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METODOLOGA PARA LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINO
CARNE
Jos Denis Osuna Amador, No de Jess Medina Crdova, Sandra Luz
Velzquez Alcal, Ricardo Ortega Prez, Jos Luis Espinoza
Villavicencio
Centro de Investigacin Regional del Noroeste Campo Experimental
Todos Santos La Paz, Baja California Sur, Mxico. Julio de 2014
Folleto Tcnico Nm. 12 ISBN: 978-607-37-0263-8
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Tiraje: 500 ejemplares
La impresin de la presente publicacin y la informacin contenida
en esta, se realiz con el apoyo otorgado al INIFAP durante el
proceso de
investigacin por la Fundacin Produce Baja California Sur,
A.C.
www.gobiernofederal.gob.mx www.sagarpa.gob.mx
www.inifap.gob.mx
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SECRETARA DE AGRICULTURA, GANADERA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y
ALIMENTACIN
Lic. Enrique Martnez y Martnez Secretario
Lic. Jess Aguilar Padilla Subsecretario de Agricultura y
Ganadera
Lic. Arturo Osornio Snchez Subsecretario de Desarrollo Rural
Lic. Ricardo Aguilar Castillo Subsecretario de Alimentacin y
Competitividad
Lic. Marcos Bucio Mujica Oficial Mayor
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES,
AGRCOLAS Y PECUARIAS
Dr. Pedro Brajcich Gallegos Director General
Dr. Manuel R. Villa Issa Coordinador de Investigacin, Innovacin
y Vinculacin
M.Sc. Arturo Cruz Vzquez Coordinador de Planeacin y
Desarrollo
Dr. Eduardo Francisco Berterame Barqun Coordinador de
Administracin y Sistemas
CENTRO DE INVESTIGACIN REGIONAL DEL NOROESTE
Mtro. Jorge Alberto Senz Flix Director Regional
Dr. Jess Arnulfo Mrquez Cervantes Director de Investigacin,
Innovacin y Vinculacin
Dr. Ramn Antonio Armenta Cejudo Director de Planeacin y
Desarrollo
Lic. Jos Silva Constantino Director de Administracin
CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS
M.C. Jos Denis Osuna Amador Director de Coordinacin y Vinculacin
del INIFAP en B.C.S.
Jefe del Campo Experimental Todos Santos
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INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRCOLAS Y
PECUARIAS
CENTRO DE INVESTIGACIN REGIONAL NOROESTE CAMPO EXPERIMENTAL
TODOS SANTOS
Metodologa para la transferencia de embriones en ganado
bovino
M.C. Jos Denis Osuna Amador Director de Coordinacin y Vinculacin
del INIFAP en B.C.S.
M.C. No de Jess Medina Crdova
Investigador del C.E. Todos Santos
Ing. Sandra Luz Velzquez Alcal Investigador del C.E. Todos
Santos
Dr. Ricardo Ortega Prez
Profesor-Investigador, Departamento Acadmico de Zootecnia,
UABCS
Dr. Jos Luis Espinoza Villavicencio
Profesor-Investigador, Departamento Acadmico de Zootecnia,
UABCS
La Paz, Baja California Sur, Mxico Julio de 2014
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Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y
Pecuarias Progreso No. 5 Barrio de Santa Catarina Delegacin
Coyoacn. C.P. 04010, Mxico, D.F. Telfono: (55)-3871-8700
Primera edicin 2014 ISBN: 978-607-37-0263-8 La presente
publicacin se termin de imprimir en el mes de julio de 2014, en la
imprenta Ciudad de Los Nios, calle Revolucin S/N entre 5 de Febrero
y Cuauhtmoc, Colonia Pueblo Nuevo. La Paz, Baja California Sur,
Mxico. C.P. 23060. Telfono: (612) 122-0327, 122-9595. No est
permitida la reproduccin total o parcial de esta publicacin, ni la
transmisin de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea
electrnico, mecnico, fotocopia, por registro u otros medios, sin el
permiso previo y por escrito de la institucin.
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CONTENIDO
Pgina I.
Introduccin................................................... II.
Biotecnologas reproductivas.................... III. Seleccin de
donantes................................
Criterios genticos..........................................
Criterios no genticos.....................................
IV. Manipulacin del ciclo estral......................
Superovulacin de donantes.......................... V.
Transferencia de embriones........................
Tcnicas de recoleccin.................................
Identificacin de los embriones...................... Estadios de
desarrollo del embrin................ Calificacin de los
embriones......................... Tcnica de
transferencia................................ Conservacin de
embriones...........................
VI. Manejo de las receptoras...........................
Caractersticas de las receptoras.................. Sincronizacin
de receptoras........................ Sincrona
donante-receptora.........................
VII. Resultados y recomendaciones.............. VIII. Literatura
citada.......................................
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10 10
14 15 16 17 19 21 24
26 26 27 28
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I. Introduccin
El mejoramiento gentico ha jugado un papel esencial en el
desarrollo de la ganadera, el cual consiste en aplicar principios
biolgicos, econmicos y matemticos, con el fin de encontrar las
estrategias ptimas para aprovechar la variacin gentica de los
animales y con ello maximizar su calidad, siendo la identificacin y
el uso de registros las herramientas que ms han impactado en sta,
adems de la evaluacin y seleccin de animales, y la distribucin del
material gentico seleccionado mediante tecnologas reproductivas
como la inseminacin artificial y transferencia de embriones. En
Baja California Sur la obtencin de animales de alta calidad gentica
para incrementar la produccin de carne y leche, se ha hecho
importando animales a costos elevados, en ocasiones con limitada
adaptacin y con resultados en mejora gentica a largo plazo. Al
respecto, la transferencia de embriones permite acelerar el
mejoramiento gentico del ganado ya que tambin se aprovecha la
gentica del lado materno, lo cual disminuye el intervalo entre
generaciones y favorece el proceso de seleccin obteniendo un gran
nmero de progenie de donadoras valiosas. Por lo anterior, en el
presente documento se describen las caractersticas y procedimientos
bsicos para desarrollar e implementar la tecnologa de transferencia
de embriones en forma adecuada.
