Micro Meios[1]

Luciana Silva Ribeiro, 2011.

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PREPARO DE MEIOS E REAGENTES

ÁGAR BAIRD PARKER (BP)

Aplicação: Meio seletivo/diferencial para isolamento e contagem de S. aureus. Composição da base

Triptona (peptona de caseína e digestão pancreática) 10g

Extrato de carne 5g

Extrato de levedura 1g

Piruvato de sódio 10g

Glicina 12g

Cloreto de lítio 5g

Ágar 20g

Água destilada 940ml

pH 7,0+-0,2 - 121°C/15min

Suplementos

Solução aquosa de telurito de potássio 1% 10ml/940ml base

Emulsão gema de ovo:salina (1:1 p/p) 50ml/940ml base

Preparação

Preparar a base, esterilizar, resfriar a 45-50ºC, adicionar assepticamente os suplementos estéreis previamente preparados. Plaquear imediatamente, o meio complemento não pode reaquecido. Estocar a placas sob refrigeração por não mais de 48h. Solução aquosa de telurito de potássio 1%: dissolver 1g de telurito de

potássio em 100ml de água destilada, esterilizar por filtração e estocar em frasco escuro, sob refrigeração. Emulsão de gema de ovo: mergulhar os ovos em etanol 70% por 10 min,

flambar, abrir assepticamente e transferir as gemas para um frasco estéril tarado. Adicionar às gemas uma quantidade de solução salina 0,85% estéril, suficiente para diluição 1:1 (peso/peso). Misturar o conteúdo por agitação ou com auxílio de baguetas estérieis, até obter uma suspensão homogênea.

O meio é adicionado de gema de ovo (evidenciar a produção de lecitinase), telurito de potássio e cloreto de lítio (inibir a flora acompanhante). Piruvato de sódio e a glicina atuam favorecendo seletivamente o crescimento da flora acompanhante. Colônias típicas: são negras (devido a redução do telurito de potássio a

telureto), circulares, pequenas, lisas, convexas, com bordas perfeitas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente (ação da lecitinase).


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Fig 01. Colônias típicas de S. aureus

Colônias atípicas: características de outros microrganismos são negras,

lustruosas, de forma irregular sem halo opaco ou transparente. (podem ser colônias de S. epidermidis). Colônias pequenas, negras e sem halo de clarificação são características de Micrococos. Leveduras e Bacillus, eventualmente podem crescer neste meio, porém as colônias são pardo-escuras e brancas, respectivamente.

Fig 02. Colônias atípicas de S. aureus


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ÁGAR BATATA DEXTROSE ACIDIFICADO (PDA ACIDIFICADO)

Aplicação: Meio seletivo para isolamento de bolores e leveduras. Composição

Amido de batata ou infusão de 200g de batatas 4g

Dextrose 20g

Ágar 15g

Água destilada 1L

121°C/15min

Preparação

Preparar o meio e esterilizar a 121ºC/ 15min. No momento do uso, fundir o Agar, resfriar a 45-50°C e adicionar uma quantidade suficiente de solução aquosa de ácido tartárico 10% estéril, para obter pH final de 3,5. Geralmente, a adição de 1ml de solução de ácido tartárico para cada 100ml de meio é suficiente para obter o pH requerido. O meio acidificado deve ser utilizado imediatamente, não podendo ser reaquecido.

Solução de ácido tartárico 10%: dissolver 10g de ácido em água

destilada e completar o volume para 100ml. Esterilizar por filtração.

O crescimento de bolores possui aspecto cotonoso em função da presença do agrupamento de hifas que forma um micélio. Podem apresentar colônias com diversas colorações.

Fig 03. Crescimento de bolores


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As leveduras apresentam colônias mucóides, de colorações diferentes.

Fig 04. Colônias de Leveduras

Na contagem de bolores e leveduras em alimentos, o resultado deve

ser expresso em unidades formadoras de colônias (UFC) por grama ou mililitro de amostra de bolores e leveduras, e não, contando separadamente os bolores e as leveduras, pois, sua confirmação só é possível, quando se procede a microscopia. As placas devem ser incubadas a 25°C por 3 a 5 dias.

ÁGAR BISMUTO SULFITO (BS)

Aplicação: Meio seletivo diferencial para detecção presuntiva de Salmonella. Composição

Peptona 10g

Extrato de carne 5g

Dextrose 5g

Fosfato dissódico (NaHPO4) 4g

Sulfito de Bismuto 8g

Sulfato ferroso 0,3g

Verde Brilhante (2,5ml da solução aquosa 1%) 0,025g

Ágar 20g

Água destilada 1L

pH 7,7+-0,2

Preparação

Dissolver os ingredientes e aquecer em banho-maria apenas o tempo necessário para a completa fusão do ágar. Não autoclavar. Distribuir em placas imediatamente, agitando continuamente para suspender o precipitado que normalmente permanece após o aquecimento.


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Obs.: os fabricantes recomendam que as placas de BS sejam preparadas no dia de uso, porém, diversos estudos têm demonstrado que o meio recém preparado é tóxico para várias cepas de Salmonella.

