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1.1.1.5. Microscopia de contraste de fases e interferencia de
Nomarski.
Las clulas vivas se pueden observar con nitidez en un
microscopio de contraste defases o de contraste de fases
interferencial. La posibilidad de que algunos componentesde la
clula puedan perderse o distorsionarse durante la preparacin de las
muestras noha dejado de preocupar a los especialistas en
microscopia. La nica solucin a esteproblema es examinar las clulas
mientras an estn vivas, sin ningn tipo de fijacinni congelacin.
Para este propsito son tiles microscopios con sistemas
pticosespeciales. Cuando la luz pasa a travs de una clula viva, la
fase de la onda luminosa vara enrelacin al ndice de refraccin de la
clula: la luz que pasa a travs de una zonarelativamente gruesa o
densa de la clula, como por ejemplo el ncleo, se retrasa y sufase
queda desplazada de forma correspondiente respecto a la de la luz
que ha pasado atravs de una regin adyacente de citoplasma, ms fina.
El microscopio de contraste defases y el microscopio de contraste
de fases interferencial aprovechan los efectos deinterferencia que
se producen cuando se combinan estos dos grupos de ondas, creandode
esta forma una imagen de la estructura celular. Ambos tipos de
microscopios pticosse utilizan habitualmente para visualizar clulas
vivas.
1930 Labedeff : Disea primer microscopio de contraste
interferencial.1932 Frits Zernike : Inventa microscopio de
contraste de fases.1952 Nomarski : Inventa y patenta el sistema de
contraste Interferencial quelleva su nombre.1953 Premio Nobel de
Fsica otorgado a Zernike.
Objetivo La microscopia de contraste de fases y la del
microscopio de interferencia nos dan laposibilidad de observar
clulas vivas y sin ninguna preparacin , ya que al realizar
otrosprocedimientos existe la posibilidad de que algunos de sus
componentes puedanperderse o distorsionarse por mtodos como la
fijacin, coloracin, congelacin, yotros, asi, estos instrumentos
pticos ayudan a resolver el problema.
Principio de la microscopia de contraste Las clulas vivas son
transparentes a la luz visible, por lo tanto los rayos de luzpasan
a travs sin sufrir prdidas en intensidad.
La luz transmitida a travs de las clulasvivientes, sin embargo,
encuentra a su paso,regiones de ndices de refraccin diferentes,
ydiferentes grosores y/o densidades, lo que escapaz de alterar su
velocidad y su direccin.En la Figura 1 se da la
representacinesquemtica en donde dos regionesadyacentes de una
misma clula, A y B, de undiferente grosor, t1 y t2 y con
diferentesndices de refraccin, n1 y n2, son atravesadaspor un rayo
luminoso. Las variaciones engrosor e ndices de refraccin son
capaces de producir una diferencia en el curso pticode la luz
transmitida por las dos regiones. En este caso especfico, le toma
ms tiempopasar a la luz a travs de la fraccin B, cuyo ndice de
refraccin es mayor (n2) y por lotanto esta retrasada la onda del
rayo en velocidad con respecto al que es capaz deatravesar la
porcin A, cuyo ndice de refraccin es ms bajo. Si la diferencia de
los ndices de refraccin es pequea, la magnitud del cambio defase
inducido igualmente es muy pequea y se mide en trminos de
longitudes de onda(). As, en la representacin de la Figura 1, el
rayo que pasa a travs de la parte B semuestra retrasado 1/4 de
longitud de onda ( /4) y emerge fuera de fase. con respectoa la
transmisin que nos muestra la parte A.
