MIDI SHERLOCK® MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM MARIA C. VELÁZQUEZ RIVAS INEZA M. RODRÍGUEZ DÍAZ 1.

MIDI SHERLOCK® MICROBIAL

IDENTIFICATION SYSTEM

MARIA C. VELÁZQUEZ RIVAS

INEZA M. RODRÍGUEZ DÍAZ

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MIDI SHERLOCK® MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM

Myron Sasser, Ph.D.

• Fundador de MIDI inc.

• Desarrollador del MIDI SHERLOCK® MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM

• Director de R&D

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TEMAS• Identificación microbial por ácidos grasos

• FAMEs ¿qué son?

• Técnicas principales para identificación bacteriana

• Análisis por FAMEs

• Ventajas del MIDI SHERLOCK

• Banco de datos de FAMEs

• Banco de datos: especies importantes

• Metodología

• Interpretación de resultados

• Resumen

• Nuevos Productos

• Referencias

• Sección de preguntas

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OBJETIVOS

1. Explicar como funciona la identificación de microorganismos utilizando análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs)

2. Describir como funciona el sistema de identificación microbial MIDI SHERLOCK®

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IDENTIFICACIÓN MICROBIAL POR ÁCIDOS GRASOS

La composición de ácidos grasos microbiales• Son únicos por especie y sumamente

conservados por nicho ecológico.

• Conservados genéticamente entre cepas.

• Mutaciones afectan ADN, no los ácidos grasos de la membrana.

• Intercambio de plásmidos entre bacterias no afecta el perfil de ácidos grasos.

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FAMEs ¿QUÉ SON?FAMEs

• Fatty Acid Methyl Esters – ésteres metílicos de ácidos grasos

Ácidos Grasos FAMEs

Transesterificación de grasas con

metanol

Se forma un producto volátil (FAMEs) más adecuado para cromatografía de gas.

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TÉCNICAS PRINCIPALES PARA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

• Pruebas Bioquímicas• Requiere conocimiento y pruebas dirigidas.• Conocimiento y uso adecuado de materiales.

• Secuenciación de ADN• Requiere ciertas destrezas o conocimientos.• Base de datos no incluye cepas variantes.

• Perfiles de ácidos grasos (FAMEs)• Sencillez• No requiere pre-pruebas.• Preparación simple estándar.

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ANÁLISIS POR FAMEsMIDI SHERLOCK® MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM:

• Identificación de microorganismos por la composición de ácidos grasos en la membrana

• Identificación por cromatografía de gas (CG) Agilent® Gas Chromatograph Software

• Posee un estándar de calibración:

• Mezcla de calibración: ácidos grasos saturados de cadena lineal (9-20 C) y cinco hidroxiácidos.

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ANÁLISIS POR FAMEs• No es necesario hacer tinción gram

Identificación bacterias gram +/-

• Gram (+) predominan ácidos grasos ramificados• Gram (-) predominan ácidos grasos en cadenas sencillas

• Lipopolizacáridos(LPS) promueven ácidos grasos hidroxilados

Gram (+) Gram (-)

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VENTAJAS DEL MIDI SHERLOCK• Identificaciones precisas, más de 2,000 especies.

• Amplias bibliotecas microbianas y ambientales.

• Capacidad de realizar "tracking” por cepa presuntiva (para encontrar la fuente de un contaminante).

• Alto rendimiento

• 200 muestras por día• Corto tiempo

• Bajo costo por muestra: $3 por muestra

• Todos los organismos son analizados utilizando el mismo procedimiento, sin necesidad de tinción Gram o pruebas bioquímicas.

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BANCO DE DATOS DE FAMEs

MIDI SHERLOCK LIBRARIES

• Catálogos de perfiles microbianos

• 1500 especies bacterianas• 200 especies de levadura

• Cepas obtenidas de diferentes fuentes y nichos ecológicos.

• Colaboración con una red de investigadores• Adición de organismos/cepas

nuevas

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Las entradas más grandes le pertenecen al género de Bacillus.

• 42 especies catalogadas

• Aceptado como un método oficial para la confirmación de B. anthracis

BANCO DE DATOS: ESPECIES IMPORTANTES

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METODOLOGÍA

• Se crecen bacterias en agar• Se selecciona colonias purasInoculación• Extracción de células a partir de medios de

cultivoRecolección• Lisis de las células para liberar los ácidos grasos

de los lípidos celulares • (Bacterias Mueren)

Saponificación

•Formación de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs)Metilación•Transferencia de FAMEs de la fase acuosa a la fase orgánicaExtracción• Lavado acuoso de la extracción orgánica antes del análisis cromatográficoLavado Base

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METODOLOGÍA

Cultivo

Saponificación y metilación

Extracción Análisis por CG y comparación de

resultados con bancos de datos de perfiles

microbianos

Reporte de identificación

bacteriana por índice de

similaridad

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LECTURA DE RESULTADOS: EJEMPLO

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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Índice de similaridad

- Valor numérico que expresa cuan cerca está la composición de FAMEs de un desconocido con la media de la composición de cepas dentro del banco de datos.

- No es un por ciento, es una expresión de la distancia relativa de la muestra desconocida a partir de la media poblacional.

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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

• 1.00 identificación perfecta

• 1.00-0.500 comparación buena

• 0.500-0.300 puede ser una cepa atípica

• 0.300 o menor, no es de la especie

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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

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NUEVOS PRODUCTOS

MIDI Sherlock Instant FAMETM

• Muestras de aerobios ambientales y levaduras

MIDI Sherlock Instant AnaerobeTM

• Muestras de anaerobios clínicos

MIDI Sherlock Q-FAMETM

• Muestras de aerobios clínicos

MIDI Sherlock DNA Software• Analiza muestras de secuencias de ADN de especies de bacterias, hongos y

levadura.

Todos tardan entre 15-25 minutos para la identificación de cultivo puro

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RESUMEN

• El MIDI SHERLOCK identifica microbios a base de su composición de ácidos grasos.

• Utiliza una base de datos sumamente amplia de FAMEs, incluyendo para muestras ambientales y diferentes nichos ecológicos.

• Es un sistema automatizado, fácil de utilizar, y de bajo costo por muestra.

• Se ha utilizado en diferentes áreas de investigación por los últimos 20 años ya que provee resultados constantes y precisos, en un tiempo razonable.

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REFERENCIAS1. MIDI Recuperado de http://www.midi-inc.com/

2. Products: Sherlock® Microbial ID System (MIS) Recuperado de http://www.midi-inc.com/pages/microbial_id.html

3. Kunitsky, C., Osterhout, G. and Sasser, M. Identification of microorganisms using fatty acid methyl ester (FAME) analysis and the MIDI Sherlock® Microbial Identification system Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Recuperado de https://store.pda.org/TableOfContents/ERMM_V3_Ch01.pdf

4. Sherlock® Microbial Identification system Automated Microbiology solutions. Recuperado de http://www.learneasy.ch/MIDI-GC-Full-Brochure.pdf

5. Sasser, M. (2001) Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical Note #101Recuperado de http://www.microbialid.com/PDF/TechNote_101.pdf

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¿PREGUNTAS?