METODE FITOKIMIA

1

METODE FITOKIMIA

2

REFERENSI

List PH and Schmidt PC, 1989, Phytopharmaceutical Technology, CRC Press, Boston

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan Republik Indonesia

Harbone,J.B., 1984, Metode Fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan, Penerbit ITB, Bandung

3

ALUR PENCARIAN B. AKTIF DARI TUMBUHAN

Tumbuhan

Simplisia

(Skrining fitokimia, Ekstraksi)

Ekstrak

(Uji biaktivitas, Separasi)

Fraksi

(Uji biaktivitas, Pemurnian)

Isolat

(Uji biaktivitas, Identifikasi)

….???

4

EKSTRAKSI

Pengambilan bahan aktif dari tumbuhan dengan pelarut tertentu

Macam-Macam Ekstrak– EKSTRAK TOTAL– EKSTRAK PARSIAL

5

FAKTOR2 YANG BERPENGARUH

• Bahan Awal

• Pelarut (Menstruum)

• Cara/Metode

6

Bahan Awal

SEGAR KERING

BUAH/FRUCTUSDAUN/FOLIUM

BIJI/SEMENHERBA

BATANG/CAULISRIMPANG/RHIZOMA

KULIT KAYU/KORTEKSKAYU/LIGNUM

7

PELARUT

SelektifitasMudah penanganannyaEkonomisRamah Lingkungan

8

JENIS-JENIS PELARUT

AisHidrokarbon alifatis (PE,heksan)Kloro hidrokarbon (Diklormetan, Triklormetan)Alkohol (Etanol, metanol, isopropanol)Asam karboksilatEsterEtherMinyak

9

METODE EKSTRAKSI

3 Metode Ekstraksi Proses yang menghasilkan

keseimbangan konsentrasi antara larutan dan residu padatContoh : Maserasi, digesti, ultrasonic extraction, dll

Proses Ekstraksi seksama/menyeluruhContoh : Perkolasi, Countercurrent extraction.

Ekstraksi dengan Gas superkritis

PHYTOPHARMACEUTICAL TECHNOLOGY

10

METODE EKSTRAKSI

• Ekstraksi dengan menggunakan Pelarut• Dingin maserasi, perkolasi• Panas Infus, dekokta, Refluks, Soxhlet

• Destilasi• Lainnya

• Ekstraksi berkesinambungan• Ekstraksi dengan gas superkritis• Ekstraksi dengan ultrasonik• Ekstraksi dengan tenaga listrik

PARAMETER STANDAR UMUM EKSTRAK TUMBUHAN OBAT

11

Proses yang menghasilkan Proses yang menghasilkan keseimbangan konsentrasi antara larutan keseimbangan konsentrasi antara larutan

dan residu padatdan residu padat

Maseration, Kinetic maceration,

DigestionVortical (Turbo) ExtractionUltrasound extractionExtraction by Electrical Energy

12

MACERATION

Penyarian dengan menggunakan pelarut beberapa hari (5 hari) dengan pengadukan (tidak kontinu)

Sesuai untuk bahan aktif yang mudah larut dalam cairan penyari

Simplisia yang mengandung musilago dan bahan lain yan mudah mengambang.

(+) Cara pengerjaan dan peralatan sangat sederhana dan mudah

(-) Pengerjaan lama dan penyarian kurang sempurna

Kinetic Maceration: Maserasi dengan pengadukan konstan dan kontinu

Digesti : Maserasi dengan pemanasan (40-50 C)

13

VORTICAL (TURBO) EXTRACTION

Bahan dan pelarut diaduk dengan kecepatan tinggi (high speed mixer/homogenizer)

Bahan semakin halus karena ada pengecilan ukuran partikel selama proses, sehingga meningkatkan luas permukaan bahan dengan cairan penyari

Penyarian lebih baik dan waktu lebih singkat dari maserasi

Cukup beresiko untuk bahan yang termolabil

Pemisahan antara cairan penyari dengan residu jauh lebih sulit

Tidak efektif untuk large scale.

14

ULTRASOUND EXTRACTION

Penyarian dengan menggunakan gelombang suara (ultrasonik, Frek > 20 hz)

Prinsip Meningkatkan permeabilitas

dinding sel Membentuk cavity ( lubang-

lubang) Meningkatkan tekanan mekanik

Dapat menyebabkan rusaknya bahan aktif akibat oksidasi

Ekstrak dapat tercemar oleh trace metal

High Energy Cost untuk penggunaan large scale

15

Extraction by Electrical Energy

Penyarian dengan mengunakan tenaga listrikPrinsip

Membuat cavityMenyebarkan tekanan gelombang yang dihasilkan oleh listrik dengn kecepatan Ultrasonic

16

Proses Ekstraksi Seksama/Menyeluruh

Exhaustive extraction: The complete removal of the desired extractive substance from material.Percolation :- Plant material is exhaustively extracted by fresh solvent- Only fresh solvent is used, Consumed a large quantity of

solvent- Takes a long time- Inflkuenced by : Selectivity of solvent, Quantity Flow

(Dropping rate) of the solvent, Temperatur

Repercolation- First extracted with fresh solvent and then some of percolate is

used for exhaustive extraction by stagewise concentration in another percolator.