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II. Biotecnologas reproductivas
La transferencia de embriones (TE) y la inseminacin artificial
(IA) son las tecnologas reproductivas ms utilizadas en los sistemas
de produccin, sin embargo, a pesar de sus beneficios en los
programas de mejoramiento gentico, la proporcin de animales
incluidos en ellas es an muy bajo en Amrica Latina. En Mxico, en
zonas especializadas en produccin de leche, el porcentaje de
vientres tratados con estas tecnologas no supera el 50%, esto
atribuido principalmente a motivos econmicos, culturales, as como
la falta de capacitacin de productores y tcnicos, siendo la
deteccin de celos uno de los factores ms importantes que influye en
su efectividad. En trminos generales la TE consiste en recolectar
los embriones de una hembra donante y transferirlos a una hembra
receptora, la cual se encarga de servir como madre sustituta
durante la preez. Se requiere de precisin mediante el uso de
gonadotropinas para inducir la superovulacin en la donante, y
sincronizar a las futuras receptoras para que estn en celo y ovulen
al mismo tiempo que las donantes, siendo la implementacin de
protocolos de sincronizacin del celo y ovulacin, herramientas
necesarias para el xito de la tecnologa. Para obtener una cra por
vaca por ao, es obligatorio que en un periodo de no ms de tres
meses posparto la vaca reinicie sus ciclos reproductivos normales e
inicie una nueva gestacin. Es importante la correcta deteccin de
celos para obtener buenos resultados, tomando en consideracin que
la duracin del ciclo
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estral en bovinos es de 18 a 23 das, y la oportunidad de
servicio solo de 12 a 18 horas. Para lograr tasas de concepcin
aceptables, tanto el espermatozoide como el embrin deben ser
depositados en el sitio y momento correcto con relacin a la
ovulacin de la hembra, por ello es necesario el conocimiento de
tres factores: 1) fisiologa del ciclo estral de la vaca, 2)
productos farmacolgicos y sus efectos sobre el ciclo estral de la
vaca, y 3) factores de manejo del hato que reduzcan el anestro e
incrementen las tasas de preez. III. Seleccin de donantes Es
importante seleccionar de manera adecuada a los animales que sern
designados como donantes, ya que esto influir directamente en el
nmero de embriones viables de un programa de TE. Es poco probable
encontrar una vaca donante que cubra todas las necesidades de un
ganadero y que adems se adapte a las distintas situaciones y
necesidades del mercado, por ello es necesario tomar en cuenta
ciertos criterios que se pueden utilizar para mejorar la gentica
del hato y hacer ms eficiente el proceso de TE. Criterios genticos:
Previo al tratamiento de superovulacin de una donante es
indispensable conocer su capacidad de transmisin. Un problema es
superovular vacas que no poseen las caractersticas genticas
deseables y que aparentan un mayor valor gentico del que poseen
realmente.
Es importante tomar en cuenta caractersticas productivas como la
buena fertilidad, facilidad de parto,
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buena habilidad materna, pesos al nacimiento, al destete, al ao;
adems de las caractersticas morfolgicas de mayor importancia, entre
estas: apariencia general, miembros y aplomos, tamao y forma de la
ubre. Se recomienda crear un grupo de donantes de lite que contenga
del uno al cinco por ciento de los animales presentes en el hato,
para asegurar un progreso gentico adecuado. Entre mayor sea la
variabilidad gentica de la poblacin de animales, resultar ms
interesante el uso de la TE y por lo tanto se conseguir una mayor
optimizacin del valor del semen a utilizar. Criterios no genticos:
Al decidir el momento de la superovulacin, se deben tomar en cuenta
los factores relacionados con el individuo as como tambin los
ligados al hato. Cuando se hayan seleccionado las vacas
genticamente superiores, es necesario llevar a cabo una segunda
seleccin haciendo nfasis en las caractersticas reproductivas. Es
importante seleccionar animales sin antecedentes patolgicos como
abortos, retenciones placentarias y quistes, debido a que estos
afectan la adecuada produccin de embriones, si bien es deseable que
los animales propuestos para la superovulacin no presenten una
media superior a las tres inseminaciones por gestacin, en el caso
de animales de gran valor, pueden ser utilizados como donantes, ya
que aunque la respuesta esperada puede reducirse al 50%; estos sern
igual de frtiles que los de los animales no repetidores. Para tener
la seguridad de que la funcin ovrica normal se ha restablecido, se
recomienda detectar dos a tres ciclos estrales completos y
regulares
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posparto, lo que conlleva a un intervalo parto superovulacin
mnimo de 60 a 90 das, siendo el ptimo de 90 a 120 das. Se debe
diagnosticar el estado ginecolgico de la donante a travs de una
exploracin rectal, para detectar la presencia de un buen cuerpo
lteo (CL), de buena conformacin y el tracto genital sin
apreciaciones patolgicas. La seleccin de los machos debe ser entre
aquellos de alta y probada fertilidad, que mejoren los defectos de
la hembra donante y tratando de evitar el uso de animales que
produzcan cras de gran tamao, cuando se vaya a utilizar en
vaquillas como receptoras.
a) Factores ligados al individuo: La edad es un factor
importante, siendo la ptima entre los dos y cinco aos. En el
caso de las vaquillas, la superovulacin se puede realizar a partir
de los 14-15 meses de edad, para ello es importante que los
animales presenten un buen desarrollo y una condicin corporal
adecuada.
