MICOTOXINAS NA AVICULTURA E SUINOCULTURA

0

MICOTOXINAS

FRARE, A. L.; ARAUJO, D. P.; NAVARRO, K. FACULDADE ASSIS GURGACZ, CASCAVEL, PARANÁ, 2013.

SUMÁRIO

1. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ............................................................... 5

1.1 Casuística ............................................................................................. 5

1.1.1 Setor meio de cultura ........................................................................ 5

1.1.2 Setor de Coleta e Bacteriologia ......................................................... 6

1.1.3 Setor Histopatologia .......................................................................... 7

1.1.4 Setor Sorologia ................................................................................. 7

1.1.5 Setor Micotoxinas .............................................................................. 8

1.1.6 Setor PCR ......................................................................................... 9

2. RELATO DE CASO .................................................................................. 11

2.1 Como é Feito o Teste ......................................................................... 12

3. DISCUSSÃO ............................................................................................. 18

3.1 Aflatoxinas .......................................................................................... 18

3.2 Tricotecenos ....................................................................................... 18

3.3 Zearalenona ....................................................................................... 19

3.4 Fumonisinas ....................................................................................... 20

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... 23

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 24

APÊNDICE ....................................................................................................... 27

ANEXOS .......................................................................................................... 30

1

ANEXO 1 ..................................................................................................... 30

ANEXO 2 ..................................................................................................... 31

ANEXO 3 ..................................................................................................... 32

2

INTRODUÇÃO

O estágio supervisionado III foi realizado na empresa Mercolab

(Laboratório Veterinário Cascavel LTDA) que está localizada na cidade de Cascavel

– PR, Rua Maringá, 2388 – bairro São Cristovão no período de 02/12/2013 á

21/12/2013, totalizando 100 horas. Este foi supervisionado pelo Médico Veterinário

Edmilson Freitas, CRMV 8420 - PR, que é o responsável pelo setor de Virologia.

O Mercolab foi fundado em 2002 pelo proprietário Dr. Alberto Back,

graduado em Medicina veterinária no ano de 1977 pela UFS – RS. Obteve mestrado

e doutorado em 1998 e pós-doutorado em 2000 pela University of Minnesota –

Minnesota, EUA em Microbiologia Veterinária. O laboratório está credenciado junto

ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA onde presta serviço

de análises oficiais de controle, pesquisa e monitoria para Salmonella e Mycoplasma

das aves conforme a PNSA e também para isolamento e identificação de

microorganismos proveniente de suínos, assim como outros exames como

Brucelose para Bovinos e Anemia Infecciosa Equina para os Equídeos.

O laboratório possui matriz na cidade de Cascavel e três filiais em

Chapecó – SC, Garibaldi – RS e Goiânia - GO. A matriz possui 5 Médicos

Veterinários cada um responsável por um setor, 32 biólogos, 9 auxiliares de

administração, 5 auxiliares, 2 técnico de informática, 2 administradores, 1 diretor, 4

lavadeiras, 5 responsáveis por lavagem e esterilização dos materiais e 2 ajudantes

geral, A empresa é dividida em setores:

Recepção Onde são recebidas as amostras para exames e análise;

Administrativo responsável pelas emissões de laudos, compras em

geral, e administração da empresa e controle da qualidade dos

serviços oferecidos;

Sorologia Setor onde são realizados os exames de ELISA - método

quantitativo, Soro aglutinação Rápida (SAR) - método qualitativo,

Brucelose, Leucose Bovina por Imunodifusão em Agar Gel, Vacina

para papilomatose, Anemia Infecciosa Equina; Inibição de

hemaglutinação (HI); para as seguintes doenças: Bronquite, Gumboro,

Pneumovírus, Reovírus, Anemia Infecciosa, Mycoplasma

3

Gallissepticum (MG), Mycoplasma Sinoviae (MS), Salmonella

Enteritidis, Encefalomielite, Newcastle e Leucose;

Virologia Setor responsável pelo Diagnóstico final dos exames

realizados pela Sorologia e também, realiza Titulação de vacinas,

Isolamento Viral para Bronquite, Gumboro, Pox e Laringotraqueíte;

PCR Detecção por Diagnostico molecular dos seguintes agentes

patogênicos: Bronquite Infecciosa, Circovírus Suíno, Gumboro,

Laringotraqueíte, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae,

Pneumovirus, Salmonella spp., Parvovírus Suíno, Mycoplasma

hyopneumoniae dos suínos, Haemophilus parasuis de suínos,

Actinobacillus pleuropneumoniae de suínos, Pasteurella multocida de

suínos e aves, Pneumovírus I, Tipificação de Bronquite, Tipificação de

E. coli para suínos, Reovírus, Tipificação dos Pneumovírus, Tipificação

de MG, MS E MGF., Coronavírus entérico, Rotavírus, Multiplex de

Brachyspira e Lawsonia. Multiplex de Mycoplasmas e Mycoplasma

hyorhinis;

Exames Laboratoriais de Pequenos Animais Realizado todos os

exames de rotina, pré e pós cirúrgicos de pequenos animais, como

Hemograma, Leucograma, Plaquetas, Bioquimicos Hepáticos, Renais

e Cardíacos, além de parasitológico e análise urinária e hormonal;

Histopatológica Preparação de lâminas, Imunohistoquimica,

Patologia macroscópica e microscópica;

Bacteriológico Onde são realizadas as seguintes análises:

Isolamento de Salmonella, Micológico de Pulmão, Contagem de

Fungos Totais, Isolamento microbiológico, Contagem de Bacterias

totais, Contagem de Clostridium perfrigens, Contagem de Aspergilus

fumigatus, Teste de eficiência de desinfetantes, Antibiograma,

Plaqueteamento, Contagem de leveduras, contagem de E. coli,

Contagem de enterobactérias, Sorotipificação de Salmonella, análise

de PH, OPG e detecção de oocisto raspado, Sorotipificação de

Salmonella spp completa, Contagem de Clostridium Sulfito Redutores,

Teste de Esterilidade, Coleta de Material, Análise morfológica

espermática, Contagem de coliformes totais e termotolerantes;

4

Micotoxina análise de farinhas, rações utilizando para o diagnóstico

o método ELISA;

Meio de cultura onde são feitos os meios de cultura pra uso próprio

do laboratório;

Setor de Necrópsia Onde são realizadas necropsias dos animais do

próprio laboratório e dos que chegam de clientes, são animais vivos e

que são sacrificados pelos métodos de câmara de gás, deslocamento

cervical, eletrochoque;

Gaiolas Metabólicas, Boxes aviários, e Aviário Teste Onde são

realizados experimentos para controle de agentes patogênicos,

crescimento e ganho de peso, sejam por rações, medicamentos, ou

vacinas;

Fábrica de Ração Onde é produzido rações experimentais intra

laboratoriais;

Lavagem A lavagem e esterilização das roupas;

Esterilização lavagem e esterilização de materiais.

As atividades desenvolvidas durante o estágio são basicamente

acompanhamento da rotina laboratorial e aprendizagem do funcionamento de cada

setor, assim como auxiliar nos procedimentos realizados, sempre sendo

supervisionado por um funcionário treinado e capacitado.

O objetivo do estágio foi acompanhar o dia a dia de um laboratório veterinário

aprender o funcionamento, logística e demanda de cada um dos setores e também o

aprendizado de como chegam os materiais para análise que são coletadas por

médicos veterinários de empresas e como são feitas as análises e interpretação de

seus resultados.

