•1 CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio Juan M. González Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología Consejo Superior de Investigaciones Científicas Sevilla Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio Curso anterior (2006) : Que son los microorganismos, como crecen y otras características de interés Muy pequeños Son muchos Muy diversos En esta ocasión Como podemos detectar y estudiar los microorganismos El punto de partida es determinar que microorganismos participan en procesos de biodeterioro
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Métodos para el estudio de microorganismos en … Curie Research Training/10_Gonzalez.pdf · hasta 50 µl 10 x 50 mM 20-50 µl 20-50 µl 1-5 u/µl Componentes Concentración final
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Seminario de Guadalupe, diciembre 2004Seminario de Guadalupe, diciembre 2004Las Humanidades y el Patrimonio Cultural: Los Monumentos y la MeLas Humanidades y el Patrimonio Cultural: Los Monumentos y la Memoriamoria
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS
Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Juan M. GonzálezInstituto de Recursos Naturales y Agrobiología
Consejo Superior de Investigaciones CientíficasSevilla
Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Curso anterior (2006):
Que son los microorganismos, como crecen y otras características de interés
Muy pequeños
Son muchos
Muy diversos
En esta ocasión
Como podemos detectar y estudiar los microorganismos
El punto de partida es determinar que microorganismos participan en procesos de biodeterioro
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TTéécnicas avanzadas de diagncnicas avanzadas de diagnóóstico. Cesstico. Cesááreo reo SSááiziz
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Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
I. Introducción
II. Métodos Moleculares
III. Resultados (13 Marzo)
Ecología y diversidad microbiana
Detección por cultivos
Otras técnicas
Pasos básicos
Técnicas empleadas y análisis
Cultivos vs. Técnicas moleculares
Apartados
Microscopía
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Recordemos que:
Son muy pequeños y están en todas partes
Muchos de ellos son desconocidos
Pueden presentar metabolismos muy diferentesAerobios, Anaerobios, Heterotrofos, Autotrofos, etc.
Microorganismos
Frecuentemente viven asociados
Existen muchos tipos diferentes de microorganismos
El biodeterioro dependeráde los microorganismos existentes
de las condiciones ambientales
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La diversidad más alta se observa entre los microorganismos
ArchaeaBacteria Eukarya
Euryarchaeota
Crenarchaeota
Animals
Fungi
Plants
Ciliates
Flagellates
Slimemolds
Entamoebae
Trichomonads
Diplomonads
Microsporidia
Termotogales
FlavobacteriaCyanobacteria
Purple bacteria
Gram positivebacteria
Green non-sulfurbacteria
Pyrodictium
HaloarchaeaMethanosarcina
Methanobacterium
ThermoproteusThermococales
Methanococcus
Diversidad Microbiana
Arbol universal de formas vivientes basado en secuencias de genes ARN ribosómicos
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Microscopía
Dibujos y microscopio
de Robert Hooke
Hongos
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Cianobacterias
Bacteria y ArchaeaHongos
Microalgas
10 µm
10 µm
Microscopía y Diversidad Microbiana
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Microscopía
Recuentos directosCámaras de recuento
(hemocitómetros o Hausser)
Recuentos directosSobre filtros
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Microscopía
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Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Microbiología clásica ⇒ cultivos
DilucionesMuestra
Most-Probable Number
(MPN)
Placa Petri
Incubación
Recuentos
Sólo detectamos células que somos capaces de cultivar
Cultivos de Microorganismos
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Cultivos de Microorganismos
Métodos de recuento en placa
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Cultivos de Microorganismos
Recuento de “Unidades Formadoras de Colonias” (CFU)
Recuentos totales por Microscopía
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Cultivos de Microorganismos
Cultivo de microorganismos anaerobios estrictos
Cámara de anaerobiosisCultivos anaeróbicos
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Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Cultivo y Aislamiento de microorganismos
Cultivos de Microorganismos
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Cultivos de Microorganismos
1. Detectar microorganismos (“CFU”)
2. Identificar esos microorganismos
(métodos moleculares)
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Cultivos vs. Técnicas Moleculares
Bacterias
cultivablesAmbiente
~1 %Suelos, monumentos
0.1-1 %Ríos y lagos
<0.1 %Mares
Bacterias totales
Número/ml
~108
~106-107
~0.5-1×106
Comparación de recuentos de microorganismos cultivables y totales
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Cultivos vs. Técnicas Moleculares
123
45
67
Técnicas Moleculares
(gen 16S rRNA)
Proteobacteria
ChloroflexiPlanctomycetes
Bacteroidetes
Acidobacteria
Actinobacteria
Técnicas
de cultivo
1234567
Proteobacteria
FirmicutesActinobacteria
Composición de comunidades microbianas de la cueva de Altamira (Cantabria)
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Técnicas Moleculares
Detección de microorganismos cultivables y no cultivables
El fragmento (gen) más utilizado: 16S (18S) rRNA
Universal
Varias copias en cada célula
Secuencia con alto valor filogenético
Buenas bases de datos
Permite fácil identificación
Técnicas moleculares no requieren cultivo de los microorganismos
Disponibilidad de primers y sondas específicas
Extracción de ADN Amplificación específica análisis
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Técnicas Moleculares
ADN
ARN
Proteinas
Información celular. Genoma
Información de los genes
Moléculas funcionales
Transcripción
Traducción
Los ácidos nucleicos (ADN) contienen la información de la célula.