En vacas en produccin, el tiempo entre el parto y la
superovulacin est relacionado con el estado reproductivo de la
donante, es decir cuando el aparato reproductor est en perfectas
condiciones (alrededor del da 60 posparto), adems de haberse
observado ms de un celo a intervalos regulares; de esta manera se
considera que el momento ideal para superovular est entre los 90 y
120 das posparto.
b) Factores ligados al hato: La nutricin influye directamente en
el tiempo transcurrido entre el parto y la superovulacin de la
donante, as como tambin
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en el porcentaje de vacas que responden al tratamiento y en la
cantidad y calidad de los embriones obtenidos. La vaca elegida como
donante debe tener una ptima condicin corporal, procurando que no
estn ni gordas ni flacas, es decir con una condicin de 5 en la
escala del 1 al 9. Se debe iniciar con una adecuada alimentacin de
las donantes mucho antes de que se programe la superovulacin,
debido a que las fallas cometidas incluso siete u ocho meses antes
se ven reflejadas en la respuesta.
Los factores estresantes como los cambios bruscos en el manejo o
la aplicacin de tratamientos preventivos como vacunaciones, pueden
afectar la respuesta superovulatoria; asimismo, hacerlo en los
meses ms calurosos.
Otro componente de vital importancia es el ganadero o tcnico a
cargo de la explotacin, puesto que est en sus manos todo el manejo
de los animales y en gran medida el xito de la TE. Debe ser
eficiente en la deteccin de celos, ya que de esto depende el inicio
de la superovulacin, as como la inseminacin de la donante y la
posterior implantacin de los embriones en las receptoras. La
presencia de errores en la deteccin de celos, se ver reflejada en
la viabilidad de los embriones el da de la colecta, as como en el
nmero de gestaciones despus de la transferencia.
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IV. Manipulacin del ciclo estral
Para obtener buenos resultados en la TE, es necesaria la
observacin de celos al menos dos veces por da, lo que dificulta la
eficiencia de la tecnologa. La manipulacin del ciclo estral para
que un grupo de hembras previamente seleccionadas presenten celo y
ovulen en un determinado periodo de tiempo, ha estimulado el
desarrollo de varias lneas de investigacin. Actualmente existe un
gran nmero de protocolos con caractersticas distintas que presentan
ventajas y desventajas, por ello es importante conocer la fisiologa
reproductiva del bovino, para determinar el mtodo que ms se adapte
a nuestras necesidades. Superovulacin de donantes: El fundamento de
los tratamientos superovulatorios es producir una gran cantidad de
ovulaciones y obtener la mayor cantidad de embriones transferibles
en un solo ciclo reproductivo, lo cual se traduce en altas
probabilidades de preez. No obstante la respuesta a estos
tratamientos es muy variable e impredecible, lo que genera una
serie de problemas que afectan tanto la eficiencia como la
rentabilidad en los programas de TE. Son varios los factores que
influyen en la respuesta a los tratamientos superovulatorios y la
produccin de embriones viables de una vaca donante, entre los que
destacan los relacionados con el tipo de tratamiento
superovulatorio, factores individuales y los ligados al ambiente
(Cuadro 1).
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Cuadro 1. Factores que afectan la respuesta superovulatoria de
una donante.
Factores relacionados con el tratamiento
Factores inherentes al animal y su ambiente
Momento de inicio del
tratamiento en relacin con el ciclo estral
Tipo de gonadotropina usada Lotes de gonadotropinas Relacin
hormona
folculoestimulante (FSH) y hormona luteinizante (LH) de los
preparados comerciales
Duracin del tratamiento Dosis total de gonadotropinas Va de
administracin de las
gonadotropinas Uso de hormonas adicionales
Estado nutricional Historia reproductiva Edad de la donante
Estacin del ao Raza Causas genticas o fisiolgicas Repeticin de
tratamientos
superovulatorios
El esquema tradicional de superovulacin (Cuadro 2) comienza el
tratamiento con gonadotropinas entre los das ocho y diez del ciclo
estral, aproximadamente cuando comienza la segunda onda de
crecimiento folicular. Las gonadotropinas ms utilizadas son
extractos de pituitaria porcina u ovina, o gonadotropina corinica
equina (eCG). Los extractos de pituitaria contienen altas
cantidades de FSH y cantidades variables de LH, dependiendo del
producto. Generalmente, los tratamientos consisten en dosis
decrecientes o constantes durante cuatro o cinco das, y se
prefieren los extractos con bajo contenido de LH porque producen
embriones de mejor calidad. La eCG tiene una vida media de 40 horas
en la vaca y persiste por ms de 10 das en la circulacin sangunea;
por ello normalmente se administra en una sola dosis
intramuscular.
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Adems de la administracin de gonadotropinas, la donante recibe
una dosis luteoltica de prostaglandinas (PGF2) a las 48 horas
despus de comenzado el tratamiento superovulatorio, y regularmente
presenta celo de 36 a 48 horas pos aplicacin de la PGF2. En caso de
transferir embriones frescos, las receptoras debern ser tratadas
con PGF2 de 18 a 24 horas antes que las donantes, de manera que el
estro de las receptoras coincida con el de las donantes.
Cuadro 2. Esquema de tratamiento de superovulacin en
bovinos.
