microRNAs: A SEGUNDA REVOLUÇÃO DOS RNAs Luciana … · • presente na maioria dos organismos multicelulares • bastante conservados • bloqueia a tradução • modulam a expressão

microRNAs:

A SEGUNDA REVOLUÇÃO DOS RNAs

Luciana Vasques

PRIMEIRA?

to

vacuum

pump

boiling water

spark

discharge

liquid water in trap

water containing

organic compounds

water droplets

water in

condenser

electrodes

water out

CH4

NH3 H2O

H2

gases

H2O, CO, CO2, N2, H2S e H2

- 20 aminoácidos

- Açúcares

- Bases nitrogenadas

- ATP, etc

Componentes Orgânicos

Formação de polímeros de carbono

(macromoléculas)

Mundo do RNA

Eventos

químicos

RNA

armazenamento

catálise reprodução

CÉLULAS

PRIMITIVAS

MICROAMBIENTE

Molecular Biology of the Cell, 3º Edição

DNA -> RNA -> PROTEÍNA

C A T T C A C C T C G A T G C A C C T G

G T A A G T G G A G C T A C G T G G A C

3’ 5’

3’ 5’

C A U U C A C C U C G A U G C A C C U G

3’ 5’

Val Ser Gly Ala

Thr Trp

transcrição

tradução

DNA -> RNA -> PROTEÍNA

C A T T C A C C T C G A T G C A C C T G

G T A A G T G G A G C T A C G T G G A C

3’ 5’

3’ 5’

am

plific

açã

o

RNAs rRNAs

tRNAs

mRNAs C A U U C A C C U C G A U G C A C C U G

3’ 5’

ncRNAs RNAs

mRNAs

rRNAs tRNAs

DNA codificante e não-codificante em humanos

ENCODE CONSORTIUM

(2007)

Seqüenciamento do genoma = 21.000 genes codificantes de proteína

Caracterização de 1%

do genoma humano

High-throughput

bioinformática

Maior parte do DNA é transcrita

Regiões não-codificantes ou

silenciosas

Sobrepostas com ORF

Sítios múltiplos

de iniciação

ncRNAs

centenas a milhares por genoma

estrutural enzimática

Braço de ligação Braço de ligação

Região

catalítica

transporte

molde

(complexo

enzimático)

ncRNAs

centenas a milhares por genoma

ncRNAs Longos Regulação da tradução

modificações

epigenéticas

Xa Xi

regular a expressão de gene codificante de

proteína (cis)

Regulação

da tradução

Regulação da tradução

microRNAs:

A SEGUNDA REVOLUÇÃO DOS RNAs

1993: Nemátoda

Fases do

desenvolvimento

embrionário

2000: Nemátoda (Ruvkun lab)

2000: (Pasquinelli e col)

Conservado

entre várias

espécies

Fases do

desenvolvimento

embrionário

Let-7

2001: microRNAs

Grande classe de

pequenos RNAs

Publicação tripla na Science:

- C. elegans (Bartel D; Ambros V)

- invertebrados e vertebrados (Tuschl T)

2002: Plantas

(Bartel D)

He & Hannon (2004)

microRNAs

microRNAs (miRNAs)

• pequenos RNAs de ~ 22 nt

• gene endógeno

• presente na maioria dos organismos multicelulares

• bastante conservados

• bloqueia a tradução

• modulam a expressão de genes envolvidos com

desenvolvimento em C. elegans, Drosófila e

mamíferos

• outras funções: defesa contra vírus; regulação de

genes envolvidos com proliferação celular

Principal função dos miRNAs

Estabelecimento e manutenção do estado diferenciado

Roomkeeping genes

microRNAs

X

RNAi

1990: Petúnias

(Napoli e col.; van der Krol e col.)

Co-supressão

1998: Nemátoda

(Mello, Fire, e col)

Transmissão:

• célula - célula

• progênie

Zamore, 2002

(Hannon e col; Zamore, Tuschl, Sharp)

2000: Drosófila

Zamore, 2002

RNAi

Hannon (Nature, 2002)

siRNAs

RNAi

fenômeno que promove o

silenciamento pós-transcricional

através de pequenos RNAs

evolutivamente conservado

mecanismos naturais

ferramentas para

pesquisa

ESTUDO DE FUNÇÃO GÊNICA

TERAPIA GÊNICA

RNAi

RNAi

Seqüenciamento do genoma

de diversos organismos

The RNAi Web

He & Hannon (2004)

microRNAs:

He & Hannon (2004)

