Krzysztof Gibasiewicz Zaklad Biofizyki Molekularnej tel. 61 829 6370 e-mail: [email protected]Metody spektroskopii molekularnej - III rok biofizyki molekularnej Metody eksperymentalne biofizyki - I rok II stopnia fizyki medycznej i optometrii http://bio4.fizyka.amu.edu.pl/MSM/MSM.htm Biofizyka molekularna Ćwiczenia – demonstracje: czwartki 9.00-10.30 lub inny termin po uzgodnieniu z osobami prowadzącymi; pierwsze zajęcia – dr A. Wilk 23 luty 2012 ([email protected])
87
Embed
Metody spektroskopii molekularnej - bio4.fizyka.amu.edu.plbio4.fizyka.amu.edu.pl/MSM/MSM_Wyklad_1_do_3_Wprowadzenie12.pdf · Metody spektroskopii molekularnej – plan wykładów
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Metody spektroskopii molekularnej- III rok biofizyki molekularnej
Metody eksperymentalne biofizyki- I rok II stopnia fizyki medycznej i optometrii
http://bio4.fizyka.amu.edu.pl/MSM/MSM.htm
Biofizyka molekularna
Ćwiczenia – demonstracje: czwartki 9.00-10.30 lub inny termin po uzgodnieniu z
osobami prowadzącymi; pierwsze zajęcia – dr A. Wilk 23 luty 2012 ([email protected])
Literatura
Wiliam W. Parson, Modern Optical Spectroscopy, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2007
Zbigniew Kęcki, Podstawy spektroskopii molekularnej, PWN W-wa 1992 lub nowsze wydanie
Metody spektroskopii molekularnej – plan
wykładów
1) Spektroskopia optyczna (12 wykładów)- wprowadzenie do zjawisk optycznych (absorpcja, fluorescencja, rozpraszanie światła) i technik z nimi związanych (3 wykłady),- wprowadzenie do mechaniki kwantowej jako podstawy rozumienia zjawisk optycznych (3 wykłady),- światło - klasyczny i kwantowo-mechaniczny opis promieniowania elektromagnetycznego (2 wykłady),- zjawiska absorpcji i fluorescencji w ujęciu kwantowo-mechanicznym (4 wykłady).
2) Spektroskopia magnetyczna (3 wykłady)- jądrowy rezonans magnetyczny (NMR, nuclear magnetic resonance),- elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR, electron paramegnetic resonance).
Plan wykładu wprowadzającego
1) Zagadnienia do przypomnienia
2) Definicje i podział spektroskopii
3) Informacje wstępne nt. spektroskopii optycznej
4) Wprowadzenie do zjawisk absorpcji i fluorescencji
5) Metody pomiaru absorbancji
6) Wprowadzenie do zjawisk dichroizmu liniowego i kołowego
7) Podstawowe pojęcia i techniki pomiaru fluorescencji
8) Wprowadzenie do spektroskopii podczerwieni i rozpraszania ramanowskiego
Zagadnienia do przypomnienia
1) Światło jako fala (elektrodynamika)
2) Kwantowa natura poziomów energetycznych atomów i
cząsteczek (fizyka atomu i cząsteczki).
3) Orbitale atomowe i molekularne (chemia organiczna).
4) Formy energii cząsteczek – rotacyjna, oscylacyjna i elektronowa (podstawy biofizyki II).
Spektroskopia – nauka o badaniu materii za pomocą promieniowania (elektromagnetycznego, neutronowego,...).
Spektroskopia molekularna – materię stanowią cząsteczki.
Skupimy się na cząsteczkach:
a) biologicznych,
b) w roztworach wodnych lub organicznych.
Definicje
Spektroskopia optyczna
EPR
~1 cm
NMR~10 m
spektroskopia
optyczna
~1 µm
Spektroskopia optyczna –badanie materii za
pomocą światła
(włączając bliski nadfiolet i podczerwień)
Zalety technik spektroskopii
optycznej
1) Czułość
- fotopowielacze, fotodiody rejestrują pojedyncze
fotony emitowane przez wzbudzone cząsteczki,
2) Szybkość
- impulsy światła <10-14 s – zachowanie cząsteczek w skali czasu ruchu jąder atomowych.
milisekundy, ms – 10-3 s
mikrosekundy, µs – 10-6 s
nanosekundy, ns – 10-9 s
pikosekundy, ps – 10-12 s
femtosekundy, fs – 10-15 s
Informacje uzyskiwane za pomocą
technik spektroskopii optycznej
Absorpcja, fluorescencja, liniowy i kołowy dichroizm:
� identyfikacja cząsteczek,
� stęŜenie,
� energie,
� konformacja,
� dynamika,
� wpływ otoczenia na ww.,
� wyznaczanie odległości między cząsteczkami,
� umiejscowienie i dynamika cząsteczek w Ŝywych komórkach (w powiązaniu z inŜynierią genetyczną i mikroskopią).