Fig 05. Agar Bismuto Sulfito Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Sistema inibidor: ação combinada do precipitado de bismuto-sulfito com solução de sulfito de sódio e o verde brilhante. Sistema indicador: fosfato ácido dissódico e sulfato ferroso.

Fig 06. Ágar BS – crescimento de Salmonella

Fonte: Hajdenwurcel (2004)

A Salmonella reduz o sulfito a sulfeto na presença de glicose

produzindo sulfeto de hidrogênio, graças à presença de ferro e fosfato, tornando as colônias negras. Em volta da colônia aparece um brilho metálico devido à redução dos íons bismuto a bismuto metálico.


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Fig 07. Ágar BS – crescimento de E. coli Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fig 08. Ágar BS – crescimento de Proteus Fonte: Hajdenwurcel (2004)

E. coli apresenta colônias pequenas, de coloração variando de marrom a verde sem brilho metálico. Proteus apresenta colônias pequenas e verdes, sem brilho metálico.

ÁGAR CITRATO DE SIMMONS

Aplicação: Meio para prova bioquímica, teste do citrato. Composição

Sulfato de magnésio 0,2g

Fosfato de amônia (NH4H2PO4) 1g

Fosfato dipotássico (K2HPO4) 1g

Citrato de sódio 2g

Cloreto de sódio 5g

Ágar 15g

Azul de bromotimol (40ml as solução 0,2%) 0,08g

Água destilada 1 L

pH 6,6+-0,2 – 121°C/ 15 min

Preparação

Dissolver os ingrediente, fundir o Agar, distribuir em tubos de 10x110mm (4-5ml/tubo), esterilizar a 121°C/15min e inclinar. Solução de 0,2% de azul de bromotimol: dissolver 0,1g em 2,5ml de NaOH

0,1N e completar o volume para 50ml com água destilada.

Esta prova fundamenta-se em determinar a capacidade dos microrganismos utilizarem o citrato de sódio como única fonte de carbono para seu metabolismo, resultando em alcalinidade do meio.

O ágar Citrato de Simmons contém sais inorgânicos de amônia que serão utilizados pelo microrganismo, resultando na produção de amônia. A utilização de ácidos orgânicos e seus sais como fonte de carbono, também, promovem a produção de carbonatos e bicarbonatos. A produção desses


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compostos provoca um aumento do pH do meio de cultura, que tem em sua composição o indicador de pH azul de bromotimol.

Fig 09. Prova do citrato – positivo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Resultado positivo: Alcalinização do meio e viragem do indicador de pH (azul de bromotimol) para azul. Ex.: E. aerogenes.

Fig 10. Prova do citrato – negativo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Os microrganismos que não conseguem utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono, não crescem no meio de cultura e o mesmo permanece com sua cor inicial (verde). Ex.: E. coli.

ÁGAR (CALDO) INFUSÃO CÉREBRO CORAÇÃO (BHI)

Aplicação: Meio de enriquecimento e manutenção para uso geral. Composição do caldo

Infusão de 200g de cérebro de bezerro (sólidos) 7,7g

Infusão de 250g de coração de boi (sólidos) 9,8g

Proteose peptona 10g

Dextrose 2g


Fosfato dissódico (Na2HPO4) 2,5g

Água destilada 1 L

pH 7,4+-0,2 – 121°C/ 15 min

Preparação

Dissolver os ingredientes, ajustar o pH e esterilizar a 121°C/15min. Para a preparação do ágar, adicionar 15g de ágar para cada litro de caldo.


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ÁGAR LEVINE EOSINA AZUL DE METILENO (L-EMB)

Aplicação: Meio seletivo/diferencial para detecção presuntiva de E. coli. Composição

Peptona 10g

Lactose 10g


Eosina amarela 0,4g

Azul de metileno 0,065g

Ágar 15g

Água destilada 1 L

pH 7,1+-0,2 – 121°C/ 15 min

Preparação

Dissolver os ingredientes, ajustar o pH e esterilizar a 121°C/15min. Distribuir em placas imediatamente, pois não pode ser reaquecido.

Fig 12. Ágar EMB Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Os corantes eosina e azul de metileno inibem o crescimento de bactérias Gram positivas permitindo diferenciação entre microrganismos fermentadores e não fermentadores de lactose com aparecimento do brilho metálico são características utilizadas para diferenciação de E. coli das outras enterobactérias.


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Fig 13. Ágar EMB – Crescimento de E. coli


Colônias típicas de E. coli neste meio de cultura são nucleadas com centro preto e brilho verde metálico (reação da eosina em pH baixo, devido a produção de ácido pela fermentação da lactose).

Fig 14. Ágar EMB – Crescimento de Enterobacter aerogenes


As colônias de Enterobacter são mucóides, rosas, acinzentadas, sem brilho verde metálico. A produção de colônias mucóides deve-se a presença de cápsula (material polissacarídico produzido pelo microrganismo).