Da 0 Deteccin de celo de la donante Da 9 am Comienzo de la
superovulacin-donante
Da 10 medioda Inyeccin de PGF2 -Receptoras
Da 11 am Inyeccin de PGF2 -Donante
Da 13 am Celo de donante y receptora Da 13 pm Primera IA-Donante
Da 14 am Segunda IA-Donante
Da 20 Recoleccin de embriones en la donante y congelado o
transferencia en receptoras
Para optimizar los resultados, los tratamientos superovulatorios
deben iniciarse al comienzo de una onda de desarrollo folicular,
antes de la seleccin del folculo dominante, por lo que es
recomendable controlar la dinmica folicular y comenzar los
tratamientos en el momento ms oportuno.
Existen diversos mtodos para controlar la dinmica folicular del
bovino. La mayora se han orientado hacia la disminucin del efecto
del folculo dominante (por mtodos fsicos u hormonales), lo que
permite el comienzo de una nueva onda folicular en un determinado
periodo de tiempo. Por otra parte, un mtodo fsico es la aspiracin
de los folculos mediante
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ultrasonografa transvaginal, dando como resultado el comienzo de
una nueva onda folicular alrededor de un da y medio despus. El
tratamiento superovulatorio consiste en la aspiracin de todos los
folculos presentes o la aspiracin del folculo dominante (cuando las
vacas estn entre los das cinco y ocho del ciclo) dos das antes de
la aplicacin de las gonadotropinas. El resto del tratamiento es
similar a los tratamientos convencionales.
Los tratamientos hormonales ms utilizados incluyen el uso de
estrgenos y progestgenos, debido a que en cualquier momento del
ciclo estral inducen el crecimiento sincrnico de una nueva onda
folicular aproximadamente cuatro das despus. El intervalo entre el
tratamiento y el inicio de la superovulacin es de cuatro das si
utilizamos estradiol-17 o benzoato de estradiol (EB) combinados con
una inyeccin de progesterona (P4) en el momento que se coloca el
dispositivo con P4. De los estrgenos disponibles en el mercado se
obtienen mejores resultados con el EB que con el valerato de
estradiol (EV). Este procedimiento es simple, fcil de llevar a cabo
por el personal, no depende de la deteccin de celos, y permite
producir cantidades similares o superiores de embriones de calidad
que con los tratamientos tradicionales, iniciados a los nueve das
del celo. El tratamiento previo tiene la ventaja de que en l es
posible elegir el momento adecuado para realizar la recoleccin, y
de esta manera programar grupos de donantes para recolectar al
mismo tiempo. Esto sin duda facilita la aplicacin de la tcnica de
transferencia de
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embriones y disminuye los costos, ya que permite elegir el
momento de la recoleccin y armar circuitos eficientes de trabajo.
V. Transferencia de embriones
La tcnica de TE ha sido usada en casi todos los animales
domsticos, y en muchas especies salvajes y exticas. Fue a
principios de la dcada de los 70s cuando comenz el gran inters
comercial en la TE en el bovino. Las razas europeas de doble
propsito eran importadas a Norteamrica, y dada su escasez eran
extremadamente valiosas. Como resultado, exista gran incentivo
econmico para la aplicacin de la TE; los criadores queran un mtodo
que aumentara el porcentaje reproductivo de sus hembras para una
provechosa venta de su descendencia. En consecuencia, el uso de la
tcnica en animales domsticos fue desarrollada con dinero de los
criadores, ms que con fondos para la investigacin. Despus de la IA,
la TE se ha convertido en la herramienta ms poderosa para el
mejoramiento animal. Varios pases han incorporado programas de TE
dentro de los programas de progenie, como ayuda para el
mejoramiento gentico en ganado productor de carne y leche. La
tcnica de TE comprende varios pasos: 1. La sincronizacin de
donantes y receptoras, 2. La superovulacin de las vacas
donantes,
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3. La doble IA de las donantes, 4. La coleccin de los embriones,
5. La identificacin, clasificacin y calificacin de los
embriones, 6. La transferencia del embrin a la receptora, y 7.
El manejo previo y posterior de las receptoras. Tcnicas de
recoleccin: Estas consisten en el lavado interno de los cuernos
uterinos. Siete das despus de la IA de la donante, los embriones
son recolectados con la ayuda de un catter que es introducido en el
tero por la vagina y el crvix. Existen varias clases de catteres
para la recoleccin: Foley de dos vas, Foley de tres vas, el modelo
Neustadt/Aisch o modificaciones de los mismos realizadas por
distintos proveedores. Los catteres ms usados son los Foley de dos
y tres vas. Se pueden utilizar una gran variedad de medios de
recoleccin, pero el ms popular actualmente es el Dulbeccos Fosfato
Buffer Salino (DPBS), debido a que tiene fosfato como buffer, y su
pH cambia en forma mnima al ser expuesto a la atmsfera. Un medio de
cultivo de embriones ideal ser aquel que se asemeje fsica y
qumicamente al medio en que se encontraban los embriones al momento
de ser recolectados. Los embriones mamferos estn altamente
adaptados al medio uterino de la madre, por lo que se hace
imprescindible mantenerlos en condiciones ptimas. El pH debera
mantenerse a 7.4 + 0.5, y la osmolaridad (concentracin de sales) en
285-300 miliosmoles/l.
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En sntesis, podemos decir que siete das despus de que la donante
fue detectada en celo e inseminada artificialmente, estamos en el
momento ptimo para recolectar los embriones. Lo ideal es trabajar
con grupos de cuatro o cinco donantes por da por la variabilidad de
la respuesta superovulatoria. No es recomendable trabajar con una
sola donante por da.
