Esteban Braggio por todo auxílio neste trabalho, que foram
além dos oito meses que trabalhei fisicamente em seu grupo. Todos os momentos
de discussões foram admiráveis, e sua atenção a cada detalhe foi impecável: desde
os preparativos pré-viagem, até as discussões de dados meses após o retorno ao
Brasil. Seu amor e carinho pela profissão são materializados na riqueza de detalhes
e precisão de suas respostas a qualquer aluno ou pesquisador que se dirigisse ao
seu escritório para discussão de dados. Muito obrigada pelo suporte durante a
instalação em Scottsdale e por ter feito meus dias longe do Brasil mais alegres ao
me apresentar três Brasileiras incríveis: Silvana, Marina e Sofia.
À Drª Eliana Abdelhay por todo incentivo e pelas discussões pontuais e
precisas.
Ao meu marido André Vidal, por ter sido um companheiro incondicional: me
apoiado desde o início quando resolvi retornar a vida acadêmica; por ter incentivado
minha ida ao laboratório americano; por todas as noites mal dormidas durante este
período do sanduíche, em que ficava acordado até tarde, por vezes até às 2h da
madrugada, só para nos falarmos via Skype; e é claro, pelo lindo arranjo de flores
que me enviou em Scottsdale no dia do meu aniversário!
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Ao meu pai, que sempre incentivou a lutar pelos meus objetivos e a seguir a
profissão que escolhi. Infelizmente não estará presente fisicamente em mais um
momento especial da minha vida, mas agradeço imensamente por todos os valores
ensinados.
A toda minha família e amigos por todo o carinho, apoio e preocupação, e por
estarem presentes nos preciosos e importantes momentos da vida: na alegria e na
tristeza, na saúde e na doença. Não enunciarei nomes para não arriscar me
esquecer de alguém em função dos preparativos intensos para tese que me fazem
ter a memória falha, mas vocês serão devidamente listados e agradecidos
pessoalmente num futuro próximo. Mas saibam todos, que o incentivo especial de
vocês, notadamente nos momentos mais árduos, foi inesquecível.
Aos colegas e amigos do laboratório de biologia molecular, do laboratório de
oncovirologia – CEMO – e do MartinLab (CPQ) por todo apoio, carinho e incentivo,
especialmente nos momentos mais difíceis. A caminhada com vocês foi mais
divertida! Meus sentimentos mais sinceros e profundos a todos aqueles que ficaram
até tarde no laboratório para me ajudar nos experimentos; não enunciarei nomes
para não ser injusta. Obrigada a Juliana Pontes, Natália Amaral, Ana Caroline
Coelho e Diego Coutinho pela ajuda no desenvolvimento de alguns dados e
experimentos deste trabalho. Um agradecimento especial a Michelle por todo o
apoio administrativo, como a ajuda na emissão de documentos, envio de laudos, só
para citar algumas das suas multifunções. Obrigada a Bárbara Monte-Mor por todos
os questionamentos e pelas discussões, sempre enriquecedoras e bem colocadas e
claro, pela revisão pontual desse manuscrito.
Aos colegas e amigos que fiz na Clínica Mayo-Arizona, por terem feitos meus
dias longe do Brasil mais alegres. Com certeza as reuniões e festinhas em que
Danielle, Juhi, Sinto, Martin, Jan, Leena, Victoria e Esteban organizaram tornaram a
nossa convivência muito mais lúdica. Obrigada por terem me acolhido como membro
de suas famílias, de forma bastante calorosa e acolhedora, em especial a Danielle
Miranda, minha mais nova irmã de coração.
Ao setor de quimioterapia do HUAP, em especial ao Dr. Adelmo Daumas
Gabriel, e ao setor de Hematologia do HUPE, em especial à Drª Cristiana Solza, por
todo carinho e auxílio na consulta aos prontuários dos pacientes e particularmente
por todas as discussões clínicas proporcionadas que foram muito importantes para o
x
desenvolvimento deste trabalho. Aos setores de Anatomia Patológica do HUAP e do
HUPE pela revisão das lâminas e recorte de blocos.
À Maria Emmerick Gouveia pela enérgica e alegre ajuda na coleta dos dados
clínicos e pelas discussões científicas.
Ao Dr. Alexandre Mello de Azevedo pela ajuda na elaboração das fichas
clínicas e das tabelas de coleta de dados.
Ao programa de Pós Graduação em Oncologia pelas excelentes aulas e
discussões proporcionadas; A toda equipe técnico-administrativa do Programa de
Pós-graduação em Oncologia, Danielle, Rodrigo e Andreia, por toda a ajuda e
eficácia nos mais diversos momentos e documentos solicitados.
Ao INCa, CNPq, INCT, FAPERJ e Clínica Mayo por todo apoio técnico e
financeiro para execução deste trabalho. Em especial ao INCT pela bolsa de
doutorado sanduíche.
A todos vocês a minha imensa gratidão e o mais sincero obrigada!
Anexo 4 – Publicações em colaboração relacionadas à tese – Publicação 1.............................124
Anexo 5 – Publicações em colaboração relacionadas à tese – Publicação 2.............................125
Anexo 6 - Manuscritos em preparo .................................................................................................126
Anexo 7 – Publicações em colaboração.........................................................................................127
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Lista de abreviaturas
AAS - ácido acetilsalicílico ABL - abelson murine leukemia viral oncogene homolog aCGH - array comparative genomic hybridization ARSA - anemia refratária com sideroblastos em anel ARSA-t - anemia refratária com sideroblastos em anel com trombocitose AS – allelic specific AS-PCR – alelic specific PCR (PCR alelo específico) ATP – Adenosine triphosphate (adenosina trifosfato) Bcl-Xl - B-cell lymphoma-extra large BMO-biópsia de medula óssea CALR – calreticulina CEMO - Centro de Transplantes de Medula Óssea CH- clínico hematológica COSMIC - Catalog of Somatic Mutations in Cancer Ct - threshold cycle DNA - ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid) EPO – eritropoietina ERK - extracellular-signal-regulated kinases FDA – food and drug administration FERM - 4.1, Ezrina, Radixina, Moesina GATK - Genome Analyis Toolkit GM-CSF - granulocyte macrophage colony-stimulating factor HAPMAP - haplotype map Hel - human erythroleukemia HU - Hidroxiureia HUAP - Hospital Universitário Antônio Pedro HUPE - Hospital Universitário Pedro Ernesto IGF-1 insulin like growth factor IGV – integrated genomic viewer IL-3 – interleucina 3 ILD - infusão de linfócitos do doador INDELS – inserções e deleções IR – inhibitory region JAK2 – Janus Kinase2 KDEL - Lys-Asp-Glu-Leu LA – leucemia aguda LLA – leucemia linfocítica aguda LLC – leukemia linfocítica crônica LMA – leucemia mieloide aguda LMC – leucemia mielóide crônica MAPK - mitogen-activated protein kinases MF – mielofibrose MFS – mielofibrose secundária MPL - myeloproliferative leukemia virus oncogene MPN – myeloproliferative neoplasms MT – mutado NGS – next generation sequencing NMP- Neoplasias mieloproliferativas NMP-U - Neoplasias mieloproliferativas crônicas-unclassified (não classificadas)
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OMS – organização mundial de saúde OSM – oncostatina M PBS - phosphate buffer solution PCR – polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase) PCR-C – PCR capilar (análise de fragmentos) PIAS - protein inhibithors of activated STATs PTP - protein tyrosine phosphatases PV – policitemia vera q-PCR – quantitative PCR (PCR quantitativo em tempo real) RCLB - red cell lysis buffer RDC – Resolução da Diretoria Colegiada RE- retículo endoplasmático RNA - ribonucleic acid (ácido ribonucleico) Rpm – rotações por minuto SCF – stem cell factor SF3B1 - splicing factor 3b subunit 1 SH2 - Src homology 2 SMD – síndrome mielodisplásica SMD/SMP – síndrome mielodisplásica/ síndrome mieloproliferativa SNV - single nucleotide variant SOCS - suppressores of cytokine signaling SOE – sem outra especificação STAT - Signal transducers and activators of transcription TCAG - The Centre for Applied Genomics TCTH - transplante alogênico de células tronco hematopoéticas TE – trombocitemia essencial TET - ten eleven translocation TPO - trombopoetina TREAT - Targeted RE-sequencing Annotation Tool UAF – unidades arbritárias de fluorescência USA – United States of America WES - whole exome sequencing WGS - Whole genome sequencing WHO – World Health Organization WT – wild type (selvagem)
1
1. Introdução
1.1. Histórico
Neoplasia Mieloproliferativa (NMP) é o termo utilizado para caracterizar um
grupo de doenças clonais, decorrentes da transformação maligna de uma célula
tronco hematopoética, sendo caracterizadas por um aumento da proliferação de
células mielóides e um risco aumentado de desenvolvimento de Leucemia Mielóide
Aguda (LMA). Historicamente, as NMP foram classificadas de acordo com o tipo de
célula (eritrócitos, plaquetas e granulócitos) predominante no sangue periférico ou
medula óssea (DE KEERSMAECKER; COOLS, 2006; TEFFERI; VARDIMAN, 2007).
O grupo das NMP clássicas é constituído pela Leucemia Mielóide Crônica
(LMC), Policitemia Vera-PV, Trombocitemia Essencial-TE e Mielofibrose-MF,
dependendo do fenótipo apresentado.
A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) constitui o paradigma do estabelecimento
das bases genéticas do câncer a partir da identificação do cromossomo Filadélfia
(Ph). Desta identificação resultaram a clonagem dos genes BCR e ABL, justapostos
molecularmente como resultado da t(9;22), a caracterização da atividade tirosina
cinase, constitutiva do ABL do gene de fusão, e a geração da primeira terapia alvo -
específica contra o ABL (o inibidor de tirosina cinase, Imatinib).
Neste trabalho serão abordadas as NMP clássicas com exceção da LMC. Não
serão discutidas outras NMP, tais como: leucemia neutrofilica crônica, leucemia
eosinofilica crônica, mastocitose, leucemia mielomonocitica e neoplasias
mieloproliferativas não classificáveis (TEFFERI; VARDIMAN, 2007).
Nas NMP clássicas BCR-ABL negativas, a produção excessiva de células
maduras ocorre sem distúrbio óbvio de diferenciação e envolve principalmente a
linhagem eritróide na PV, a linhagem megacariocitica na TE e as linhagens
megacariocitica e granulocítica na MF. A proliferação anormal do progenitor inicial
está associada à hipersensibilidade ou independência a citocinas, incluindo
CRISE BLÁSTICA 50% NA 5% 17% 20% 18% NA NA 14% 19% 10% Tabela 3 Tabela 1.3: Taxa das mutações descritas em NMP. Adaptado de Tefferi et al. (2011). PV -
Policitemia Vera; TE – Trombocitose essencial; MF – mielofibrose.
No entanto, a maior parte dos estudos disponíveis foram decorrentes da
progressão leucêmica secundária à SMD (GONDEK et al., 2007a, 2007b; BEER et
al., 2009;HEINRICHS et al., 2009) ou não especifica qual doença de base a LA
ocorreu (SANTANA-DAVILA et al., 2008a); ou analisa a progressão leucêmica de
SMD e NMP conjuntamente como se fosse um mesmo fenômeno (GONDEK et al.,
2007a, 2007b; STEGELMANN et al., 2009; KLAMPFL et al., 2011; RUMI et al.,
2011). Mesmo em situações onde existe um esforço em discriminar melhor os
subgrupos, pela raridade do evento, poucas amostras por doença foram até hoje
analisadas (PV, TE e MF) (REILLY et al., 1997; TEFFERI et al., 2005; DINGLI et al.,
2006; GANGAT et al., 2008, 2009; ABDULKARIM et al., 2009; BEER et al., 2009;
HUSSEIN; VAN DYKE; TEFFERI, 2009; KNOOPS et al., 2009; STEGELMANN et al.,
25
2009; TEFFERI et al., 2009; ABDEL-WAHAB et al., 2010; THOENNISSEN et al.,
2010; VISANI et al., 2011).
Desta forma, é de grande importância que mais estudos sejam focados em
subgrupos específicos a fim de melhorar o entendimento dos mecanismos
subjacentes à progressão para leucemia aguda secundária nas NMP. Avaliações
seriadas de pacientes ao longo da evolução das NMP são necessárias para este tipo
de estudo. É neste contexto, em um agrupamento de doenças englobadas sob a
mesma denominação, mas altamente heterogêneas, no momento de maior evolução
clonal, que este trabalho está inserido.
26
2. Objetivos
2.1. Principal
O objetivo principal deste trabalho foi identificar perfis moleculares
diferenciados em pacientes com NMP pela presença ou ausência de mutações nos
genes JAK2, CALR e MPL, correlacioná-los aos padrões de resposta terapêutica
além de identificar mecanismos genéticos subjacentes à progressão leucêmica
revelados por técnicas genômicas de alta resolução.
Para isto, foram propostos os seguintes objetivos secundários:
2.2. Secundários
Estabelecer um banco de dados clínicos de um grupo de pacientes com NMP
para estudos de correlação e associação com biomarcadores moleculares;
Estabelecer metodologias para detecção de mutações descritas na literatura:
mutações do exon 12 e 14 do gene JAK2, inserções e deleções no gene CALR e
mutações no gene MPL;
Correlacionar a presença e a frequência das mutações encontradas com o
curso clínico dos pacientes no grupo estudado;
Analisar a carga alélica da mutação p.val617phe em JAK2 e correlacioná-la
com resposta ao tratamento e progressão da doença;
Avaliar a presença de mutações em IDH1, IDH2 e TET2 em subgrupos de
pacientes de NMP com progressão leucêmica e correlacionar com aspectos clínicos;
Avaliar a variação do número de cópias (alterações cromossômicas) em
pacientes com NMP com progressão leucêmica por técnicas de alta resolução
(aCGH – array comparative genomic hybridization);
Avaliar, através de técnicas de sequenciamento massivo paralelo (WES –
Whole exome sequencing), a presença de mutações pontuais, inserções e deleções
visando avaliar o possível papel preditivo destas para o diagnóstico, prognóstico e
principalmente como marcador preditivo ou associado à progressão leucêmica;
Analisar a arquitetura clonal da NMP de acordo com a evolução clonal nos
casos de progressão leucêmica;
Iniciar a análise de algumas das mutações encontradas pelo WES em uma
subcoorte de NMP.