5

1. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

1.1 Casuística

1.1.1 Setor meio de cultura

O meio de cultura é responsável pela fabricação de todo os materiais que se

usam no laboratório. Todos os dias são realizados desinfecções do ambiente com

álcool 70%. Foi realizada a fabricação de suabes que consistia de um pedaço de

gaze amarrado nas duas bordas opostas com um barbante comprido, após ele é

colocado em um saco plástico e levado para a autoclave para eliminar qualquer tipo

de agente, em seguida adiciona leite que é um meio nutritivo para manter a bactéria

viva após o seu uso. Além do suabes era realizado o armazenamento dos Propés

para usar dentro dos aviários (APÊNDICE: figuras 1).

No setor de meio de cultura são produzidos os meios, BHI, RAPA, Caldo

TETRA, Agar XLD, Caldo verde brilhante, Caldo de uréia, LIA, SIM, TSI (APÊNDICE:

figura 2, 3, 4).

O BHI é um meio utilizado para enriquecimento prévio para uma

grande variedade de bactéria aeróbicas e anaeróbicas;

RAPA e o Caldo TETRA meio para enriquecimento seletivo para

salmonella;

Agar XLD é um meio seletivo para salmonella e shigella de amostras

clinicas e de alimentos;

O caldo verde brilhante utilizado pra confirmar a presença de

coliformes totais;

Caldo uréia meio usado para demonstração para produção de urease;

LIA faz diferenciação bioquímica pela habilidade de um microrganismo

descarboxilar e lisina.

SIM meio para identificar enterobactéria através de detecção de

formação de acido sulfídrico, indol e verificação da motilidade.

Água peptonada é nutriente para crescimento de salmonella.

6

1.1.2 Setor de Coleta e Bacteriologia

O setor de recebimento e coleta recebe todos os dias amostras de ração e

farinhas, ovos, pintinhos, patos, galinhas, frangos, galos, perus, suínos, leite, para

análise.

Durante o estagio foi acompanhado diversos procedimentos de e dentre eles

são:

Necrópsia (APÊNDICE: figura 5).

O laboratório recebe 150 ovos bicados de 19 dias de encubação, para analise

oficial para salmonella. Desses 150 ovos são retirado 10 pitinhos, o restante é

utilizado para contra-prova se necessário onde se fez a necropsia e retirado dos

órgãos (fígado e coração), gema e ceco. Esse três sistemas são separados em seus

receptivos recipientes são picotados e misturados (com o auxilio de uma tesoura

estéril), após vão para analise na bacteriologia (APÊNDICE: figura 6, 7). Chegando

na Bacteriologia são colocados dentro de ´potes com água peptonada ( que é um

meio de enriquecimento para bactéria) (APÊNDICE: figura 8) , após são colocado

em estufa por 24 horas a 36 graus, no outro dia dentro de uma câmera de fluxo é

retirado 1ml dessa solução e colocado 0,800 ml no TETRA e 0,200 ml no RAPA

(APÊNDICE: figura 9), em seguida são levados para a estufa e fica 24 horas a 36

graus, no dia seguintes essas amostra são homogeneizadas e semeada em placas

(XLD e Verde brilhante) (APÊNDICE: figura 10), retornam para a estufa por mais 24

horas a 36 graus, no próximo dia é feito a leitura pra saber de cresceu salmonela

ssp - ou +, se der suspeito vai pra a bioquímica para fazer TSI, SIM, LIA, Ureia e

Indol.

Coletas de suabes, que são feitos com o auxilio de um lança chamas para

evitar contato com fungos e bactéria na amostra e da amostra com o ambiente, é

coletado cerca de 7 gramas das partes mais sujas e colocados em potes com água

peptonada e levada pra analise na bacteriologia e feita igual ao procedimento 1, o

restante da amostra é refrigerado para contra prova.

O laboratório também recebe lotes contendo 10 patos com um dia de viva.

Onde são feitos a necropsia para diagnosticar efeito patogênico (APÊNDICE: figura

11).

São recebidos também órgãos isolados de suínos e aves para análise

bacteriana, essas são partes que são utilizadas diretamente na placa contendo Agar

7

sangue, que é um meio próprio de crescimento rápido para qualquer

microorganismo.

Também são realizados testes de antibiogramas.

1.1.3 Setor Histopatologia

No setor histopatológico são feitas lâminas para análise dos órgãos, para o

diagnóstico de existência ou não de alguma patologia.

Os órgãos chegam até a sala, onde são realizados os cortes na estufa de

fluxo em uma tabua de parafina, após eles são colocados dentro de placas

chamadas de cacete, após são fechadas e levada para a máquina de diafanização,

onde esse órgão vão dentro de uma cuba e passam por um processo de

desidratação, hidratação e moldagem. Primeiro passa por formol tamponado a 10%

e fica duas horas, após mais duas horas em formol tamponada, mais duas horas em

álcool 70%, 80%, 96%, 100% e por mais duas horas em álcool 100%, após mais

duas de xilol e por ultimo duas horas na parafina, sempre movimentando em sentido

vertical. Logo em seguida são colocados em uma forma de gelo e levado pra o

refrigerador por alguns minutos, após é retirado da forma para ser feito o corte

histológico, em seguida o corte é colocado uma vasilha contendo água temperatura

ambiente e em outra contendo água quente, para facilitar sua conduta na lamina,

colocado na lamina vai para a estufa para poder derreter toda a parafina. Após

retirar a lamina da estufa faz o contrario da maquina. Mergulha a lamina no xilol

xilol álcool 100% 100% 96%, 80%, 70% após coloca-se na água, para

fazer a hidratação do tecido coloração da placa em hematoxina por 1 minuto,

eosina 2 minutos, água 1 minuto, em seguida faz o contrario para desidratar o tecido

álcool 70%, 80%, 96%, 100%, 100%, xilol + xilol, em seguida é colocado balsamo

do Canadá na lamina e fixa a lamínula, espera secar e fazer a leitura (APÊNDICE:

figura, 12 a 21).

1.1.4 Setor Sorologia

Na sorologia são realizados testes para a detecção de anticorpos contra o

vírus da anemia das galinhas. O kit para a detecção de Anticorpos contra o vírus de

Anemia de Galinhas é realizado em uma microplaca de titulação revestida com

8

antígeno do vírus da Anemia das Galinhas. Durante a primeira incubação, os

anticorpos da CAV presente na amostra reagem com os antígenos imobilizados.

Após a lavagem, são adicionados nas microcavidades uma enzima da CAV. Se

acaso não tiver anticorpos contra CAV na amostra, o conjunto de anti-CAV vai ficar

livre pra reagir com o antígeno. Mas se tiver anticorpos na amostra eles vão ser

bloqueados na reação antígeno-anticorpo.

No mesmo setor são feitos o IDEXX MG/MS que é um ensaio

imunoenzimático para a detecção de anticorpos contra o Mycoplasma gallisepticum

e Mycoplasma syniviae (Mg/Ms), em soro de galinha e peru. Essa analise serva para

medir o nível relativo de anticorpos contra a Mg/Ms em soro de galinha e peru. O

teste faz em uma placa contendo 96 cavidades, contendo antígeno. Após a

incubação da amostra, os anticorpos específicos contra Mg/Ms formam um

complexo com os antígenos impregnados na placa. Após a lavagem do material não

reagente da cavidade, um conjunto é adicionado, o qual se aglomera à qualquer

anticorpo aderido às cavidades. O conjunto não reagente é lavado e um substrato

enzimático é adicionado. Após se desenvolve uma cor que é diretamente

relacionada à quantidade de anticorpos contra Mg/Ms presente na amostra de teste.

