Metody s využitím reakce antigen- protilátka
Mar 19, 2016
Metody s využitím reakce antigen-protilátka
Metody s využitím reakce antigen - protilátka
Neznačený antigen/protilátka• Precipitace• AglutinaceZnačený antigen/protilátka• Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)• Radioimmunoassay (RIA)• Western blotting• Immunofluorescence• Průtoková cytometrie
Význam metod a hodnocení
• Důkaz přítomnosti antigenu• Důkaz přítomnosti protilátky
• Kvalitativní hodnocení – pozitivní x negat.• Vznik zákalu, precipitátu, aglutinace• Kvantitativní hodnocení – měření vzniklých
IK
Sensitivita metod
precipitace - 30 g/ml
aglutinace - 1 g/ml
radioimunoassay, ELISA - 1 pg/ml
Precipitation reactionAgregáty vzniklé interakcí multivalentních protilátek a multivalentních makromolekulárních antigenů
Poměr reagujících složek, při němž je doba flokulace nejkratší nebo precipitace nejvýrazněj ší, se nazývá optimální poměr a j e obvyke tvořen ekvivalentními množstvími antigenu a protilátky.
Precipitační reakce
Ab + solubilní Ag Síť antigenů a protilátek Precipitace
•Radiální imunodifúze •Dvojitá difúze•Imunoelektroforéza
Stanovení imunoprecipitace:vizuálně metodami rozptylu světla (nefelometrické nebo turbidimetrické stanovení)
MetodyFlokulační : postupné ředění jedné z reagujících složek - ve zkumavceImunodifuzní (ID) : ředění se dosahuje difuzí do prostředí gelu
Radiální imunodifúze – jednoduchá, dvojitá
Protilátka je rozpuštěná v gelu; Ag je přidán do jamek
Měření koncentrace různých sérových proteinů, např. hladiny imunoglobulinů
Vyhodnocení RID• podle MANCINIOVÉ, precipitace se měří po skončení
imunodifúze (48 až 72 hodin)• průměr prstence je přímo úměrný koncentraci Ag• pokud není precipitace ukončená, vzniká křivka• Stanovení koncentrace IgG, IgA, IgM, IgD, albuminu,
alfa1-antitrypsinu, ceruloplasminu, alfa 2-makroglobulinu, transferinu, C1 inhibitoru
Dvojitá difúze (podle Ouchterlonyho)
Identické Neidentické Částečně identické
Ab a Ag difundují proti sobě• Stanovení homogenity systému antigen-protilátka• Diagnostika specifických autoimunitních onemocnění• Používáno následně po purifikaci směsi antigenů• Hledání reakcí mezi serologicky příbuznými antigeny• V agaru bez obsahu antigenu nebo protilátky• Závislost na poměru koncentrací antigenu a protilátky
Dvojitá difúze
Dvojitá difúze
Dvojitá difúze
Imunoelektroforéza Kombinace separace antigenů elektroforézou s identifikací pomocí dvojité difúze detekce presence nebo absence proteinu v seru
Aglutinační reakce
• Přímá aglutinace• Pasivní aglutinace• Aglutinační inhibice
Ab + Ag nerozpustný (korpuskulární) Aglutinace (shlukování)
Aglutinace - použití• Identifikace mikroorganismů• Identifikace živočišných buněk• Identifikace erytrocytů• Aglutinace přímá - s protilátkou reagují aglutinogeny
na povrchu částic • Nepřímá - reagují rozpustné antigeny nebo haptény,
které se předtím pasivně adsorbovaly na povrch buňky nebo inertní částice
• Aglutinační reakce jsou citlivější než precipitační.
