Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 1. Úvod Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013 Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364
Jan 25, 2016
Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin
1. Úvod
Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013
Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických
oborů PřF JU
reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364
Přehled témat
► Úvod (základní pojmy, typy markerů, variabilita, apod.)
► Isozymy
► Izolace DNA
► PCR
► Přímé sekvenování
► NGS (next generation sequencing)
► Metody s arbitrárními primery (RAPD, ISSR)
► Mikrosatelity (SSR)
► Restrikční metody (RFLP, PCR-RFLP, T-RFLP)
► AFLP
ke každé metodě technický princip, struktura a vyhodnocení dat, příklady použití v botanice
Úvod
Co jsou markery?
= znaky, v širším smyslu jsou markery např. morfologické, cytologické, chemické ...
Co jsou molekulární markery?
= ty, které odrážejí molekulární podstatu genetické informace; variabilita je generována mutacemi a přestavbami genomu:
►DNA metody – pracují s variabilitou na úrovní DNA» konkrétní sekvence
» délková variabilita fragmentů DNA (elektroforéza apod.)
►proteiny, isozymy – variabilita odvozená ze struktury DNA
►organizace DNA na cytogenetické úrovni (FISH, GISH,...)
►příp. další, jako charakteristiky biosyntetických drah apod.
Úvod
sekvence DNA ►
▲ nepřímá informace:variabilita ELFO mobility (= hlavně délky) molekul - fragmentů DNA
banding pattern
přepis do RNA a následně do proteinů
▲ nepřímá informace:variabilita ELFO mobility (délka, elektrický náboj) molekul proteinů
Aplikace molekulárních markerů
Taxonomie
vedle dalších znaků do datové matice také informace o vztazích mezi taxony, reprodukčních bariérách, genetické variabilitě taxonů...
Populační biologie studium genetické variability populací a faktorů ji ovlivňujících (inbreeding, gen. drift, migrace,…); podíl pohlavního / nepohlavního rozmnožování; identifikace klonů; v širším geografickém měřítku migrace a refugia (fylogeografie)
Ekologie společenstev od prosté základní identifikace organismů (barcoding) i z fragmentárních vzorků, až ke komplexní analýze složení daného společenstva – např. mikroorganismů nebo hub, které často nelze zkoumat pomocí klasické morfologické determinace
(+ aplikace v biotechnologiích, identifikace kultivarů v zemědělství apod.)
Výhody a omezení
Výhody molekulárních markerů
► nejsou ovlivněny vnějším prostředím (není fenotypová plasticita)
► teoreticky téměř neomezený počet znaků
► měly by být více variabilní než ostatní markery» velmi výhodný zdroj dat pro taxony s obtížně detekovatelnou morfologickou variabilitou (např. mikroorganismy)
» někdy velmi rychlá evoluce → možnost detekovat recentní procesy
Nevýhody molekulárních markerů:
► Mají stejnou hlavní nevýhodou jako kterýkoli jiný typ dat: homoplazie, i když obvykle v menší míře
homoplazie = stejný stav znaku, který u 2 nebo více studovaných jedinců vznikl nezávisle; zdánlivá podobnost, která ale neodráží příbuznost
AAGGTA (předek)
AAGATA AAGCTA
AAGTTA AAGTTA
Bird Bat
(morfologická homoplazie) (homoplazie na úrovni sekvence DNA) (homoplazie DNA fragmentu)
stejná ELFO mobilita, ale odlišná sekvence:
ATCTCATC CTTGATTA
Výhody a omezení
Nevýhody molekulárních markerů:
► pro některé typy markerů je nutná určitá předběžná znalost genomu studovaného organismu
» krajním případem jsou specifické markery, které fungují jenom na danou taxonomickou skupinu (např. rod)
» potřebné informace často nejsou k dispozici• drahé / pracné je získat de novo
► stále relativně vysoká cena molekulárních analýz
► potřeba speciálně vybavené laboratoře
Výhody a omezení
Variabilita
Jak variabilní marker potřebujeme?