Los ovarios de la donante deben ser palpados (o examinados por
ultrasonografa) para estimar la respuesta al tratamiento
superovulatorio. Es mejor comenzar con las que tienen mayor
respuesta para poder organizar la transferencia de los embriones
frescos y el congelado, en caso de tener ms embriones que
receptoras. El medio de recoleccin es vertido al filtro especial
Emm-com con una malla de 50 m que permite el paso del medio y no de
los embriones. Finalizando el filtrado se lava la malla del filtro
con PBS utilizando una jeringa y agua fina; el fluido es
recolectado en una caja de Petri y se procede a la bsqueda de los
embriones.
Identificacin de los embriones: El dimetro de un ovocito es de
aproximadamente 150-190 m, incluyendo el espesor de la zona pelcida
(12-15 m). El dimetro del ovocito permanece prcticamente sin
variacin desde el estado de clula hasta el estado de blastocisto
expandido (Figura 1).
Figura 1. Bsqueda e identificacin de embriones
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El nmero de clulas de un embrin puede ser contado sin dificultad
hasta el estado de 16 clulas. Cuando el embrin alcanza el estado de
32 clulas se produce la compactacin en la cual los blastmeros
pierden su forma esfrica y comienzan a adherirse entre ellas. En
este estado el embrin recibe el nombre de mrula.
Luego los blastmeros comienzan a diferenciarse, y dan origen a
dos tipos de clulas, las clulas del trofoblasto y la masa de clulas
interna o macizo celular interno (MCI). Las primeras darn origen a
la placenta, y el MCI dar origen al feto. A partir de ese momento
comienza a formarse una cavidad interna que se denomina blastocele
y el embrin comienza a denominarse blastocisto. Es ms fcil
distinguir el MCI cuando el embrin se encuentra en el estado de
blastocisto, que en el estado de mrula.
La individualizacin de embriones de ocho a diez das de edad es
difcil, ya que el embrin eclosiona y la zona pelcida se pierde
durante estos das. La zona pelcida refleja la luz del microscopio y
se observa como una estructura transparente que rodea la masa
celular dejando un espacio vaco denominado espacio perivitelino,
que es identificable hasta el estadio de blastocisto. El color de
los blastmeros es ms oscuro que el debris celular, lo que facilita
la bsqueda. Una buena prctica es mover el debris celular y mucus
que se encuentran en la placa, ya que los embriones tienden a
adherirse a ella.
Estadios de desarrollo del embrin: En las primeras etapas se
denominan de acuerdo al nmero de clulas: dos clulas, seis clulas,
ocho clulas, hasta 16 clulas, despus se nombran de manera
distinta.
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Mrula (estadio tres): Su aspecto se asemeja al de una mora, los
blastmeros son poco visibles, la mayor parte del espacio
perivitelino la ocupa la masa de clulas (embrin) y la edad estimada
es de cuatro a cinco das. Mrula compacta (estadio cuatro): Los
blastmeros se unen y forman una masa compacta. El embrin ocupa el
60-70% del espacio perivitelino (edad estimada 5 a 6 das).
Blastocisto temprano (estadio cinco): Se observa una cavidad con
fluido o blastocele, aparentando un anillo de sello. El 70-80% del
espacio perivitelino lo ocupa el embrin el trofoblasto y el macizo
celular interno se pueden diferenciar en forma visual (edad
estimada siete das). Blastocisto (estadio seis): La diferencia
entre el trofoblasto externo y el macizo celular interno se vuelve
ms obvia (ms oscuro), claramente se observa el blastocisto y el
embrin ocupa casi por completo el espacio perivitelino (edad
estimada siete a ocho das). Blastocisto expandido (estadio siete):
El tamao se incrementa 1.2 a 1.5 veces, la zona pelcida se adelgaza
aproximadamente una tercera parte con respecto al grosor original,
en esta etapa los embriones se pueden encontrar colapsados (edad
estimada ocho a nueve das). Blastocisto eclosionado (estadio ocho):
Se puede observar al embrin en proceso o totalmente fuera de la
zona pelcida, los blastocistos eclosionados son
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esfricos con el blastocele bien desarrollado (nueve a diez das).
Calificacin de los embriones: Se realiza para evaluar la calidad
del embrin, basndose en las caractersticas morfolgicas, son
subjetivas y dependen principalmente de la experiencia del tcnico.
El mejor indicador para determinar la calidad de los embriones, es
la tasa de preez obtenida despus de ser transferidos. Sin embargo
las caractersticas ms importantes a tomar en cuenta para otorgar
una calificacin a un embrin son:
1. Forma del embrin. 2. Color y textura de la masa celular. 3.
Nmero y compactado de los blastmeros. 4. Diferencia de tamao entre
blastmeros. 5. Tamao del espacio perivitelino. 6. Presencia de
blastmeros sueltos, degenerados, o
detritus celular. 7. Presencia, nmero y tamao de vesculas
(indican
degeneracin). 8. Apariencia de la zona pelcida.
De acuerdo con la Sociedad Internacional de Transferencia de
Embriones (IETS), la clasificacin y calificacin de los embriones es
la siguiente:
a. Estadio de desarrollo
1= Infertilizado. 2= De 2 a 12 clulas. 3= Mrula temprana. 4=
Mrula.
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5= Blastocisto temprano. 6= Blastocisto. 7= Blastocisto
expandido. 8= Blastocisto eclosionado. 9= Blastocisto eclosionado
en expansin.
b. Calidad 1= Excelentes o buenos (esfrico, simtrico, clulas
uniformes). 2= Regulares (imperfecciones ligeras, blastmeros
extruidos, vesculas). 3= Malos (alteraciones ms severas, vesculas,
clulas degeneradas). 4= Muertos o degenerados.