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3. Metodologia
3.1. Pacientes
A coorte central deste estudo é composta de 1.892 amostras provenientes de
1.236 pacientes com suspeita diagnóstica de NMP enviadas e registradas ao
laboratório de Biologia Molecular (LabBioMol) do Centro de Transplantes de Medula
Óssea (CEMO) para análise molecular da mutação p.Val617Phe no gene JAK2 de
janeiro de 2007 a 12 de novembro de 2013. Esta coorte central possui 25 centros de
diversos Estados brasileiros (RJ, BA, CE, RS, ES).
No presente estudo foi avaliada uma subcoorte retrospectiva e prospectiva de
FRALEY; RAFTERY; SCRUCCA, 2013;), e uma função para implemenatção do
SOTA (DOPAZO; CARAZO, 1997). Além dos pacotes de agrupamento, clValid tem
funções de validação interna e de medida de estabilidade do agrupamento. As
medidas de validação interna medem a qualidade do agrupamento como
compactação, conectividade e separação das partições dos agrupamentos. Neste
estudo foram utilizadas as medidas de conectividade, Dunn (DUNN, 1974) e
Silhoueta (ROUSSEEUW, 1987). Como foram analisadas duas amostras por
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paciente, não foi possível rodar os algoritmos de medição da estabilidade do
agrupamento do pacote clValid. Para tal empregamos do pacote fpc (Flexible
procedures for clustering) a função de bootstrap e utilizamos as medidas de força da
predição, o melhor número de agrupamentos, os valores de instabilidade média para
cada agrupamento e a matriz com os valores de instabilidade para cada rodada de
bootstrap. A análise de ontologia de genes foi realizada através do banco de dados
de anotação, visualização e descoberta integrada V6.7 (DAVID- Database for
Annotation, Visualization and Integrated Discovery) do Instituto Nacional de Alergia e
Doenças Infecciosas (NIAID - National Institute of Allergy and Infectious Diseases,
NIH) (HUANG; SHERMAN; LEMPICKI, 2009a, 2009b).
42
4. Resultados
No período de 2007 a 2009 foram referidas ao LabBioMol 370 amostras para
diagnóstico de NMP, sendo aproximadamente 130 amostras/ano. Desta maneira,
estimávamos uma entrada de 560 amostras, oriundas dos 9 centros parceiros
participantes do grupo de estudo inicial, ao longo do período deste estudo (2010-
2013). É de se notar, que após termos estreitado o grupo de estudo original para
dois centros, ainda assim, a entrada de amostras superou nossas estimativas
originais perfazendo um total de 513 amostras (diagnóstico e acompanhamento)
relativas a 162 pacientes classificados como NMP.
Desta forma, no período entre janeiro de 2007 a 12 de novembro de 2013
foram referidas 1892 amostras ao LabBioMol relativas a 1236 pacientes (coorte
central) com suspeita de NMP para análise da mutação p.Val617Phe no gene JAK2
(figura 4.2). Amostras com leucocitose com suspeita de NMP, seguiram o seguinte
algoritmo laboratorial: i) PCR multiplex para avaliação de transcritos BCR-ABL, este
quando positivo, estabeleceu o diagnóstico de LMC. Quando negativo, as amostras
seguiram o fluxograma abaixo (figura 4.1): PCR qualitativo para detecção da
mutação JAK2V617F; as amostras negativas para JAK2V617F e com suspeita de
PV foram testadas para presença de mutação no gene JAK2 no éxon 12 ou no éxon
14 para mutações diferentes da JAK2V617F. Da mesma maneira, pacientes com
suspeita clínica de TE negativos para JAK2V617F, foram também, testados para
presença de mutação no éxon 9 do gene CALR e no éxon 10 do gene MPL.
Finalmente, pacientes com suspeita de anemia refrataria associada à trombocitose
(ARSA-T) foram também avaliados para mutações nos éxons 14 e 15 do gene
SF3B1.
O desenho experimental do estudo encontra-se simplificado na figura 4.2.
Brevemente, a partir de uma coorte central de 1236 pacientes, identificamos 218
pacientes provenientes de dois hospitais universitários parceiros – HUPE e HUAP –
dos quais coletamos os dados clínicos e hematológicos. A partir destes dados e em
conjunto com os dados de BMO e diagnóstico molecular, estes pacientes receberam
um diagnóstico final pelo clínico responsável pelo acompanhamento dos pacientes.
Após esta etapa, obtivemos 162 pacientes, sendo 38 PV, 91 TE e 33 MF. Destes,
tivemos 8 pacientes que transformaram para leucemia aguda secundária. Entretanto,
somente 5 pacientes possuíam amostra da fase de NMP (crônica) e da
transformação leucêmica (aguda) e estas foram estudadas por aCGH e WES.
43
Figura 3 Figura 4.1: Fluxograma de avaliação de mutações em NMP. Retângulos representam
ensaios diagnósticos para detecção de mutações em determinados genes. Círculos ou ovais verdes representam subgrupos de NMP. Como as mutações somáticas em JAK2, CALR e MPL são excludentes, uma vez detectada a mutação JAK2V617F, a análise de uma NMP foi considerada finalizada.
44
Figura 4 Figura 4.2: Desenho experimental do estudo. O laboratório de Biologia Molecular do
CEMO recebeu de 2007 a novembro de 2013, amostras 1236 pacientes para o diagnóstico molecular
da mutação V617F em JAK2 provenientes de 25 centros parceiros. Para o presente estudo,
escolhemos uma subcoorte contendo dois centros (HUPE e HUAP) nos quais tivemos 218 pacientes
que receberam o diagnóstico final de NMP/SMD pelo clínico responsável por cada um dos centros.
Destes, 162 pacientes tiveram o diagnóstico de PV, TE ou MF confirmados através de exames
hematológicos, moleculares e de anatomia patológica (critérios da OMS/WHO). Destes, 8 pacientes
progrediram para leucemia aguda secundária, mas enfatizamos nesta gravura, somente aqueles
pacientes que tiveram suas amostras estudadas molecularmente. As setas indicam quais as
metodologias empregadas em cada etapa do estudo.
4.1. PCR qualitativa (alelo – específico) para a mutação JAK2V617F
Após a análise da mutação JAK2V617F em 162 pacientes com diagnóstico
final de PV, Te e MF, observamos uma distribuição semelhante das categorias
clínicas abordadas neste estudo nos dois centros envolvidos, demonstrando uma
homogeneidade na distribuição dos pacientes, independentemente do centro (figura
4.3).
45
Figura 5 Figura 4.3: Distribuição das NMP, BCR-ABL negativas, clássicas (PV, TE e MF primária ou
secundária), de acordo com a Classificação da OMS/WHO-2008, nos dois centros participantes deste
Comparação dos eventos adversos durante o acompanhamento entre os pacientes com MF JAK2V617F positivos e negativos
Tabela 14 Tabela 4.9: Comparação dos eventos adversos em qualquer momento ao diagnóstico ou
durante o acompanhamento dos pacientes com MF. RR – risco relativo; OD-odds ratio; IC- intervalo de confiança.
A variação da carga alélica foi estudada em amostras seriadas ao longo do
acompanhamento de pacientes positivos para JAK2V617F. Como resultados foram
observados padrões de oscilação ou estabilidade da carga tumoral.
Em nosso trabalho recente (ZALCBERG et al., 2011) (anexo 4), analisamos a
variação da carga alélica, entre a primeira e a última amostra disponível no
laboratório, de pacientes submetidos a tratamento com Hidroxiureia (HU). A
comparação da carga alélica da amostra inicial de pacientes virgens de tratamento
com a última amostra de acompanhamento, disponível no laboratório, sugere que a
carga alélica inicial é maior, em pacientes com PV e TE. Já as variações observadas
em pacientes cuja primeira amostra disponível era após o início do tratamento esta
variação foi mais sutil (figura 4.9).
Análises de acompanhamento de alguns pacientes mostraram que a dose de
HU utilizada no tratamento teve impacto nos parâmetros hematológicos (pacientes 3-
PV, 4-TE, 6-TE, 7-PV, 10-TE, 11-TE, 31-TE e 63-PV) sem que houvesse uma
correlação direta entre a dose de HU utilizada e os níveis de JAK2V617F. Os
pacientes 1-PV e 2-PV mostraram um aumento da carga alélica, apesar de
55
apresentarem uma resposta hematológica em resultado ao uso de HU (anexo 4,
publicação 1).
De modo geral, nossos resultados mostraram que a carga tumoral permanece
estável durante o tratamento com HU. Pacientes com níveis de carga alélica
situados no 1º e 4º quartis (53-PV; 62-TE; 31-TE; 34-TE; 51-TE e 54-TE) tendem a
apresentar maior estabilidade dos níveis de carga alélica, enquanto que os
pacientes com níveis intermediários (2º e 3º quartil) apresentam maiores variações
(pacientes 3-PV e 12-PV) (tabela 4.10). Alguns pacientes que necessitaram
interromper o tratamento em função dos parâmetros hematológicos (número de
plaquetas, hematócrito baixo), apresentaram um aumento da carga tumoral
(pacientes 3-PV e 8-TE) (anexo 4, publicação 1).
Os pacientes 53-PV, 62-PV, 4-TE, 10-TE, 11-TE, 17-TE, 34-TE e 54-TE
apresentaram oscilações discretas da carga alélica. Em função da observação que
pacientes com PV apresentaram carga alélica mais alta (4º quartil) em comparação
aos com TE (1º quartil), propusemos uma correlação entre níveis de carga alélica e
categoria de NMP (anexo 4, publicação 1).
Figura 11 Figura 4.9: Variação da carga alélica de JAK2 em pacientes com PV e TE. À esquerda está
demonstrada a dinâmica entre uma amostra inicial do diagnóstico (sem tratamento) e a última amostra de acompanhamento disponível no laboratório. À direita a mesma dinâmica é demonstrada com a diferença de que na data da coleta da amostra inicial os pacientes já haviam iniciado o tratamento. As análises foram realizadas utilizando o teste pareado não paramétrico de Wilcoxon.
56
Paciente Doença Resposta hematológica às modificações nas doses de HU Resposta JAK2V617 às modificações nas doses de HU
2 PV oscilação oscilação V617F não relacionada à HU
3 PV oscilação oscilação V617F não relacionada à HU
9 PV oscilação discreta ausência de modificações (4º quartil)
53 PV oscilação discreta ausência de modificações (4º quartil)
63 PV oscilação discreta variação independente de V617F
6 TE oscilação ausência de modificações (2º quartil)
13 TE oscilação oscilação relacionada à HU
17 TE oscilação ausência de modificações (1º quartil)
31 TE oscilação modificação induzida por HU? (1º-2º-1º quartil)
34 TE oscilação ausência de modificação
51 TE oscilação oscilação V617F não relacionada à HU
54 TE oscilação oscilação discreta (1º quartil)
18 TE-LA ausência de variações modificação discreta (3º-2º-3º quartil)
Tabela 15 Tabela 4.10: Tabela resumo de alguns pacientes ressaltando as respostas hematológicas à
terapia citorredutora (HU) e as respostas de carga alélica.
Durante o acompanhamento, cinco pacientes evoluíram para mielofibrose
secundária. O diagnóstico inicial dos pacientes era: PV(2) e TE(3). O paciente #192,
portador de TE, cursou com níveis baixos de carga alélica, sendo a inicial de 10% e
durante o acompanhamento oscilando em torno de 5%. Este paciente ainda se
encontra em acompanhamento para avaliar se um aumento da carga alélica é
observado, como o esperado, em uma progressão de TE para mielofibrose
secundária (MFS). A carga alélica do paciente #714, portador de PV aumentou
durante o acompanhamento sendo observada uma mudança dos níveis da
JAK2V617F de < 50% para >50%. Entretanto a mudança de padrão não foi preditiva
ou concomitante ao aparecimento de MFS, sendo esta detectada somente 4 anos
após o aumento da carga alélica de JAK2V617F acima dos 50% (figura 4.10). Para o
paciente #341, portador de TE, com carga alélica próxima a 100% na amostra inicial,
não foi possível avaliar o comportamento da carga alélica ao longo da doença até a
transformação para MFS por perda de seguimento. Em contraste, para o paciente
#502 portador de PV, estavam disponíveis somente amostras do acompanhamento
após o período da transformação para MFS, quando a carga alélica era próxima a
100%. Para o paciente #144, portador de TE, várias amostras do seguimento
estavam disponíveis. A análise seriada destas amostras, ao longo do tratamento
com HU, mostra uma diminuição de clones JAK2V617F positivos com reflexo na
diminuição da carga alélica após o primeiro ciclo de HU e um aumento da carga
alélica, com níveis similares ao do diagnóstico, um ano antes da progressão. A
última amostra analisada após a transformação apresentou níveis de carga alélica
mais elevados do que a carga inicial (figura 4.11).
57
Figura 12 Figura 4.10: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F do paciente
#714, portador de PV e progressão para mielofibrose secundária (janeiro de 2013).
Figura 13 Figura 4.11: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F do paciente
#144 portador de TE e progressão para mielofibrose secundária (junho de 2012).
O uso compassivo do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib), aprovado em 2012 pela
ANVISA, e revogado em 2013, em três pacientes, permitiu avaliar se o uso do
Ruxolitinib apresentava impacto na carga alélica de JAK2V617F em pacientes
positivos para a mutação. As figuras 4.12 e 4.13 mostram a cinética da carga alélica
ao longo do tratamento em 2/3 pacientes submetidos ao inibidor de JAK2V617F
positivo. É de se notar a não alteração dos níveis de JAK2V617F, sugerindo uma
não diminuição relevante do clone mutado. Em contraste, os pacientes
apresentaram uma melhora global dos sintomas clínicos. O terceiro paciente
58
negativo para JAK2V617F, submetido ao inibidor de JAK2 também apresentou
melhora global dos sintomas, apesar das intercorrências diretas (neutropenia) ou
indiretas (acentuação dos eventos adversos: microcirculação vascular – ferida no pé
associada à diabetes; lesão hipocrômica associada à hanseníase), associadas ao
tratamento. O paciente continua em uso do inibidor, com melhora das lesões,
parâmetros hematológicos estáveis e diminuição do baço.