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Diseo del instrumento ptico El sistema ptico del microscopio de
contraste de fases difiere del microscopioordinario (de luz)
solamente en la adicin de un diafragma anular colocado debajo de
laplatina para iluminar el objeto con un cono de luz estrecho y una
placa de difraccinmontada en el objetivo, un diagrama representado
en la Figura 2, muestra el diseo deun microscopio de contraste de
fase y el curso que siguen los rayos que pasan a travsde una
estructura celular. La fase relativa de luz desviada, saldra 1/4 de
longitud de onda retrasado, s escapturada y cambiada con la
introduccin de un material retrasador de fase, en aquellaparte de
la placa de difraccin que sea cubierta por cualquiera de los dos
rayos,aumentando an ms, otro 1/4 de longitud de onda y logrando
retrasar en rayoluminoso en total 1/2 longitud de onda, con lo que
se logra que este rayo quedetotalmente fuera de fase con respecto a
la luz no desviada. Cuando la diferencia se presenta es por que los
ndices de refraccin son diferentes yel microscopio de contraste de
fase transforma estas variaciones en brillo o intensidad.Las
estructuras celulares presentan muchas irregularidades y son
objetos pticamenteno homogneos as, la luz que "choca" con el objeto
se presenta desviada.
Contraste de fase oscuro o positivo: cuando los rayos de luz, la
desviada y la nodesviada tienden a cancelarse creando una
interferencia destructiva y hacer que el
objeto aparezca mucho ms oscuro que los alrededores.
Contraste de fase brillante o negativo: se presenta cuando
retrasamos la luz nodesviada y la hacemos 1/4 de longitud de onda
menor, lo que hace que salga al tiempocon la luz desviada, que
tiene un retraso de 1/4 de longitud de onda, logrando de estamanera
que salgan al mismo tiempo y se recombinen para dar brillo, creando
unainterferencia constructiva aumentando en esta forma el objeto
mientras su contornopermanece con menos
intensidad.http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/phasecontrast/phase.html
Microscopio de interferencia
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La
microscopia de interferencia o tcnica DIC
(DiffentialInterference Contrast) Nomarski, permite la visualizacin
de especmenes mucho msdensos gracias a que la imagen proyectada es
tridimensional. Los principios pticos yla operacin del DIC, son
bien diferentes a los de microscopia de contraste y suoperacin es
compleja. Como los cambios de fase producidos por las estructuras
celulares son muypequeos y por lo general de fracciones de longitud
de onda, para poder medir estecambio con precisin es necesario
separar por completo la luz que se transmitedirectamente de la
desviada por el objeto, tal como lo hace el microscopio
deinterferencia.
Nomarski differential interference contrast microscopy.
Fundamentalmente, la luz que seemplea en este caso es
polarizada(blanca o monocromtica), o sea quetiene la propiedad de
concentrar losrayos dispersos en uno solo y seadicionan a los
lentes objetivos cuatrocomponentes pticos: Polarizador,prisma DIC,
sealador DIC y unanalizador. El objeto espcimen que seencuentra en
fase toma direccionesdiferentes de acuerdo con los valores degrosor
e ndices de refraccin quepresente. El prisma
(birrefringente)situado sobre la parte posterior delplano focal del
objetivo es usado para
recombinar las dos ondas en un solo rayo. El objeto atravesado
por los dos rayos vuelve a otro prisma (Wollaston) que es elque en
realidad crea la interferencia (destructiva o constructiva), as el
planopolarizado es recapturado por un analizador, que transforma
esto en ondas de vibracinde la misma longitud y habilita la
interferencia como respuesta a estas dos ltimasacciones tenemos que
diferentes regiones del objeto estudiado apareceran con msbrillo o
menos brillo sobre un fondo oscuro. Los espacios laterales de las
dos ondas se miden en trminos de micrmetros y nose exceden en el
tamao de la resolucin perceptible al ojo humano, logrando asi queno
se presente una doble imagen al observador. En esta microscopia
incluir el tipo Nomarski (prisma), lo que obtendremos seruna
apariencia seudo tridimensional del objeto.