Los embriones deben ser transferidos antes de su salida de la
zona pelcida que suele ocurrir alrededor del da nueve o diez, es
decir aquellos que se encuentran en estado de mrula o blastocisto.
Los embriones de calidad uno resultan los mejores para congelar y
son los ms comercializados; los de calidad dos resultan en buenos
porcentajes de preez si se les transfiere frescos, pero los
resultados de preez son menores cuando se les congela. Los de
calidad tres no deben ser congelados, y tienen ndices de preez
regulares a malos si son transferidos frescos. La calidad de los
embriones es una de las variables que condicionan los resultados.
Si se tiene control sobre la condicin corporal y la sincrona de la
receptora, una buena calificacin de los embriones nos permitir
predecir el porcentaje de preez a obtener con la
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transferencia. Se pueden obtener porcentajes de preez de entre
40 y 60% con embriones frescos y congelados. Tcnica de
transferencia: El mtodo no quirrgico de transferencia es usado con
mucho xito por la mayora de los tcnicos. Generalmente se utilizan
pajillas francesas de 0.25 ml, un pipeta desechable de plstico con
punta metlica y descarga lateral (IMV, Francia), y una pistola para
TE (IMV, Francia) (Figura 2).
Figura 2. Preparacin de pistola para transferencia de
embriones
La hembra receptora se ubica en una trampa y se procede a la
palpacin para ubicar el ovario que contiene el cuerpo lteo (Figura
3). Despus se administra anestesia epidural baja (xilocana al 2%) y
se limpia la regin perineal y la vulva.
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Figura 3. Identificacin de ovario con cuerpo lteo
El embrin se coloca dentro de una pajilla esterilizada (0.25 ml)
de la siguiente forma (Figura 4):
a. Aspiracin de un pequeo volumen de medio de
mantenimiento. b. Aspiracin de una burbuja de aire. c. Aspiracin
de un pequeo volumen de medio de
mantenimiento. d. Aspiracin de una burbuja de aire. e. Aspiracin
del embrin con un pequeo volumen
de medio de mantenimiento. f. Aspiracin de una burbuja de aire.
g. Aspiracin de un pequeo volumen de medio de
mantenimiento. h. Aspiracin de una burbuja de aire. i. Aspiracin
de medio de cultivo hasta llenar la
pajilla.
Figura 4. Metodologa para cargar el embrin en una pajilla para
su
posterior transferencia o conservacin
-
23
La primera columna de medio humedece el algodn y el alcohol
polivinlico del extremo cerrado de la pajilla, esto para que un
lado permanezca sellado y no permita la salida del embrin antes de
ser transferido. La pajilla con el embrin se coloca dentro de la
pistola de TE, y sta dentro de la pipeta plstica. Para depositar el
embrin en la hembra receptora se puede utilizar la tcnica recto
cervical, procurando realizar este procedimiento con la mayor
rapidez posible, en el caso de una persona diestra se introduce la
mano izquierda, el tcnico sujeta el crvix a travs de la pared del
recto. La pipeta se introduce en el canal cervical, y
posteriormente se introduce en el cuerno ipsilateral al CL. El
embrin es depositado en el tercio anterior del cuerno uterino. La
pistola es removida suavemente y se retira la mano del recto
(Figura 5).
Figura 5. Depsito de embrin en hembra receptora mediante la
tcnica recto cervical Con la tcnica se pueden obtener buenos
porcentajes de preez (60% con embriones frescos y 40 a 50% con
embriones congelados), siempre y cuando las receptoras estn sanas,
con ciclos reproductivos normales y con buen estado nutricional.
Normalmente, una vaca promedio produce por tratamiento
-
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superovulatorio entre 10 y 12 ovulaciones con 8 a 10 embriones
recuperados, de los cuales cinco o seis son transferibles, lo que
resulta en tres o cuatro posibles cras. Un ltimo factor a tomar en
cuenta en la TE es el factor humano, de tal manera que las tasas de
fertilidad pudieran variar de un 20% a un 60% segn la habilidad de
cada tcnico. As pues, la experiencia del operador es fundamental no
solo en la palpacin, sino en la transferencia para evitar cualquier
dao a la receptora y as conseguir el mayor nmero de
gestaciones.
Conservacin de embriones: Una vez obtenidos los embriones, podrn
ser transferidos a las hembras receptoras, debidamente preparadas
con antelacin, tan pronto como sea posible. Sin embargo, los
embriones tambin pueden ser conservados a bajas temperaturas (0C -
4C), sin que se aprecie una prdida de viabilidad en las primeras 24
horas, decreciendo en un 50% a las 48 horas y se pierde totalmente
a las 120 horas. Por lo tanto, la congelacin a -196C es la mejor
opcin para la conservacin y transporte de embriones, esta permite
el mantenimiento de la viabilidad embrionaria por largos perodos de
tiempo y contribuye a incrementar el rendimiento de un programa de
superovulacin al no perder embriones cuando no se dispone del nmero
suficiente de receptoras (Figura 6). Es importante resaltar que
solo los embriones de excelente calidad y con un grado de
desarrollo normal sern adecuados para ser sometidos al proceso de
congelacin. La congelacin es un proceso fsico-
-
25
qumico gobernado por el calor y el transporte de sustancias
entre las clulas y su medio externo. Para controlar esto se han
utilizado una serie de compuestos crioprotectores con
caractersticas similares; estos compuestos protegen a las clulas de
los efectos dainos de las altas concentraciones de solutos, a
medida que avanza la congelacin. Inicialmente los crioprotectores
se adicionaban y retiraban del embrin mediante su inclusin en
soluciones sucesivas de concentracin crecientes y decrecientes, en
la actualidad este proceso se puede realizar en un solo paso,
descongelando y transfiriendo los embriones de forma similar a como
se realiza una inseminacin artificial y con resultados de gestacin
semejantes. El descenso lento de la temperatura (0.3C - 0.5C/min)
permite realizar la inmersin en nitrgeno lquido (a -196C) desde
temperaturas comprendidas entre -30C a -40C, posibilitando la
descongelacin rpida de los embriones, de manera similar a la
realizada con el semen.