Figura 14 Figura 4.12: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2 V617F do paciente
#471 portador de mielofibrose ao longo do uso do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib).
Figura 15 Figura 4.13: Cinética de acompanhamento da carga alélica de JAK2V617F, do paciente #
616 portador de mielofibrose, ao longo do uso do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib).
59
4.3. Estabelecimento das metodologias para a detecção de mutações
adicionais em amostras de pacientes com NMP e JAK2V617F negativo
Amostras de pacientes com NMP e JAK2V617F negativo foram testadas para
a presença de outras mutações somáticas, de forma hierárquica, de acordo com a
suspeita clínica (figura 2). Desta forma, o rastreamento para mutações em MPL foi
realizado em pacientes com TE e MF e o rastreamento para mutações no gene
JAK2 no éxon 12 e ao longo de todo o exon 14 foi realizado nos casos de PV e MFS
à PV. A análise do status mutacional foi primeiramente realizada pelo método de
sequenciamento direto de Sanger. Os casos com mutações identificadas pelo
sequenciamento direto foram utilizados para padronização da técnica de HRM
utilizada posteriormente como de triagem.
4.3.1. MPL
A técnica de HRM para MPL foi padronizada utilizando-se amostras de
pacientes saudáveis doadores de medula óssea e de uma amostra, de padrão em
homozigose definido por sequenciamento direto, positiva para a mutação
p.Trp515Leu (W515L). Para fins de determinação de sensibilidade da técnica foi
realizada uma curva com diluições seriadas do DNA da amostra mutada contra a
amostra do tipo selvagem (100%, 75%, 50%, 25%, 10%, 5%, 1% e 0%mt). O gráfico
mostra que amostras positivas para a mutação p.Trp515Leu em MPL podem ser
diferenciadas daquelas do tipo selvagem quando presentes em um percentual ≥ 5%
Descrição das características clínicas-hematológicas dos pacientes leucemizados
Tabela 17 Tabela 4.12: Parâmetros hematológicos dos pacientes com NMP que progrediram para
leucemia aguda (95% IC, p<0,05, teste de Wilcoxon).
63
Descrição dos eventos adversos durante a fase crônica dos pacientes leucemizados
Leucemia aguda secundária à NMP TOTAL (N-%)
EVENTOS DURANTE O ACOMPANHAMENTO 7
EMAGRECIMENTO 1
HEMORRAGIA 2
TROMBOSE 1
PARESTESIA 0
PRURIDO 0
ESPLENOMEGALIA 1
HEPATOMEGALIA 0 Tabela 18 Tabela 4.13: Eventos adversos em qualquer momento ao diagnóstico ou durante o
acompanhamento (fase crônica) dos pacientes com NMP que progrediram para leucemia aguda.
A procura de um marcador preditivo da progressão leucêmica teve início pela
busca de mutações nos genes IDH1 e IDH2, estas descritas em trabalhos anteriores
(MARDIS et al., 2009; ANDRULIS et al., 2010; GREEN; BEER, 2010;) como
associadas à progressão leucêmica. O estudo em amostras antes e na progressão
leucêmica, para mutações pontuais no éxon 4 dos genes IDH1 e 2, nos 5 pacientes
em questão não revelou positividade para estas mutações. Desta forma a presença
de mutações na região codificante de TET2, outro gene envolvido na regulação
epigenética, foi investigada. A alteração p.Pro363Leu no éxon 3 de TET2 do
paciente #834 foi observada nas duas amostras estudadas (figura 4.17). Após a
consulta em bancos de dados (100genomas, dbSNP, UniProt) relativos a frequência
populacional, esta troca de um único nucleotídeo foi caracterizada como
polimorfismo (tabela 4.14). A presença deste SNV (troca simples de nucleotídeo)
ocorreu no paciente com a menor contagem de plaquetas durante a progressão
leucêmica.
64
JAK2 JAK2 MPL IDH1 IDH2
diagnóstico
leucemização
diagnóstico
leucemização
diagnóstico
leucemização
diagnóstico
leucemização
diagnóstico
leucemizaçãoneg neg neg neg
neg neg neg neg
neg
TET2
Éxon 3 Éxon 9
neg neg neg
neg
neg
719 + neg
negneg negneg
249 neg
neg
neg
neg847 neg neg neg
negneg
883 neg neg
Paciente AmostraJAK2
V617F Éxon 12 Éxon 14
neg
834 neg neg neg
Éxon 10
neg
Éxon 4
neg negp.Pro363
Leu
Éxon 4
neg
Tabela 19 Tabela 4.14: Genes analisados para presença de mutações em amostras pré e no
momento da progressão leucêmica em pacientes com NMP que progrediram para leucemia aguda. Identificação do polimorfismo p.Pro363Leu no éxon 3 de TET2 (+ positivo; neg – negativo).
Figura 19 Figura 4.17: Cromatogramas de sequenciamento do éxon 3 do gene TET2, (A) forma
selvagem (WT), (B e C) presença de SNV em heterozigose em amostras do paciente 834 durante a
fase crônica (B) e de progressão para leucemia aguda secundária (C).
Mediante a complexidade, morosidade e baixa sensibilidade do
sequenciamento direto para análises de genes grandes como o TET2, e pelo grande
número de genes possivelmente envolvidos no processo de progressão leucêmica,
sugeridos na época de elaboração deste trabalho, partimos para a investigação
desta questão, ou seja, a definição de marcadores moleculares preditivos de
transformação, com técnicas genômicas de alta resolução.
65
4.4.1. Análise de hibridização genomica comparativa (aCGH – array
comparative genomic hybridization)
Dos oito pacientes que progrediram para leucemia aguda, cinco pacientes
com diagnóstico de TE possuíam amostras da fase crônica (NMP), e da fase de
progressão leucêmica, e foram analisados pela técnica de aCGH. Destes cinco
pacientes, três apresentaram alterações (amplificações e deleções) na amostra da
progressão leucêmica e por isso também tiveram o DNA da amostra ao diagnóstico
analisado por aCGH. O paciente #883 possuía uma amostra intermediária, 10 meses
após o diagnóstico de NMP e cinco meses anterior ao diagnóstico de leucemia
aguda e desta forma teve também esta amostra analisada.
Os resultados mostraram que 3/5 dos pacientes apresentaram alterações
cromossômicas detectáveis pela técnica de aCGH com chips de alta resolução
(244k). A mediana do tamanho mínimo teórico (resolução) detectável por este chip
são alterações de 19Kb. Como esperado, o número de alterações cromossômicas foi
maior na fase de leucemia aguda do que na fase de NMP, sendo o evento de perda
cromossômica o mais recorrente (figura 4.18 e figura 4.19). A média do número de
alterações/paciente foi de 6,3 (5 - 8) nas amostras na leucemia aguda e de 2,5 (1-
10) ao diagnóstico (figura 4.20 e 4.21 e tabelas 4.16 e 4.17). Nas amostras durante a
progressão leucêmica os pacientes tinham na média 29,3 Mb alterados, 2,3
amplificações/paciente, sendo o tamanho médio das amplificações de 33,3Mb
(mediana de 27,5Mb, variando de 1Mb a 71,5Mb). Dentre as deleções foi observado
uma média de 4 deleções/paciente sendo que o tamanho médio das deleções foi de
27 Mb (mediana de 14,6Mb, variando de 80kb a 92Mb) (figura 4.20 e 4.21 e tabelas
4.16 e 4.17).
Interessantemente, duas alterações (+2p e del(5q)) foram especificas da
leucemia aguda e ambas recorrentes com co-ocorrência em 2/3 pcs (figuras 4.22 e
4.23). Estas alterações não foram identificadas no diagnóstico em nenhum dos
casos, estando inclusive ausente na amostra intermediária do paciente #883 relativa
a 5 meses antes da progressão leucêmica (tabela 4.17). A presença desta alteração
esteve associada a níveis de hemoglobina e hematócrito mais altos, quando
comparados os pacientes positivos para estas alterações com os que não
apresentavam estas duas alterações.
Foi observado que 2/3 pacientes apresentaram alterações desde o
diagnóstico, que foram exclusivas, a cada um deles, ou seja, não se mostraram
66
recorrentes entre eles. A comparação entre as amostras da fase NMP e da
progressão leucêmica mostrou em um paciente, 10 alterações, e no outro, uma
alteração comum entre as duas fases. As alterações observadas eram em sua
maioria do tipo deleção (del), e com um comprimento médio de 2,7Mb (848Kb-
6,4Mb). Somente um ganho de 500Kb foi observado (tabela 4.17 e figura 4.21).
Os outros dois pacientes analisados não apresentaram alterações do número
de cópias nas amostras de progressão leucêmica e por isso não tiveram a amostra
ao diagnóstico investigada.
Figura 20 Figura 4.18: Gráfico mostra o número de alterações total por paciente, obtido por aCGH, em
amostras da progressão leucêmica e da fase crônica (NMP) da doença. NMP- amostra da fase de NMP; LA- amostra da fase de leucemia aguda.
Figura 21 Figura 4.19: Gráfico mostra o número e tipo de alteração (ganho ou perda) encontrada na
fase de leucemia aguda dos pacientes estudados por aCGH.
67
Figura 22 Figura 4.20: Alterações identificadas por aCGH durante a fase de crônica das amostras
estudadas. Chr-cromossomo; CNV – copy number variation
Figura 23 Figura 4.21: Alterações identificadas por aCGH durante a fase de leucemia aguda (LA) das
amostras estudadas. Notar que as alterações do cromossoma 2 e 5 estão localizadas na mesma região e são recorrentes. Chr-cromossomo; CNV – copy number variation
68
Figura 24 Figura 4.22: Resultado de aCGH mostrando as alterações observadas no cromossoma 2
dos 3 pacientes com rearranjos cromossômicos. Cada cor de linha representa um paciente: azul – paciente #883; lilás – paciente #249; vermelho – paciente #719. No eixo das abcissas, temos a representação do cromossoma 2, sendo à esquerda o braço curto e à direita o braço longo. No eixo das ordenadas temos o valor de log2 da razão entre o número de cópias do DNA tumoral e o DNA referência
Figura 25 Figura 4.23: Resultado de aCGH mostrando as alterações observadas no cromossoma 5
dos 3 pacientes com rearranjos cromossômicos. Cada cor de linha representa um paciente: azul – paciente 883; lilás – paciente 249; vermelho – paciente 719. No eixo das abcissas, temos a representação do cromossoma 5, sendo à esquerda o braço curto e à direita o braço longo. No eixo das ordenadas temos o valor de log2 da razão entre o número de cópias do DNA tumoral e o DNA referência
69
paciente #883
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
chr2 p25.3 - p13.3 ganho 71,46132
chr5 q23.3 - q35.3 perda 53,123196
chr7 q32.3 perda 0,160687
chr10 p15.1 - p14 perda 7,063712
chr12 q24.31 perda 0,090047
chr17 q25.1 - q25.3 perda 9,846114
paciente #249
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
chr2 p25.3 - p25.1 perda 9,881828
chr9 p21.3 - p11.2 perda 19,422864
chr9 q13 - q34.3 perda 69,912548
chr18 q12.1 perda 0,085504
chr18 q12.3 - q23 perda 36,338132
paciente #719
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
chr2 p25.3 - p16.1 ganho 55,610263
chr3 q23 - q29 ganho 56,230282
chr5 q14.3 - q35.3 perda 92,121742
chr6 p25.3 - p22.1 perda 26,713382
chr6 p22.1 - p12.1 ganho 27,558361
chr8 q23.2 - q23.3 ganho 1,065098
chr8 q24.13 - q24.3 ganho 19,67531
chr17 p13.3 ganho 1,3239 Tabela 20 Tabela 4.15: anormalidades exclusivas da progressão leucêmica observadas pela técnica
de aCGH
70
paciente #883
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
chr1 p36.31 - p36.23 perda 2,000608
chr1 p32.3 perda 1,000292
chr3 p25.1 - p24.3 perda 6,155235
chr3 p22.2 perda 0,848593
chr3 p21.31 perda 3,95882
chr3 q21.3 - q22.1 perda 2,186143
chr7 q22.1 perda 2,003467
chr13 q12.12 ganho 0,49895
chr17 p13.3 - p13.1 perda 6,400794
chr17 q11.2 perda 1,807016
paciente #249
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
chr12 q24.31 perda 1,080697
paciente #719
cromossomo citobanda tipo de alteração tamanho (Mb)
ausência de alterações comuns Tabela 21 Tabela 4.16: Anormalidades presentes na amostra ao diagnóstico de MPN e que
permaneceram na leucemia aguda observadas pela técnica de aCGH.
Nas amostras da fase de leucemia aguda secundária foram observadas
alterações na via JAK-STAT como a perda monoalélica de SOCS3 (região 17q25.1 -
q25.3), que é um regulador negativo da via, no paciente #883 e ganho no gene da
trombopoetina (região 4q23 - q29), THPO, no paciente #719. Foram observadas
deleções em diversos cromossomas afetando genes de regulação epigenética do
complexo polycomb2 e em proteínas que participam ou interagem com o complexo
SET: PHF1, PHF19, JARID2, SETD1B, WDR5, CXXC1, associados à repressão da
transcrição.
Dos genes alterados desde o diagnóstico de NMP, podemos destacar a perda
monoalélica de eritropoietina (EPO) (região7q22.1), SUZ12 (17q11.2), TP53,
POLR2A (17p13.3 - p13.1) e SETD1B (12 q24.31).
A análise de processos biológicos dos genes das regiões comumente
alteradas na fase de leucemia aguda secundária mostrou que no cromossomo 5q há
71
9 genes deletados envolvidos na via de JAK-STAT (CSF2, TSLP, IL3, IL4, IL5, IL9,
IL13, IL12B, SPRY4) e 4 desses genes também envolvidos na via de diferenciação
hematopoética (CSF2, IL3, IL4, IL5). No cromossoma 2 foi observado o ganho em
genes de regulação epigenética (DNMT3A, ASXL2 e DPY30) e de reparo de
mismatch (MSH2).