Přímá aglutinace
• Ag je přirozenou složkou částice • Např. testování pacientova séra na
přítomnost protilátek proti určité bakterii:– Pacientovo sérum je sériově ředěno do
zkumavek, mikrotitračních destiček s konstantním množstvím korpuskulárního antigenu. Poslední zkumavka s viditelnou aglutinací určuje titr protilátky v séru
Přímá aglutinace• Stanovení protilátek proti erytrocytům• Erytrocyty: negativně nabité (zeta potenciál), může být
ovlivněna agluginační reakce (zejména IgG protilátky)• Řešení: Coombsův test - použití anti
imunoglobulinového séra
Eg. Detection of anti-Rh antibodies in the blood of an Rh- woman
Coombsův Test• Přímý: přidá se protilátka proti lidskému
imunoglobulinu (Coombsovo činidlo) k červeným krvinkám. Aglutinace se objeví, pokud jsou erytrocyty pokryty protilátkami
• Nepřímý: inkubuje se testované sérum s erytrocyty zdravého dárce. Promytí. Přidá se Coombsovo činidlo.
• stanovení Rh protilátek• diagnostika získané hemolytické anémie - průkaz
volných antierytrocytárních protilátek v plazmě (séru)
Přímý a nepřímý Coombsův test
Měření vázané protilátky
Měření sérové protilátky
Pasivní aglutinace• Aglutinace mezi protilátkou a solubilním antigenem
vázaným na nesolubilní částici (latexová částice)• Mnohonásobně zvýšení citlivosti oproti precipitační
reakce• Diagnostika autoprotilátek u autoimunitních
onemocnění– Diagnostika autoimunitní thyroiditidy:
Thyroglobulin je připojen k latexové částici a je použit k detekci anti-thyroidních protilátek v séru pacienta
- Diagnostika revmatoidní artritidy
Inhibice aglutinace• velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých
množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag, která aglutinuje.
• Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab.
• Průkaz užívání drog (kokain, heroin). • Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice
hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k diagnostice (zarděnky, chřipka).
Hemaglutinace
EIA x ELISA• EIA – enzymoimunoanalýza • Heterogenní – vyžadují separaci volné a vázané frakce
analytu • Homogenní – nevyžadují separaci• imunochemická reakce s enzymatickou detekcí ke
stanovení koncentrace antigenu nebo protilátky v neznámém vzorku
• ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay (speciální druh EIA) aktuálně heterogenní kompetitivní EIA se značenou protilátkou
• Enzymy – křenová peroxidása a alkalická fosfatása
Principle of ELISA/RIAEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
1 2
3 4
1. Potažení jamek antigenem
2. Přidání vzorku séra
3. Přídání enzymem značené protilátky(anti-human IgG)
4. Přidání substrátu
5. Odečtení barevné reakce
Použití ELISA testů
• Stanovení cytokinů• Stanovení autoprotilátek u
systémových onemocnění (ANCA, anti-ds DNA)
• Speciální modifikace – CAP – specif. IgE (úprava hmoty pro navázání antigenu a použití fluorescenční detekce)
Western blot jako podskupina imunoblotingu
• detekce proteinů po elektroforéze v PAA gelu• princip spočívá v elektrotransferu proteinů z gelu na membránu
a následné detekci pomocí série protilátek• Gel se vloží na membránu (vytvoří se sendvič) a pomocí
elektrického proudu se proteiny z gelu přenesou na membránu, která je na sebe naváže.
• Membrána se potom podrobí inkubaci se sérií dvou protilátek, z nichž první/primární se váže s vysokou specifitou na daný protein. Druhá/sekundární protilátka bývá značena – alkalickou fosfatasou, peroxidasou
• Western blot – slovní hříčka, Southern blot – přenesení DNA z gelu na membránu, posléze Northern blot – pro RNA
Western blottingWestern blot
Využití Western blot
• Autoprotilátky – antigangliosidové u neurologických autoimunitních onemocnění, autoprotilátky u hepatopatií
Imunofluorescence
Přímá – vazba značené protilátkyNepřímá • vazba primární protilátky a značené sekundární protilátky• k detekci autoprotilátek. Sérum pacienta se nechá reagovat se substrátem. (normální tkáň jiného pacienta nebo tkáň zvířecí nebo buňky standardních buněčných kult). Detekce navázaných protilátek pomocí značených sekundárních protilátek, specifických vůči jednotlivým třídám lidských protilátek.
Průtoková cytometrie
Průtoková cytometrie: stanovení CD4 T buněk
Monitoring CD4 T buněk u HIV pacienta