Aplicaciones
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Una de las grandes ventajas del microscopio de contraste de
fases,del microscopio de contraste de fases interferencial y del
microscopiode campo oscuro estriba en que los tres permiten
observar las clulas enaccin y estudiar los movimientos implicados
en procesos como lamitosis o la migracin celular. Puesto que muchos
movimientos sondemasiado lentos para ser observados a tiempo real,
normalmenteresulta til hacer pelculas o vdeos por el sistema de
aceleracin de
movimiento (microcinematografa). En esto casos, se toman
fotografas sucesivas,separadas por breves perodos de tiempo, de
modo que cuando la pelcula o videoregistrados se proyectan a la
velocidad normal los acontecimientos aparecen muyacelerados.
Estatcnicamicroscpicase usa paramedir ndicede refraccin
yconcentracinde slidos delas estructuras
celulares utilizando un metodo de refractometra por inmersin, as
se sumergen lasclulas en una solucin isotnica cuyo ndice de
refraccin puede variarse. Esta refractometra se ha empleado para
ser medidos en procesos como la divisincelular y el desarrollo de
esporas fungicas. Igualmente es til para determinar masaseca y
espesor de las estructuras celulares.
2. Microscopio de interferencia diferencial de Nomarski
2.1. Fundamento La posibilidad de que algunos de los componentes
celulares se distorsionen en elmomento del corte y preparacin, ha
conducido a los cientficos a crear microscopioscon los cuales se
pueda observar clulas vivas sin ningn tipo de fijacin ni
decongelacin para este propsito se utilizan sistemas pticos
especiales (1).C uando la luz pasa a travs de una clula viva, la
fase de la onda luminosa vara conrelacin al ndice de refraccin de
la clula crendose una interferencia, que retrasa laonda luminosa
cuando atraviesa una zona relativamente densa la microscopia
deinterferencia diferencial de Nomarski, aprovecha estos efectos de
interferencia, paracrear una imagen de la estructura celular viva,
ntida y tridimensional (1). Existen en principio tres tipos de
microscopios de interferencias: los microscopiosde interferencia de
longitud desdoblada, los de dos ondas y los de ondas mltiples.
Losde una sola onda, generalmente se denominan microscopios de
contraste de fases. Losde dos ondas, son los autnticos microscopios
de interferencia. En el sistema deiluminacin, sistemas pticos
diversos, desdoblan el rayo incidente en haces prximosunos del otro
en forma variable segn lo desee el operador un segundo sistema
ptico,simtrico al primero, pero situado detrs del objetivo,
recompone los dos haceshacindolos interferir para construir la
imagen. Los de ondas mltiples, no sonutilizados en microscopia
biolgica sino en metalografa, para medida de la profundidadde las
estructuras (3).
2.2. Partes del microscopio de interferencia diferencial de
NomarskiLos componentes bsicos del microscopio de interferencia
diferencial de Nomarski soniguales al microscopio ptico, difiriendo
en los sistemas que transmiten el rayo de luzincidente (3) estos
son:
Filtro polarizador plano: polariza el rayo de luz incidente que
proviene de lalmpara en uno solo y con una misma longitud.Prismas
de Nomarski modificado por Wollaston: son dos, uno ubicado dentro
delcondensador birrefringente que genera dos rayos de luz paralelos
formado un
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ngulo de 90? elsegundo se ubica en laparte posterior
delobjetivo, es ajustable yen l convergen los dosrayos de luz
generadospor el prisma inferiorpara que serecompongan.Filtro
polarizador oanalizador: se ubica enla parte superior de
losobjetivos y del prismasuperior y su funcines recombinar losrayos
de luz, paraproducir la imagenseudotridimensionalobservada a travs
delocular.