4.4.2. Sequenciamento do exoma completo (WES - Whole exome
sequencing)
Pela a técnica de WES foram analisadas seis amostras (NMP e leucemia
aguda) dos três pacientes que apresentaram alterações cromossômicas na fase de
leucemia aguda pela técnica de aCGH. Neste momento, foram analisados três
pacientes com diagnóstico inicial de TE (um JAK2 V617F e dois negativos para esta
mutação). Após o alinhamento das leituras de 100 pb de cada paciente, o exoma
sequenciado foi alinhado contra o genoma humano, versão hg19, do qual obtivemos
os seguintes resultados:
O WES teve em média: 71 milhões de regiões exônicas de 100pb mapeadas;
cobertura de 99,6x por nucleotídeo; qualidade de 80% das regiões-alvo
seqüenciadas; 7% de regiões duplicadas. Foram observadas em média 199
mutações exônicas somáticas não sinônimas / paciente (144 mutações pontuais e
55 INDELS).
Foram observadas em média 10752 variações não sinônimas, sendo 924
ainda não reportadas em bancos de dados (dbSNP, HAPMAP, 1000 genomas etc) e
12057 variações sinônimas, sendo 844 não reportadas. A razão entre mutações não
sinônimas/ sinônimas foi em média de 0,89. Após a triagem dos dados, com
enriquecimento das variações somáticas (após exclusão das SNV reportadas em
banco de dados), observamos uma taxa de variações não sinônimas/ sinônimas de
1,8, 2,3 e 1,6 para os pacientes 883, 249 e 834, respectivamente. A taxa de
transições/transversões foi de 2,4 e de 2,2 para as variações únicas de nucleotídeos
conhecidos (já reportados em banco de dados) e novos, respectivamente.
Dentre as mutações já sabidamente associadas às NMP encontramos JAK2 e
CALR. O paciente 719 apresentou JAK2 V617F e o paciente 883 apresentou CALR.
O resultado de JAK2 por WES confirmou os dados que já tínhamos do PCR alelo
específico (qualitativo) e do quantitativo (PCR-C). A carga alélica de JAK2 por WES
foi de 40% e de 52%, com uma taxa de cobertura de 77 e 27 leituras (reads), no
diagnóstico e na fase de leucemia aguda, respectivamente. Por PCR-C a carga
72
alélica estimada foi de 37% e 66%. A mutação em CALR encontrada foi a
p.K385fs*47, que é a mais frequente em TE. A frequência da carga alélica de CALR
por WES neste paciente mostrou variação de 44% para 29%, com 16 e 48x
cobertura, para a amostra de NMP e da leucemia aguda, respectivamente.
Mutações em alguns genes tais como TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, DNMT3A já
foram associados à NMP, principalmente à progressão leucêmica. Desta forma, já
havíamos escolhido os éxons acometidos com maior frequência por mutações (hot
spots) dos genes TET2, IDH1 e IDH2 para a busca de mutações, através de
sequenciamento direto utilizando o método de Sanger. Como discutido, quando
analisados por sequenciamento direto, não foram observadas mutações exônicas
nestes genes. O sequenciamento por WES confirmou e ampliou estes resultados,
mostrando ausência de mutações nos éxons analisados por sequenciamento direto
e nos outros éxons cobertos pelo WES, dos genes previamente estudados (TET2,
IDH1 e IDH2) e também nos genes ASXL1 e DNMT3A.
Entretanto, mutações nas diferentes isoformas dos genes TET3, ASXL2,
DNMT3B foram observadas.
Um gene recorrentemente mutado em 2/3 pacientes foi o TP53, no paciente
719, JAK2V617F positivo, que apresentou duas mutações em TP53, p.Tyr236Asp e
p.Arg267Trp, e o paciente 249 que apresentou a alteração p.Ser106fs (deleção de
1pb). A mutação p.Tyr236Asp é descrita no COSMIC (Catalog of Somatic Mutations
in Cancer) em 2/7 pacientes com neoplasias linfoides (B e T) e a mutação
p.Arg267Trp descrita em 1/30 amostras de leucemia linfoide aguda (LLA-B). Para a
posição 106, estão descritas somente quatro tipos de mutações, tendo sido
encontrada somente uma descrição com o mesmo tipo de mutação que
encontramos, e esta associada a câncer de esôfago.
Com relação à categoria de genes associados ao spliceossoma, encontramos
mutações no gene SF3B1 e nas isoformas de outros genes desta categoria, já
descritos em SMD e NMP, tais como os genes U2AF1L4 e SRSF3. Mutações em
SF3B1 foram descritas como fortemente associadas à presença de sideroblastos em
anel nos subtipos de SMD, ARSA (85%) e ARSA-t (87%). Nós encontramos a
mutação descrita como de maior frequência, p.Lys700Glu, no paciente #249. Ao
diagnóstico, este paciente apresentava trombocitose (plaquetas >450mil/mm³) e
anemia (hemoglobina < 12g/dL). A presença de sideroblastos em anel não pode ser
verificada porque a coloração de Perls na BMO não funcionou, muito provavelmente
73
devido ao efeito deletério do ácido no processo de descalcificação e o mielograma
do paciente não estava acessível para análise. De fato, a recomendação para
realização da técnica para evidenciar sideroblastos em anel é no material de
mielograma para que sejam evitados problemas, do tipo que nos deparamos,
decorrentes do pré-analíticos.
Com relação à descoberta de novas mutações que possam estar implicadas
na progressão da fase crônica de uma NMP para leucemia aguda, foram observadas
uma média de 16 mutações exônicas/paciente (13 SNV e 3 INDELS), que possuem
pelo menos 1,5X de aumento na amostra leucêmica, quando comparada à amostra
ao do diagnóstico de NMP. Se ampliarmos a análise para todos os clones que
aumentaram na progressão leucêmica, observamos uma média de 85 mutações
exônicas/paciente (69 SNV e 16 INDELS) e 13 mutações que foram estáveis entre o
diagnóstico e a progressão leucêmica (12 SNV e 1 INDEL).
A análise da evolução clonal mostrou que há dois clones que permanecem
em equilíbrio (frequência alélica estável), mesmo após a leucemogênese (figura
4.24). O clone dominante está presente em cerca de 70% do tumor e apresenta
mutações diretoras encontradas nas NMP associadas a mutações em JAK2, a
clássica V617F, e uma nova (p.Arg1063Cys) localizada no domínio cinase e
revelada pela primeira vez neste trabalho (figura 4.25). O outro clone ocupa o
restante dos 30% do tumor e carrega as mutações subclonais associadas a
leucemia aguda (figura 4.24). Neste clone temos um subclone que regride de
tamanho na leucemia aguda e que carrega a mutação em CALR, outro que se
prolifera e que apresenta mutações em TP53, MDM4 e MAPK15 (figura 4.25). O
paciente #719 apresenta uma evolução clonal convergente, pois na amostra ao
diagnóstico ele já apresentava uma mutação pontual em TP53 em 66% do tumor
que regrediu na progressão leucêmica, entretanto o outro subclone adquiriu uma
nova mutação em TP53.
74
Figura 26 Figura 4.24: Análise de clonalidade nos pacientes analisados por WES. A análise individual
dos pacientes mostrou o mesmo padrão clonal em todos eles, com um clone majoritário ocupando 70% do tumor e um clone minoritário ocupando o restante do tumor. Os clones também se apresentaram em equilíbrio ao longo da progressão da doença da fase crônica para fase aguda.
75
Figura 27 Figura 4.25: Análise individual da frequência alélica dos genes associados às NMP ao longo
da progressão da doença da fase crônica para fase aguda. Notar que as mutações presentes no clone majoritário são as mutações classicamente associadas às NMP. Na fase aguda, observamos dois pacientes com mutações em TP53 que são específicas desta fase. No paciente JAK2V617F, observamos uma mutação em TP53 desde a fase de NMP, mas o clone que contém esta mutação tem uma perda proliferativa na fase aguda. O paciente com ins 5pb em CALR não apresentou mutação em TP53.
76
Avaliando a possibilidade de existirem recorrências de genes mutados nos
três pacientes analisados, observamos que 28 genes apresentavam-se nesta
condição, sendo que 16 deles possuíam mutações exclusivas, que algumas vezes
apresentava-se como indel em um paciente e como SNV em outro; os outros 12
genes possuíam o mesmo tipo de mutação entre os pacientes. Apesar de termos
excluído as variantes reportadas em bancos de dados de SNPs e termos
confrontado nossos dados com 25 controles, a possibilidade de serem SNPs não
pode ser refutada, uma vez que não foi utilizado nenhum tecido não tumoral do
mesmo paciente para exclusão das variantes germinativas.
A análise de ontologia de genes baseando-se nos dados de anotações
funcionais mostrou que as mutações somáticas encontradas remetem para vias de
transcrição, regulação da transcrição e regulação do processo metabólico do RNA
(108 genes estão na via de RNA / 295 genes com mutações somáticas = 36%). A
análise somente com os genes associados ao mecanismo de progressão leucêmica
mostrou um agrupamento e recorrência de genes envolvidos na via de regulação da
transcrição e regulação de RNA. Estes genes eram praticamente todos pertencentes
à família dedo de zinco.
A figura 4.26 mostra um resumo integrativo dos resultados de aCGH e WES
dos três pacientes que progrediram para leucemia aguda.
Figura 28 Figura 4.26: Resumo dos resultados de análise genômica utilizando as técnicas de aCGH e
WES nos três pacientes com diagnóstico inicial de TE que progrediram para leucemia aguda. Em cada círculo estão representados os genes alterados que já possuem alguma associação com NMP. As interseções representam os achados recorrentes. O paciente 719 possui duas mutações pontuais em TP53 e o paciente 249 apresentou um indel em TP53 que ocasionou mudança na fase de leitura. Na amplificação do 2p e no círculo menor denominado del17 estão representados os genes situados na região alterada (número de cópias) que possuem associação previamente descrita com NMP.
77
4.4.3. Validação de alguns genes do WES numa coorte JAK2 negativa
Para validar alguns de nossos achados, escolhemos dentro do subgrupo de
estudo HUPE-HUAP os pacientes JAK2V617F negativos, com diagnóstico inicial de
TE, MF, NMP-U e SMD para validação dos resultados. Optamos para validação a
inclusão dos seguintes genes e éxons: CALR (éxon9), SF3B1 (éxons 14 e 15), TP53
(éxon 2 a 8) e MAPK15/ERK8 (éxon 11 e 12).
Para CALR estudamos 66 pacientes JAK2V617F negativos e os resultados
mostraram que 46% dos pacientes possuem alterações do tipo INDEL em CALR e
54% possuem o alelo na sua versão selvagem (figura 4.27).
Figura 29 Figura 4.27: Distribuição das mutações em CALR em um subgrupo de pacientes
JAK2V617F negativos proveniente de 2 centros (HUPE e HUAP). wt- wild type (selvagem).
Nesta validação inicial conseguimos cobrir, do total de pacientes JAK2V617F
negativos, 70% das TE, 35% das MF, 88% das NMP-U e 44% das SMD presentes
em nosso subgrupo de estudo HUPE-HUAP com 332 pacientes.
Em TE observamos que 62% dos pacientes JAK2V617F negativos
apresentaram indels em CALR, sendo a inserção de 5pb (p.K385fs*47) a mais
frequente. Em MF, observamos indels em CALR em 67% dos pacientes, que neste
caso apresentou deleção de 52pb (p.L367fs*46) como a mais frequente. Nos casos
de NMP-U observamos somente 23% dos pacientes portadores de indels, sendo
neste caso a mais recorrente a inserção de 5pb. Em SMD não conseguimos detectar
indels em CALR (figura 4.28).
78
Figura 30 Figura 4.28: Distribuição das mutações em CALR de acordo com as categorias clínicas
analisadas. Em TE, a ins5pb e a del52pb estão presentes em 41% e em 21% dos pacientes, respectivamente. Em MF, a ins5pb e a del52pb estão presentes em 17% e 50% dos pacientes. Em NMP-U observamos 18% e 5% das mutações sendo ins5pb e del34pb, respectivamente. TE-trombocitemia essencial; MF – mielofibrose; NMP-U – neoplasia mieloproliferativa crônica não classificável; SMD – síndrome mielodisplásica; wt – wild type (selvagem).
Adicionalmente foram avaliados quatro pacientes JAK2V617F positivos que
serviram como controles negativos para mutações no éxon 9 de CALR. Os
resultados destes quatro pacientes confirmaram os achados de outros grupos
publicados previamente em que as mutações em JAK2V617F e CALR são
excludentes. Esses quatro pacientes testados possuem o diagnóstico de TE e MF.
O segundo gene testado foi SF3B1, que está mutado em 86% dos casos de
ARSA e ARSA-t e somente 2% dos casos de TE e MF. Os éxons 14 e 15 deste gene
foram avaliados em 51 pacientes, todos apresentando a versão selvagem do alelo.
Alterações no gene TP53 têm alta prevalência no câncer, e também na
leucemia mielóide aguda secundária. É de se notar que, na comparação dos genes
candidatos encontrados neste trabalho, associados a progressão para leucemia
aguda, com os genes encontrados em outros trabalhos que utilizaram técnicas de
sequenciamento massivo paralelo em NMP, este foi o único gene recorrente. Nesta
parte do trabalho quando analisamos os éxons 2 a 8, por sequenciamento direto,
observamos 3/45 (7%) pacientes portadores de mutações em TP53. As mutações
encontradas foram: p.Trp146*, p.Cys242Gly, p.Arg273Cys. Na posição 242
encontramos a mutação p.Cys242Gly reportada previamente, no COSMIC, em
casos de neoplasias hematológicas de origem linfóide e em cânceres de origem não
79
hematológica. O paciente da nossa coorte, portador deste tipo de mutação,
apresentava o diagnostico de TE. A mutação p.Arg273Cys também foi observada
em um paciente com diagnóstico de TE, e este tipo de mutação tem sido
classicamente associada a Síndrome de Li Fraumeni. No banco de dados COSMIC,
a mutação p.Arg273Cys tem 477 ocorrências, sendo 23 relatadas em tecidos
hematopoéticos. Há 40 descrições da mutação p.Trp146* (c.437G>A) no COSMIC,
sendo que 5 dessas mutações foram observadas em amostras de tecido
hematopoético. Neste trabalho, o paciente portador desta mutação foi diagnosticado
com MF.
Para os éxons 11 e 12 de MAPK15/ERK8 triamos 49 pacientes, sendo que 40
(82%) deles portavam o alelo selvagem e 9 (18%) o alelo variante (p.Pro358Leu,
p.Gly385Asp, p.Ala373Pro, p.Leu424Pro). Dos que portavam o alelo selvagem em
MAPK15, 17 possuíam indels em CALR e dois apresentaram mutação em MPL. Dos
pacientes que apresentaram variações em MAPK15 (p.Pro358Leu, p.Gly385Asp), 5
possuíam indels em CALR (p.L367fs*46, p.K368fs*51, p.K385fs*47). As variações
encontradas em MAPK15, em geral foram muito recorrentes, sugerindo tratarem- se
de polimorfismos. A variação mais frequente neste gene a p.Pro358Leu, possui uma
frequência de 5% reportada no projeto 1000genomas, e foi encontrada em 4/49
(8%) dos pacientes (3 TE e 1 MF) deste estudo. A variação p.Gly385Asp foi
observada em 2/49 (4%) pacientes (1 TE e 1 NMP-U) e é reportada no banco de
dados 1000genomas em frequência de 1% dos indivíduos. A variação p.Ala373Pro
foi observada em 1/49 (2%) pacientes e no 1000 genomas em 5% das 1088 pessoas
estudadas. A variação p.Leu424Pro foi observada em 1/49 pacientes (NMP-U) neste
estudo e com frequência de 3% no 1000genomas, sugerindo que esta variação
também seja um polimorfismo. Esta variação também foi observada no paciente
#249 no estudo de WES. No início desse estudo, os dados do 1000genomas ainda
não estavam disponíveis para consulta.
Os três pacientes com mutações em MPL não apresentaram mutações
adicionais em nenhum dos éxons dos genes estudados.
80
5. Discussão
5.1. JAK2
A análise da frequência da mutação V617F em JAK2 e da sua carga alélica
frente ao tratamento, bem como a descoberta de biomarcadores que possam servir
como marcador de diagnóstico e monitoramento da resposta terapêutica em NMP
têm sido alvo de estudo durante anos. De forma semelhante, nosso estudo visou
comparar a nossa coorte com os resultados já descritos na literatura e aprofundar o
estudo em alguns aspectos ainda não completamente elucidados, como a
investigação sobre alguns dos mecanismos responsáveis pela progressão da fase
crônica para a fase aguda (leucemia) em NMP.
Dessa forma, este trabalho implementou e aprimorou no laboratório algumas
das metodologias de diagnóstico em NMP e estabeleceu alguns exames que não
estavam disponíveis anteriormente a este trabalho. Como exemplo, temos os
ensaios de detecção de mutações em MPL, éxon 12 e 14 de JAK2, CALR, IDH1/2,
TET2, em que alguns deles já estão incluídos na rotina diagnóstica. A quantificação
da carga alélica de JAK2V617F foi aprimorada e validada por outras metodologias e
permitiu a análise da flutuação da carga alélica frente ao tratamento com hidroxiureia
durante o acompanhamento de pacientes JAK2V617F, que culminou em dois
trabalhos de colaboração. O estudo da progressão leucêmica usando tecnologias
genômicas de alta resolução é pioneiro e trouxe novas informações sobre o
entendimento da heterogeneidade clonal em NMP.
A avaliação da frequência de JAK2 na coorte de estudo mostrou resultados
semelhantes à literatura, em que a frequência da mutação JAK2V617F em PV é
acima de 95%, em TE cerca de 50% e em MF por volta de 60%. Em nosso subgrupo
de estudo, tivemos em PV 92% dos pacientes portando a mutação JAK2V617F, em
TE 46% e em MF 48%. Na literatura, para PV, é demonstrado que praticamente
todos os pacientes possuem mutações em JAK2, seja no éxon 12 ou 14. Em nosso
subgrupo não encontramos pacientes portadores de mutações em JAK2 que não
fossem a p.Val617Phe. Nestes casos, além de uma revisão criteriosa da biópsia de
medula óssea, também é recomendada a dosagem de eritropoietina (TEFFERI,
2013a). Entretanto, este exame laboratorial raramente é realizado nos hospitais que
nos enviaram as amostras e por isso vários pacientes não possuem este dado
laboratorial em seus prontuários. Além disso, utilizamos o sequenciamento direto
81
pelo método de Sanger modificado para detecção das mutações no éxon 12 de
JAK2. Dessa forma, é possível que a sensibilidade do ensaio por nós realizado não
seja suficiente para detectar mutações no éxon 12 em todos os pacientes. Relatos
na literatura mostraram uma maior prevalência de mutações no éxon 12 de JAK2
quando o ensaio é realizado especificamente no DNA extraído da linhagem
eritrocítica e por isso a extração de DNA de colônias eritróides seria mais
recomendado do que a utilização de granulócitos (CAZZOLA, 2007).
Através da dosagem da carga alélica de JAK2V617F foram evidenciadas
algumas associações descritas na literatura, tais como: a) maior homozigosidade em
PV; b) cargas alélicas abaixo de 50% em TE; c) PV é mais frequente em homens e
TE em mulheres; d) os pacientes com carga alélica mais alta possuem maior
tendência a apresentar eventos trombóticos; e) os pacientes com TE e com carga
alélica mais alta (>50%) geralmente apresentam níveis de hematócrito,
hemoglobina, leucócitos e neutrófilos mais altos e número de plaquetas mais baixo
do que os pacientes que apresentam o alelo em heterozigose (CAMPBELL et al.,
2005; CAMPBELL, 2006; BAROSI et al., 2007b; VANNUCCHI et al., 2007c;
ANTONIOLI et al., 2008;).
Em vista desses dados, foi possível comparar nosso subgrupo de estudo com
alguns já descritos na literatura. Em geral, os nossos resultados estão em
conformidade com os descritos na literatura. Por exemplo, observamos que a
maioria dos pacientes com PV apresentou carga alélica da mutação V617F acima
dos 50% e hematócrito mais alto em relação aos pacientes com carga alélica abaixo
dos 50%. O número de plaquetas costuma ser mais baixo nos pacientes com PV
com carga alélica acima de 50% do que aqueles com carga alélica abaixo dos 50%.
Nesse sentido, nosso resultado foi controverso, mas há relatos na literatura de que
pacientes com PV podem cursar com trombocitose e ter um maior risco de eventos
trombóticos (OHYASHIKI et al., 2007). De fato, os eventos trombóticos foram o
segundo evento adverso mais frequente em PV. Desta forma, estes dados podem
sugerir que tenhamos um subgrupo de pacientes que cursam com trombocitose,
sendo interessante estendermos as nossas análises. Outro dado em contradição
com a literatura foi a observação da PV sendo mais frequente em mulheres do que
em homens.
Em TE observamos um maior número de pacientes com carga alélica da
mutação abaixo dos 50%, e em nossa coorte os pacientes mais velhos
82
apresentaram carga alélica mais alta. Além disso, a TE também se apresentou mais
frequente em mulheres do que em homens, reforçando os dados publicados
previamente por outros grupos (ANTONIOLI et al., 2005, 2008; CAMPBELL et al.,
2005).
Com relação à flutuação da carga alélica ao longo do acompanhamento,
nossos resultados foram semelhantes à literatura com relação a uma maior
diminuição da carga alélica na primeira administração da hidroxiureia após o
diagnóstico. Já a manutenção da hidroxiureia ao longo do tratamento resultou em
variações mais sutis da carga alélica. Nosso grupo foi o primeiro a demonstrar que
as maiores variações parecem estar nos pacientes com carga alélica entre o 2º e 3°
quartis (ZALCBERG et al., 2011).
A frequência de mutações em MPL na nossa coorte também foi semelhante à
literatura, com frequência de 7% em TE.
5.2. CALR
Em dezembro de 2013 foi descrito pela primeira vez, que pacientes
JAK2V617F negativos podem apresentar Indels na CALR em cerca de 67-82% dos
pacientes com TE, 80-88% dos pacientes com MF e 12,5% em ARSA-t (KLAMPFL
et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a) o que demonstra a importância que a
detecção molecular destas alterações terão no auxílio ao diagnóstico das NMP. Este
novo marcador recentemente descrito nos levou a avaliar em nossa coorte
JAK2V617F negativa a frequência dessas alterações, para que pudéssemos
correlacionar o seu impacto no prognóstico e na caracterização genética desses
pacientes.
A nossa análise inicial no subgrupo de estudo mostrou a inserção de 5pb
(p.K385fs*47) em 62% das TE, e a deleção de 52pb (p.L367fs*46) em 67% das MF,
o que foi semelhante aos resultados relatados nos estudos que descreveram este
novo marcador (KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013b). Neste subgrupo de
validação, resolvemos avaliar as NMP-U por ser um grupo de difícil diagnóstico e no
qual a caracterização da mutação poderá ajudar na decisão clínica quanto ao
diagnóstico final. Assim, foi possível observar que 23% dos casos de NMP-U eram
portadores de indels em CALR, sendo a inserção de 5pb a mais recorrente. Este
dado será importante numa possível correlação desta mutação com o fenótipo
destes pacientes, principalmente naquelas entidades clínicas que apresentam a
trombocitose como manifestação clínica, tais como a TE, a MFS à TE, e a ARSA-t.
83
Por exemplo, em um dos pacientes com NMP-U detectamos a presença de uma
deleção de 34pb (p.K368fs*51) que foi observada anteriormente em casos de TE e
MF primária (NANGALIA et al., 2013a) mostrando, dessa forma, a importância do
rastreamento molecular de mutações para o direcionamento do diagnóstico clínico.
Apesar da literatura relatar uma baixa frequência de indels em CALR em
SMD, em nossa pesquisa inicial não detectamos indels em CALR.
Um fato curioso são os baixos relatos de INDELS em CALR em pacientes
com progressão da doença tanto para MFS quanto para LA (KLAMPFL et al., 2013),
diferentemente do que observamos em nossa coorte na qual tivemos um paciente
com TE que progrediu para LA. A identificação de mutações em genes na LA com
frequência superior à fase crônica sugere a relação desses genes com o processo
de progressão leucêmica. Desta forma, a análise adicional desses genes deve ser
realizada para avaliar a importância destes como marcadores prognósticos.
Do ponto de vista celular, a calreticulina é uma proteína imunogênica
fortemente associada a sinais de apoptose da célula neoplásica, induzindo a
fagocitose mediada por células dendríticas (GARDAI et al., 2005; TESNIERE et al.,
2007; ZITVOGEL et al., 2008; KEPP et al., 2009; CHAO et al., 2010). Entretanto, os
resultados dos estudos funcionais com células COS-7 transfectadas com a proteína
CALR mutante mostraram que a CALR permanece no RE (NANGALIA et al., 2013a).
Células tumorais tratadas com antraciclinas ou radiação induzem a expressão de
CALR na superfície, como sinal de morte. Seria interessante observar se a proteína
mutada possui esta função preservada após o tratamento com antracilinas, o que
poderia torná-la um alvo terapêutico.
A deleção do domínio KDEL em 21 proteínas de localização no RE resultou
na secreção/ exposição na superfície de somente três destas, demonstrando que
outros mecanismos são necessários para causar distúrbios na localização celular de
proteínas que apresentam este peptídeo de localização. Proteínas como CALR e
CALR3 podem formar complexos que fazem com que elas permaneçam no RE,
mesmo com a perda do domínio KDEL c-terminal. A deleção do domínio KDEL em
CALR3 não afetou a localização no RE, indicando que este domínio não é
determinante para o sinal de localização desta proteína (RAYKHEL et al., 2007). O
paciente que apresentou a inserção de 5pb também apresentou uma mutação
pontual em CALR3. Investigar o efeito da interação entre essas duas proteínas
84
mutantes pode ser interessante na busca de um entendimento mais profundo da
biologia da doença.
Estudos in vitro com células Ba/F3 transduzidas com a mutação mais
frequente de CALR (del 52pb), mostraram ativação de STAT5 e crescimento
independente de IL3 (KLAMPFL et al., 2013). Estes resultados mostram que a via
JAK2-STAT5, que sabidamente está ativada nos pacientes JAK2V617F positivos,
parece ser uma via de ativação comum dos pacientes com NMP independente da
mutação encontrada (LAUBACH et al., 2009; OKU et al., 2010).
5.3. Progressão leucêmica
As progressões de NMPs para as leucemias são eventos raros e ocorrem em
cerca de 5-7% dos casos (ABDULKARIM et al., 2009). A evolução mais comum é
uma transição de TE e PV para MF secundária e, a partir da MF, a evolução para
leucemia aguda. Semelhante aos dados descritos na literatura, observamos em
nosso grupo de estudo uma frequência de progressão para LA de 7%.
Há relatos na literatura sobre a presença de anormalidades citogenéticas na
fase de NMP, sendo detectada de 5-15% em TE, 15-35% em PV e 44-50% em MF
(TEFFERI et al., 2001; STEENSMA; TEFFERI, 2002; GANGAT et al., 2008, 2009;
TEFFERI et al., 2009). Em nosso estudo, foi observada uma maior complexidade
citogenética na fase de leucemia aguda, com um aumento do número e da
amplitude das anormalidades, o que demonstra a severidade da progressão
leucêmica. Vale ressaltar que um dos pacientes apresentou, desde a amostra ao
diagnóstico, muitas alterações em diversos cromossomos, e mesmo na fase de
leucemia aguda este paciente apresentou aumento das regiões alteradas, com
aquisição da +2p e del5q. O número de regiões alteradas não superou o número de
anormalidades cromossômicas ao diagnóstico, mas o tamanho das novas alterações
adquiridas foi, em geral, maior.
Diferentemente dos casos já descritos na literatura, não observamos
mutações no éxon 4 dos genes IDH1 e 2, já amplamente associadas à leucemia
aguda, e também não observamos as alterações citogenéticas recorrentes tais como
del(20q), del(13q), que possuem prognóstico mais favorável (DINGLI et al., 2006),
+8, +9, e anormalidades nos cromossomas 1 e 7 (BENCH et al., 1998; NAJFELD et
al., 2002).