ÁGAR LISINA FERRO (LIA)

Aplicação: Meio para provas bioquímicas, teste de descarboxilação da lisina e teste de produção de H2S. Composição

Peptona 5g


Dextrose 1g

Cloridrato de L-Lisina 10g

Citrato férrico amoniacal 0,5g

Tiossulfato de sódio 0,04g

Púrpura de bromocresol (2ml de solução 1%) 0,02g

Ágar 15g

Água destilada 1 L

pH 6,7+-0,2 – 121°C/ 15 min

Preparação

Dissolver os ingrediente, fundir o ágar, distribuir em tubos de 10x110mm (4-5ml/tubo), esterilizar a 121°C/15min e inclinar, mantendo fundo de 2,5cm, no mínimo, porque a reação de descarboxilação da lisina é mais eficiente em condições anaeróbias. Solução de 1% de púrpura de bromocresol: dissolver 1g em 1,9ml de NaOH

0,1N e completar o volume para 10ml com água destilada.


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Fig 15. Ágar LIA Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O meio de cultura deve ser inoculado com a colônia suspeita, através de picada com agulha e platina e estrias na rampa.

Carboidrato: glicose. Indicador de H2S: tiossulfato de sódio e Citrato férrico amoniacal. Indicador de pH: Púrpura de bromocresol Lisina: aminoácido que será ou não descarboxilado.

Fig 16. Ágar LIA – Crescimento de Salmonella Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fundo e rampa alcalinos (púrpura) com produção de H2S (escurecimento do meio). Pode também ocorrer ausência de produção de H2S. O meio fica alcalino, porque mesmo ocorrendo a fermentação da glicose com produção de ácido, a lisina é descarboxilada, produzindo um composto alcalino (cadaverina) que neutraliza o ácido formado.

Fig 17. Ágar LIA – Crescimento de Proteus Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O meio adquire uma coloração castanha em função da reação de desaminação da lisina a ácido α-cetocarbônico. Este composto reagindo com os sais de ferro provoca o aparecimento da cor castanha. O fundo fica amarelo em função da fermentação da glicose.


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ÁGAR MANITOL GEMA DE OVO POLIMIXINA (MYP)

Aplicação: Meio seletivo/ diferencial para isolamento presuntivo de Bacillus

cereus. Composição da base

Extrato de carne 5g

Peptona 3g

D-Manitol 1g


Vermelho de fenol (12,5ml da solução 0,2%) 0,5g

Ágar 15g

Água destilada 1 L

pH 7,1+-0,2 – 121°C/ 15 min Suplemento

Solução de sulfato de polimixina B 10.000IU/ml 10ml/900ml base

Emulsão gema de ovo:salina (1:1) 100ml/900ml base Preparação Esterilizar a base a 121°C/20min, resfriar a 45-50ºC, adicionar assepticamente os suplementos previamente preparados e plaquear imediatamente, pois o meio completo não pode ser reaquecido. Solução 0,2% de vermelho de fenol: dissolver 0,1g em 4ml de NaOH 0,1N e

completar o volume para 50ml com água destilada. Solução de sulfato de polimixina B 10.000IU/ml: dissolver 500.000 unidades de sulfato de polimixina em 50ml de água destilada, esterilizar por filtração e estocar sob refrigeração. Para determinar o peso da polimixina necessário para 500.000 unidades, verificar no frasco a potência da polimixina adquirida. Por exemplo, se a o potência for 7.900 U/mg, significa que cada miligrama tem 7.900 unidade e que são necessárias 63,29mg para 500.000 unidades. Emulsão gema de ovo: VIDE ágar Baird Parker.

Fig 18. Ágar MYP (Mossel) Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O meio de cultura é adicionado de gema de ovo (evidenciar a produção de lecitinase) e polimixina (inibir a flora acompanhante). O indicador de pH é o vermelho de fenol. Apresenta o manitol que pode ou não ser fermentado.


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Fig 18. Ágar MYP (Mossel) - Crescimento de B. cereus Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Bacillus cereus não fermenta o manitol, utilizando as peptonas e

alcalinizando o meio que muda para coloração vermelha mais escura (esta coloração torna-se um róseo leitoso, quando misturada com a precipitação da gema de ovo). A presença de lecitinase é evidenciada pelo halo opaco ao redor das colônias.

Fig 19. Ágar MYP (OXOID) Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O meio de cultura é também é adicionado de gema de ovo e polimixina, porém o indicador de pH é o azul de bromotimol. Apresenta do piruvato de sódio na composição, possibilita uma melhor reação de hidrólise da lecitina da gema de ovo, facilitando a formação de esporos e reduz o crescimento invasivo de algumas colônias de B. cereus.

Fig 20. Ágar MYP (OXOID) - Crescimento de B. cereus


Bacillus cereus não fermenta o manitol, utilizando as peptonas e alcalinizando o meio e mudando-o de coloração amarela-esverdeada para azul em função do indicador de pH. A presença de lecitinase é evidenciada pelo halo opaco ao redor das colônias.


