Métodos de identificación bacteriana Identificación fenotípica • Tinción de Gram • Morfología celular • Motilidad • Tolerancia al oxígeno • Morfología de colonia • Tipificación bioquímica • Perfiles de proteínas celulares Identificación genética • Hibridaciones DNA - DNA • PCR • Secuenciación 16 S rRNA
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Métodos de identificación bacteriana - Universidad Nac · Métodos de identificación bacteriana Identificación fenotípica •Tinción de Gram ... determinación y posterior seguimiento
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Métodos de identificación bacteriana
Identificación fenotípica•Tinción de Gram•Morfología celular•Motilidad•Tolerancia al oxígeno•Morfología de colonia•Tipificación bioquímica•Perfiles de proteínas celulares
Secuencia consecutiva de métodos de “microbiología tradicional” que en conjunto llevan a la identificación de especies bacterianas en cultivo; mediante la determinación y posterior seguimiento de sus características fenotípicas y metabólicas a través de diagramas de flujo de identificación aceptados
Aplicación • Identificación y cuantificación de especie cultivable previamente caracterizadas o de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas• Permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana posteriores o
en paralelo a la identificación• Es posible realizar la cuantificación de las especies evaluadas
Desventajas
En comparación a la identificación genética:• Más laborioso• Mayor tiempo y costo• Difícil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Subestimación de especies fastidiosas• No permite la identificación de especies no-cultivables
Identificación fenotípica- Diagrama de flujo
Tinción de Gram
Morfología celular
Motilidad
Tolerancia al O2
Morfología de colonia
Tipificación bioquímica
Perfiles de proteínas celulares
Gram positivo
Gram negativo
Identificación fenotípica- Tinción de Gram
Identificación fenotípica- Morfología celular
Coco
Bacilo
PleomórficoEspirilo
•Sin motilidad•De nado (Swimming)•De deslizamiento (Glidding)•En espasmos (Twitching)
•Fermentación de carbohidratos•Productos terminales•Catalasa•Oxidasa•Coagulasa•Reacciones de aglutinación
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)
Identificación fenotípica- Perfiles de proteínas celulares
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la detección de fragmentos cortos de DNA marcados (sondas) tras su enlace a moléculas de DNA complementarias en una muestra (templete)
Aplicación • Identificación y cuantificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Capacidad para evaluar mayor número de especies y muestras
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Permite la identificación de especies no-cultivables
En comparación a otras pruebas genéticas:• Es posible cuantificación las especies evaluadas
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificaciónEn comparación a otras pruebas genéticas:
• Menor sensibilidad y especificidad
•Sonda: fragmento de DNA marcado con una molécula reportadoraque permite su detección después de la hibridación
•Molécula ReportadoraRadioactiva: Isótopos con emisiones β (generalmente P32)No-Radioactiva: Digoxigenina, Fluorescina, Biotina, etc.
•Especificidad: determinada por el diseño de la sonda•Sensibilidad: determinada por el tipo y concentración de la sonda
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la amplificación de porciones específicas de DNA en una muestra (templete)
Aplicación • Identificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Mayor sensibilidad
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Permite la identificación de especies no-cultivables
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificaciónEn comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:
• No permite la cuantificación de especies (excepto PCR en tiempo real)En comparación a hibridaciones DNA-DNA:
• Bajo número de especies evaluadas
PCR
Métodos genéticos- PCR
•Ciclos repetitivos de desnaturalización, alineamiento de primers yextensión para producir múltiples copias de una secuenciadeterminada de DNA
•Especificidad: determinada por el diseño de los primers•Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula
Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA
DefiniciónMétodo no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la determinación de la secuencia en el DNA de la fracción 16S rRNA en una muestra (templete) y su posterior comparación con secuencias publicadas
Aplicación • Identificación de cualquier microorganismo a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:• Mayor especificidad
En comparación a la identificación fenotípica:• Menor tiempo y costo• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de
especies fastidiosas• Permite la identificación de especies no-cultivables
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo
a la identificaciónEn comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:
• No permite la cuantificación de especiesEn comparación a hibridaciones DNA-DNA:
• Bajo número de especies evaluadas
Secuenciación 16S rRNA
Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA