Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4. PCR Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013 Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364
Jan 26, 2016
Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin
4. PCR
Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013
Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických
oborů PřF JU
reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364
Historie
Co bylo před PCR?
k dispozici pouze DNA, kterou se podařilo vyizolovat
fragmenty DNA bylo možné namnožit klonováním (zač. 70. let)
(zapojením do plazmidu a vnesením do bakt. buněk)
sekvenování NK (od konce 70. let)
RFLP
RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) variabilita generována restrikčními enzymy z
bakterií - rozpoznávají krátkou specifickou sekvenci dsDNA
vyizolovaná genomová DNA naštěpena jedním nebo více enzymy
fragmenty separovány ELFO, vizualizace obarvením, nebo přenesením na membránu a hybridizací se značenou DNA sondou (Southern-blot)
sondy:
• specifické pro určitý lokus (např. rDNA; další využití – restrikční mapování
genomu, určování pořadí genů pomocí genově specifických sond)
• multilokusové (např. hypervariabilní repetitivní sekvence: mini- a mikrosatelity)
RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Lokusově specifická sonda: variabilita RFLP patternů 11 izolátů Candida albicans
(A - celková genomická DNA po naštěpení enzymem EcoRI)
B - Southern blot hybridizace se sondou pro oblast 28S, 18S a 5S rDNA
RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Multilokusová sonda:
variabilita patternů generovaných pomocí 2 mikrosatelitových sond (r. Candida)
PCR
PCR:
Polymerase Chain Reaction
in vitro namnožení určité části DNA
*1983, ale první (zapomenuté) pokusy už v r. 1971; Nobelova cena za chemii (1993)
Princip PCRPrincip PCR
vždy musíme mít k dispozici primery: levý-forward a pravý-reverse
elongace produktu 5´→3´!
první nasynt. vlákna jsou o něco delší než cílový produkt, cyklováním ale téměř absolutně převládne cílový produkt
teoreticky by měla stačit 1 molekula, v reálu je potřeba o něco víc (aspoň 10?)
(DNA polymeráza)
PCR cycling
1)
2)
3) Elongace
Templát. DNA
Princip PCRPrincip PCR
enzymatická syntéza DNA: prodlužování vlákna vždy ve směru 5´→3´(nezapomenout na to ani při designu primerů!)
Princip PCRPrincip PCR
počet kopií narůstá exponenciálně, postupně ale pokles - opotřebování polymerázy, inhibice narůstajícím množstvím nově nasynt. DNA (nastává obvykle po 30-35 cyklech)
Princip PCR
PCR cyklus:
1) denaturace – rozpletení dvouvlákna templátové DNA, obvykle stačí 94-95°C, 30-60 s
(záleží na CG obsahu, lze ovlivnit přidáním aditiv)
Princip PCR
PCR cyklus:
2) annealing (nasedání) primerů
obvykle v rozmezí ca 48-62°C, 30-60 s specifické pro každý primerový pár, nutné optimalizovat,
příp. odhadnout podle sekvence primerů přibližně o 3-5°C pod metling temperature (Tm) primerů:
Tm = 64.9°C + 41°C x (počet G + C – 16.4) / délka primeru [bp] – pro primery >14bp
(Tm = 4°C x ( počet G + C) + 2°C x (počet A + T) – pro primery <14bp, Wallace rule)
http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx
Princip PCR
PCR cyklus:
3) elongace – syntéza komplement. vlákna DNA polymerázou
teplota podle typu polymerázy, obvykle 72°C (ale ~10% aktivity v 37°C)
délka podle aktivity polymerázy a délky amplifikovaného úseku Taq: 1000 bp/min
Taq polymerázy před odpadnutím z vlákna DNA dávají na jeho konec jeden A (terminal transferase activity; využití při AT klonování)
Princip PCR
Složení PCR reakce:
primery: 0.1-1 µM každého primeru reakční pufr (Tris-HCl):
• MgCl2 příp. MgSO4: 1-4 mM (Mg2+ je kofaktor polymeráz)
• KCl: 50 mM deoxynukleotidy (dNTP): 40-200 µM každého typu dNTP polymeráza: 0.5-2U / 25 µl reakce
templát: 1-1000 ng / 25 µl reakce (pro genomovou DNA)
s PCR chemikáliemi pracovat na ledu, skladovat v -20°C (hlavně polymeráza!)
