Mikrobiologia Wybrane metody barwienia Dr n. biol. Henryk Różański Laboratorium Biologii Przemysłowej i Eksperymentalnej Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa w Krośnie
Mikrobiologia Wybrane metody barwienia
Dr n. biol. Henryk Różański
Laboratorium Biologii Przemysłowej i Eksperymentalnej
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa w Krośnie
Barwienie złożone
• Barwienie złożone pozwala na wyraźniejsze zróżnicowanie właściwości biologicznych bakterii.
• Polega na zastosowaniu kilku barwników.
• Metoda Grama
• Metoda Ziehla-Neelsena
• Metoda Neissera
• Metoda Giemsy
Metoda Grama
• Pozwala podzielić bakterie na dwie zasadnicze grupy: Gram-dodatnie i Gram-ujemne.
• Odmienne barwienie się bakterii metodą Grama związane jest ściśle z różnicami w budowie chemicznej.
Hans Christian Joachim Gram 1852-1938
• Duński botanik, lekarz.
• Metoda barwienia 1884 r.
Hans Christian Joachim Gram, 1852-1938.
Metoda Grama – technika barwienia
• Utrwalony preparat traktować odczynnikami wg kolejności:
- fiolet krystaliczny 2-3 minuty,
- płyn Lugola 1-2 minuty,
- alkohol aż do odbarwienia ok. 30 sekund,
- woda – spłukanie,
- Fuksyna w roztworze fenolowym (rozc. 1:10) 20 sekund,
- Woda – spłukanie.
Metoda Grama
• Pod wpływem fioletu krystalicznego i płynu Lugola w niektórych drobnoustrojach powstają związki chemiczne (kompleksowe) nierozpuszczalne w alkoholu.
Bakterie takie mimo działania alkoholu pozostają zabarwione na kolor fioletowy bakterie Gram-dodatnie (Gram+).
Inne bakterie odbarwiają się pod wpływem alkoholu, dobarwione fuksyną barwią się na kolor czerwony bakterie Gram-ujemne (Gram-).
Gram Positive Bacteria (Cocci) http://www.sciencephoto.com/media/80940/enlarge
http://www.medschool.lsuhsc.edu/microbiology/DMIP/dmex17.htm
http://faculty.cbu.ca/cglogowski/2008%20BIOL101LAB2.htm
Gram positive (purple) & Gram negative (pink) bacteria
Metoda Ziehla-Neelsena • Rozróżnia bakterie kwasooporne i niekwasooporne.
• Kwasooporność jest cechą gatunkową niektórych bakterii (prątek gruźlicy, niektóre promieniowce).
• Zależy to od składu chemicznego cytoplazmy bakterii.
• Odgrywa ważną rolę w diagnostyce gruźlicy.
• Prątki gruźlicy ze względu na dużą zawartość związków lipidowych nie barwią się metodami zwykłymi.
• Metoda Ziehla-Neelsena służy również do barwienia zarodników.
Franz H. Ziehl 1857-1926, niemiecki bakteriolog
• Friedrich Carl Adolf Neelsen 1854-1898, niemiecki patolog
http://www.spcollege.edu/hec/vt/vtde/ate2639lgs/gramstain.htm http://pathtalk.org/archives/22
http://www.khdf.de/cms/index.php?id=194&site=www&lang=de
Metoda Ziehla-Neelsena – technika barwienia
• Postępowanie wg kolejności: - potraktować preparat fuksyną fenolową, następnie
ogrzewać preparat płomieniem palnika do 1 pary, barwić przez 2-3 minuty;
- Po ostudzeniu, zlać barwnik i spłukać preparat wodą; - Odbarwić alkoholem kwaśnym; - Spłukać wodą - Dobarwić rozcieńczonym błękitem metylenowym przez 1-
2 minuty; - Spłukać wodą; - Wysuszyć; - Obserwować obiektywem metoda immersji. • Bakterie kwasooporne, np. prątek gruźlicy są zabarwione
na czerwono, tło jest niebieskie.
Metoda Neissera
• Uwyraźnia charakterystyczne dla maczugowców błonicy ziarenka wolutyny
• Maczugowce błonicy zostają zabarwione na kolor żółty, a ziarenka wolutyny na fioletowo
http://de.wikibooks.7val.com/wiki/Medizinische_Mikrobiologie:_Grampositive_St%C3%A4bchen
Metoda Neissera – technika barwienia
• Przed barwieniem zmieszać 2 części odczynnka I (błękit metylenowy 1 g, alkohol absolutny 20 ml, kwas octowy lodowaty 50 ml, woda destylowana – do 1000 ml) z 1 częścią odczynnika II (fiolet krystaliczny 1 g, alkohol absolutny 10 ml, woda destylowana do 300 ml).
• Utrwalony preparat barwi się mieszaniną 5 minut. • Po zlaniu barwnika preparat potraktować
odczynnikiem III (chryzoidyna 10 g, woda destylowana 300 ml) w ciągu 15 sekund, potem spłukać wodą.