1.1.5 Setor Micotoxinas

Setor responsável pela análise de Toxinas potencialmente patogênicas para a

avicultura e suinocultura, sendo analisadas as Ocratoxinas, Fumonisinias,

Zearalenona, Aflatoxinas, Toxina T2, Deoxinivalenol (Don).

As matérias primas são pesadas e extraídas 20g de cada amostra, essas

amostras são adicionadas água ou metanol, e são trituradas e após são filtradas. É

coletado uma amostra e colocado no kit específico de cada micotoxina que é

adquirido da empresa Romerlabs, os quais passam pelo analisador de fotômetro,

onde indicam quantas partes por bilhão ou milhão estão contaminadas. Em anexo 1

segue a tabela dos procedimentos individuais assim como as dosagens permitidas.

Os parâmetros utilizados seguem a resolução RDC no 7 de 18/02/2011 para limites

máximos de micotoxinas, desenvolvido pela comunidade Européia e com

regulamentação 1126/2007, em anexo 2.

9

1.1.6 Setor PCR

Setor responsável pelo Diagnóstico molecular de doenças, atualmente pouco

divulgado pelo laboratório, mas com planejamentos de aumentar o seu uso e

potencial de diagnóstico para um potencial de prevenção.

Os principais exames realizados pelo PCR são:

AVES

CÓD. PROCEDIMENTO PATOLOGIA MATERIAL DE COLETA PRIMER RESULTADO

PCR 01 BRONQUITE TRAQUÉIA, PULMÕES,

TONSILAS CECAIS,

OVÁRIO E OVIDUTO.

41, 11, 21 + banda na

altura de 266pb

ou 179pb.

- Ausência de

banda.

PCR 05 MG TRAQUÉIA E PULMÃO MG1 e MG2 + banda na

altura de

732pb.

- Ausência de

banda.

PCR 06 MS TRAQUÉIA, PULMÃO E

ARTICULAÇÃO

MS1 e MS2 + banda na

altura 207 pb.

- Ausência de

banda.

PCR 07 PNEUMOVÍRUS TRAQUÉIA, PULMÃO,

SEIOS NASAIS, SACOS

AÉREOS.

G1, G5, G6,

G8+A, G9+B

+ banda na

altura de

444pb, 268pb,

361pb.

- Ausência de

banda.

PCR 08 SALMONELLA SPP. SUABE DE ARRASTO

ENRIQUECIDO COM

BHI OU

TETRATIONATO,

MECÔNO, CAMA E

FARINHA.

MG1 e MG2 + banda na

altura de 285

pb.

- Ausência de

banda.

SUÍNOS

COD. PROCEDIMENTO PATOLOGIA MATERIAL DE COLETA PRIMER RESULTADO

PCR 11 HAEMOPHILUS

PARASUIS

PULMÃO,

PERICÁRDIO,

CORAÇÃO, LIQ.

ARTICULAR E

HPS1 e HPS2 + banda na

altura de 821pb.

- Ausência de

banda.

10

CÉREBRO.

PCR 21 MULTIPLEX

BRASCHPIRA

INTESTINO, SUABE

RETAL E FEZES.

BRAH1,

BRAH2,

BRAP1,

BRAP2, LAW1,

LAW2.

+ braschpira

hyodysenteriae:

354pb.

+ braschpira

pilosicoli:

821pb.

+ lawsonia

intracelularis:

655pb;

- Ausência de

banda.

PCR 22 ROTAVÍRUS FEZES E INTESTINO ROTA1,

ROTA2, RT

PLATINUM

TAQ.

+ banda em

532pb.

- Ausência de

banda.

PCR 27 INFLUENZA A PULMÕES, TRAQUÉIA,

SUABE

RESPIRATÓRIO.

AHAH1,

AHART,

AHAH3, N1FW,

N1RV, N2FW,

N2RV.

+ H1 = 325pb

+ H3 = 198pb

+ N1 = 754pb

+ N2 = 502 pb

- Ausência de

banda.

PCR 30 LAWSONIA INTESTINO E FEZES. LAW1 e LAW2. + banda em

655pb.

- Ausência de

banda.

11

2. RELATO DE CASO

Foram Realizados 123 testes para verificação de presença ou não de

micotoxinas nos seguintes alimentos: Farelo de Trigo (14), Milho (58), Ração (34),

casquinha de soja (1), silagem (5), Farelo Soja (4), Glúten de milho (3), cevada (1),

massa de mandioca (1), farelo de gérmen (1) e resíduo bolacha (1), gráfico 1. São

nutrientes que chegam ao laboratório em dias aleatórios, e em amostras separadas.

Em anexo 3 encontram-se as análises.

Os nomes das empresas foram preservados para não haver problemas jurídicos.

Os resultados são dados em Partes por Bilhão (PPB). E são realizados

conforme indicações da bula do Laboratório Romerlabs, que fornece os meios para

a realização dos testes.

Cada Micotoxina possui um teste específico com uma metodologia específica,

as metodologias estão anexadas em formas de bulas, fornecidas pelo laboratório

Romerlabs.

Pode-se perceber que não foram encontradas irregularidades em nenhuma

amostra realizada no período 01/12/2013 até 31/12/2013.

Gráfico 1

Amostras Farelo de Trigo

Milho

Ração

Casquinha de Soja

Silagem

Farelo de Soja

Glútem de Milho

Cevada

Massa de Mandioca

Farelo de Gérmem

Resíduo de Bolacha

12

2.1 Como é Feito o Teste

Para a realização do teste usa-se os kit’s do laboratório Romerlabs, os quais

vem especificados os detalhes da realização, assim como a interpretação dos

resultados. Aqui será exposto somente o teste referente a micotoxina denominada

Aflatoxina.

Princípios Analíticos:

AgraQuant® Total Aflatoxin Assay é um ensaio por competição direta de

enzimas imuno-adsorvidas (ELISA). As aflatoxinas são extraídas de uma amostra

triturada com solução de 70% de metanol. Esse extrato da amostra é misturado com

aflatoxina enzima conjugado e a mistura é colocada num micropoço contendo

anticorpos. As aflatoxinas na amostra e os padrões controle possibilitam a

competição com a aflatoxina enzima-conjugada pela ligação aos anticorpos nos

micropoços. Após a etapa de lavagem, um substrato enzimático é acrescentado e a

coloração azul é desenvolvida. A intensidade da cor é inversamente proporcional à

concentração de aflatoxina na amostra ou padrão. A solução “stop” é em seguida

acrescentada mudando a coloração azul para amarelo. Os micropoços são

mensurados opticamente usando um leitor de micropoços com um filtro de

absorbância de 450nm (DO450) e um filtro diferencial de 630nm. As densidades

ópticas das amostras são comparadas as DO dos padrões e um resultado

interpretativo é determinado.

Precauções:

1. Os reagentes devem ser mantidos entre 2-8°C (35-46°F) quando não estiverem

em uso, e não usar após a data de expiração.

2. Seguir o tempo de incubação estipulado no procedimento. Alterar o período de

incubação por outro diferente do especificado pode fornecer resultados inexatos.