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ÁGAR (CALDO) DE MAN ROGOSA & SHARP (MRS)

Aplicação: Meio para cultivo de bactérias láticas. Composição do caldo

Peptona 10g

Extrato de carne 8g


Glicose 20g

Sorbitano monooleato 1g


Acetato de sódio.3H2O 5g

Citrato de amônia 2g

Sulfato de magnésio.7 H2O 0,2g

Sulfato de manganês.4 H2O 0,05g

Água destilada 1 L

pH 6,2+-0,2 – 121°C/ 15 min

Preparação

Dissolver os ingredientes, ajustar o pH e esterilizar a 121°C/15min.

Para a preparação do ágar, adicionar 15g de ágar para cada litro de caldo.

Fig 21. Ágar MRS glicose acidificado - Crescimento de Lactobacillus delbrueckii ssp.

Bulgaricus Fonte: Silva (2007)

Fig 22. Ágar MRS com adição de solução de maltose - Crescimento de Lactobacillus

acidophilus Fonte: Silva (2007)


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ÁGAR PADRÃO PARA CONTAGEM (PCA)

Aplicação: Meio de enriquecimento para contagem total de microrganismos

em placas, ou para manutenção da cultura de bactérias. Composição

Triptona 5g

Extrato de levedura 2,5g

Dextrose 1g

Ágar 15g

Água destilada 1L

pH 7,0+-0,2 – 121°C/ 15 min

Fig 23. Ágar PCA


O método de contagem de microrganismos em placas pode ser

utilizado para contagem de grupos microbianos como aeróbios mesófilos, psicrotróficos, termófilos, variando apenas a temperatura de incubação.


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ÁGAR TRÍPLICE AÇÚCAR FERRO (TSI)

Aplicação: Meio para prova bioquímica, testes de fermentação da glicose, lactose e sacarose, teste de produção de H2S. Composição

Extrato de carne 3g


Peptona 15g

Proteose peptona 5g

Glicose 1g

Lactose 10g

Sacarose 10g

Sulfato ferroso (FeSO4) 0,2g

Cloreto de Sódio 5g

Tiossulfato de sódio (Na2S2O3) 0,3g

Vermelho de fenol (12ml da solução 0,2%) 0,024g

Ágar 12g

Água destilada 1 L

pH 7,4+-0,2 – 121°C/ 15 min

Preparação

Dissolver os ingredientes, fundir o ágar, distribui em tubos de

10x100mm (4-5 ml/tubo), esterilizar a 121°C/15min e inclinar, mantendo fundo de no mínimo 2,5cm. Solução 0,2% de vermelho de fenol: Dissolver 0,1g em 4 ml de NaOH 0,1N e completar o volume para 50ml com água destilada.

Fig 24. Ágar TSI Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O meio de cultura deve ser inoculado com a colônia suspeita, através

de picada com agulha de platina (crescimento em anaerobiose) e estrias na rampa (aerobiose).

Carboidratos: Glicose, lactose, sacarose. Indicador de H2S: Tiossulfato de sódio e Sulfato ferroso. Indicador de pH: Vermelho de fenol.


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Fig 25. Ágar TSI – crescimento de Samonella Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Fermentação da glicose em aerobiose com produção de CO2, H2O e energia e fermentação da glicose em anaerobiose com produção de ácidos orgânicos, aldeídos, alcoóis, CO2, H20 e energia. A glicose está em concentração dez vezes menor que os outros carboidratos, e quando acaba o microrganismo começa a utilizar as peptonas e produzir compostos alcalinos. Como na superfície (aerobiose) não há produção de ácido, o meio fica alcalino (viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo). Neste tubo pode ser visualizada a produção de gás.


Reação igual a anterior, só que a cepa foi produtora de H2S (precipitado preto), e o H2S produzido mascarou a parte amarela do tubo.


Perfil típico da Salmonella onde ocorreu fermentação da glicose em anaerobiose, produção de H2S e produção de alcalinidade na superfície do meio (aerobiose).

Fig 28. Ágar TSI – crescimento de Coliforme Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O coliforme fermenta a lactose e a glicose. Portanto, as condições ácidas após 18-24h ainda existem. O meio fica amarelo no fundo e na superfície, ocorrendo produção de gás.


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ÁGAR VERDE BRILHANTE SULFA (BGS)

Aplicação: Meio seletivo diferencial para isolamento de Samonella. Composição


Polipeptona 10g


Lactose 10g

Sacarose 10g

Vermelho de fenol 0,08g

Verde brilhante 0,0125g

Sulfapiridina 1g

Ágar 20g

Água destilada 1 L

pH 6,9+-0,2 – 121°C/15min

Preparação

Suspender os ingredientes na água destilada, ajustar o Ph, aquecer até a completa fusão do ágar e esterilizar a 121°C/15min. Plaquear imediatamente, o meio não pode ser reaquecido.

Fig 29. Ágar Verde Brilhante – Crescimento de Salmonella


A Salmonella apresenta colônias de cor vermelha, pois não fermenta a lactose. Ela utiliza as peptonas como fonte de energia produzindo substâncias alcalinas que elevam o Ph do meio, modificando para uma coloração vermelha mais intensa.