ideálně alikvoty (dNTP jsou senzitivní na opakované zamražování; výhodné i proti kontaminacím)
PCR produkt naopak snese hodně…
Princip PCR
Vlastní příprava PCR:
objem 1 reakce může být libovolně v rozmezí 5-100 µl namíchat mix pro požadovaný počet vzorků, vždy používat
negativní kontrolu (PCR směs bez DNA → kontrola reakčních komponent, zda nejsou kontaminované DNA)
komerčně dodávané premixy – obsahují všechny složky reakce kromě primerů a templátu
před přesunem do cykleru držet vzorky na ledu
Příklad PCR cyklování: 95°C – 3 min počáteční denaturace DNA
35x: 95°C – 3 min denaturace
Ta – 1 min nasedání primerů
72°C – 1 min elongace
72°C – 10 min závěrečná elongace (dosynt. případná neúplná vlákna)
5°C hold temp. drží teplotu dokud nevyzvedneme vzorky z cykleru
Princip PCR
ELFO produktu PCR:
amplifikace 1 lokusu (za předpokladu, že se alely neliší délkou):
cílový PCR produktnespecifický PCR produkt
dimery primerů
neg. kontrola
(bez templátu)
Princip PCR
PCR polymerázy:
nejdříve se musely měnit po každém PCR cyklu (zničení tepelnou denaturací; Klenowův fragment)
průlomem izolace termostabilní Taq polymerázy *1965
(bakterie Thermus aquaticus)
různé typy PCR polymeráz se liší:
• procesivitou - počet nasynt. bp/min
• chybovostí - inkorporace nesprávného nukleotidu
• reakčními podmínkami - složení reakčního pufru, elongační teplota, kolik musíme dát enzymu atd.
Princip PCR
nejčastěji používané PCR polymerázy:
Taq (Thermus aquaticus; 1965)
1 kb/min (<5 kb), 72°C, frekvence chyb 1x10-4 – 2x10-5 , tvoří polyA-konce; nejlevnější
Pfu (Pyrococcus furiosus; 1991)
0.5-1 kb/min, 72°C, frekvence chyb ~2x10-6 (proof-reading = 3´to 5´ exonuclease activity, high fidelity), ale netvoří polyA-konce; MgSO4 jako zroj Mg2+
modifikace Taq a její směsi s proof-readingovými enzymy
(např. Ex Taq apod.): tvoří polyA-konce, chybovost ~mezi Taq a Pfu
Princip PCR
amplifikace dlouhých úseků, genomových fragmentů:
◄ fúze dvou proteinů:
modrá jednotka váže dsDNA
zelená jednotka (~Pyrococcus) syntetizuje
Phusion polymerase (<20 kb)
rychlá - 1 kb/15-30s; 6x míň chyb než Pfu (proof-reading)
LA polymerase (<30-40 kb; Long and Accurate)
1kb/min; Taq polymeráza + proof-reading jednotka
Optimalizace PCR
1. Odstranění nespecifických produktů:
příčina: nespecifická vazba primerů
teplota annealingu – zkusit různé Ta, nebo gradient (např. po 2-3°C)
• touch-down PCR: první cykly PCR jsou zásadní pro specifitu → pokud primery nenasedají specificky, tak se případný mismatch zafixuje; začít s vyšší Ta, a postupně ji snižovat (např.: 1. cyklus – 60°C, 2. cyklus 59°C, ...)
zkrácení času annealingu snížit koncentraci primerů, polymerázy
koncentrace MgCl2 (např. po 0.5 mM) - spíše snižovat
koncentrace KCl (ovlivňuje denaturaci DNA, kratší fragmenty preferenčně denaturují za vyšší koncentrace KCl)
• krátké nespecif. produkty: ↓ KCl
• dlouhé nespecif. produkty: ↑ KCl (> 50 mM může inhibovat Taq)
Optimalizace PCR
1. Odstranění nespecifických produktů:
příčina: nespecifická vazba primerů
dlouhé nespecif. produkty může redukovat zkrácení elongace Cold-start: vzorky před umístěním do cykleru držet na ledu! (omezení
aktivity polymerázy)
Hot-start polymerázy: blokovány navázanou protilátkou, aktivovány až počáteční denaturací → nevznikají nespecifické PCR produkty způsobené sníženou aktivitou polymerázy před umístěním vzorků do cykleru
ředění DNA templátu (1:10, 1:100...)