3. Metanol é inflamável. Precauções devem ser tomadas no seu uso e estocagem.

4. A solução “Stop” contém ácido. Evitar contato com pele e olhos. Se exposto, lavar

com fluxo de água.

5. Considerar todos os materiais, recipientes, e equipamentos que são expostos à

amostra ou padrões estarem contaminados com toxina. Usar luvas protetoras e

óculos de proteção quando usar o kit.

13

6. Descartar todos os materiais, recipientes e equipamentos apropriadamente após o

uso.

Procedimento: Preparação da Amostra / Extração

1. Obter uma amostra representativa e triturar usando um moinho Romer Series II®

Mill até que 75% passe através de uma peneira 20-mesh, em seguida misturar

completamente a porção da subamostra.

2. Pesar 20 g da amostra triturada dentro de um jarro limpo que permita ser fechado

completamente. (Para casca de milho pesar 10 gramas ao invés de 20 gramas).

3. Acrescentar 100 mL de solução de extração 70/30 (v/v) metanol/água e fechar o

jarro. Nota: A amostra (exceto para casca de milho) deve ser extraída na proporção

de 1:5 (p:v) da amostra para a solução de extração, respectivamente. (Para casca

de milho, acrescentar 100 ml de solução de extração 70/30 (v/v) metanol/água para

10 gramas de amostra triturada e fechar o jarro; a proporção é 1:10 (p/v). O

resultado final da aflatoxina em casca de milho é o resultado final da análise ELISA

multiplicado pelo fator de diluição de 2).

4. Agitar vigorosamente por 3 minutos.

5. Permitir que a amostra assente, e em seguida filtrar a camada de cima do extrato

através do filtro Whatman #1 e coletar o filtrado.

Nota: os extratos dos produtos devem ter um pH entre 6-8. Condição

excessivamente alcalina ou ácida pode afetar os resultados das análises e devem

ser ajustadas antes da análise.

6. Amostra está pronto para ser analisada. (Exceto para noz que necessita realizar

uma pré-limpeza com coluna MycoSep 112 antes da análise, contate o serviço

técnico para detalhes).

Análise

Nota: Todos os reagentes e componentes do Kit devem estar à temperatura

ambiente 18-30°C (64-86°F) antes de usar. É recomendado o uso de uma pipeta de

8 canais para realizar a análise. Não mais do que 48 amostras e padrões totais (6

faixas de teste) devem ser corridas num ensaio quando usa uma pipeta de 8 canais.

Se não for usada uma pipeta de 8 canais (ex. usando apenas pipeta de canal

único),é recomendado não mais do que 16 amostras e padrões (2 faixas de testes)

serem corridas num ensaio.

14

1. Colocar apropriado número de tiras de diluição azul/verde num recipiente para

tiras de micropoços. Um Poço Diluição será requerido para cada padrão, (ex. 0, 4,

10, 20 e 40 ppb) ou amostra.

2. Colocar em igual número tiras de Micropoços Revestidos com Anticorpos no

recipiente para tiras de micropoços. Retornar as tiras de micropoços não utilizadas

para a bolsa metálica com o pacote dessecante e selar a bolsa com fita.

3. Medir a quantidade requerida de Conjugado do frasco de tampa verde (~240

μL/poço ou 2 mL/tira) e colocar num recipiente separado (recipiente para reagente

quando usar pipeta de 8 canais) Usando uma pipeta de 8 canais, dispensar 200 μL

do Conjugado dentro de cada Poço de Diluição azul/verde.

4. Usando uma pipeta de canal único, acrescentar 100 μL de cada padrão ou

amostra dentro do apropriado Poço de Diluição contendo 200 μL do Conjugado.

Usar uma pipeta com ponteira nova para cada padrão ou amostra. Nota: Certificar-

se que a ponteira da pipeta tenha sido completamente esvaziada.

Usando uma pipeta de 8 canais com ponteiras novas para cada tira de 8

poços, misturar cada poço cuidadosamente pipetando e esvaziando a ponteira 3

vezes e imediatamente transferir 100 μL do conteúdo de cada Poço de Diluição

dentro do correspondente Micropoço Revestido de Anticorpos. Incubar a

temperatura ambiente por 15 minutos.

Nota: Não agitar a placa para misturar porque pode ocorrer uma

contaminação dos conteúdos entre os poços.

5. Esvaziar os conteúdos das tiras de micropoços dentro de um recipiente de

descarte. Lavar cada micropoço pelo preenchimento com água destilada ou

deionizada, e em seguida emborcar a água das tiras de micropoços. Repetir esta

etapa 4 vezes num total de 5 lavagens.

Nota: Tomar cuidado para não deslocar as tiras do recipiente durante a etapa

de lavagem. Um pedaço de fita pode ser colocado na extremidade do recipiente para

ajudar a manter as tiras no local.

6. Colocar muitas camadas de papel absorvente na superfície e bater levemente nas

tiras de micropoços no papel absorvente para expelir o máximo possível de água

residual após a quinta lavagem. Secar o fundo dos micropoços com pano seco ou

papel absorvente.

7. Medir a quantidade requerida de Substrato do frasco de tampa azul (~120 μL/poço

ou 1 mL/tira) e dispensar dentro de um recipiente separado. (recipiente de reagente

15

para uma pipeta de 8 canais). Pipetar 100 μL do Substrato dentro de cada tira de

micropoços usando uma pipeta de 8 canais. Incubar a temperatura ambiente por 5

minutos.

8. Medir a quantidade requerida de Solução Stop do frasco de tampa vermelha

(~120 μL/poço ou 1 mL/tira) e dispensar dentro de um recipiente separado

(recipiente de reagente para uma pipeta de 8 canais). Pipetar 100 μL da Solução

Stop dentro de cada tira de micropoços usando uma pipeta de 8 canais. A cor deve

mudar de azul para amarelo.

9. Ler as tiras com um leitor de micropoços usando filtro de 450 nm e um filtro

diferencial de 630nm. Registrar as leituras das DO de cada micropoço Nota: Bolhas

de ar devem ser eliminadas antes da leitura das tiras porque podem afetar os

resultados analíticos.

Notas adicionais: A proporção entre Conjugado e Padrão/Amostra deve

permanecer a 2:1, mas os volumes de Conjugado e Padrões/Amostra podem ser

reduzidos, usando 100μL e 50μL, respectivamente. O conteúdo a ser transferido do

poço de diluição para o poço revestido de anticorpos deve permanecer o mesmo,

sendo 100 μL. Não retornar reagentes não utilizados para os frascos originais.

Cuidado para manter a ordem das posições das Amostras e Padrões durante a

análise. Não misturar o conteúdo dos micropoços pela agitação manual em nenhum

momento durante a análise.

Intepretação dos Resultados:

Usando os valores da DO não modificada ou os valores da DO expresso

como porcentagem da DO do padrão zero (0), construir a curva dose-resposta

usando os cinco padrões. Desde que a quantidade de aflatoxina em cada padrão é

conhecida, as desconhecidas podem ser medidas pela interpolação da curva

padrão. Os resultados podem ainda ser facilmente calculados usando a tabela

Romer® Log/Logit que é fornecida (livre de encargos) sob solicitação. Se o nível de

aflatoxina numa amostra for maior do que o mais alto padrão (>40 ppb), o extrato

filtrado deve ser diluído em metanol 70% até que os resultados da amostra diluída

se situem na faixa de 5.0 - 40 ppb e sejam analisadas novamente para obter

resultados exatos. O fator de diluição deve ser incluído quando o resultado final é

calculado.