Encontramos recorrência nas alterações de +2p e del5q. A +2p possui raras
descrições prévias na literatura (BRECQUEVILLE et al., 2013; GANGAT et al.,
85
2009), mas a del 5q é bastante recorrente (SANTANA-DAVILA et al., 2008a, 2008b;
GANGAT et al., 2009; THOENNISSEN et al., 2010; MILOSEVIC et al., 2012;
BRECQUEVILLE et al., 2013), principalmente na SMD, onde constitui uma entidade
clínica distinta e de bom prognóstico (GIAGOUNIDIS et al., 2004; LEHMANN et al.,
2007; EBERT, 2009;).
As características da síndrome do 5q, como a doença é conhecida, são
anemia macrocítica, número de plaquetas normal ou elevado, micromegacariócitos
hipolobados, contagem de neutrófilos normal ou discretamente diminuída, e um
baixo índice de progressão para leucemia aguda (GIAGOUNIDIS et al., 2004;
EBERT, 2009, 2011;). A região comum minimamente deletada do 5q possui mais de
40 genes, com vários genes supressores de tumor inclusos. Nesta região há duas
deleções mais comuns, uma mais proximal e outra mais distal. A proximal está na
região q31 e inclui genes como EGFR1 e a distal, q33, onde estão genes como
RPS14, que causa o bloqueio da diferenciação eritróide e, como consequência, o
desenvolvimento de anemia macrocítica. O gene RPS14 codifica a subunidade
ribossomal 40S (EBERT et al., 2008).
Outro alvo importante desta região são os microRNAs, miR145 e miR146a,
que, após o knockdown, foram apontados como responsáveis pelo fenótipo de
megacariócitos hipolobados e trombocitose periférica em camundongos. Em
humanos foi observada a baixa expressão desses dois miRNAs em pacientes com
SMD (STARCZYNOWSKI et al., 2009). Os pacientes que analisamos apresentaram
anemia durante a progressão leucêmica, mas não podemos afirmar que era
macrocítica por falta de uma descrição detalhada do hemograma. A BMO dos
pacientes ressalta o aumento de megacariócitos, mas não descreve com maior
riqueza de detalhes a morfologia dessas células. Outro fato interessante é o próprio
prognóstico dos pacientes que apresentaram a del5q na progressão leucêmica. Na
SMD, a del 5q é tida como fator de bom prognóstico e de menor risco de progressão
para leucemia aguda. Nesta síndrome, no entanto, a del5q é encontrada isolada,
fato que não observamos em nossos pacientes. A presença de outras alterações
cromossômicas junto com a del5q parece modificar o prognóstico e o fenótipo da
doença, que neste caso se mostra muito mais agressiva.
A análise de agrupamento de genes na região deletada do cromossoma 5q
mostrou 9 genes deletados envolvidos na via de JAK-STAT (IL4, CSF2, TSLP, IL3,
IL5, IL9, IL13, IL12B, SPRY4) e 4 desses genes também envolvidos na fisiologia
86
hematopoética (CSF2, IL3, IL4, IL5). Alguns estudos apontam o papel que a
modulação de citocinas em tumores sólidos pode desempenhar no recrutamento de
linfócitos, gerando um microambiente tumoral que pode ser importante no controle
da proliferação tumoral (FINN, 2008). No caso de tumores líquidos como as NMP,
essa modulação pode estar ocorrendo diretamente no plasma, gerando um efeito
sistêmico ou ainda no microambiente da medula óssea. A variação no número de
cópias dos genes de citocinas e de receptores de citocinas em câncer colorretal
mostrou que a diminuição de expressão de IL15 e de genes de citocinas agrupados
no cromossoma 4 modula a quantidade de linfócitos T e B infiltrantes e, como
conseqüência, há uma maior proliferação tumoral e maior risco de recorrência e
metástase (MLECNIK et al., 2014). O impacto das deleções que descrevemos neste
trabalho ainda devem ser avaliadas sob o ponto de vista tanto da função na
maturação da célula mutada, quanto nas interações com outras populações
celulares.
Vários genes de citocinas estão localizados nos cromossomas 1, 5 e 9 e já é
sabida a existência de vários pacientes com NMP com alteração do número de
cópias nos cromossomas 5 e 9. Desta forma, estes resultados sugerem um papel
potencial das citocinas nestas doenças, aspecto ainda pouco explorado. De fato, o
tratamento de pacientes refratários ao uso de hidroxiureia com interferon alfa tem-se
mostrado eficaz (HASSELBALCH et al., 2014). Os dados do tratamento de pacientes
com ruxolitinib, que inibe JAK1 e JAK2, mostrou a diminuição do nível sérico de
várias citocinas pró-inflamatórias tais como a proteína C reativa (VERSTOVSEK et
al., 2010).
A região amplificada do cromossoma 2p nos pacientes analisados mostrou
ganho em genes da maquinaria de controle epigenético, tais como DNMT3A,
ASXL2, DPY30, o que pode representar um aumento no padrão de metilação global
do DNA caso esses genes estejam funcionando de forma exacerbada devido a uma
desregulação estequiométrica. De fato, mutações em genes da maquinaria
epigenética já foram associados à fase crônica de NMP (VANNUCCHI; BIAMONTE,
2011) e com frequência aumentada na fase aguda ou blástica (TEFFERI; NOEL;
HANSON, 2011). Desta forma, seria interessante aprofundar o estudo nesta região,
utilizando um maior numero de casos, a fim de observar a frequência da del2p e
tentar associar esta deleção com a progressão da doença.
87
A perda do padrão de metilação com a consequente hipermetilação global do
genoma é um fenômeno amplamente associado ao processo de carcinogênese
(SHEN; LAIRD, 2013). O padrão de metilação aberrante foi observado na leucemia
aguda promielocítica, mas não parece ser o evento chave, tendo um papel
secundário na leucemia aguda secundária (SCHOOFS et al., 2013). A desregulação
da expressão de genes através da alteração dos mecanismos epigenéticos da célula
foi observada como um dos principais processos patogênicos na SMD e na LMA
secundária, mas que ainda não é bem entendido. Sabe-se que há mutações em
diversos genes que regulam a maquinaria epigenética, tais como TET2, IDH1/2,
EZH2, DNMT3A, e que essas mutações estão pouco associadas às neoplasias
linfoproliferativas (VOSO et al., 2013).
Em NMP, um estudo com 35 amostras de fase crônica, TE e PV, não mostrou
padrão de metilação aberrante ou diferencial entre as doenças estudadas. Desta
forma, a alteração no padrão de metilação não parece ser um evento essencial na
fase crônica das NMP clássicas (BARRIO et al., 2011). Entretanto, diversos estudos
tentaram mostrar que reguladores negativos da via JAK-STAT poderiam estar
silenciados através de metilação do gene, alterando, portanto a sua expressão
(JOST et al., 2007; FOUROUCLAS et al., 2008).
No caso da transformação leucêmica dos pacientes que estudamos, uma
investigação adicional será necessária para obtermos dados sobre o padrão de
metilação desses pacientes. Dessa forma poderemos saber se a evolução para
leucemia aguda está induzindo algum padrão aberrante de metilação e se este
padrão está presente desde a fase crônica ou se seria um evento específico da
progressão leucêmica. Em geral, as alterações encontradas em reguladores
epigenéticos sugerem perda de função, como no caso de DNMT3A na leucemia
aguda (LEY et al., 2010). No nosso caso, estas alterações, diferente do esperado,
tiveram como consequência um aparente aumento de função. De forma adicional,
não foram encontradas mutações nos genes da maquinaria de metilação
classicamente associados às NMP, somente nas suas isoformas. Faz-se, portanto,
necessário um estudo funcional destas alterações novas a fim de que seja possível
um melhor entendimento do papel destas mutações na patogênese da doença.
Mutações em genes de maquinaria de splicing também já foram reportadas
em NMP (BRECQUEVILLE et al., 2012), e na leucemia aguda (MAKISHIMA et al.,
2012), mas estas mutações são mais frequentes na SMD ou na leucemia linfocítica
88
crônica (LLC) (GRAUBERT et al., 2011; PAPAEMMANUIL et al., 2011; QUESADA et
al., 2011; WANG et al., 2011; LANDAU et al., 2013). O gene mais recorrentemente
mutado é o SF3B1 que compõe a subunidade U2 da maquinaria de splicing, mas há
outros genes como o U2AF1 que também estão largamente associados à SMD.
Nos casos que estudamos, encontramos a mutação mais frequentemente
reportada em SF3B1, a p.Lys700Glu, que está fortemente associada à ARSA (85%)
e ARSA-t (87%). A descoberta da mutação em SF3B1 conjuntamente com os dados
clínicos que mostraram trombocitose e anemia ao diagnóstico no paciente que
estudamos, são fortes indícios de que o diagnóstico final deste paciente
provavelmente seja uma anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitose
(ARSA-t). Infelizmente não conseguimos ter acesso ao mielograma para realizarmos
a coloração de Perls a fim de evidenciar os depósitos de ferro nos eritrócitos.
Tivemos acesso aos blocos da BMO, mas a coloração não funcionou, muito
provavelmente devido ao efeito deletério do ácido na descalcificação (THAM;
COUSAR, 1993; STUART-SMITH, 2005). Este caso ilustra o impacto da
investigação de lesões moleculares e mutações na determinação do diagnóstico
hematológico correto, especialmente para entidades complexas em que pode haver
diagnósticos imprecisos.
A análise de clonalidade mostrou que a mutação em SF3B1 está presente no
subclone majoritário e que praticamente não há flutuação de carga alélica entre a
fase crônica e aguda. De fato, resultados recentes da literatura corroboram nossos
dados, mostrando que as mutações em SF3B1 são adquiridas desde o diagnóstico e
que a progressão da doença ocorre com a aquisição de mutações em outros genes
(LIN et al., 2014). Ao procurarmos mutações em SF3B1 nos pacientes que possuíam
evidências de trombocitose e anemia ao diagnóstico, não observamos nenhum outro
paciente portador de mutação neste gene. No trabalho de LIN et al. (2014), a
detecção de mutações em SF3B1 em dois pacientes só foi possível a partir da
clonagem do DNA amplificado dos mesmos. O grupo reportou a presença de
mutações em SF3B1 em 10% dos pacientes analisados com diagnóstico de SMD
(48/479), sendo 62% das mutações presentes em ARSA. Já o trabalho de WANG et
al. (2014) mostrou a presença de mutações em SF3B1 em 2/31 pacientes com PV.
A taxa de incidência da ARSA-t é baixa (e.g. 21 casos em 20 anos em
Duesseldorf) (WARDROP; STEENSMA, 2009), sendo que de 10 a 20% dos
pacientes com ARSA apresentam trombocitose. Tais dados demonstram a
89
dificuldade em se ter um bom diagnóstico e uma coorte de ARSA-t que possibilite a
descoberta de marcadores que melhor diferenciem ARSA-t da TE e da ARSA. O
caso que estudamos apresentou mutação em U2AF1L4, que também faz parte da
maquinaria de splicing, sugerindo que pacientes que apresentem fenótipo de doença
com características mais relacionadas à SMD parecem apresentar genes
relacionados à maquinaria de splicing mais frequentemente mutados.
Trinta e um a 76% dos pacientes com ARSA-t também podem apresentar
mutações em JAK2 (BOISSINOT, 2006; JEROMIN et al., 2013) e, em alguns casos
(13%), podem não apresentar mutação em SF3B1, mas apresentar somente a
mutação clássica em JAK2 (JEROMIN et al., 2013). No paciente que analisamos,
não foi detectada a mutação clássica de JAK2, mas observamos uma mutação não
reportada previamente, no domínio cinase de JAK2 (p.Arg1063Cys), que foi definida
como mutação pela análise in silico por ter um potencial efeito deletério na função
proteica.
Previamente, o domínio cinase de JAK2 foi estudado e foram observados
3/93 pacientes com diagnóstico de PV com mutações somáticas não sinônimas no
mesmo resíduo (p.Arg1063His), mas gerando uma modificação diferente da
alteração que encontramos (LEVINE et al., 2005). Recentemente foram descritas
duas mutações no domínio cinase de JAK2, p.Arg867Gln e p.Arg938Gln, ambas em
casos de trombocitose familiar. Estas mutações mostraram, em estudos funcionais
com células da linhagem Ba/F3-MPL, crescimento espontâneo e ativação de STAT1
(MARTY et al., 2014). No caso em que estudamos, não foi possível obter maiores
dados sobre os familiares do paciente, pois este declarou durante as anamneses
que não possuía contato com outros parentes além de seu filho, impossibilitando
uma análise mais aprofundada da nova mutação identificada com a hereditariedade.
Estudos funcionais que investiguem o efeito da mutação, bem como se há algum
efeito aditivo quando uma célula apresenta a mutação clássica em SF3B1 e a
mutação no domínio cinase de JAK2, contribuirão para um maior entendimento da
patogênese.
Buscando correlacionar a presença de genes mutados que pudessem
participar de vias de sinalização previamente descritas nas NMP, tais como JAK-
STAT, MAPK e PI3K, pudemos detectar pelo sequenciamento do exoma mutações
em MAPK15 em 3 pacientes. Uma das alterações encontradas foi prevista in silico
como tendo um efeito danoso. Após o início do nosso estudo de validação de
90
mutações nos éxons 11 e 12 de MAPK15 numa coorte de 49 pacientes JAK2V617F
negativos, os dados do projeto 1000 genomas para este gene se tornaram
disponíveis. Neste momento, pudemos comprovar que as duas mutações
observadas fora do domínio cinase pela técnica do WES eram polimorfismos e, de
fato, a previsão in silico era de um efeito benigno dessas alterações.