Figura 6. Conservacin de embriones a -196C
-
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VI. Manejo de las receptoras
La fertilidad es el diagnstico ms fiable de la viabilidad
embrionaria, adems de ser el principal objetivo de cualquier tcnica
artificial de reproduccin. Existen una serie de factores que
conciernen al tipo de tcnicas empleadas para la transferencia y
sincronizacin entre donantes y receptoras, al embrin y a la
receptora, que son los que determinan el xito o el fracaso de la
TE. Caractersticas de las receptoras: Diversos factores se deben
tomar en cuenta a la hora de seleccionar animales para organizar un
lote de futuras receptoras de embriones, entre otros los ms
importantes a considerar son:
a) Edad: La utilizacin de vaquillas como receptoras
frente a vacas ofrece superiores tasas de gestacin (53% vs 71%),
mayor facilidad de manejo por su uniformidad y menores costos.
Deben ser seleccionadas aquellas vaquillas que ciclen normalmente y
hayan alcanzado un 45-55% de su peso adulto, con un buen desarrollo
y condicin corporal.
b) Nutricin: El aporte energtico y una condicin corporal
adecuada (de 5 a 6) son los principales factores que condicionan el
xito en la consecucin de la gestacin. Las receptoras deben estar en
un estado positivo de energa y la racin en todos sus componentes
(protena, energa, vitaminas y minerales) debe ser equilibrada.
En caso contrario habr que suplementar hasta satisfacer las
necesidades de cada animal, cualquier
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27
cambio deber realizarse gradualmente, siendo recomendable
mantener a las posibles receptoras con la misma dieta por lo menos
desde seis semanas antes de la transferencia y mantenerla hasta los
dos meses de gestacin.
c) Estrs: El estrs puede interferir en casi todos los
aspectos de la reproduccin, tales como el celo, la ovulacin, el
desarrollo embrionario y la gestacin. En la receptora, varias
pueden ser las causas de estrs, como climticas, nutricionales y en
muchas ocasiones el trato recibido por el ganadero. En el manejo de
las receptoras se ha de evitar en lo posible cualquier factor
estresante; as, en el hato de receptoras se debe mantener su
composicin y tamao para evitar todo conflicto y trastorno de la
conducta estral que impida la identificacin del animal en celo. Los
corrales deben disponer de condiciones apropiadas, instalaciones
cmodas y elementos de sujecin seguros para su manejo. El
acostumbramiento de los animales al manejo que recibirn el da de la
transferencia favorecer el incremento de las tasas de gestacin.
Sincronizacin de receptoras: Consiste en la sincronizacin de
celos entre donante y receptora, tratando de hacer coincidir lo
mejor posible el estadio de desarrollo embrionario con su
correspondiente estado uterino, siendo el margen de desequilibrio
aceptable de 1 da para que no represente un efecto adverso. Para la
sincronizacin de celos de las receptoras existen actualmente en el
mercado los anlogos de prostaglandina F2 (PGF2) y los progestgenos.
Las
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receptoras a las cuales para su sincronizacin con la donante se
les administran PGF2 (con o sin progestgenos), presentan tasas de
gestacin significativamente superiores en comparacin con las que
son utilizadas tras la observacin de un celo natural. Sincrona
donante-receptora: La obtencin de tasas aceptables de preez por
transferencia de embriones depende parcialmente de que el celo de
receptoras y donantes este dentro de una sincrona aceptable, cuyo
rango puede variar si los embriones son frescos o congelados. Lo
ideal con embriones congelados es no tener una asincrona mayor a 24
horas. En cambio con embriones frescos se puede llegar a transferir
embriones en receptoras que estn entre el da cinco y nueve del
ciclo. Sin embargo hay una pequea disminucin de preez cuando nos
alejamos de las 36 horas de asincrona en relacin con la donante. El
estadio del ciclo de la receptora y el porcentaje de preez tambin
estn relacionados con la calidad embrionaria. Varios experimentos
han demostrado que embriones de excelente calidad soportan ms el
asincronismo que los embriones regulares o malos. Asimismo, se
obtuvieron los mayores porcentajes de preez con embriones regulares
o malos en receptoras que entraron en celo despus que la donante.
Esto puede estar relacionado con el hecho de que en los embriones
de calidad pobre, el desarrollo embrionario retardado es frecuente,
por lo que el ambiente uterino proporcionado por una receptora en
un estadio ms temprano del ciclo resulta ms propicio para este tipo
de embrin.
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29
VII. Resultados y recomendaciones
El INIFAP en Baja California Sur incluy dentro de sus programas
de validacin y transferencia de tecnologa, la TE mediante la tcnica
no quirrgica usando embriones congelados, para lo cual fueron
seleccionadas 10 receptoras, en las que se implement el siguiente
protocolo de sincronizacin: El diagnostico de gestacin se realiz
mediante palpacin y ecografa transrectal a los 56 das, el
porcentaje de preez fue de 33.3%, menor a los porcentajes promedio
reportados para esta tecnologa, esto probablemente como resultado
de la poca del ao en que se realiz (septiembre), donde se
presentaron temperaturas elevadas en la zona.
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Ante lo expuesto, para optimizar los resultados es importante
tomar en cuenta las siguientes recomendaciones:
Asignar tcnicos experimentados, las tasas de fertilidad pudieran
variar de un 20% a un 60% de acuerdo a la habilidad de cada
tcnico.