Características Executáveis:

16

Limite de detecção: 3 ppb para milho e outros produtos exceto para sorgo o

qual é 5ppb e DDGS que é 6 ppb (Determinada pela média de valores de 10

amostras de milho livre de aflatoxina somada a 2 desvios padrões) Limite de

quantificação: 4 ppb (Descrito como o menor ponto de concentração na curva de

calibração que a prova pode com confiança detectar aflatoxina) Faixa de

quantificação: 4 – 40 ppb (Para quantificação de amostras com nível acima de 40

ppb as amostras devem ser diluídas até que o resultado da amostra diluída se situe

na faixa de 5.0 - 40 ppb); o método foi validado para amostras com concentração

acima de 320 ppb). Nota: Os limites de detecção e quantificação para gérmen de

milho e glúten de milho, favor contatar o serviço técnico.

Materiais Fornecidos com o KIT:

• 96 micropoços revestidos com anticorpos (12 tiras com 8 poços) em um recipiente

para micropoços (numa bolsa metálica selada)

• 96 micropoços de diluição não revestidos (12 tiras com 8 poços marcado com

azul/verde na base)

• 5 frascos de 1.5mL de cada padrão de aflatoxina (0, 4, 10, 20 e 40 ppb)

• 1 frasco de 25mL de aflatoxina conjugada (frasco de tampa verde)

• 1 frasco de 15mL de solução do substrato (frasco de tampa azul)

• 1 frasco de 15mL de solução stop (frasco de tampa vermelha)

Materiais Requeridos, mas não fornecidos com o KIT:

Procedimento de Extração

• *EQMMS2010: Romer Series II® Mill ou equivalente

• *EQOLE1025: Blender ou um jarro com tampa para fechar

• *EQOLE1010: Balança, 400 g

• *EQOLE1050: Proveta graduada: 100mL

• *100% metanol: Metanol grau ACS

• *70% metanol ou o Metanol grau ACS para fazer metanol 70 % o Água destilada

ou deionizada para fazer methanol 70 %

• *84% acetonitrila

• Recipiente com capacidade mínima de 125mL

• Filtro de papel Whatman#1 , ou equivalente

• *Funil de filtração

• *Coluna MycoSep 112

17

Procedimento Analítico

• *Pipeta de 8 canais ou única com capacidade de pipetar 100μL e 200μL com

ponteiras

• *EQOLE1300: Cronômetro/Timer

• *COKAD1150: Pisseta

• Água destilada ou deionizada

• Toalhas de papel absorvente

• *3 recipientes para usar os reagentes com pipeta de 8 canais

• *Leitor de micropoços com filtro de 450nm, (leitores aprovados pela GIPSA: Stat

Fax® 303 Plus fabricado pela Awareness Technology Inc. ou o EL301 fabricado pela

BIO-TEK® Instruments, Inc.) ou equivalente. *Ítens disponíveis pela Romer Labs do

Brasil Ltda.

18

3. DISCUSSÃO

A presença de micotoxinas em grãos e rações, cujo tipo ou estrutura química

depende do desenvolvimento de linhagens fúngicas específicas, está sujeita à

influência de fatores ambientais como umidade do substrato, temperatura ambiente

e processo correto de armazenagem. Portanto, a contaminação de rações e outros

alimentos por micotoxinas pode variar de acordo com as condições ambientais,

métodos de processamento ou produção e armazenamento. Vai também depender

do tipo alimento, já que alguns grãos são substratos mais aptos que outros para o

crescimento de determinados fungos (Santurio, 2000).

3.1 Aflatoxinas

Aflatoxinas (AFL) fazem parte de um grupo de toxinas produzidas por fungos

como metabólitos secundários, sendo produzidas pelos fungos Aspergillus flavus, A.

parasiticus eA.nominus (Kurtzman et al., 1987). AFL foram descobertas em 1960, ao

provocarem um surto com alta letalidade em perus na Inglaterra conhecido como

"turkey - X disease".Nesse surto, milhares de aves morreram após consumirem torta

de amendoim na ração, proveniente do Brasil (Sargeant, 1961). O principal fungo

encontrado na torta de amendoim foi Aspergillus flavus. Em uma análise química na

torta de amendoim, foi encontrada uma série de compostos tóxicos que

apresentavam flluorencência sob luz ultravioleta.

3.2 Tricotecenos

As principais micotoxinas deste grupo são: toxina T-2; deoxynivalenol (DON);

diacetoxyscirpenol (DAS), todas produzidas através de diversas espécies de fungos

do gênero Fusarium.

Estudos com intoxicações crônicas envolvendo toxina T-2 ou DAS revelaram

redução no consumo de ração e ganho de peso, lesões orais, necrose dos tecidos

linfóide, hematopoiético e mucosa oral, com eventuais distúrbios nervosos (posição

anormal das asas, falta de reflexos), empenamento anormal e diminuição na

19

espessura da casca dos ovos (Vieira, 1995). Particularmente em poedeiras, as

lesões orais foram provocadas em 50% dos lotes quando essas aves receberam

2mg/kg de T-2, decrescendo paralelamente a produção de ovos (Diaz et al., 1994).

Outras aves, como perus e gansos, são mais susceptíveis à toxina T-2 que

frangos de corte (Richard et al., 1978). Em gansos, a partir de 0,1 mg/kg de peso

vivo, começou a queda na produção de ovos, e os níveis de postura e aclodibilidade

caíram em 50% quando foram administrados 300 mg/kg de peso vivo de toxina T-2

(Vanyi et al., 1994). As micotoxinas T-2 e DAS produziram lesões orais em frangos

de corte em níveis em torno de 1ppm na ração (Hoerr et al., 1982). Ocorreram

efeitos tóxicos mais significativos com níveis de 4 ppm, nos quais as aves

apresentaram baixo consumo, retardo no crescimento, alterações no quadro

sangüíneo e neurotoxidade (Burditt et al., 1983; Wyatt et al., 1991).

Também foram observadas lesões orais em peruzinhos em níveis de 5 ppm

com toxina T-2 e redução de ganho de peso com 10 ppm da mesma micotoxina

(Richard et al., 1978; Dsiuk et al., 1979). Uma comparação direta mostrou

peruzinhos mais sensíveis que frangos de corte (Richard et al., 1978). Já 3 ppm de

T-2 em alimentos naturalmente contaminados foi letal para gansos (Palyusik &

Koplik-Kovács, 1975).

3.3 Zearalenona

O principal fungo produtor de zearalenona é Fusarium graminearum.

Com exceção de níveis extremamente altos de contaminação, as aves não

são afetadas pela ingestão de zearalenona, mas existem indícios de que perus são

levemente mais sensíveis que poedeiras e frangos de corte (Chi et al., 1980).

Em níveis normalmente encontrados em rações comerciais, não ocorreram

alterações no consumo alimentar, ganho de peso, produção ou qualidade de ovos,

nem nos parâmetros bioquímicos e hematológicos do sangue, aspecto micro e

macroscópico dos tecidos e no comportamento das aves. Com concentrações

elevadas ou toxicose induzidas em perus machos, os sinais clínicos não foram

específicos, mas incluíram redução na conversão alimentar, pequena alteração no

peso dos órgãos, redução na fertilidade e mudança no comportamento das aves

(Bock et al., 1986). Com níveis de 800 ppm de zearalenona pura, foram intoxicados

20

frangos de corte e peruzinhos, sem esses apresentarem a menor alteração no seu

desempenho, mas sendo observado um decréscimo no número de leucócitos,

hipertrofia de alguns ovidutos, diminuição da crista de frangos de corte e aumento do

desenvolvimento da barbela em perus machos (Allen et al., 1981).