RNAi X microRNAs

RISC: RNA-Induced Silencing Complex

• endonuclease direcionada pelos siRNAs/miRNAs

• pode clivar o RNA alvo complementar aos siRNAs/miRNAs

• RECICLÁVEL

Algumas proteínas do complexo em mamíferos

• helicase: desenrola a dupla fita (Gemin-3)

• Proteína da família ARGONAUTA (RNase H)

- endoribonuclease: cliva o RNA-alvo (Ago2) ou não Ago1;3; 4

- 2 Domínios PAZ ligam-se ao siRNA (3´overhang 2nt)

- Domínio PIWI

exógeno

defesa

degradação

Complementaridade

Inibem a expressão gênica

Utilizam a Dicer e o RISC

siRNA miRNA

endógeno

desenvolvimento/

processos fisiológicos

impede a tradução

complementaridade

total

complementaridade

total ou parcial

X

siRNA miRNA =

Estrutura Gênica microRNAs

Kim V, 2005

isolado

cluster

Exon em

ncRNA

Intron em

ncRNA

Intron em

RNA

codificante

70

% i

ntr

ag

ên

ico

40%

He & Hannon (2004)

Bloqueio tradução

P-bodies

citoplasma

Chan & Slack, 2006

PUBLICAÇÕES

miRNAs

plantas

PUBLICAÇÕES

miRNAs 625

2006

642

> 13.000

Difícil estudar !

- Região alvo pode variar

para um mesmo miRNA

- Combinação de miRNA para

ocorrer o silenciamento

- Tecido específica

- Expressão temporal

miRNAs humanos

• 1527 microRNAs

• 1-3% dos transcritos são miRNAs

• 30-60% dos genes são regulados por

miRNAs

miRNAs

• Trabalhos:

predição

clonagem

- novos miRNA

- Validação

- Organização

/ Função

miRNAs

• Trabalhos:

clonagem

- novos miRNA

Clonagem

(concatâmeros)

extração de RNAs

pequenos

Ligação de

Adaptadores 3´ e 5´

Transcrição Reversa

PCR

sequenciamento

predição

- Validação

- Organização

/ Função

miRNAs

• Trabalhos:

regiões conservadas

3’ UTR (seed)

Localização no

genoma (seed)

Comparação com

outros organismos

precursor

predição

clonagem

- novos miRNA

predição

- Validação

- Organização

/ Função

miRNAs

• Trabalhos:

predição

clonagem

- novos miRNA

- Organização sinergia

gene hospedeiro

isolado

cluster

predição

- Validação

- Organização

/ Função

miRNAs

• Trabalhos:

predição

clonagem

- novos miRNA

- Validação

- Organização

/ Função RNAs-alvo

precursor

DESENVOLVIMENTO

miRNA REGISTRY

miRBase (http://www.mirbase.org/)

miRNA REGISTRY

miRBase (http://www.mirbase.org/)

miRNA REGISTRY

miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/)

miRNA REGISTRY

miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/)

miRNA Target

(www.microrna.org)

Painel de expressão: microarray

- 175 miRNAs em 24 órgãos humanos

- Presença e abundância

- Maioria amplamente expressa

- Co-expressão com outros miRNAs

- Paralelo com expressão de

hospedeiros

Painel de expressão: microarray

microarray Identificação de alvos

miR-124

miR -1

HeLa transfecção

- 12/24h Diminuiu a expressão de 100 genes

-88% da região 3’UTR tinha o motivo (5’- 2-7)

(mutação na semente)

miR-124 miR-1

-miRNAs específicos para cada

tipo celular

-depende da origem do tecido /

subgrupos

- Tumores têm baixo nível de

expressão de miRNAs (geral)

- marcador (Grau de

malignidade/ origem)

miR-127 cluster – ilha CpG – metilada em tumores

miR-127

BCL6 (proto-oncogene)

células tumorais + 5-AZA + PBA

proto-oncogene miRNA supressor tumoral

miR-17-92 cluster – superexpresso em tumores

supressor tumoral oncomiR

C-MYC

E2F1 apoptose

tumores expressão de miRNAs

- >50% dos miRs sítios frágeis – amplificações, deleções,

quebras e rearranjos

- Desregulação transcricional

- Problemas na biogênese

- Mutações e polimorfismos (SNPs)

- Modificações Epigenéticas

Identificação de alvos

- miR-16

miR-122

miR-192

miR-194

- específico e

prolongado (2 semanas)

(fígado)

DESENVOLVIMENTO

miR-302 CLUSTER iPSC – Induced pluripotent stem-cells

CÂNCER

relação indireta

não confirmada

vírus

doenças

SNPs

splicing alternativo

si x miRNA para terapia

PERSPECTIVAS

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