Jak cząsteczki reagują na światło?
Cząsteczki istnieją w dobrze określonych stanach i przechodzą z jednych stanów do innych.
Opisu tych stanów i przejść dostarcza mechanika kwantowa.
Ale!
Cząsteczki biologiczne są zbyt duŜe, Ŝeby mogły być opisane ściśle metodami kwantowo-mechanicznymi.
Jednak!
Kwantowo-mechaniczne zasady sformułowane na podstawie prostszych układów pomagają zrozumieć duŜe cząsteczki.
Stan podstawowy
RóŜne stany cząsteczek wynikają z róŜnego obsadzenia orbitali molekularnych przez elektrony.
KaŜdy orbital ma ściśle określoną energię.
Stan podstawowy 2n-elektronowej cząsteczki:
- kaŜdy z n orbitali o najniŜszej energii jest obsadzony przez 2 elektrony o przeciwnych spinach,
- orbitale o wyŜszych energiach są puste.
W nieobecności zaburzeń zewnętrznych cząsteczka pozostaje w stanie podstawowym nieskończenie długo.
Światło (klasycznie) = oscylujące pole elektromagnetyczne
Oscylacja elektronów w cząsteczce
Przemieszczenie elektronu z jednego z zajętych orbitali na
wolny orbital o wyŜszej energii
Ekspozycja cząsteczki na światło
Dwa warunki przejścia elektronu na
wyŜszy orbital
1) Pole elektromagnetyczne musi drgać z odpowiednią częstotliwością:
- ∆E róŜnica energii pomiędzy stanami podstawowym i wzbudzonym
- h – stała Plancka.
Kolory cząsteczek!
(Nie ma konieczności odwoływania się tutaj do kwantowej natury światła! Wystarczy kwantowa natura stanów energetycznych cząsteczki!)
ν = ∆E/h
Kolory cząsteczek!
Pasmo Qy – w czerwieni
(Chl)
Pasmo Soreta – w obszarze
niebieskim lub uv
Zielony kolor chlorofili
Dwa warunki przejścia elektronu na
wyŜszy orbital – c.d.
2) Orbitale, pomiędzy którymi przechodzi elektron muszą mieć róŜną symetrię
geometryczną i muszą być odpowiednio zorientowane względem kierunku
oscylacji pola EM
� pasma absorpcji róŜnych cząsteczek róŜnią się,
� absorpcja światła przez próbki anizotropowe zaleŜy od kierunku polaryzacji
światła względem próbek.
Moment przejścia
Moment przejścia (transition dipole)
– wektor określający siłę pasma absorpcji i optymalny kierunek polaryzacji światła dla danej cząsteczki,
– moŜe być obliczony ze znajomości orbitali molekularnych w stanie
Pomiar widm fluorescencji wymaga korekty ze względu na widmo lampy i zaleŜność czułości miernika od długości fali światła
Wybór koloru światła
wzbudzającego
Wybór koloru światła
emitowanego
2 typy widm:
Widma emisji i wzbudzenia
λ
A, Fl
A Fl
A, Fl
A Fl
λ
Wydajność fluorescencji
- odsetek wzbudzonych cząsteczek powracających do stanu podstawowego na drodze emisji fluorescencji
Procesy konkurujące z emisją fluorescencji
- wygaszanie przez inne cząsteczki (podczas zderzeń)
- przejście interkombinacyjne ze stanu singletowego do tripletowego
- konwersja wewnętrzna
abs fl
Czasowo-rozdzielcze pomiary
fluorescencji
τ – czas Ŝycia fluorescencji (średni czas
jaki cząsteczka pozostaje w stanie
wzbudzonym)
k
k
k
k k
- natęŜnie fluorescencji, F(t), zanika w czasie (jedno- lub wielowykładniczo):
F(t) = F(0) exp(−t/τ)
F(t) =ΣFi(0) exp(−t/τi)
[M*(t)] – stęŜenie cząsteczek wzbudzonych
F(t) ~ [M *(t)]
dM*/dt = -kM
(dM*/M)/dt = -k
k – prawdopodobieństwo, zaniku wzbudzenia w
jednostce czasu
M*(t) = M*(0) exp(−kt/)
M*(t) = M*(0) exp(−t/τ), τ = 1/k
- wzbudzenie krótkim impulsem światła
fluore
sce
ncja
Techniki czasowo-rozdzielczych
pomiarów fluorescencji
1) Zliczanie pojedynczych fotonów (demonstracja)
2) Metoda modulacyjna
3) Up-konwersja fluorescencji
Cel: wyznaczenie czasu (czasów) Ŝycia fluorescencji
Zliczanie pojedynczych fotonów
1) wzbudzenie b. słabymi impulsami
światła – kaŜdy impuls światła
powoduje rejestrację tylko jednego
fotonu;
2) mierzone są czasy od wzbudzenia
do zarejstrowania fotonu
fluorescencji, a następnie liczone
fotony, które wpadają do
odpowiednich kanałów czasowych
3) budowany jest histogram: liczba
zliczeń w funkcji nru kanału
czasowego
4) 105 zarejestrowanych fotonów –
gładki histogram
5) Rozdzielczość czasowa ~10 ps Kanał czasowy
Lic
zba
foto
nów
F
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 .....