Apesar de a zearalenona não afetar o desempenho de aves em

contaminações naturais, convém salientar que autoridades sanitárias de alguns

países importadores de carne de frango estão em alerta quanto aos resíduos de

zearalenona na carne dessas aves, pois esta micotoxina, em determinadas

concentrações, pode induzir a um efeito anabolizante em humanos e outros

mamíferos.

3.4 Fumonisinas

O fungo produtor de fumonisina é Fusarium moniliforme.

Seis tipos de fumonisinas são produzidas pelo fungo Fusarium moniliforme:

A1, A2, B1, B2, B3 e B4 (Leeson et al., 1995). A Fumonisina B1 é a forma molecular

mais produzida pelo fungo. Essa toxina é responsável pelo desencadeamento das

síndromes leucoencefalomalácea em eqüinos e do edema pulmonar em suínos. O

cereal em que as fumonisinas são mais detectadas é o milho e seus derivados.

Sydenham et al. (1992) avaliaram 21 amostras de alimentos envolvidos com

fuminisina-toxicose em eqüinos, suínos, frangos e coelhos no estado do Paraná. Em

20 amostras, fumonisinas foram isoladas em concentrações médias de 12 e 4,1 ppm

de fumonisina B1 e B2, respectivamente. O mecanismo de ação das fumonisinas

está relacionado com o bloqueio na síntese dos esfingolipídeos, substância

importante para a integridade da membrana celular e transporte iônico através das

células. Os esfingolipideos são predominantes no sistema nervoso central e

periférico, principalmente como lipídeo da mielina, estando localizados nos

oligodendrócitos e células de Schwann (Wang et al.,1991).

A simples presença ou detecção de micotoxinas na ração de aves não implica

com certeza que a mesma irá produzir efeitos tóxicos. A dose tóxica está

diretamente relacionada com a sensibilidade das aves para a micotoxina ingerida e,

no caso de aflatoxinas, com os níveis de conforto das aves, ou seja, quanto menos

21

stress tiver o lote, mais resistente ele se torna para níveis mais elevados de

aflatoxina.

Indubitavelmente, o melhor método para controlar a contaminação de

micotoxinas em alimentos é prevenir o crescimento de fungos. A contaminação de

grãos por micotoxinas pode ser um problema sério que pode acontecer não só

através de condições inadequadas de armazenagem, mas também já na lavoura,

durante o período pré-colheita. É extremamente importante o uso de práticas, como

o plantio de genótipos de plantas mais resistentes à contaminação por fungos de

armazenagem. São essenciais, também, os procedimentos para dimuição da

umidade dos grãos colhidos e a armazenagem dentro de padrões recomendados

internacionalmente. O uso de inibidores de crescimento fúngico em grãos

armazenados tem sido muito utilizado como um método preventivo. O controle da

atividade dos fungos nas rações animais e seus componentes tem como premissa

básica conseguir matérias primas livres da produção de micotoxinas durante o

processo de armazenamento (Smith & Hamilton, 1970).

Os métodos de detoxificação podem ser através da remoção física de grãos

ardidos, remoção de aflatoxinas por solventes polares, destruição através do calor

ou degradação de aflatoxinas por substâncias químicas ou microorganismos. Todos

esses métodos podem ou não ser efetivos, mas, com certeza, são extremamente

caros e economicamente inviáveis.

Diversas substâncias químicas têm sido testadas e usadas como inibidores

de fungos (Stewart et al., 1977). O principal grupo destes anti-fúngicos é classificado

como ácidos orgânicos. Nesse grupo estão incluídas substâncias de estrutura

simples como o ácido propiônico, acético, sórbico e benzóico e seus sais de cálcio,

sódio e potássio. O ácido propiônico e seus derivados, os denominados propionatos,

são eficientes inibidores fúngicos e têm sido usados há bastante tempo nas rações

para aves com este objetivo (Krabbe, 1994).

Outro método para colaborar no controle de aflatoxicoses nas aves é a

utilização de materiais inertes na dieta para reduzir a absorção de aflatoxinas pelo

trato gastrointestinal da ave. O uso de carvão ativado na ração obteve resultados

pouco expressivos (Kubena, 1990).

Porém, essas medidas somente podem tornar-se viáveis quando cada

empresa tomar consciência de que o monitoramento é o ponto fundamental num

programa de controle de micotoxinas. Isso deve ser feito através de um programa

22

amostral consistente da massa de grãos recebida ou a ser adquirida, com análises

periódicas das micotoxinas aflatoxinas, toxina T-2 e fumonisinas. Somente ao

analisar os dados semanais das análises, pode-se tomar medidas para controle da

mictoxinas, um verdadeiro flagelo para a produção avícola.

23

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O estagio foi de suma importância, pois se consegue assemelhar a pratica

com a teórica. E também como é o dia a dia de um laboratório de Medicina

Veterinária. Quais são as doenças que mais causam problema na avicultura,

suinocultura e nos alimentos e sub produtos que podem fazer parte da dieta

humana.

O estagio no mostrou quais são as principais ferramentas para chegar e um

diagnostico conclusivo, mas não demonstrou as atitudes que devem ser tomadas

após o parecer diagnóstico.

Pode-se concluir com este estagio que ainda existem ramos a serem

explorados dentro da Medicina Veterinária, onde o mercado está em maior

crescimento que é o ramo de produtos alimentares, pois o laboratório se faz

extremamente necessário nessa cadeia produtiva, para poder diagnosticar, prevenir

o aparecimento de doenças na avicultura e suinocultura, que são fontes de

alimentos para a população mundial.

24

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Allen, N. K, Mirocha, C. J, Weaver, G, Aakhus-Allen, S, Bates, F. Effects of dietary

zearelenone on finishing broiler chickens and young turkey poults. Poultry

Science 1981; 60: 124-31.

Burditt, S. J, Winston, M, Hagler, W, Hamilton, P. B. Survey of molds and

mycotoxins for heir ability to cause feed refusal in chickens. Poultry Science

1983; 62: 2187-91.

Brasil. MINISTÉRIO DA SAÚDE. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA

SANITÁRIA Diretoria Colegiada RESOLUÇÃO - RDC Nº 7, DE 18 DE FEVEREIRO

DE 2011. <ftp://ftp.saude.sp.gov.br/.../U RS-MS-AN ISA-RDC-7 180211.pdf >

acessado em 07 de março de 2014.

Bock, R. R, Shore L. S, Samberg, Y, Perl, S. Death in broiler breeders due to

salpingintis: Possible role of zearalenone. Avian Pathology 1986; 15: 495-

502.

Chi, M. S, Mirocha, C. J, Kurtz, H. J, Weaver, G. A, Bates, F, Robinson, T, Shimoda,

W. Effect of dietary zearalenone on growing broiler chicks. Poultry Science

1980a; 59: 531-36.

Diaz, G. J, Squires, E. J, Julian, R. J, Boermans, H. J. Individual and combined

effects of T-2 toxin and DAS in laying hens. British Poultry Science 1994; 35(3):

393-405

Dziuk, H. E, Nelson, G. H, Duke, G. E, Maheswaran, A. K, Chi, M. S, Mirocha, C. J.