Fig 30. Ágar Verde Brilhante – Crescimento de E.coli


E. coli apresenta colônias de cor amarela, pois fermenta a lactose.


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ÁGAR (CALDO) VERMELHO DE FENOL - CARBOIDRATOS

Aplicação: Meio para prova bioquímica, teste de fermentação de carboidratos Composição do caldo base

Proteose peptona 10g

Extrato de carne (opcional) 1g

NaCl 5g


Água destilada 1 L

pH 7,4+-0,2 - 121°C/15min

Preparação do caldo: Dissolver os ingredientes da base, acertar o pH,

distribuir em tubos 10x100mm (4ml/tubo) com tubinhos de Durhan e esterilizar a 121°C/15min. Preparar e esterilizar por filtração uma solução aquosa a 10% do carboidrato a ser testado e adicionar assepticamente aos tubos de meio base, na quantidade necessária para atingir a concentração final de 0,5 ou 1% no meio completo (0,4ml ou 0,2ml de solução de carboidrato/4ml de base) Preparação do ágar: Preparar o caldo base suplementado com 15g/L de ágar e esterilizar em porções de 100ml. Resfriar a 50-55°C e adicionar assepticamente, a cada 100ml de base, 10ml da solução de ccarboidrato, para concentração final 1%. Plaquear imediatamente ou distribuir em tubos de 10x100mm estéreis (5ml/tubo). Solução de Vermelho de fenol 0,2%: dissolver 0,1g em 4ml de NaOH 0,1N e completar o volume para 50ml com água destilada.

Fig 31. Caldo vermelho de fenol – Teste positivo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Prova bioquímica da fermentação da glicose em anaerobiose: esta prova é recomendada para confirmação de colônias suspeitas de B.cereus. Caldo vermelho de fenol 1% glucose. Deve ser desaerado (fervura por 15min, seguido de imediato resfriamento). Após a inoculação da colônia suspeita, adicionar óleo mineral estéril. O resultado positivo se dá quando ocorre viragem do indicador, alterando a cor do meio de vermelho para amarelo. Ex.: Bacillus cereus.

Fig 32. Caldo vermelho de fenol – Teste negativo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Quando o meio permanece com a cor inalterada significa teste negativo de utilização da glicose em anaerobiose.


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ÁGAR XILOSE LISINA DESOXICOLATO (XLD)

Aplicação: Meio seletivo diferencial para isolamento presuntivo de Samonella. Composição


L-Lisina 5g

Xilose 3,75g

Lactose 7,5g

Sacarose 7,5g

Desoxicolato se sódio 2,5g

Citrato férrico amoniacal 0,8g

Tiossulfato de sódio (Na2S2O3) 6,8g



Ágar 15g

Água destilada 1 L

pH 7,4+-0,2 – fervura

Preparação

Dissolver os ingredientes, ajustar o pH e ferver em banho-maria, sob

constante agitação, até completa fusão do ágar. Não autoclavar. Plaquear imediatamente, não pode ser reaquecido.

Solução 0,2% de vermelho de fenol: Dissolver 0,1g em 4 ml de NaOH 0,1N e

completar o volume para 50ml com água destilada.

Fig 33. Ágar XLD Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Sistema inibidor: Desoxicolato de sódio. Indicador de pH: Vermelho de fenol. Indicadores de produção de H2S: Tiossulfato de sódio e Citrato férrico

amoniacal. Lisina: aminoácido que poderá ser descarboxilado, levando a formação

de uma diamina (composto básico) chamada cadaverina e CO2, resultando em alcalinidade do meio.


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Fig 34. ágar XLD – Crescimento de E.coli Fonte: MicrobLog: Microbiology Training (2011)

A Salmonella não fermenta a lactose nem a sacarose, mas fermenta a

xilose, levando a viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo, devido á produção de ácido. Após, haverá um aumento de pH devido a descarboxilação da lisina, tornando o vermelho de fenol novamente vermelho, inclusiva mais intenso que a cor original do meio. A produção de H2S varia de acordo com a espécie, produzindo ou não, colônia com centro negro.

Fig 35. ágar XLD – Cresimento de Salmonella

Fonte: http://www.jlindquist.net/generalmicro/dfentericplate.html

E.coli produz colônias amarelas em função da fermentação da lactose. Lactose e sacarose estão em excesso para que os coliformes lisina positivo não alcalinizem o meio.

http://microblog.me.uk/

http://www.jlindquist.net/generalmicro/dfentericplate.html


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ÁGUA PEPTONADA 0,1% (H2Op)

Aplicação: Diluente para homogeneização e diluição de amostras para análise. Composição

Peptona 1g

Água destilada 1 L

pH 7,0+-0,2 - 121°C/15min

Preparação

Dissolver a peptona na água destilada e distribuir em tubos ou frascos, na quantidade requerida. Esterilizar a 121°C/15min.

ÁGUA PEPTONADA TAMPONADA (BPW)

Aplicação: Diluente e meio de pré-enriquecimento para detecção de

Salmonella. Composição

Peptona 10g

NaCl 5g

Fosfato dissódico (Na2HPO4) 3,5g

Fosfato monopotássico (KH2PO4) 1,5g

Água destilada 1 L

pH 7,2+-0,2 - 121°C/15min

Preparação

Dissolver os ingredientes na água destilada, ajustar o pH e distribuir em tubos ou frascos, na quantidade requerida. Esterilizar a 121°C/15min.