► „tak akorát“ – pokud možno co nejvyšší variabilita odlišující studované skupiny (populace / taxony) nebo odhalující určitý jev + zároveň co nejnižší „nevysvětlená“ variabilita
» málo variabiliní marker nenese dost informace
» pozor na příliš variabilní markery (viz dále)
► marker vhodný pro jednu skupinu organismů na dané taxonomické úrovni může být zcela nevhodný pro jinou skupinu na téže úrovni
» ale může být výhodný na jiné úrovni
► genetická variabilita může souviset s typem rozmnožování (viz dále)
Variabilita
Příliš variabilní markery
► obvykle nelze použít totéž na různých taxonomických úrovních
» co dobře funguje mezi populacemi může být příliš variabilní mezi druhy / rody, a naopak
► zvýšené riziko homoplazií
» mutace se ”protočí” a stejný stav znaku vznikne nezávisle u nepříbuzných jedinců
» předpoklad homologie srovnávaných znaků je kritický, bez jeho splnění nemá většina analýz smysl
Variabilita
Příklady problémů u příliš variabilních markerů:
ISSR banding pattern dvou odlišných druhů r. Schoenoplectus:
- oba druhy značně odlišné
- málo sdílených lokusů
- i u několika málo potenciálně sdílených bandů (◄) není jistota homologie
◄
◄
◄
Nejistá homologie bází v evolučně příliš vzdálených sekvencích DNA:
(shoda bází může být čistě náhodná, nelze z ní odhadovat homologii)
Lokus, multilokusová dataLokus
► konkrétní místo v genomu (konkrétní gen / sekvence; určité místo na daném chromosomu;…)
► srovnáváme data v rámci 1 lokusu» jinak není homologie
► vždy je výhodné mít co nejvíc data z různých míst genomu (lokusů)
Multilokusová data► některé markery poskytují informace
z více lokusů najednou – většinaDNA metod vytvářejících tzv. banding pattern
» trochu definice kruhem: lokus = fragment dané délky
► u ostatních markerů (isozymy, sekvenování) je možné získat data z více lokusů, ale za cenu vyšších nákladů
▲ 8 lokusů, metoda ISSR
Dominantní data = jsme schopni rozlišit pouze přítomnost / nepřítomnost (dominantní homozygot a heterozygot vypadají stejně)
» kódování 0 / 1
» typicky ISSR, AFLP
» často multilokusová data
Kodominatní data = jsme schopni rozlišit i heterozygoty» allozymy, mikrosatelity,
PCR-RFLP, někdy sekvence
► pro populační genetiku výhodná kodominantní data
► často ale stačí i dominantní data (příbuznost / fylogeneze, míra genetické podobnosti, identifikace klonů, …)
Dominantní a kodominantní data
0 0 0 1 0 1 1 1 1 1
AB AA BB BB BC CC AB CC BC
Selekční neutralita
► úspěšnost (fitness) jedince není ovlivněna (ne)přítomností konkrétní alely pro daný lokus; frekvence alel v čase se mění náhodně
► nutná pro studium náhodných procesů v populační genetice
» genetický drift (včetně founder effect apod.)
» migrace (genový tok)
» mutační rychlost
► typicky nekódující úseky DNA, omezeně isozymy
Tři genomyjaderný genom:
biparentální přenos
+ rekombinace
možnost polyploidie
chloroplastový genom (cpDNA):
maternální přenos
(u nahosemenných paternální!)
v buňce velké množství kopií
mitochondriální genom (mtDNA):
maternální přenos
v buňce velké množství kopií
Tři genomy
► jaderný» biparentální přenos = semena + pyl
► chloroplastový» maternální přenos = pouze semena» pouze u nahosemenných paternální = pyl
► mitochondriální» maternální přenos» u rostlin obvykle ale nepoužitelný (malá variabilita,
někdy přestavby, výměna genů s jádrem,…)» výjimkou jsou nahosemenné
► výhodné kombinovat jádro + chloroplast (→ fylogeografie)
Specifita markerů
► nespecifické markery » do značné míry univerzální, lze je použít pro řadu taxonů
► specifické markery » fungují pouze na daný taxon (příp. blízké příbuzné)
» lze je použít, pouze pokud máme pro daný taxon informaci o genomu nutnou pro vlastní provedení metody
► v reálu použijeme markery, které pro daný taxon už někdo vyvinul a publikoval, příp. optimalizval nebo musíme vyvinout vlastní markery (časově a finančně náročnější)
Specifita markerů
► specifické markery je nutné použít, pokud pracujeme se vzorky obsahující tkáně dalších organismů, které potřebujeme z analýzy odfiltrovat (endosymbionti, paraziti apod.)