Effects of T-2 toxin in the diet of turkey poults. Proceedings of Annual Meeting of

American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticans 1979; 22: 215-22.

25

Hoerr, F. J, Carlton, W. W, Yagen, B, Joffe, A. Z. Micotoxins caused by either T-2

toxin or diacetoxyscirpenol in the diet of broiler chickens. Fundamental Applied

Toxicology 1982; 2:121-24.

Krabbe, E. L, Penz Jr, A. M, Lazzari, F. A, Reginatto, M. F. Efeito da umidade e do

ácido propiônico sobre as características bromatológicas e microbiológicas de

grãos de milho. In: Conferência 94 Apinco de Ciência e Tecnologia Avícolas 1994.

Santos, SP. p.27-28.

Kubena, L. F, Edrington, T. S, Kamps-Holtzapple, C, Harvey, R. B, Elissalde M. H,

Rottinghaus, G. E. Influence of fumonisin B1, present in Fusarium moniliforme

culture material, and T-2 toxin on turkey poults. Poultry Science 1995; 74(2): 306-

13.

Kurtzman, C. P, Horn BW, Hesseltine, C. W. Aspergillus nomius, a new aflatoxin-

producing species related to Aspergillus flavus and Aspergillus tamarii. Antonie

Leeuwenhoek 1987; 53: 147-158,.

Leeson, S, Diaz, G, Summers, J. D. Poultry metabolic disorders and mycotoxins.

University Books, Guelph, Ontario. 1995.

Mannon, J, Jonhson, E. Fungi down on the farm. New Scientist 1985; 105: 12-

16.

Polyisik, M, Koplik-Kovács E. Effect on laying geese of feeds cotaining the

fusariotoxins T-2 and F2. Acta Veterinaria Academiae Scientiarum Hungaricae

1975; 25: 363-68. .

Richard, J. L, Cysewski, S. J, Pier, A. C, Booth GD. Comparison of effects of

dietary T-2 toxin on growth, immunogenic organs, antibody formation and

pathologic chances in turkey and chikens. American Journal Veterinary Research

1978; 39: 1674-1679.

26

Romer Labs do Brasil. Romer Labs® Methods: Method #: PI-000041-1. Romer

Labs Singapore Pte Ltd. 2007.

Santurio, J. M. Micotoxinas e Micotoxicoses na Avicultura. Rev. Bras. Cienc.

Avic. vol.2 no.1 Campinas Jan./Apr. 2000.

Sargeant, K, O'Kelly, J, Carnaghan R. B. A, Allcroft, R. The assay of a toxic

principle in certain groundnut meals. Veterinary Record 1961; 73: 1219-23.

Stewart RG, Wyatt RD, Ashmore MD. The effect of various antifungal agents on

aflatoxin production and growth characteristics of Aspergillus parasiticus and

Aspergillus flavus in liquid medium. Poultry Science 1977; 56(5): 1630-35.

Smith, T. W, Hamilton, P. B. Aflatoxicosis in the broiler chicken. Poultry Science

1970; 49: 207-15.

Sydenham, E, Marasas, W. F. O, Shephard, G. S, Yrooka, E. Fumonisin

concentrations in brazilian feeds associated with field outbreaks of confirmed

and suspected animal mycotoxicosis. Journal of Agriculture Food Chemistry

1992a; 40(6): 994-97. .

Vieira, S. L. Micotoxinas e produção de ovos. In: I Simpósio Internacional sobre

Micotoxinas e Micotoxicoses em Aves; 1995; Curitiba , Paraná, Brasil. p.65-80.

Wang, E, Norred, W. P, Bacon, C. W, Riley, R. T, Merrilm A. H. Inhibition of

sphingolipid biosynthesis by fumonisins. Journal of Biological Chemistry 1991;

266: 14486-90. .

Wyatt, R. D, Smith, J. E & Hendenson, R. S, ed. Mycotoxins and Animal Foods.

CRC Press, Boca Raton, Fl. 1991. p. 553-605

27

APÊNDICE

Figura 1, suabe de araste. Fonte: André Figura 2, XLD e verde brilhante. Fonte: André

Figura 3, meios tetra e rapa. Figura 4, Uréia, SIM, LIA, TSI. Fonte: André

Figura 5, sistema reprodutor e ascite. Figura 6, necropsia de pintinhos. Fonte: André

Figura 7, fígado e coração, gema, ceco. Figura 8, água peptonada enriquecimento.

Figura 9, passagem do meio para TETRA e RAPA Figura 10, passagem do meio TETRA e

RAPA para XLD e Verde brilhante

28

Figura 11, necropsia de patinhos. Figura 12, corte dos órgãos na capela de fluxo.

Figura 13, placas de cacete. Figura 14, maquina de diafanização

Figura 15, formas para a parafina. Figura 16, parafina com orgão. Fonte: André Luiz Frare

Figura 17 corte histológico. Fonte: André Luiz Frare Figura 18 órgão com parafina .

Figura 19 derretimento da parafina . Figura 20 coloração da lamina . Fonte: André Luiz Frare

Figura 21 coloração da lamina. Figura 22 desidratação e hidratação da lamina.

29

Figura 23 fixação da lamínula. Fonte: André Luiz Frare

30

ANEXOS

ANEXO 1

Tabela Demonstrativa dos Ensaios para Micotoxinas adaptada pelo Mercolab

KIT MC1 – AFLATOXINA 1-20ppb / 4-40 ppb

MC2 – ZEARALENONA 40-1000 ppb

MC3 - FUMONISINA 250-5000 ppb

MC4 – OCRATOXINA 2–40 ppb

MC5 – T2 75-500 PPB

MC6 – DON 250-5000PPB

EXTRAÇÃO

20 GRAMAS DE AMOSTRA + 100 ML DE METANOL 70%

SOMENTE 100 ML DE ÁGUA

DILUIÇÃO

NÃO

1:5 / 400mcl de metanol + 100mcl de amostra

1:20 / 950mcl de água + 50mcl de amostra

NÃO



ETAPAS DO ELISA

1 – ACRESCENTAR CONJUGADO 200 mcl de conjugado no poço de diluição (bordas verdes)

2 – AMOSTRA ; PADRÃO 100 mcl da amostra/padrão dentro do poço de diluição (bordas verdes) contendo conjugado

3 – TRANSFERIR A MISTURA Homogeinizar a amostra com o conjugado e transferir 100mcl para o poço de ELISA (bordas transparentes).

4 – 1a INCUBAÇÃO 15 MIN 10 MIN 10 MIN 10 MIN 10 MIN 15 MIN

5 – LAVAGEM LAVAR 5 VEZES COM ÁGUA DESTILADA 10 MIN 15 MIN

6 – SUBSTRATO E 2ª INCUBAÇÃO Remover o excesso de água do poço e pipetar 100mcl de substrato e incubar por 5 minutos

7 – SOLUÇÃO STOP Acrescentar 100 mcl da solução STOP

8 – LEITURA Realizar a leitura em leitor de ELISA e inserir o valor da DENSIDADE ÓPTICA na planilha de resultados.

Fonte: Tabela do Laboratório MERCOLAB para procedimento de extração e análise de

Micotoxinas.

31

ANEXO 2

Limites Máximos Tolerados (LMT) para Micotoxinas

Fonte: RESOLUÇÃO - RDC Nº 7, DE 18 DE FEVEREIRO DE 2011.