snižování počtu PCR cyklů
Optimalizace PCR
1. Odstranění nespecifických produktů:
příčina: krátké, zdánlivé nespecif. produkty mohou být
nedosyntetizovaná vlákna cílového úseku
podpořit činnost polymerázy
• prodloužením času elongace
• zvýšením koncentrace polymerázy
• koncentrace MgCl2• aditiva vázající inhibitory polymerázy (BSA, T4 protein)
prodloužit čas denaturace, nebo přidat aditiva usnadňující denaturaci templátu (10% DMSO, 5% formamid)
Optimalizace PCR
extrakce - vyřezávání cílových bandů z agarózy po ELFO (vhodné např. pro sekvenaci, klonování)
asi nejefektivnější postup pro odstranění dimerů primerů
1. Odstranění nespecifických produktů:
• celý vzorek nanést na 1-1.5% agarozový gel, nechat rozjet v ELFO
• ideálně Sybr Green + modré světlo (UV fragmentuje DNA, proto minimalizovat dobu expozice / odstínit např. skleněnou petriskou)
• vyřízlý kousek agarózy s cílovým bandem purifikovat běžně dostupnými kity (lyze agarózy, purifikace DNA na membráně)
• může být ztrátové → dělat větší PCR reakce (např. 30 a víc µl)
Optimalizace PCR
2. Slabá nebo žádná amplifikace
chyba při míchání PCR, nesprávný program apod. – odhalí se pomocí pozitivní kontroly (= vzorek templátu, u kterého máme ověřené, že amplifikuje)
teplota annealingu – pomůže především snižování zvýšit počet cyklů PCR (max. ca 45)
• pokud je málo cílové DNA, pozor na kontaminace! zvýšit koncentraci templátu nebo naopak templát ředit (1:10 – 1:1000) – pokud obsahuje inhibitory
• spike control: pozitivní kontrola + vzorek, který nefunguje → pokud nedá produkt, je to inhibitory ve vzorku
zvýšit koncentraci primerů, polymerázy
gradient koncentrace MgCl2 aditiva vázající inhibitory polymerázy (BSA, T4 protein), nebo
usnadňující denaturaci templátu (DMSO, komerční PCR enhancery)
Optimalizace PCR
použití více PCR: více cyklů PCR, méně opotřebované polymerázy
a) reamplifikace
• vzorek PCR reakce (např. 1 µl z 25 µl rce), která na gelu nedala band, se použije jako templát pro novou PCR za ± stejných reakčních podmínek
• někdy nefunguje (dané typem použitých primerů???)
b) nested PCR
• vzorek PCR reakce se použije jako templát pro novou PCR za použití vnitřních primerů (příp. se použije jeden vnitřní primer + jeden z primerů původní PCR = semi-nested PCR)
• obvykle funguje lépe
• umožňuje větší specifitu
(selektují až 4 primery!)
• x musíme mít vnitřní primery...
2. Slabá nebo žádná amplifikace
Optimalizace PCR
zkontrolovat primery: zda sedí na naši cílovou sekvenci - kritický je mismatch na 3´ konci, kde nasedá polymeráza
2. Slabá nebo žádná amplifikace
pokud nesedí, pokusit se o design nových primerů:
• shromáždit co nejvíc cílových sekvencí, vytipovat vhodná místa
- co nejvíce konzervované mezi cílovými sekvencemi
• někdy jsou sekvence tak variabilní, je nutné použít tzv. degenerované báze (IUPAC kód - např. M značí A nebo C)
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ - program na design primerů, umožňuje mj. zvolit oblast kam chceme v sekvenci umístit primery, testuje jejich parametry
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx - pokročilejší testování parametrů primerů
Optimalizace PCR
◄ stabilní dimer primerů (Delta G<6 kcal/mol),
který je při PCR elongován (5´- 3´!)
pro důslednou eliminaci dimerů nastavit např. v Primer3:Max Self Complementarity: 3Max Self Complementarity: 1
• neměly by tvořit smyčky, které nedenaturují za annealingové teploty
• pozor na dimery primerů:
někdy i ideální primery nefungují a naopak teoreticky špatné fungují bez problémů...
Obecná pravidla pro design primerů:
• 15-28 bp dlouhé, GC obsah 40-60%
• pro optimální specifitu by 3´ konec měl být bohatší na GC, ale ne víc jako 3 GC v posledních 5 bázích (zvyšuje riziko nespecif. nasedání)
• oba primery by se neměly příliš lišit v teplotě nasedání (max. ~3°C)