▲ hyfy mykorhizních hub (AMF) v kořenech ▲ fykobiont lišejníků
► … a nebo je naopak chceme selektivně zkoumat
Další pojmy
DNA fingerprinting (DNA typing, DNA profiling)► termín používaný spíše ve forenzní genetice► souhrnné označení metod vytvářejících „DNA profil“, podle
kterého lze identifikovat daného jedince► hypervariabilní markery
DNA barcoding► určování organismů podle sekvence DNA („čárový kód“)
» izoláty z půdy, hyfy hub z kořenů, pozůstatky potravy ve střevech / trusu zvířat,…» běžně neurčitelný materiál – larvy a jiní nedospělci, zbytky mrtvých jedinců, kořeny, morfologicky neodlišitelné druhy,…
► variabilní, snadno amplifikovatelné úseky DNA» mitochondriální gen pro cytochromoxidasu (cox) u zvířat» ITS úsek jaderné ribosomální DNA u rostlin
Ploidní stupeň
► Polyploidie častá u rostlin (vč. mechorostů), u některých řas» neopolyploidie vs. paleopolyploidie
► Stupeň ploidie = počet kopií chromosomů / genů v genomu
► Někdy celé komplexy cytotypů / taxonů různých stupňů, retikulátní evoluce
» příklad: Achillea millefolium agg. (2n = 2x, 4x, 6x, 8x)
► Zásadní informace při vyhodnocování dat!
► Jak se zjišťuje – viz samostatná přednáška
Co je dobré vědět dopředu
Ploidní stupeň
► Více typů heterozygotů (→ kodominantní markery)» AAAB, AABB, ABBB
» až x alel v jednom genomu (x = počet kopií)
► Odhad míry heterozygotnosti jiný než u diploidů» míry genetické vzdálenosti
» nesrovnatelné hodnoty mezi ploidiemi (platí i pro další parametry založené na míře heterozygotnosti)
► Některé výpočetní postupy předpokládají diploidy, resp. neumí pracovat s více ploidiemi zároveň
» populační genetika (F-statistiky, H-W rovnováha,…)» STRUCTURE
Co je dobré vědět dopředu
Vegetativní rozmnožování
► Co je jedinec?
► Pozor při sběru vzorků!
► a co teprve mikroorganismy …
Co je dobré vědět dopředu
http://alpandino.org/en/course/19/19e.htm
Co je dobré vědět dopředu
Reprodukční systémy
► 3 hlavní způsoby tvorby semen» sexualita – allogamie
» sexualita – autogamie
» apomixie
► zásadní vliv na očekávanou genetickou variabilitu(vnitro- i mezipopulační)
► nutno brát v úvahu již při sběru vzorků» smysluplný počet populací a počet jedinců na populaci je různý
► … nebo to naopak může být cílem studia (na základě pozorované variability v „náhodném“ vzorku)
Co je dobré vědět dopředu
vlastnost allogamie autogamie apomixie
meiosa, ano ano nerekombinace
identita s ne ne (ale homo- anorodiči zygotní linie)
vnitropopul. velká menší ± žádnávariabilita (homozyg. linie)
mezipopul. malá n. spíše velká velká (nebovariabilita velká někdy žádná)
heterozygo- různá malá často velkásita (hl. u diploidů) (allopolyploidi)
Reprodukční systémy
Co je dobré vědět dopředu
počet vzorků allogamie autogamie apomixie
populace méně více více
jedinci v více méně málopopulaci
► … a aby toho nebylo málo, spousta druhů má směs:» různý podíl auto- a allogamie
» fakultativní apomixie
» … a ke všemu vegetativní rozmnožování
Reprodukční systémy