32

ANEXO 3

Relatório das Análises de Micotoxinas Realizadas no Período Dezembro 2013.

ID amostra

Mês Matriz Aflatoxina Zearalenona Fumonisina Ocratoxina DON T2

PPB PPB PPM PPB PPM PPB

60973 dez/13 milho 5,35 x x x x x

61085 dez/13 silagem 8,38 200,7 0,78 x 1,52 x

61122 dez/13 milho 4,39 x 5,69 x x ND

61123 dez/13 milho 4,02 x 0,72 x x ND

61148 dez/13 farelo germem 6,63 175,7 2,85 x 1,19 x

61149 dez/13 ração 5,78 x x x x x

61280 dez/13 residuo bolacha 5,97 ND ND x 0,31 x

61281 dez/13 farelo trigo 4,07 ND ND ND 0,59 ND

61282 dez/13 farelo soja ND ND ND ND 0,81 87,3

61283 dez/13 milho <4,0 263,2 0,39 x 0,33 x

61454 dez/13 silagem 5,3 x 0,41 x x ND

61494 dez/13 ração 4,85 x x x x x

61505 dez/13 milho <4,0 x 1,37 x x x

61506 dez/13 milho <4,0 x 0,33 x x x

61774 dez/13 milho x x 2,28 x x x

61822 dez/13 ração ND 30,7 1,61 x x x

61869 dez/13 milho ND x 0,91 x x ND

61870 dez/13 milho ND x ND x x ND

62035 dez/13 milho <4,0 ND 1,88 x x x

62036 dez/13 milho ND ND ND x x x

62037 dez/13 ração 4,9 ND 1,41 x x x

62038 dez/13 ração <4,0 ND 1,34 x x x

62039 dez/13 ração <4,0 ND <0,25 x x x

62040 dez/13 farelo soja <4,0 ND ND x x x

62041 dez/13 farelo trigo x x x x 2,03 x

62042 dez/13 farelo trigo x x x x x 31,6

62043 dez/13 milho ND x 1,36 x x x

62102 dez/13 milho ND 26,3 <0,25 ND 0,32 25,1

62165 dez/13 milho ND 46,7 ND x 0,3 x

62166 dez/13 milho ND ND 4,41 x 1,48 x

62167 dez/13 milho ND 137,3 1,69 x ND x

62168 dez/13 milho ND 199,6 6,54 x 0,26 x

62169 dez/13 milho ND 40,7 ND x 0,45 x

62170 dez/13 milho ND ND ND x 0,27 x

62171 dez/13 milho <4,0 59 ND x <0,25 x

62172 dez/13 milho ND ND 0,39 x 0,34 x

62173 dez/13 milho 4,4 ND 3,15 x 0,5 x

62174 dez/13 milho 4,42 50,3 <0,25 x 0,32 x

62175 dez/13 milho 4,72 402,5 ND x 2,45 x

62238 dez/13 milho 4,17 x 2,02 x x x

62270 dez/13 cevada 4,83 ND x x x x

62271 dez/13 massa mandioca <4,0 ND x x x x

33

62272 dez/13 silagem 7,5 25,5 x x x x




62951 dez/13 milho <4,0 ND <0,25 x x x

62902 dez/13 ração 4,71 <25 0,32 ND 0,34 ND


63051 dez/13 ração 4,03 x 1,5 x x x

63052 dez/13 ração ND x 2,28 x x x

63138 dez/13 milho <4,0 ND 1,37 x 0,35 x

63139 dez/13 ração <4,0 25,5 1,52 x x x

63153 dez/13 milho ND ND <0,25 ND 0,44 ND

63184 dez/13 ração 6,09 x x x x x

63160 dez/13 Glúten de milho 4,83 94,7 3,06 x <0,25 x

63161 dez/13 Glúten de milho 5,57 659,7 2,8 x 0,26 x

63162 dez/13 Glúten de milho 5,99 90,2 3,18 x 0,25 x

63163 dez/13 milho <4,0 ND ND x 3,14 x

63164 dez/13 milho <4,0 164,9 ND x ND x

63165 dez/13 milho 4,7 27,8 ND x <0,25 x

63166 dez/13 milho 4,07 ND <0,25 x ND x

63167 dez/13 milho 5,6 47,1 <0,25 x 0,29 x

63168 dez/13 milho ND ND 1,5 x 0,3 x

63169 dez/13 milho <4,0 ND ND x 0,89 x

63170 dez/13 milho 4,55 400,4 ND x ND x

63282 dez/13 ração 6 x 0,53 x 1,79 30,3

63283 dez/13 ração 5,26 x 2,14 x 0,81 x

63284 dez/13 ração 6,29 x 1,11 x 0,96 x

63419 dez/13 milho <4,0 x 0,26 x x ND

63504 dez/13 farelo soja x x x x x 74,8

63608 dez/13 milho 4,31 x 0,9 x x x

63643 dez/13 milho 5,24 x 4,94 x x x

63979 dez/13 milho ND x x x x x

63986 dez/13 silagem 5,21 626,9 ND x x x

64033 dez/13 ração 5,82 263,2 0,55 x x x

64034 dez/13 ração <4,0 228,3 0,26 x x x

64065 dez/13 ração 4,15 ND 0,32 x x x

64066 dez/13 milho ND ND 1,88 x x x

64067 dez/13 milho ND 310,9 ND x 0,51 x

64068 dez/13 milho 5,57 255 ND x 0,72 x

64069 dez/13 milho <4,0 ND 10,76 x 0,59 x

64070 dez/13 milho 4,13 372,5 ND x 0,62 x


64343 dez/13 farelo trigo x x x x x ND

64348 dez/13 milho ND ND ND ND 1,12 ND

64557 dez/13 milho x x 1,46 x x x


34


64560 dez/13 milho x x 1,66 x x x




64697 dez/13 silagem <4,0 ND 2,83 x x x

64712 dez/13 ração <4,0 127,6 0,76 ND 1,13 x

64713 dez/13 casquinha soja ND 52,1 0,31 ND 0,97 x

64714 dez/13 farelo soja <4,0 ND 0,3 ND 1,48 x

64715 dez/13 milho ND 36,6 0,45 ND 0,88 x

64746 dez/13 ração ND <25 0,4 x x x

64747 dez/13 ração ND ND 0,67 x x x

64748 dez/13 ração <4,0 28,8 1,04 x x x

64749 dez/13 ração ND ND 2,03 x x x

64750 dez/13 ração ND 61,4 1,32 x x x

64751 dez/13 ração <4,0 111,8 0,62 x x x

64752 dez/13 ração ND 87,1 0,63 x x x

64753 dez/13 milho ND ND 0,83 x x x


64843 dez/13 farelo trigo x x x x x <25



64881 dez/13 ração <4,0 x 0,75 x x x





65107 dez/13 ração ND 119,9 x ND 0,89 33,5

65110 dez/13 ração ND 91,4 ND x x x

65111 dez/13 ração ND 115 <0,25 x x x

65112 dez/13 ração ND x ND x x x

65113 dez/13 ração ND x <0,25 x x x

65140 dez/13 milho ND x ND x x x


65142 dez/13 farelo trigo x x x x x <25

Legenda x: Análise não solicitada ND: Não Detectado Fonte: Laboratório de Mictoxinas da Mercolab – Cascavel.

MICOTOXINAS NA AVICULTURA E SUINOCULTURA

Documents