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CALDO E. COLI (EC)

Aplicação: Meio para contagem de coliformes fecais, confirmação de resultado presuntivo pelo método NMP. Composição

Triptose 20g

Lactose 5g

Sais biliares N°3 1,5g

Fosfato dipotásssico (K2HPO4) 4g



Água destilada 1 L

pH 6,9+-0,2 – 121°C/15min

Preparação

Dissolver os ingredientes, ajustar o pH distribuir em tubos de 16x150mm com tubo de Durhan (aproximadamente 6ml/tubo) esterilizar a 121°C/15min.

Fig 36. Caldo EC – Crescimento de coliformes fecais Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O caldo EC é seletivo para microrganismos Gram negativos em função da presença de sais biliares. A incubação a temperatura de 45,5°C em banho-maria por 24 horas permite evidenciar a presença de coliformes fecais, pois eles apresentam a capacidade de fermentação da lactose com produção de gás à temperaturas mais elevadas.


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CALDO LACTOSADO (CL)

Aplicação: Meio de pré-enriquecimento para detecção de Salmonella. Composição

Extrato de carne 3g

Peptona 5g

Lactose 5g

Água destilada 1 L

pH 6,9+-0,2 – 121°C/15min

Preparação

Dissolver os ingredientes, ajustar o pH e esterilizar a 121°C/15min.

Fig 37. Caldo Lactosado Fonte: Hajdenwurcel (2004)

O pré-enriquecimento tem a finalidade de promover o crescimento de

células injuriadas que foram submetidas à ação do calor, alta pressão, mudança de pH, ação de inibidores. Também permite uma diluição na água de substâncias inibidoras solúveis existentes nas amostras de alimentos.


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CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSE (LST)

Aplicação: Meio seletivo para detecção presuntiva de coliformes totais, fecais e E. coli pelo método NMP. Composição

Triptose 20g

Lactose 5g

Fosfato dipotásssico (K2HPO4) 2,75g


NaCl 5g

Lauril Sulfato de sódio 0,1g

Água destilada 1 L

pH 6,8+-0,2 – 121°C/15min

Preparação

Dissolver os ingredientes, ajustar o pH, distribuir em tubos de 16x150mm com tubo de Durhan (10ml/tubo) e esterilizar a 121°C/15min.

Fig 38. Caldo LST Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Crescimento com produção de gás evidencia o teste positivo. Este meio de cultura permite um enriquecimento seletivo de coliformes, recuperando as células injuriadas.


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CALDO RAPPAPORT-VASSILIADIS MODIFICADO (RV – R10)

Aplicação: Meio seletivo para enriquecimento de Salmonella em alimentos. Composição Solução A

Triptona 5g

NaCl 8g


Água destilada 1 L

Preparação

Dissolver os ingredientes, aquecendo se necessário. Essa solução deve ser preparada no dia em que for preparado o meio completo. Solução B

MgCl2.6H2O 400g

Água destilada 1 L

Preparação

Mantendo a proporção, dissolver todo o conteúdo de um novo frasco de cloreto de magnésio na água, porque o sal é muito higroscópico. Acondicionar em frasco âmbar, com tampa bem apertada. Solução C

Verde de malaquita oxalato 0,4g


Preparação

Dissolver o corante na água e estocar em frasco escuro. Meio completo

Solução A 1000ml

Solução B 100ml

Solução C 10ml

pH 5,2+- 0,2 - 115°C/15min

Preparação do meio completo

Juntas as quantidades de solução A, B e C, ajustando o pH. Distribuir em tubos de 16x150mm (10ml/tubo). Esterilizar a 115°C/15min.


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Fig 39. Caldo Rappaport-Vassiliadis


Os seguintes fatores tornam esse meio de cultura excelente para o enriquecimento seletivo de Salmonella: alta pressão osmótica (cloreto de magnésio), pH baixo (5,2). Presença de ver de malaquita. A Salmonella cresce muito bem nessas condições, sendo a flora acompanhante inibida.


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CALDO SELENITO CISTINA (SC)

Aplicação: Caldo para enriquecimento seletivo de Salmonella em alimentos. Composição

Triptona 5g

Lactose 4g

Fosfato dissódico (Na2HPO4) 10g

Selenito ácido de sódio 4g

L-Cistina 0,01g

Água destilada 1 L

pH 7,0+-0,2 – fervura/ 10 min

Preparação

Dissolver os ingredientes na água destilada, ajustar o pH, distribuir em tubos de 16x150mm (10ml/tubo) e submeter a fervura por 10 min. Não autoclavar. A altura do meio no tubo não deve ser inferior a 5 cm, porque o meio é mais eficiente quando apresenta potencial de óxido-redução reduzido. Cuidado: os sais de selenito são tóxicos quando inalados ou ingeridos.