Metoda modulacyjna1) Wzbudzenie próbki światłem ciągłym o modulowanym sinusoidalnie natęŜeniu
światła z częstotliwością ω
2) Fluorescencja oscyluje sinusoidalnie z tą samą częstotliwością ω, ale
amplituda i faza (φ) tych oscylacji względem oscylacji światła wzbudzającego
zaleŜy od iloczynu ω i τ (czas Ŝycia fluorescencji)
3) Im dłuŜszy czas Ŝycia fluorescencji – tym większe przesunięcie fazowe,
najlepiej gdy ω = 1/τ . τ wyznacza się ze znajomości ω i φ
4) Zaniki wieloeksponencjalne – kilka częstotliwości ωi
wzbudzanie emisja fluorescencji
amplituda sygnału
fluorescencji
przesunięcie fazowe
Metoda modulacyjna1) Wzbudzenie próbki światłem ciągłym o modulowanym sinusoidalnie natęŜeniu
światła z częstotliwością ω
2) Fluorescencja oscyluje sinusoidalnie z tą samą częstotliwością ω, ale
amplituda i faza (φ) tych oscylacji względem oscylacji światła wzbudzającego
zaleŜy od iloczynu ω i τ (czas Ŝycia fluorescencji)
3) Im dłuŜszy czas Ŝycia fluorescencji – tym większe przesunięcie fazowe,
najlepiej gdy ω = 1/τ . τ wyznacza się ze znajomości ω i φ
4) Zaniki wieloeksponencjalne – kilka częstotliwości ωi
wzbudzanie emisja fluorescencji
amplituda sygnału
fluorescencji
przesunięcie fazowe5)Rozdzielczość czasowa
~100 ps
Up-konwersja fluorescencji
1) Zasada uzyskiwania rozdzielczości
czasowej (10-14 s) i układ
eksperymentalny podobne jak w
czasowo-rozdzielczych pomiarach
typu pompa-sonda.
2) Światło fluorescencji jest ogniskowane
na nieliniowym krysztale wraz krótkim
impulsem swiatła próbkujacego
3) W momencie gdy światło fluorescencji
dotrze do kryształu w tym samym
czasie co impuls światła
próbkujacego, kryształ emituje światło
o nowej częstotliwości będącej sumączęstotliwości światła fluorescencji i
światła próbkującego.
4) ZaleŜność natęŜenia fluorescencji od
czasu – zmiana opóźnienia impulsu
próbkującego względem impuslu
pompującego
Laser
femtosekundowy
próbka
kryształ
5) Rozdzielczość czasowa ~0.1 ps
impuls pompujący
impuls próbkujący
fluor.
Anizotropia fluorescencji
- jeśli fluorescencja następuje z tego samego stanu, który został wzbudzony
(momenty przejścia absorpcji i fluorescencji są wzajemnie równoległe) i cząsteczka
nie obraca się pomiędzy tymi dwoma zdarzeniami wówczas fluorescencja
spolaryzowana równolegle do wzbudzenia jest ok. 3 razy większa niŜ fluorescencja
spolaryzowana prostopadle
- informacje o ruchach cząsteczek i przekazywaniu wzbudzenia innym cząsteczkom
P1, P2 – polaryzatory
S - próbka
Spektroskopia podczerwieni
1) Klasycznie, częstotliwość (ν) drgań dwuatomowej cząsteczki rośnie ze wzrostem stałej siłowej (k’) a maleje ze wzrostem masy zredukowanej (mr, wstęp do biofizyki II):