METODI ANALITICI PER LA RICERCA DI COCCIDIOSTATICI …old.iss.it/binary/meta/cont/Muscarella_Metodi_analitici_per_la... · Metodo multimatrice per la ricerca di Nicarbazina Il metodo

Workshop LNR Additivi nei mangimi Istituto Superiore di Sanità

29 - 30 Ottobre 2013

Dott.ssa Marilena Muscarella

METODI ANALITICI PER LA RICERCA DI COCCIDIOSTATICI NEI

MANGIMI E MONITORAGGIO DI CAMPIONI REALI

Progetto di Ricerca corrente IZSPB 01/09

U.O.1 IMS. Responsabile Dott. ssa M. Muscarella IZS della Puglia e della Basilicata

U.O.2 IMS. Responsabile Dott. P. Gallo IZS del Mezzogiorno

U.O.3 IMS Responsabile Dott.ssa M. Gili IZS del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta, CREAA

U.O.1 EMS Responsabile Dott. M. Fiori Istituto Superiore di Sanita’

U.O. 2 EMS Responsabile Dott. ssa C. Palermo Universita’ degli Studi di Foggia – Facolta’ Di Agraria

Coccidiostatici

I Coccidiostatici sono additivi zootecnici usati nei

mangimi medicati per prevenire e curare la coccidiosi,

una malattia contagiosa che colpisce principalmente

specie avicole, ma anche bestiame ed altri animali da

allevamento. E’ la più importante malattia parassitaria

che può colpire le specie avicole*. Manifestazioni

dell’infezione sono diarree emorragiche, febbri,

dimagrimento, anoressia e lesioni delle vie urinarie

* Oswald et al. Food Addit. Contam. (2005)

Da quanto emerso dai documenti dell’EFSA*, durante la

produzione o il mescolamento di mangimi medicati, una

certa quantità di mangime può rimanere nel circuito

produttivo e contaminare altri mangimi.

Questa cross-contamination potrebbe determinare effetti

tossici per gli animali e per la salute pubblica.

* The EFSA Journal (2008) 690, 2-34

Contaminazione dei mangimi

Le proprietà elettrostatiche di alcune molecole possono

rendere difficoltose le operazioni di pulizia dei macchinari

fra una preparazione e l’altra e contaminare le partite di

alimento medicamentoso o mangime. L’ industria

mangimistica ha cercato di porre rimedio a tale problema,

impiegando principi attivi microincapsulati o in forma

granulare anziché polverulenta.

Contaminazione dei mangimi

Nel 2009 sono stati emanati due provvedimenti che

definiscono i limiti di legge per la presenza a dosi sub-

terapeutiche per gli undici coccidiostatici autorizzati dalla

UE come additivi nei mangimi.

Contaminazione dei mangimi

Direttiva 8/2009 (attualmente modificato dal

Regolamento 574/2011)

Regolamento 124/2009

Tali limiti riguardano sostanzialmente

il problema del carry-over dei mangimi.

Contaminazione dei mangimi

Il Regolamento 124/2009 stabilisce tenori massimi per i

residui di coccidiostatici negli alimenti di origine animale

(latte, uova, muscolo). Tali residui possono essere ritrovati

sempre per effetto del carry-over nei mangimi.

Contaminazione dei mangimi

Coccidiostatici

I coccidiostatici, sulla base delle loro caratteristiche

chimiche, sono suddivisi in due gruppi. Il primo gruppo

è costituito dagli ionofori

Coccidiostatici

Il secondo gruppo è costituito dalle molecole non

ionofore

Coccidiostatici Tossicità

Come tutte le sostanze antibatteriche, i coccidiostatici

possono essere un rischio indiretto per la salute umana

perché il loro uso diffuso potrebbe essere responsabile

della promozione di ceppi di batteri resistenti. I

principali segni clinici di intossicazioni acute con

monensin e altri composti ionofori sono debolezza

muscolare e insufficienza del miocardio. Questi sintomi

sono stati osservati nell’uomo, ma anche negli animali.

Coccidiostatici Tossicità

I farmaci più pericolosi sono sicuramente gli antibiotici

ionofori. Intossicazioni acute, talvolta ad esito letale,

sono state riscontrate negli equini (più sensibili) e

praticamente in tutte le specie da reddito. In altri casi

possono comparire forme più lievi dal punto di vista

clinico, ma sufficienti per diminuire la produttività *.

* Carlo Nebbia. 2009 Ed. Edises

Limiti Massimi di

Concentrazione

Contaminazione dei

mangimi

Problematiche legate ai nuovi Regolamenti:

1) Tradizionalmente i livelli di controllo dei farmaci

veterinari nei mangimi si aggiravano intorno a 0.5-1.0

mg/kg. Il Regolamento 574/2011 stabilisce i tenori

massimi per alcuni coccidiostatici dell’ordine dei ppb

(alofuginone, maduramicina, diclazuril).