Fig 40. Caldo Selenito Cistina Fonte: Hajdenwurcel (2004)


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CALDO TETRATIONATO (TT)

Aplicação: Meio de enriquecimento seletivo para análise de Salmonella. Composição da base

Proteose peptona 2,5g

Peptona de caseína digestão pancreática 2,5g

Oxgall 11g

Tiossulfato de sódio 30g

Carbonato de cálcio 10g

Água destilada 1 L

pH 8,4+-0,2 – aquecer até a fervura

Suplemento

Solução de iodo 0,2ml/10ml base

Solução 0,1% de verde brilhante (opcional) 0,1ml/10ml base

Preparação

Suspender os ingredientes da base e aquecer até a fervura. Não

autoclavar. O precipitado não vai dissolver completamente. No momento do uso adicionar, a cada litro de base, 20ml de solução de iodo e 10ml de solução 0,1% de verde brilhante. Ajustar o pH e distribuir em tubos. Utilizar imediatamente, o meio completo não deve ser estocado. Solução de iodo

Iodo 6g

Iodeto de potássio 5g


Colocar o iodo e o iodeto de potássio num almofariz e homogeneizar

com o pistilo. Adicionar consecutivamente, porções de 1ml, 5ml e 10ml de água destilada, homogeneizando a solução após cada diluição. Em seguida, transferir a solução para um frasco âmbar, lavando o almofariz e o pistilo com o restante da água destilada.

Fig 41. Caldo Tetrationato Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Permite o crescimento de Salmonella e previne o crescimento de parte da flora acompanhante. Com a adição de iodo ao caldo, haverá oxidação do tiossulfato de sódio com formação de tetrationato. A toxicidade desse meio está relacionada com a presença desses dois compostos (tetrationato e tiosulfato). O meio é tamponado com carbonato de cálcio que irá neutralizar os ácidos que podem ser produzidos pela decomposição do tetrationato por algumas enzimas.


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CALDO TRIPTONA 1%

Aplicação: Meio para prova bioquímica, teste do indol. Composição

Triptona 10g

NaCl 5g

Água destilada 1 L

pH 7,3+-0,2 – 121°C/15min

Preparação

Dissolver os ingredientes na água destilada, distribui em tubos de 10x100mm (4-5ml/tubo) e esterilizar a 121°C/15min.

O princípio desta prova consiste em detectar a habilidade do microrganismo produzir indol a partir do aminoácido triptofano, através da enzima triptofanase. O principal intermediário da degradação do triptofano é o ácido indolpirúvico que pode forma indol por desaminação e escatol por descarboxilação do ácido indolacético. O triptofano é fornecido no meio de cultura através da adição de peptonas. A presença do indol é detectada pelo teste colorimétrico, pela adição do reagente de Kovacs, que apresneta em sua composição (p-dimetilaminobezaldeído, álcool amílico e ácido clorídrico).

Fig 42. Prova do indol – teste positivo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

A prova positiva é caracterizada pela presença de um anel vermelho na camada alcóolica. Ex.: E. coli.

Fig 43. Prova do indol – teste negativo Fonte: Hajdenwurcel (2004)

A prova negativa é caracterizada pela presença de um anel amarelo na camada alcóolica. Reação variável pode ocorrer com aparecimento de coloração alaranjada na camada alcóolica, devido à produção de escatol, produto precursor da formação de indol. Ex.: E. aerogenes.


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CALDO VERDE BRILHANTE BILE 2% (VB)

Aplicação: Meio seletivo para contagem de coliformes totais. Composição

Bile de boi (“oxgall”) 20g

Peptona 10g

Lactose 10g

Verde Brilhante (13,3ml de solução aquosa 0,1%) 0,0133g

Água destilada 1 L

pH 7,2+-0,2 – 121°C/15min

Preparação

Dissolver os ingredientes, acertar o pH, distribuir em tubos de 16x150mm com tubo de Durhan (aproximadamente 6ml/tubo) e esterilizar a 121°C/15min.

Fig 43. Caldo Verde Brilhante Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Crescimento com produção de gás evidencia um teste positivo. O meio de cultura apresenta sais biliares que inibem o crescimento de microrganismos Gram positivos e a lactose é utilizada como substrato para produção de gás.


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CALDO VM-VP

Aplicação: Meio para prova bioquímica, testes de Vermelho de Metila e Voges-Proskauer. Composição

Peptona 20g

Glicose 10g

Fosfato dipotásssico (K2HPO4) 10g

Água destilada 1 L

pH 6,9+-0,2 – 121°C/15min

Preparação

Dissolver os ingredientes na água destilada, acertar o pH e distribuir em tubos de 10x100mm (5ml/tubo) e esterilizar a 121°C/15min.

Prova vermelho de metila O principio da prova consiste em detectar a capcidade do microrganismo

converter a glicose em ácido em vez de acetilmetilcarbinol. Esta prova baseia-se não emprego de um indicador de pH, o vermelho de metila, para determinar a produção de ácido proveniente da fermentação da glicose. Após a incubação adiciona-se o indicador vermelho de metila que muda para coloração vermelha quando o pH atinge 4,2 ou menos.