Apesar de MAPK15/ERK7/ERK8 ter sido a última molécula da família a ser
descrita (ABE et al., 2002), sua função já foi associada com o controle do ciclo
celular (GROEHLER; LANNIGAN, 2010; YANG et al., 2013), do fuso mitótico através
de ativação de proteínas que se ligam aos telômeros (CERONE et al., 2011),
ativação de ciclina D1(GROEHLER; LANNIGAN, 2010) e à transformação maligna
de linhagens de câncer de cólon (XU et al., 2010). O papel mais importante atribuído
a esta proteína foi na promoção da instabilidade genômica, e da proliferação celular,
tendo como resultado a transformação celular. Uma das funções atribuídas à
MAPK15 é interagir com PCNA, inibindo a ligação de HDM2 (GROEHLER;
LANNIGAN, 2010; NGUYEN; BIELINSKY, 2010). Mutações com perda de função em
ERK8 podem causar a degradação de PCNA através da sua poliubiquitinação
promovida por HDM2. A perda de função de PCNA no reparo do DNA causa
acúmulo de mutações e instabilidade genômica, o que pode resultar em
transformação celular. A ativação de ERK8 parece ser mediada pela quebra do DNA
em fita simples, recrutando-a para o reparo do DNA (KLEVERNIC; MARTIN;
COHEN, 2009).
Pouco se sabe sobre os reguladores da via que estão tanto a montante
quanto a jusante de ERK8. Sabe-se que ERK8 se autofosforila e não parece ter
reguladores a montante. Proteínas fosfateses parecem regular negativamente a
molécula (ABE et al., 2002; KLEVERNIC et al., 2006). Também já foi descrita uma
homologia proteica com ERK1/2/5 no motivo Thr-Glu-Tyr no loop de ativação
(KLEVERNIC et al., 2006). Além disso, sabe-se que em linhagens de câncer de
mama foi observada a perda de imunoreatividade à ERK8 e essa perda foi
correlacionada com a progressão tumoral, onde foi observada uma diminuição na
expressão de ERK8 sem que houvesse diminuição de ER1/2. Por isso tem-se
considerado a possibilidade de que ERK8 atue como um supressor tumoral
(HENRICH et al., 2003).
A presença de um mesmo perfil de sinalização que ativa a via JAK-STAT em
pacientes mutados para JAK2 e CALR sugere uma via comum de transformação
91
entre esses pacientes (RAMPAL et al., 2014). Assim, MAPK15 poderia estar
desempenhando um papel anterior a JAK2 na transformação neoplásica nas NMP.
Papel semelhante foi observado com TET2, que parece ser um evento anterior à
aquisição de mutações em JAK2 e a outras mutações associadas às NMP
(DELHOMMEAU et al., 2009).
O estudo de clonalidade sugere que a mutação em MAPK15 está presente no
mesmo clone de JAK2 e que a flutuação de carga alélica da fase crônica para a fase
aguda é praticamente imperceptível. Estudos visando agrupar as diferentes NMP de
acordo com as vias de sinalização ainda não conseguiram demonstrar uma
correlação clara entre a ativação de diferentes vias (STAT1, 3 e 5, AKT e PI3K), o
genótipo JAK2V617F mutado e o subtipo clínico de NMP (TEOFILI et al., 2007;
GRIMWADE et al., 2009; LAUBACH et al., 2009; MEYER et al., 2009; CHEN et al.,
2010; ANAND et al., 2011;). Um estudo recente utilizando arrays de expressão
mostrou expressão diferencial entre os pacientes mutados para JAK2, CALR e TET2
e doadores saudáveis. Para JAK2 também foi possível observar genes
diferencialmente expressos entre os pacientes com carga alélica de JAK2V617F
acima ou abaixo dos 50%. No entanto, os estudos de agrupamentos hierárquicos
não conseguiram agrupar de forma clara os diferentes subgrupos de NMP clássicas
de acordo com os perfis de expressão observados. PV foi o grupo mais homogêneo,
mas o resultado foi mais bem interpretado levando-se em consideração o efeito da
carga alélica em JAK2 acima de 50% que estes pacientes apresentam (RAMPAL et
al., 2014). Este fato reforça a heterogeneidade molecular observada entre os
subgrupos de NMP.
O primeiro artigo publicado em NMP utilizando técnicas genômicas de
sequenciamento de alta resolução tinha a proposta de sequenciamento de células
únicas (single cell) para estudo da heterogeneidade clonal. O grupo sequenciou as
células de um paciente com diagnóstico de TE, JAK2 negativo e que também não
apresentou mutações em outros genes classicamente associados às NMP tais como
TET2, MPL, ASXL1, CBL, IDH, e IKZF1 (HOU et al., 2012).
Quanto à heterogeneidade clonal, este trabalho sugeriu, através de
simulações de modelos matemáticos de evolução mono ou policlonal, a existência
de um único clone, com frequência alélica de mutações somáticas em torno de 50%,
resultado semelhante ao que observamos em nosso estudo de progressão
leucêmica. Eles também comentam que resultados sugerindo a presença de
92
somente um clone também podem ser encontrados quando um clone específico
possui uma vantagem seletiva maior que os demais, promovendo uma alta
proliferação deste clone majoritário. Por isso o grupo não descarta a possibilidade de
existir um subclone minoritário. Além disso, a análise de frequências alélicas de
mutações somáticas mostra um enriquecimento de mutações na frequência de 10 a
20% e um outro pico entre 50 e 60%. Este resultado de evolução clonal está
alinhado ao resultado que encontramos em nosso estudo de progressão leucêmica,
onde observamos a presença de um clone majoritário que compõe cerca de 70% do
tumor e um clone minoritário compondo 30%. O clone majoritário apresentou as
mutações que dirigem o tumor das NMP e o clone minoritário exibiu as mutações
mais fortemente associadas ao subclone leucêmico, como TP53. Ao final, o grupo
propõe uma lista de quatro genes (SESN2, ST13, DNAJC17 e TOP1MT)
considerados de interesse biológico para a patogênese da doença, mas nenhuma
validação destes genes foi realizada (HOU et al., 2012). Comparando esta lista de
genes com a lista dos genes que encontramos com aumento da frequência alélica
em pelo menos 1,5 vezes na amostra da fase aguda, não foi possível observar
correspondência, sugerindo que estes genes não participam na promoção da
leucemogênese.
O trabalho de BRECQUEVILLE et al. (2013) sequenciou 23 genes e analisou
por aCGH 80 pacientes com mielofibrose durante a fase crônica e a fase aguda com
progressão para mielofibrose secundária e para fase blástica. O estudo mostrou
alterações recorrentes, tais como del20q, del17 e del12p, que já haviam sido
descritas anteriormente. Os genes mais frequentemente mutados foram JAK2,
ASXL1, TET2, EXH2 e NF1. Os autores também enfatizaram que a análise global
dos resultados aponta para uma heterogeneidade genômica nos casos de MF,
apesar de algumas alterações recorrentes. Dentro desta diversidade apresentada,
pudemos observar semelhanças deste estudo aos resultados encontrados em nosso
trabalho, como um paciente apresentando ganho no 2p25.3p14, que foi a mesma
região recorrente nos dois pacientes que analisamos (+2p25.3p16.1 e
+2p25.1p13.3). O mais interessante nessas três amostras é a recorrência da região
de quebra. Este paciente que apresentou +2p também apresentou mutação em
TP53, e a ausência de del5q, bem como ausência da mutação clássica em JAK2.
Em nosso estudo, o paciente com +2p também apresentou o alelo selvagem de
93
JAK2, mas com perda monoalélica de TP53, sem mutação no alelo remanescente. A
comparação destes dados só reforça ainda mais o quanto as NMP são um grupo
bastante heterogêneo do ponto de vista genético.
O estudo de MERKER et al. (2013) se propôs a sequenciar o genoma
completo (WGS- whole genome sequencing) de um paciente com MF, que possuía o
alelo selvagem de JAK2, mas apresentava a mutação pTrp515Lys em MPL. Este
estudo mostrou 6 genes candidatos que apresentaram mutações e expressão
diferencial após análise de WGS e RNAseq. A validação dos 6 genes em uma coorte
de 178 pacientes com NMP (PV, TE e MF) não mostrou recorrência de mutação em
nenhum dos genes analisados. A comparação desses 6 genes candidatos com a
nossa lista de genes candidatos também não apontou nenhuma recorrência.
O trabalho de LUNDBERG et al. (2014) sequenciou 104 genes em uma coorte
de 197 pacientes com NMP. Os resultados mostraram que não houve aumento
expressivo de genes mutados entre as amostras do diagnóstico e do
acompanhamento dos pacientes analisados e que as mutações somáticas em TP53
com perda de heterozigosidade estavam fortemente associadas à transformação
leucêmica. Essas mutações em TP53 foram observadas desde a fase inicial da
doença e permaneceram com frequência alélica baixa até o momento da perda de
heterozigosidade, quando o clone leucêmico se expandiu rapidamente. Dos genes
selecionados neste trabalho, 3 foram recorrentes nas nossas análises (JAK2, TP53 e
GDF15).
Mutações em TP53 têm sido associadas à progressão leucêmica em cerca de
30% dos casos, mas a maioria das descrições mostrou associação das mutações
em TP53 com pacientes que também continham a mutação clássica em JAK2
(HARUTYUNYAN et al., 2011; TEFFERI, 2013b). ZHANG et al. (2012) mostrou
mutações em TP53 em 6/17 pacientes com NMP, sendo que somente um paciente
era positivo para JAK2V617F e também apresentava mutação em SRSF2. Dois
pacientes tinham co-ocorrência de mutações em SRSF2, e três com mutações
concomitantes em TET2 e TP53. No estudo de BRECQUEVILLE et al.(2013)
também foi observada a presença de 2 casos com mutação em TP53 em pacientes
com MF JAK2 positivos e 2 casos de fase blástica de MF secundária à TE com JAK2
WT (BRECQUEVILLE et al., 2013). Em nosso trabalho, observamos por WES
mutações em TP53 no paciente com diagnóstico de RARS-t e TE-JAK2V617F
positivo, sendo que o paciente TE apresentou um caso interessante com duas
94
mutações em TP53 com diferentes frequências alélicas. Uma delas presente na fase
crônica, com redução do clone na fase aguda, e a outra mutação específica da fase
aguda. Um caso semelhante foi observado num paciente com leucemia linfocítica
crônica (LLC) que apresentou del11q13 e mutações em SF3B1 (p.Gly742Asp) e
DDX3X (p.Glu196fs) no clone anterior ao tratamento quimioterápico. Após a terapia,
o clone não apresentava níveis detectáveis, o que poderia representar uma
subclonalidade. Entretanto, na recaída o paciente reapresentou um novo subclone
com del11q13 e outras mutações em SF3B1 (p.Lys700Glu) e DDX3X (p.Leu21fs)
(OJHA et al., 2013). No estudo de validação de mutações em TP53 em nossa coorte
mostramos a ocorrência de mutações em TP53 em 3/45 (7%) pacientes JAK2V617F
negativos. Devido à ampla associação de alterações em TP53 com os mecanismos
neoplásicos e a recorrência de mutações TP53 em NMP, principalmente em casos
que sofrem progressão da fase crônica para fase aguda, tem-se sugerido cada vez
mais a utilização da caracterização de mutações neste gene como um marcador de
prognóstico ruim para as NMP (TEFFERI, 2013b; LUNDBERG et al., 2014; WANG et
al., 2014)
A comparação da lista dos nossos genes candidatos com a lista de genes dos
trabalhos de sequenciamento do exoma que evidenciaram as mutações em CALR
(KLAMPFL et al., 2013; NANGALIA et al., 2013a) mostrou que 26 genes estavam
mutados em nosso trabalho e em pelo menos mais um e por isso sugerimos que
estes genes podem ser importantes no processo de leucemogênese. Devido a esses
achados, planejamos a validação futura desses genes em nossa coorte de pacientes
com NMP clássicas.
A análise detalhada da lista de genes candidatos gerada por este trabalho
mostra três recorrências em genes “drivers” ou diretores (genes envolvidos em vias
celulares fundamentais para a sobrevivência da célula tumoral) descritos por
VOGELSTEIN et al. (2013) em câncer: MLL3, TP53 e JAK2. As alterações
recorrentes em JAK2 e P53 foram as únicas encontradas neste trabalho que foram
também evidenciadas como alterações recorrentes no trabalho de NANGALIA et al.
(2013). Comparando nossos achados com os de KLAMPFL et al. (2013), três genes
recorrentes foram evidenciados (MYBPC1, KIF12, C10orf71). Quando a comparação
deste trabalho foi feita contra os genes descritos por LUNDBERG et al., (2014),
foram encontrados dois genes recorrentes: JAK2 e TP53. O resultado da
comparação dos genes encontrados neste trabalho contra os trabalhos até hoje
95
disponíveis apontam três genes, JAK2, TP53 e C10orf71, em comum e participantes
da progressão leucemogênica. Estes genes foram encontrados em pelo menos dois
trabalhos além do nosso.
96
6. Conclusão
A análise integral dos resultados nos permitiu concluir que:
1) A frequência da distribuição da mutação JAK2V617F nas neoplasias
mieloides clássicas, BCR-ABL negativas, da classificação da OMS/WHO, foi
de 92% em pacientes com PV, 46% e 48% em pacientes com TE e MF
respectivamente. Na TE e na MF, pacientes JAK2V617F positivos
apresentaram maiores chances de ocorrência de eventos adversos quando
comparados aqueles JAK2V617F negativos.
2) A carga alélica de pacientes com TE é mais baixa do que a de pacientes com
PV (p= 0,0002) e MF (p= 0,0090). A quantificação do clone mutado realizada
PCR-C ou QPCR forneceu informação complementar sobre o papel do
tamanho clone, características clínicas e parâmetros hematológicos.
3) A redução da carga alélica de JAK2V617F, durante o tratamento com HU, é
mais evidente no inicio do tratamento, sendo pouco relevante ao longo da
utilização da droga. O uso do inibidor de JAK2 (Ruxolitinib) não impacta a
carga alélica, apesar da melhoria dos sintomas clínicos.
4) A incorporação de mutações somáticas recém descritas (JAK2, CALR, MPL)
em algoritmos de análise para as NMP permitiu definir, até o presente
momento, 73% e 61% dos casos de TE e MF, respectivamente, apesar da
análise de mutações em CALR nos pacientes JAK2V617F negativos ainda
não ter sido concluída. Mutações no gene CALR foram encontradas
respectivamente em 62% e 67% de pacientes com TE e MF negativos para
JAK2V617F analisados.
5) As técnicas de alta resolução genômica evidenciaram a heterogeneidade
molecular nos casos analisados e permitiram identificar lesões moleculares e
mutações nas amostras analisadas.