2) Le molecole di coccidiostatici determinate dai

laboratori IIZZSS negli alimenti/mangimi non

comprendevano tutti gli 11 principi attivi ammessi, ma

solo i coccidiostatici principali (nicarbazina,

robenidina e qualche ionoforo).

Piano Nazionale

Alimentazione Animale

Tecniche Analitiche

Screening: metodo adoperato per rilevare la presenza di una sostanza o di una

classe di sostanze al livello d’interesse. Tali metodi consentono di analizzare un

elevato numero di campioni in tempi brevi

Conferma: metodo che fornisce informazioni complete o complementari atte ad

identificare la sostanza in modo univoco e, se necessario, quantificarla al livello

di interesse.

Tecniche Analitiche

Nell’ambito del controllo ufficiale è necessario la messa a punto di

metodi di screening affidabili per una determinazione rapida e veloce,

supportati da metodiche strumentali sensibili e robuste, indispensabili

per l’analisi di conferma. La combinazione di metodi di screening e di

conferma consente studi di monitoraggio per la valutazione di eventuali

rischi tossicologici.

Metodi di screening Kit Microbiologico

Metodi di conferma

HPLC/DAD

LC/MS/MS

Tecniche Analitiche

I metodi utilizzati nell’ambito di un controllo ufficiale

devono essere sottoposti ad una attività di

valutazione/validazione che ne attesti l’idoneità allo scopo.

A tal fine è di fondamentale importanza la valutazione dei

parametri di prestazione ai livelli di interesse ( limiti di

legge) in accordo al Regolamento 882/2004 /CE e alla

Norma ISO/IEC 17025/2005

Tecniche Analitiche

Metodi di screening Kit Microbiologico

In commercio esiste un kit ELISA specifico per la

determinazione di coccidiostatici ionofori. Non è stato

possibile applicarlo ai nostri scopi analitici per due motivi

principali:

I. Tale Kit e’ stato validato solo per mangimi destinati

all’alimentazione di animali domestici

II. Si tratta di un kit non multi-residuale

Metodi di screening Kit ELISA

Blu = Monensin

Giallo = Lasalocid

Viola = Maduramicina

Verde=Salinomicina/

Narasin

Metodo Microbiologico

Un rapido metodo di screening microbiologico (Premi®Test R-Biopharm

AG) a lettura visiva è stato ottimizzato e validato per la ricerca dei 5

Ionofori (lasalocid, monensin, narasin e salinomicina, maduramicina)

indicati nel PNAA 2012-2014. Questo metodo è basato sulla proliferazione

di spore di Bacillus Stearothermophillus. Le ampolle fornite nel kit

contengono un numero standard di spore di tale microrganismo in un

terreno agarizzato, in cui è presente un indicatore di pH. Dopo aver

aggiunto l’estratto del campione, le ampolle vengono incubate a 64 C: in

assenza di coccidiostatici ionofori, le spore germinate si moltiplicano e

formano un acido che causa un cambiamento di colorazione

dell’indicatore contenuto nell’agar dal viola al giallo.

Metodo Microbiologico

Campione A Campione B Campione di

Controllo

Metodo Microbiologico

Campione A Campione B Campione di

Controllo

POSITIVO!! NEGATIVO

Metodo Microbiologico Preparazione del campione

Triturare e

omogenizzare il

campione Pesare 2.00 g

Aggiungere 10

ml di

acqua e agitare

in vortex

Filtrare

100 μl sono usati

per l’analisi

Metodo Microbiologico Validazione

Numerose metodiche basate su kit microbiologici, presenti

in letteratura, sono state validate in accordo a protocolli

validativi “soggettivi”, non seguendo rigorosi schemi di

validazione.* I requisiti del metodo analitico sono stati

verificati seguendo il regolamento 882/2004/CE e la

Decisione 657/2002/CE per tecniche a lettura visiva.

*S.L. Stead et al. International Dairy Journal 18 (2008) 3–11

Metodo Microbiologico

Specificità

La Decisione 657/2002/CE non fornisce alcun

criterio quantitativo per la valutazione della

specificità di un metodo di screening. Tuttavia, una

percentuale troppo elevata di falsi positivi,

renderebbe il test inutilizzabile nella pratica.

Come criterio generale si può accettare una

percentuale di falsi non conformi (falsi positivi) ≤

10%.