2.3. Principio pticodel microscopio deinterferencia
diferencial de Nomarski La microscopia de contraste de
interferencia diferencial de Nomarski usa lacombinacin de un
sistema de luz polarizado y dos rayos divididos para crear fases
dediferencias en la muestra. Esto provee una imagen tridimensional
de la muestra sin loshalos que rodean a la clula en las imgenes
generadas en los microscopios de fase decontraste (2). El principio
del sistema es el siguiente: se utiliza luz blanca polarizada por
el filtroplano, este rayo de luz monocromtico incide en el
condensador completamenteabierto y el prisma de Nomarski
birrefringente que se encuentra dentro de l, generados rayos de luz
paralelos, uno incide sobre la muestra a analizar y el segundo pasa
enforma paralela sobre la muestra.Ocurre una diferencia de la
trayectoria local del rayo que atraviesa el espcimencausado por el
ndice de refraccin y de grosor, creando una fase distorsionada del
rayoincidente que se representa por el desplazamiento del mismo
luego estos rayosatraviesan los lentes del objetivo y tambin al
segundo prisma de Nomarski, allubicado, en diferentes porciones,
debido a la ruta desigual en la trayectoria ptica conla cual
inciden en l se forma una imagen doble de la muestra lateral
ylongitudinalmente. Al atravesar estos rayos polarizados y an
paralelos, el filtroanalizador los transforma a un mismo plano de
vibracin, es aqu en donde ocurre laonda de interferencia
constructiva o destructiva, que es ocasionada por las diferenciasen
la trayectoria ptica dentro de la muestra y se manifiestan al
observarse en laimagen reas brillantes y opacas o reas claras u
oscuras. En donde no ocurre lainteraccin entre el par de rayos, se
produce un fondo gris uniforme. Los espacios laterales de las dos
ondas se miden en trminos de micrmetros y nose exceden en el tamao
de la resolucin perceptible al ojo humano, logrando as queno se
presente una doble imagen al observador, sino una apariencia
seudotridimensional del objeto estudiado sobre un fondo
uniforme.
2.4. Utilidades del microscopio de interferencia diferencial de
Nomarski El uso de este microscopio hace posible determinar el
ndice de refraccin, la
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concentracin de slidos, la masa seca y el espesor de las
estructuras celulares y estoscambios han sido estudiados en los
procesos como la mitosis o la migracin celularunido a un mtodo de
refractometra por inmersin4.
2.5. Ventajas
Produce una imagen brillante contra un fondo oscuro sin halos de
difraccin deuna clula viva.Determinacin del ndice de
refraccinDeterminacin de slidos, masa seca y espesor de las
estructuras celulares
2.6. Desventajas
Alto costo del equipo por los diferentes aditamentos utilizados
en el microscopioCosto alto y mantenimiento cuidadoso de la muestra
de clulas vivasLa microcinematografa requerida para mirar los
procesos que realiza la clula invivo requiere de equipos especiales
y personal entrenado
3. Bibliografa1. Alberts, A., Bray, D., Lewis, J., Raff, M.,
Roberts, K y Watson, J. 1994. Biologamolecular de la clula.
Ediciones Omega. Barcelona, Espaa. Pg.153154.2. Gerhardt, P. 1994.
Methods for general and molecular bacteriology. AmericanSociety for
Microbiology. Washington, D. C. USA. Pp. 14183. Locquin, M y
Langeron, M. 1985. Manual de Microscopia. Editorial Labor.
Barcelona,Espaa. Pg. 4245.4. Wilson, G y Morrison, J. 1991.
Citologa. CECSA. Mxico, D. F. Mxico. Pg. 296.307.
Bibliografa recomendadaAlberts, A. 1996. La clula. Ediciones
Omega, Barcelona, Espaa. pg. 155.Celis, J. 1994. Cell biology. A
laboratory hanbook. Academic press, Inc. 2: 515.Gerhardt, P., et
al. 1994. Methods for general and molecular bacteriology. American
Society for Microbiology.Washington, D.C., USA. pp. 1418.Wilson, G.
y Morrison, J. 1991. Citologa. CECSA. Mexico, D.F., Mxico. pg.
296307.
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