Cuatro bases: Adenina (A), Citosina (C), Guanosina (G), and Timidina (T)
ADN, ARN y proteinas
Azul NRojo OBlanco CAmarillo P
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Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Técnicas Moleculares
1. Extracción de ADN
2. Amplificación de secuencias específicas de ADN
3. Procesar los fragmentos de ADN y “Fingerprints”
4. Identificar los fragmentos de ADN amplificados
Pasos básicos:
5. Otros análisis
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Técnicas Moleculares MuestraExtracción RNA
DNA
cDNA
DNA Amplificado
TranscripcióninversaAmplificación
por PCR
DGGE(“Fingerprint”)
Clonación(genotecas)Screening
Secuenciación
Comparación con bases de datos
Identificación de microorganismosTiempo
Protocolo
paso a paso
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Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Técnicas Moleculares
1. Extracción de ADN
2. Amplificación de secuencias específicas de ADN
3. Procesar los fragmentos de ADN y “Fingerprints”
4. Identificar los fragmentos de ADN amplificados
Pasos básicos:
5. Otros análisis
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Técnicas Moleculares
Muestra
Lisis celular
Extracción con fenol
Lisozima
Extracción con cloroformo
Precipitación con etanol
Disolución
Estimar la concentración de ADN
Detergentes
Proteasa
(1% Sodium Dodecyl Sulfate)
(OD at 260 nm)
(TE buffer, pH 8.0)
(2.5x vol. Ethanol 99% at –20ºC)
(24:1 Chloroform:isoamyl alcohol)
(tamponado pH 8.0)
(0.3-0.4 mg/ml, 37ºC 30 min)
(1.5 mg/ml, 50ºC 3 h)
Dos fases durante las extraccionescon fenol y cloroformo
Fase acuosacon el DNA
Fase inferior
(Suspender en TNE buffer, pH 8.0) Congelación/descongelación(3x)
Extracción de ADN. Método clásico
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Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Técnicas Moleculares
1. Extracción de ADN
2. Amplificación de secuencias específicas de ADN
3. Procesar los fragmentos de ADN y “Fingerprints”
4. Identificar los fragmentos de ADN amplificados
Pasos básicos:
5. Otros análisis
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Técnicas Moleculares
Objectivo:
Generar muchas copias de las secuencias de interés
Pares de primers para la amplificación del gen rRNA:
PCR o “Polymerase-chain reaction”
Bacteria:
Archaea:
27F AGA GTT TGA TCC TGG CCA G
1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T
2OF TTC CGG TTG ATC CYG CCR G
1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T
Eucariotas: 21F AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT
1392R ACG GGC GGT GTG TRC
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Técnicas Moleculares
Desnaturalización (95ºC)
Annealing(40-65ºC)
Extensión (72ºC)
25-35 ciclos
Multiples copias de lasecuencia específica
DNA (doble hebra)PCR
“Polymerase-chain reaction”
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Técnicas Moleculares
PCR o “Polymerase-chain reaction”
Componentes de la reacción
ADN molde
Tampón (Buffer)
MgCl2
Primer “Forward”
Primer “Reverse”
DNA polimerasa
H2O
10-100 ng
1x; pH 7.5-9.5
1.5 (1-5) mM
0.1-1 µM
0.1-1 µM
0.25-2 u.
1 µl
5 µl
0-5 µl
1 µl
1 µl
0.2-1 µl
hasta 50 µl
10 x
50 mM
20-50 µl
20-50 µl
1-5 u/µl
Componentes Concentración final Volumen Stocks
dNTPs 0.2 mM 1 µl 10 mM
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Técnicas Moleculares
El número de copias aumenta exponencialmente en cada ciclo
Copias = (Número de copias inicial)2 n
n = Número de ciclos
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Técnicas Moleculares
Examinando productos de PCR
Geles de agarosa (1% en 0.5x TAE)
Marcador detamaño
Productosde PCR
Unos 5 µl de la solución de amplificación + 1 µl solución de carga por pocillo
El ADN se tiñe con Bromuro de Etidio o SYBR Green I
Transiluminador
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Técnicas Moleculares
1. Extracción de ADN
2. Amplificación de secuencias específicas de ADN
3. Procesar los fragmentos de ADN y “Fingerprints”
4. Identificar los fragmentos de ADN amplificados
Pasos básicos:
5. Otros análisis
A. Perfiles de comunidades microbianas (Fingerprints). DGGE
B. Clonación
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Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Técnicas Moleculares
Visualizar la diversidad microbiana en la muestra
Existen diferentes técnicas:
Muy útil para comparar comunidades de distintas muestras
Util para seleccionar bandas características
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis)
T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisms)
SSCP (Single Strand Conformational Polymorphisms)
Perfiles de comunidades microbianas (“Fingerprints”)
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Técnicas Moleculares
DGGE o “Denaturing Gradient Gel Electrophoresis”.
Separación en gradiente químico (urea y formamida)