Metodo Microbiologico

Specificità

Ai fini della valutazione di tale performance sono stati analizzati 20

bianchi campione rappresentativi della tipologia di campioni di nostro

interesse in due sedute differenti. Si sono quindi scelti 20 campioni di

mangime per bovini e 20 per specie avicole, ed è stata verificata l’ assenza

di campioni falsi positivi, ovvero significativamente diversi dal controllo

negativo utilizzato per la verifica del saggio.

Metodo Microbiologico

Capacità di rivelazione

(CCβverifica dell’errore beta)

Per la verifica dell’errore β ai livelli di legge sono state effettuate 20 prove

per ogni singola molecola per un numero totale di 200 prove ai livelli di

fortificazione riportati di seguito. Errore beta 5%

Metodo Microbiologico Capacità di rivelazione (CCβverifica

dell’errore beta)

In seguito a queste prove preliminari, sono state effettuate ulteriori prove

per ciascuna coppia di molecole Lasalocid + Monensin e Narasin +

Salinomicina ai livelli di fortificazione riportati in Tabella per verificare la

capacità di rivelazione del metodo nel caso della presenza simultanea di

più molecole. In particolare, per ciascuna coppia di molecole al livello di

fortificazione di interesse, sono state effettuate 2 sedute (20 prove per

ciascuna seduta). In tutti i casi tutti i campioni additivati sono risultati

positivi.

Metodo Microbiologico Robustezza

La robustezza del metodo è stata valutata in condizioni di cambiamenti marcati

studiando la matrice mangime per specie diverse da quelle di validazione (bovina

e avicola). Ai fini della valutazione di tale performance si sono realizzati 4

additivati usando una soluzione mix delle molecole Narasin e Salinomicina al

livello di additivazione 0,7 mg/kg per specie cunicola, e Monensin e Lasalocid al

livello di additivazione 1,25 mg/Kg per specie ovi-caprina e suina. Inoltre, sono

stati realizzati 4 additivati con una soluzione di maduramicina a 0,150 mg/Kg su

mangimi per specie suina e ovi-caprina e 4 additivati a 0,050 mg/Kg per mangimi

per specie cunicola. Tutti i campioni additivati non hanno presentato viraggio al

giallo.

Metodi di Conferma

Metodi strumentali

HPLC/DAD

LC/MS/MS

Metodi di Conferma

Studi di monitoraggio su campioni di matrici di origine animale (uova

e muscolo) hanno riscontrato la maggior positività per le molecole di

Nicarbazina e Robenidina

http://www.izsto.it/attachments/103_5_Galarini.pdf

Nel PNR sono inoltre previste il maggior numero di richieste di analisi

per la ricerca di Nicarbazina e Robenidina

Metodi di Conferma HPLC/DAD

Metodo multimatrice per la ricerca di Nicarbazina

Il metodo ufficiale per la ricerca di Nicarbazina nella matrice mangime

(UNI EN 15782) è stato validato solo ai limiti di concentrazione imposti

per mangimi medicati. Il metodo analitico multi-matrice per la ricerca di

nicarbazina può essere applicato a campioni di mangime, muscolo, fegato

e uova .

Campione di mangime bianco ( in rosso) e fortificato con Nicarbazina ( in nero) a un livello

di 0.5 mg/kg.

Metodi di Conferma HPLC/DAD

Metodo multimatrice per la ricerca di Nicarbazina

Metodi di Conferma HPLC/DAD

Metodo per la ricerca di Robenidina

Il metodo di conferma per la ricerca di robenidina prevede un facile e

veloce procedura di estrazione in fase organica acidificata e rivelazione

strumentale mediante HPLC/DAD. Tale metodo permette di eseguire,

quindi, un alto numero di analisi in un breve tempo

Parametri di validazione

Metodi di Conferma LC/MS/MS

Metodo LC/ESI-MS/MS per la rilevazione di 5 ionofori: lasalocid,

monensin, salinomicina, narasin e maduramicina mediante

rivelazione a trappola ionica (IZS Mezzogiorno)

Metodo LC-MS/MS mediante rivelazione a triplo quadrupolo per la

ricerca di 8 coccidiostatici: nicarbazina, robenidina, diclazuril,

lasalocid, salinomicina, monensin, narasin e maduramicina (IZS

Piemonte)

Metodo UPLC-MS/MS con rivelazione mediante triplo quadrupolo degli

11 coccidiostatici (ISS)

Metodi di Conferma LC/MS/MS

Le diverse metodiche di conferma LC/MS/MS prevedono l’uso di due

diversi analizzatori di massa

Trappola ionica Triplo quadrupolo

Metodi di Conferma LC/MS/MS

Analizzatori

Metodi di Conferma LC/MS/MS

Analizzatori

Quadrupolo Triploquadrupolo

Tempo di volo

Metodi di Conferma LC/MS/MS

Analizzatori

Metodi di Conferma LC/MS/MS

Analizzatori

Metodo di Conferma UPLC/MS/MS

Istituto Superiore di Sanità

Il metodo di Cronly et al. (Analytica Chimica Acta 700:26-33) è l’unica

procedura analitica presente in letteratura che permette di determinare

gli 11 coccidiostatici nei mangimi a livello di carry over con un protocollo

di preparazione e purificazione semplice e rapido.