Fig 44. Caldo VM-VP – Teste VM POSITIVO


Resultado positivo: o cultivo é suficientemente ácido para permitir que o vermelho de metila mantenha uma coloração vermelha definida. E. coli e outros microrganismos VM positivos produzem grande quantidade de ácidos: lático, succínico, acético e fórmico.

Fig 45. Caldo VM-VP – Teste VM NEGATIVO Fonte: Hajdenwurcel (2004)

Resultado negativo: coloração amrela (pH superior a 6,0) ocorrendo coloração alaranjada, deve-se continuar a incubação até 4 dias e repetir a prova. Os microrganismos VM negativos também produzem ácidos, porém numa menor concentração, devido à neutralização e formação de outros compostos. O ácido acético é convertido em acetoína e 2,3-butilenoglicol (produtos neutros). Enterobacter aerogenes é VM negativo.


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Prova de Voges-Proskauer

Esta prova baseia-se em determinar a capacidade dos microrganismos produzirem um composto neutro, o acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir da fermentação da glicose.

Na presença de oxigênio atmosférico e em meio alcalino (KOH 40% ou NaOH 40%) a acetoína e 2,3 butilenoglicol são oxidados para diacetil que combina com um grupamento guanídico da arginina (presente na peptona) produzindo uma coloração vermelha. O alfa-naftol e a creatina são adicionados para catalisarem a reação.

Esta reação é lenta. Inicialmente forma-se um anel vermelho na superfície do meio de cultura que vai intensificando com o tempo. A intensidade da coloração vermelha é proporcional a quantidade de diacetil no meio de cultura.

E. aerogenes é VP positivo. E. coli é VP negativo.

Fig 46. Caldo VM-VP – Teste Voges Proskauer Fonte: Hajdenwurcel (2004)


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PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO 3%

Aplicação: reagente para prova bioquímica do teste de catalase. Composição

Peróxido de Hidrogênio 30% 10ml

Água destilada 90 ml

Preparação

Dissolver 10ml de água oxigenada 30% em 90ml de água destilada. Cuidado. O peróxido de hidrogênio a 30% pode provocar queimaduras dolorosas, devendo ser manuseado com luvas e óculos protetores. Em caso de respingos, lavar com etanol 70% em abundância. Não lavar com água.

REAGENTES DE BARRIT PARA TESTE DE VP

Aplicação: reagentes para prova bioquímica, teste de Voges-Proskauer. Solução 5% de alfa-naftol

Alfa-naftol 5g

Etanol absoluto 100ml

Estocar em geladeira. CUIDADO. O reagente não deve ser pipetado

com a boca. Solução 40% de KOH ou NaOH

KOH ou NaOH 40g


Preparar o KOH rapidamente (é altamente higroscópico) Estocar sob

refrigeração, em frasco de polietileno ou em frasco de vidro com a boca e a tampa parafinadas. CUIDADO. A solução é extremante cáustica, podendo causar queimaduras dolorosas a pele. Em caso de acidente, lavar com água em abundância.

SOLUÇÕES DE ÁCIDO CLORÍDRICO

HCl 1N: Dissolver 86ml de ácido clorídrico concentrado em menos de um litro de água destilada e completar o volume para um litro. HCl 0,1N: Dissolver 8,6ml de ácido clorídrico concentrado em menos de um litro de água destilada e completar o volume para um litro. HCl 0,02N: Dissolver 20ml de HCl 1N em menos de um litro de água destilada e completar o volume para um litro.


35

SOLUÇÃO DE ÁLCOOL IODADO

Aplicação: Desinfetante Composição

Iodo 10g

Iodeto de potássio 10g

Etanol 70% 500ml

Preparação

Colocar o iodo e o iodeto de potássio em um almofariz e homogeneizar com o pistilo. Adicionar álcool em pequenas porções e continuar homogeneizando após cada adição. Em seguida, transferir para um frasco e lavar o almofariz e o pistilo com o restante do álcool.

SOLUÇÃO DE HIDRÓXIDO DE SÓDIO

NaOH 1N: Dissolver 40g de NaOH em menos de um litro de água destilada e completar o volume para um litro. NaOH 0,1N: Dissolver 4g de NaOH em menos de um litro de água destilada e completar o volume para um litro. NaOH 0,02N: Dissolver 0,8g de NaOH em menos de um litro de água destilada e completar o volume para um litro.


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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA,N.F.A.; TANIWAKI, M.H.; SANTOS, R.F.S.; GOMES, R.A.R. Manual de métodos de Análise Microbiológica de Alimentos. 3ªed. São Paulo. 2007.

HAJDENWURCEL, J.R. Atlas de microbiologia de alimentos. Vol1. São

Paulo. 2004. SILVA, S.V. Desenvolvimento de iogurte probiótico com prebiótico. (Dissertação) Universidade Federal de Santa Maria. 2007 MicrobLog: Microbiology Training Disponível: http://microblog.me.uk/286 Acesso em: 21 de maio de 2011. Differential Media: Overview of Some Common Enteric Plating Media Disponível: http://www.jlindquist.net/generalmicro/dfentericplate.html Acesso em: 21 de maio de 2011.

http://microblog.me.uk/

Micro Meios[1]

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