Contar con registros reproductivos del hato, esto nos facilitar
la seleccin de los mejores animales y con ello obtener los mayores
beneficios de esta tecnologa.
Es importante que tanto donantes como receptoras presenten un
buen desarrollo y una condicin corporal adecuada (CC= 5 a 6).
En verano la presencia de celos y las tasas de preez se reducen
significativamente, por lo tanto no se recomienda en esta poca del
ao.
Contar con el equipo adecuado, pajillas francesas de 0.25 ml,
pipeta desechable de plstico con punta metlica y descarga lateral
(IMV, Francia), y una pistola para TE (IMV, Francia), as como
corrales de manejo y trampa para la correcta sujecin de los
animales.
Descongelar correctamente los embriones a 30C durante 30
segundos.
Es importante mantener el nivel adecuado de nitrgeno en el termo
para no afectar la viabilidad de los embriones.
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VIII. Literatura citada
Colazo, M. G. y Mapletoft, R. J. 2007. Estado actual y
aplicaciones de la transferencia de embriones en bovinos.
Ciencia veterinaria vol. 9, 1.
Cutini, A., Teruel, M. y Cabodevila, J. 2000. Factores que
determinan el resultado de la transferencia no quirrgica de
embriones bovinos. Revista Taurus. 7: 28-39.
De la Fuente, M. J., 2009. Produccin de embriones Bovinos in
vivo: Manipulacin embrionaria para incrementar la produccin bovina.
XXXII Curso Internacional de Reproduccin Animal, Madrid, Espaa. 77
- 106.
Fernndez, A., Daz, T. y Muoz, G. 2007. Produccin In vitro de
Embriones Bovinos. Revista de la Facultad de Ciencias Veterinarias.
48 (1): 51 - 60.
Galina, C. y Valencia, J. 2008. Reproduccin de animales
domsticos. Edit. Limusa, S.A. de C.V. Mxico. Pp. 543 - 569.
Mapletoft, R. J. 2006. Bovine Embryo Transfer. IVIS Reviews in
Veterinary Medicine, I.V.I.S. (Ed). International Veterinary
Information Service, Ithaca NY. Disponible en URL www.ivis.org,
ltima actualizacin 17-noviembre-2006.
Mapletoft, R. J. y Hasler, J. F. 2005. Assisted reproductive
technologies in cattle: a review. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.,
24 (1): 393 - 403.
San Primitivo T., F. 2001. Livestock genetic improvement in the
second half of the 20
th century. Archivos de
zootecnia vol. 50, 192: 517-546.
-
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Agradecimientos
El Campo Experimental Todos Santos, a travs de los autores del
presente folleto, agradece a la Fundacin Produce Baja California
Sur, A.C., por su apoyo y financiamiento mediante el proyecto
titulado Implementacin de tcnicas para el mejoramiento gentico en
explotaciones ganaderas. Al M.V.Z. Ramiro Estrada Bautista,
presidente de la Asociacin Ganadera Local Llanos de Magdalena, as
como al resto de los productores y tcnicos del Estado, que siempre
han mostrado inters en colaborar con las actividades de validacin y
transferencia de tecnologa propuestas por el Campo Experimental
Todos Santos a travs de mdulos demostrativos, cursos y talleres. A
Loreto Ros Arce y David Israel Zavala Hirales, estudiantes de la
carrera de Ingeniero en Produccin Animal de la UABCS, por su activa
participacin y colaboracin en los cursos de capacitacin as como en
las actividades de campo.
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PERSONAL INVESTIGADOR
CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS
M.C. JOS DENIS OSUNA AMADOR
[email protected] DICOVI EN B.C.S. y
JEFE DE CAMPO DEL CETODS
DR. JESS NAVEJAS JIMNEZ [email protected]
INGENIERIA DEL RIEGO
DR. J.A. CRISTOBAL NAVARRO AINZA
[email protected]
FRUTALES
M.C. RIGOBERTO MEZA SNCHEZ
[email protected]
RECURSOS GENETICOS FORESTALES
ING. ERASMO GUTIERRES PREZ [email protected]
FRIJOL Y GARBANZO
La presente publicacin se termin de imprimir en el mes de julio
de 2014, en la imprenta Ciudad de Los Nios, Revolucin S/N entre 5
de Febrero y Cuauhtmoc, Colonia Pueblo Nuevo. La Paz, Baja
California Sur, Mxico. C.P. 23060. Telfono: (612) 122-0327,
122-9595.
Su tiraje consta de 500 ejemplares
-
La serie de Folletos Tcnicos est integrada por publicaciones
cuyo objetivo es difundir informacin de utilidad prctica para los
agentes de cambio, relacionada con conocimientos concretos y
detallados sobre principios, procesos y procedimientos de un
cultivo, especie de ganado o forestal. La informacin puede tener
cobertura nacional, del rea de influencia de un CIR, CE, o de una
localidad geogrfica especifica dentro del rea de influencie de un
CE.
COMIT EDITORIAL DEL
CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS
Presidente M.C. Jos Denis Osuna Amador
Secretario Dr. Jess Navejas Jimenz
Vocales M.C. Rigoberto Meza Snchez Ing. Erasmo Gutirres Prez
Diseo de portada M.C. No de Jess Medina Crdova
Edicin y Revisin
Comit Editorial del C.E. Todos Santos
Fotografa M.C. No de Jess Medina Crdova
Mayor informacin acudir al:
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Mdulo "C"
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Mxico. CP-23070
Tel: 01 (612) 122 90 18 Fax: 01 (612) 128 6320