Il metodo proposto da Cronly et al. è stato ottimizzato e adattato al

sistema UPLC al fine di ridurre notevolmente il tempo della corsa

cromatografica (9 min), requisito indispensabile per effettuare analisi di

screening e conferma di un elevato numero di campioni in tempi brevi.

L’affidabilità del metodo è stata valutata analizzando campioni di

mangimi risultati positivi per coccidiostatici ionofori al metodo di

screening microbiologico e i risultati sono stati confrontati con quelli di

un metodo LC/MS/MS con analizzatore a trappola ionica (IZS ME)

Metodi di Conferma UPLC/MS/MS

Preparazione del campione

Pesare 2,5 g di

mangime

Aggiungere 12ml

acqua deionizzata,

agitare per 15

minuti

Aggiungere 25 ml

acetonitrile

Agitare per 15 minuti

Aggiungere 4 g di

solfato di magnesio

anidro e 2 g di cloruro

di sodio

Agitare per 15 minuti

Centrifugare a 7000

rpm per 5 minuti

Recuperare la fase

organica da 50 ml e

porre in un

congelatore a – 80

°C per 15 minuti

Togliere il campione

dal congelatore e

prelevare 10 ml

dell’estratto,centrifuga

re a 4500 rpm per 10

minuti

analizzare in

UPLC-MS/MS.

.

Metodi di Conferma UPLC/MS/MS Parametri validativi

Monitoraggio di campioni

N. totale = 100 campioni di mangimi

Risultato Monitoraggio

Su un totale di 100 campioni di mangimi analizzati mediante il metodo di

screening microbiologico descritto in questo lavoro di ricerca, 8 campioni

sono risultati positivi e sono stati analizzati con i metodi di conferma

LC/MS/MS mediante analizzatore a triplo quadrupolo e a trappola ionica.

Dall’analisi di conferma, tre campioni sono risultati non conformi, in

accordo ai limiti di legge imposti dal Regolamento 574/2011.

Risultato Monitoraggio

Risultato Monitoraggio

http://www.izsto.it/attachments/103_5_Galarini.pdf ( 19/10/2012)

Risultato Monitoraggio

Su un totale di 165 campioni di mangimi analizzati nel

periodo tra il 2010-2012 mediante il metodo conferma

LC/MS/MS per la ricerca di 11 coccidiostatici, 8 campioni

sono risultati non conformi.

http://www.izsto.it/attachments/103_5_Galarini.pdf

Risultato Monitoraggio

IZS PB

3.0% campioni

Non conformi

IZS UM

3.5% campioni

Non conformi

Conclusioni

I metodi messi a punto si sono dimostrati affidabili per lo screening e la

conferma dei coccidiostatici nei mangimi a seguito di contaminazione

crociata.

La semplicità e sensibilità dei metodi, la velocità dell’analisi ed i risultati

delle procedure di validazione in accordo ai regolamenti comunitari ne

permettono l’utilizzo per il controllo ufficiale.

Ringraziamenti

Ministero della Salute

Unità Operative partecipanti al Progetto di ricerca corrente IZS

PB/01/09 : “Sviluppo e validazione di metodi analitici di conferma per la

ricerca di residui di coccidiostatici negli alimenti ad uso zootecnico e

valutazione del rischio tossicologico”

Dott. Antonio Armentano e Dott.ssa Maria Campaniello

DIVULGAZIONE DEI RISULTATI

Determination of 8 coccidiostats in feed at

cross-contamoination levels by LC/MS/MS :

validation according to Rg. 2004//882//EC.

Massa 2010 6th MS- Pharmaday. Milano, 6-

8october 2010

COMUNICAZIONI A CONVEGNI NAZIONALI/NTERNAZIONALI

Optimization and validation of a multi-matrix

confirmatory method for the determination of

Nicarbazin by HPLC-Diode Array detection

XXIV Congresso Nazionale della Società Chimica

Italiana Lecce 11-16 settembre 2011.

Determination of 11 coccidiostats in feeds by

UPLC-MS/MS

HPLC 2013 Conference Amsterdam

16-20 giugno 2013

Van Gogh Museum Amsterdam- La mietitura,1888