6) As alterações cromossômicas +2p e del (5q) foram específicas das amostras
de fase aguda, mostrando-se preferencialmente associadas à transformação
leucêmica. Análises destas regiões revelaram a presença de genes
envolvidos na regulação epigenética (DNMT3A, ASXL2 e DPY30) e em genes
das vias de proliferação e diferenciação hematopoética (CSF2, TSLP, IL3,
IL5, IL4, IL9, IL13, IL12B, SPRY4)
7) No presente trabalho, foram identificados 26 genes com status mutacional
diferenciado entre a fase crônica (NMP) e fase leucêmica. Alterações em 3
97
destes genes, CALR, MAPK15 e TP53 foram confirmadas por
sequenciamento direto.
8) Mutações em TP53 foram observadas desde a fase crônica, mas a presença
de mutações que aparecem preferencialmente na fase aguda pode estar
relacionada/ou ser preditiva da progressão leucêmica.
De maneira geral, podemos concluir que nas NMP clássicas a utilização
exclusiva da carga alélica de JAK2 para previsão da progressão da doença ainda é
controversa, pois não há um padrão previsível. Pacientes portadores de PV, TE e
MF podem progredir para leucemia aguda secundária portando mutações em JAK2,
CALR, ou não apresentar nenhuma mutação previamente associada à patogênese
das NMP. O processo de progressão para leucemia aguda secundária também
parece apresentar um panorama bastante heterogêneo devido à presença de
diversas lesões genéticas/moleculares, e a presença escassa de lesões recorrentes
e específicas da fase de leucemia aguda secundária nos três pacientes analisados.
98
7. Perspectivas
1) Estudo de validação dos 26 genes com frequência aumentada na progressão
leucêmica (fase aguda) em uma coorte de NMP, incluindo casos de
progressão para mielofibrose e leucemia aguda, a fim de verificarmos a
potencial associação desses genes com a evolução e o prognóstico dos
pacientes;
2) Estudo de validação da del2p e +5q em amostras de células de sangue
periférico de pacientes com NMP através da técnica de FISH;
3) Avaliar a frequência da nova mutação no domínio cinase de JAK2
(p.Arg1063Cys) em uma coorte de pacientes NMP e SMD e correlaciona-la
com parâmetros clínico-hematológicos;
4) Estudar o papel de ERK8 nas quatro diferentes NMPs (PV, TE, MF e ARSA-t),
gerando dados sobre a expressão e a frequência de mutações em uma coorte
de pacientes;
5) Realização de estudos funcionais das mutações de ERK8 encontradas nos
pacientes com a expressão concomitante de mutações em JAK2 e CALR;
6) Estudo comparativo do perfil proteico de pacientes NMP entre pacientes
JAK2V617F, CALR mutados, e pacientes que não possuam mutações em
JAK2, CALR e MPL através da técnica de proteômica.
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WEHRENS, R.; BUYDENS, L. Self- and Super-organising Maps in R: the kohonen package. J. Stat. Softw, v. 21, n. 5, 2007.
XAVIER, S. G. et al. Low prevalence of the JAK2V617F in patients with ischemic stroke or cerebral venous thrombosis. Blood coagulation & fibrinolysis: an international journal in haemostasis and thrombosis, v. 19, n. 5, p. 468–469, jul. 2008.
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XU, Y. M. et al. Extracellular Signal-Regulated Kinase 8-Mediated c-Jun Phosphorylation Increases Tumorigenesis of Human Colon Cancer. Cancer Research, v. 70, n. 8, p. 3218–3227, 14 abr. 2010.
YANG, S.-W. et al. The Distribution and Possible Role of ERK8 in Mouse Oocyte Meiotic Maturation and Early Embryo Cleavage. Microscopy and Microanalysis, v. 19, n. 01, p. 190–200, 28 jan. 2013.
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ZITVOGEL, L. et al. Immunological aspects of cancer chemotherapy. Nature Reviews Immunology, v. 8, n. 1, p. 59–73, jan. 2008.
114
115
9. Anexos
Anexo 1 – Tabela 1
valores de referência hemograma normal
Homens Mulheres Unidade
Hemacias 4,40 a 5,90 4,00 a 5,20 milhoes/mm3
Hemoglobina 13,0 a 18,0 12,0 a 16,0 g/dL
Hematocrito 40,0 a 54,0 36,0 a 48,0 %
% /mm3
Leucocitos: 4,0 a 11,0 mil/mm3
Basofilos: 0 a 1% 0 a 110 /mm3
Eosinofilos: 1 a 5% 40 a 550 /mm3
Bastoes: 1 a 7% 40 a 770 /mm3
Segmentados: 40 a 65% 1600 a 7150 /mm3
Linfocitos: 22 a 45% 880 a 4950 /mm3
Monocitos: 2 a 10% 80 a 1100 /mm3
Plaquetas 150 a 450 mil/mm3
SERIE VERMELHA
SERIE BRANCA
116
Anexo 2 – Carta de Aprovação CEP-INCa
117
Anexo 3 – Ficha Clínica
FICHA DE COLETA DE DADOS GRUPO DE PESQUISA JAK2
DADOS GERAIS
Nome:__________________________________________ Matrícula: ___________ Instituição: (1) INCA (2) HUCFF (3) HUPE (4) HUGG (5) HSRC-ES (6) HEMORIO (7) OUTRO: ________________________ Sexo: (0) Fem (1) Masc Data de nascimento: __ / __ / ____ Data de diagnóstico: __ / __ / ____ Município de origem: _____________________________ Estado de origem: _____ Profissão: ___________________________ Avaliação inicial? (0) Não (1) Sim
EXAMES AO DIAGNÓSTICO
Data: __ / __ / ____ Hemograma:
Hemoglobina
Hematócrito
RDW
Reticulócitos %
Leucócitos
Blastos %
Bastões %
Neutrófilos %
Eosinófilos %
Basófilos %
118
Linfócitos %
Monócitos %
Plaquetas
Coagulograma:
PTT-R
PT-RNI
Suspeita clínica: ___________________________
DADOS CLÍNICOS AO DIAGNÓSTICO
Peso (Kg): ____________ Febre: (0) Não (1) Sim Emagrecimento: (0) Não (1) Sim Perda de peso (kg): ____________ Hemorragia: (0) Não (1) Sim Local: _______________________ Trombose ao diagnóstico:(0) Não (1) Sim Local: _______________________ Parestesia ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Prurido ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Baço palpável ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Tamanho do baço à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média Fez US abdominal? Comprimento do baço ao US?(0) Não (1) Sim ______ cm Fígado palpável ao diagnóstico: (0) Não (1) Sim Tamanho do fígado à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCD e umbigo (3) Na FID ou além da linha média
119
EXAMES ESPECÍFICOS AO DIAGNÓSTICO
Saturação arterial de O2 ao ar ambiente ( ) Não realizado
Eritropoetina sérica ( ) Não realizado
Ferro sérico ( ) Não realizado
Ferritina sérica ( ) Não realizado
Vitamina B12 ( ) Não realizado
Ácido úrico ( ) Não realizado
LDH ( ) Não realizado
Cariótipo normal (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Cromossomo Filadélfia (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Rearranjo bcr-abl (0) Neg (1) Pos (-1) não realizado
Dacriocitose (HMG) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Leucoeritroblastose (HMG) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Diseritropoese (Mielo) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Disgranulopoese (Mielo) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Dismegacariocitopoese (Mielo) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Blastos % (Mielo)
Fibrose (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Grau de fibrose (BMO) (0) (1) (2) (3) (4)
Hiperplasia eritróide (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Hiperplasia granulocítica (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Hiperplasia megacariocítica (BMO) (0) Não (1) Sim (-1) não realizado
Diagnóstico final: ___________________________________ Outro diagnóstico final: ____________________________________
Ocorreu transformação leucêmica? (0) Não (1) Sim Evoluiu com neutropenia não-associada ao tratamento? (0) Não (1) Sim Evoluiu com trombocitopenia não-associada ao tratamento? (0) Não (1) Sim Evoluiu com trombose? (0) Não (1) Sim Evoluiu com sangramento? (0) Não (1) Sim
ÚLTIMOS EXAMES
Data do último exame: __ / __ / ____ Hemograma:
Hemoglobina
Hematócrito
RDW
Reticulócitos %
Leucócitos
Blastos %
Bastões %
Neutrófilos %
Eosinófilos %
Basófilos %
Linfócitos %
Monócitos %
Plaquetas
Coagulograma:
PTT-R
PT-RNI
SITUAÇÃO ATUAL
Peso (Kg) atual ____________ Febre: (0) Não (1) Sim Hemorragia: (0) Não (1) Sim Trombose: (0) Não (1) Sim
121
Baço palpável: (0) Não (1) Sim Tamanho do baço à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média Fez US abdominal? Comprimento do baço ao US?(0) Não (1) Sim ______ cm Fígado palpável: (0) Não (1) Sim Tamanho do fígado à palpação: (0) Não palpável (1) À inspiração (2) Entre RCD e umbigo (3) Na FID ou além da linha média Necessitando atualmente de transfusão de hemácias? (0) Não (1) Sim Necessitando atualmente de sangria terapêutica? (0) Não (1) Sim Em uso atualmente de aspirina? (0) Não (1) Sim Em uso atualmente de hidroxiuréia? (0) Não (1) Sim Qual a dosagem? ___________ Data de coleta da amostra para pesquisa de JAK-2: __ / __ / ____ JAKV617F qualitativo: (0) Neg (1) Pos JAK2 % (quantitativa): ____________ JAK2 12 (qualitativo): (0) Neg (1) Pos JAK2 14 (qualitativo): (0) Neg (1) Pos MPL (qualitativo): (0) Neg (1) Pos Ficha preenchida por: ______________________________________________ Data: __ / __ / ____
neutropenia associada ao tratamento (0) Não (1) Sim
trombocitopenia associada ao tratamento (0) Não (1) Sim
transfusão de hemácias (0) Não (1) Sim Transfusão de plaquetas (0) Não (1) Sim outros Qual?_____________ Baço palpável? (0) Não (1) Sim ______ cm
123
Tamanho do baço à palpação: (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média Fígado palpável: (0) Não (1) Sim (1) À inspiração (2) Entre RCE e umbigo (3) Na FIE ou além da linha média
TRATAMENTO
sangria terapêutica? (0) Não (1) Sim uso de aspirina? (0) Não (1) Sim Início: __ / __ / ____ Fim: __ / __ / ____ uso de hidroxiuréia? (0) Não (1) Sim Início: __ / __ / ____ Fim: __ / __ / ____ Outro tratamento? (0) Não (1) Sim Qual?_________________
Exame atual
Data: __ / __ / ____ Hemograma:
Hemoglobina
Hematócrito
eritroblasto
Reticulócitos %
Leucócitos
Blastos %
Bastões %
Neutrófilos %
Eosinófilos %
Basófilos %
Linfócitos %
Monócitos %
Plaquetas
124
Anexo 4 – Publicações relacionadas à tese
Publicação 1
Zalcberg IR, Ayres-Silva J, de Azevedo AM, Solza C, Daumas A, Bonamino M. Hydroxyurea
dose impacts hematologic parameters in polycythemia vera and essential thrombocythemia but
does not appreciably affect JAK2-V617F allele burden. Haematologica, v. 96, n. 3, p. e18–20, mar.
2011
125
Anexo 5 – Publicações relacionadas à tese
Publicação 2
Kaeda J, Bonamino M, Ayres-Silva J, Solza C, Ringel F, Blau O, Daumas A, Oberender C, Dörken
B, le Coutre P, Zalcberg I. JAK2 V617F allele burden quantified by real time quantitative polymerase
chain reaction and competitive polymerase chain reaction in patients with chronic
myeloproliferative neoplasia. Leukemia & lymphoma, v. 55, n. 1, p. 128–135, jan. 2014.
Bonamino, M.H.; Zalcberg, I.R.; Braggio, E. Genomic landscape of leucemogenesis in
myeloproliferative neoplasia
2. Ayres-Silva J.P; Monte-Mor, B; Coelho, A.C.; Bonamino, M.H.; Zalcberg, I.R. Study of CALR mutations in Brazilian Cohort (provisório)
127
Anexo 7 – Publicações em colaboração
1. Coutinho DF, Diniz C, Filgueiras RL, Baptista RL, Ayres-Silva JP, Monte-Mór BC, Bonamino MH, Zalcberg IR. Case Report A novel TET2 mutation in a patient with refractory cytopenia with multilineage dysplasia. Genetics and Molecular Research, v. 12, n. 4, p. 5858–5862, 2013.
2. Juhi Ojha, Jackline Ayres, Charla Secreto, Renee Tschumper, Kari Rabe, Daniel Van Dyke, Susan Slager, Tait Shanafelt, Rafael Fonseca, Neil Kay, Esteban Braggio
Deep sequencing identifies high genetic heterogeneity and recurrent convergent evolution in chronic lymphocytic leukemia
Será submetido à Blood ou Leukemia como Artigo completo. Manuscrito em preparo.
3. Dr. Juhi Ojha , Charla Secreto , Dr. Renee Tschumper, Ms. Kari Rabe , Jackline Ayres-
Silva, Dr. Daniel Van Dyke , Dr. Susan Slager , Dr. Rafael Fonseca , Dr. Tait SHANAFELT , Dr. Neil KAY. Monoclonal B-cell lymphocytosis (MBL) is characterized by mutations in CLL putative driver genes and clonal competition many years prior to disease progression.
Submetido à Leukemia (JILL14-LEU-0231) como letter to the editor, aceito para publicação.
4. Dr. Brian O'Neill , Mr. Scott Van Wier , Dr. Juhi Ojha , Dr. Ellen Remstein McPhail , Dr. Yan Assmann , Dr. Jan Egan , Jackline Ayres-Silva , David Schiff , Dr. Beatriz Lopes , Mr. Paul Decker , Dr. Riccardo Valdez , Dr. Raoul Tibes , Bruce Eckloff , Dr. Thomas Witzig , Dr. A. Keith Stewart , Dr. Rafael Fonseca.
Genome-wide analysis uncovers novel recurrent alterations in primary central nervous system lymphomas
Submetido à Leukemia (14-LEU-0369R) como Original Article.