Continuous Countercurrent Extraction- Fresh plant material is brought into contact with

loaded/charged solvent at the same time as fresh solvent is being brought into contact with already pre-extracted

17

PENGUAPAN/PEMEKATAN EKSTRAK

Rotary evaporator (pelarut organik, Airsulit)

Ekstrak kental

Labu destilasi

Labu penampung solven

Kondensor

Motor pemutar labu

Pengatur suhu dan kecepatan

Water bath

18

PRINSIP KERJA ROTAVAPOR

Penurunan titik didik solven akibat hisapan pompa vakum, suhu danadanya pemutaran labu yang meningkatkan permukaan penguapan

e.x : Etanol terdestilasi suhu 30 C dengan cepat

19

SEPARATIONSEPARATIONSEPARATIONSEPARATION

Why separate compounds?– to isolate or concentrate

component(s) from a mixture– to separate a component(s) from

other species that would interfere in the analysis

20

Methods of Separation

Extraction – washing clothes

Crystallization– drugs

Destillation– moonshine

Chromatography

21

Solvent Extraction

Extraction: transfer of a solute from one phase to another.

Can use most any combination of phases (solid, liquid, gas, supercritical fluid)

Solvent extractions use two immiscible liquids.– Typically aqueous/organic solvent

22

Solvent Extraction

Organic solvents less dense than water – diethyl ether, toluene, hexane

Organic solvents more dense than water– chloroform, CCl4, dichloromethane

Like dissolves like so ideally, the extracting solvent should be similar to the solute (analyte)

23

shake

add second immiscible

solvent

Separatoryfunnel

Solvent Extraction

24

KROMATOGRAFI

Teknik pemisahan fisik campuran komponen berdasarkan perbedaan migrasi komponen-komponen tersebut dari fase diam oleh pengaruh fase gerak

25

Klasifikasi Metode Kromatografi

G S C G L C

G A S S F C

N P R P IE C

G P C G F C

S E C

C olu m n

TL C P ap er

P lan ar

L IQ U ID

C H R O M A TO G R A P H Y

26

Kromatografi yang sering digunakan

Kromatografi Kertas Kromatografi Lapis Tipis KCKT KGC

27

Pemilihan metode kromatografi didasarkan:– Sifat Kelarutan– Sifat keatsirian

Kromatografi Kertas: – Mudah larut dlm air (Karbohidrat, asam amino,

senyawa fenolat, asam organik, basa asam nukleat

KLT:– Mudah larut lm lipid (Lipid, steroid, karotenoid,

klorofil) KGC

– Mudah teratsirikan (Minyak atsiri, monoterpena, sesquiterpena, asam lemak)

KCKT– Sulit teratsirikan

28

Kromatografi Kertas

Eluasi desending satu arah atau kadang 2 arah

Kertas whatman 46 x 57 cm Fase diam selulosa, alumina, silikat Deteksi bercak berwarna atau

berflouresensi UV setelah direaksikan Fase gerak : Butanol: Asam asetat:Air

29

Prinsip : Partisi dua fase Semakin banyak air migrasi semakin

lambat Semakin panyak pelarut organik migrasi

semakin cepat (Rf tinggi)

30

Prosedur :

Pemilihan eluen(pelarut pengembang)– Eluasi sampel dengan berbagai eluen– Pilih yang bisa memisahkan senyawa tersebut

Fraksinasi dengan kromatografi kertas– Ekstrak yang akan ditotolkan ditotolkan berupa garis– Jangan lupa di keringkan dengan hair dyer– Eluasi dengan eluen terpilih (bisa bidimensional)– Amati noda – Ambil noda yang diinginkan dengan memotong kertas– Ekatraksi dengan pelarut yg sesuai

31

Contoh: Isolasi Flavonoid

•Eluen : BAW (Butanol:Asam Asetat: Water) 4:1:5 (lapisan atas)

•Penampak noda Uap amoniak kuning intensif

•Ambil bagian yang kuning dipotong kecil-kecil

•Ekstraksi

32

KLT

Eluasi : Asending (satu atau dua arah) Fase diam: Selulosa, silika gel, celite,

Poliamida, sephadex KLT analitik : tebal 0,1-0,25 mm KLT Preparatif: tebal ad 1 mm

33

KROMATOGRAFI KOLOM

Kolom konvensional elusi berdasarkan gaya gravitasi

Kromatografi Cepat Vacum Liquid Chromatography– Eluasi dengan bantuan pompa– Eluasi bisa secara gradien

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi– Volume injeksi >> besar– Kolom juga jauh lebih besar dan panjang– Eluat dapat ditampung

34

Contoh Separasi dengan Kromatografi KolomContoh Separasi dengan Kromatografi Kolom

35

Prosedur

Pemilihan Eluen untuk FraksinasiStandar kurkumin dan ekstrak kurkuminoid yang telah dicuci dilarutkan dalam etanol 96% dan ditotolkan 2-5l pada lempeng KLT. Lempeng KLT selanjutnya dieluasi dengan menggunakan eluen yang sesuai di dalam bak kromatografi sampai batas yang ditentukan. Amatilah lempeng pada lampu UV 254 nm dan 365 nm. Eluen dipilih apabila ekstrak kurkuminoid yang ditotolkan terpisah menjadi 3 noda yaitu kurkumin, bisdemetoksi kurkumin dan desmetoksi kurkumin. Lihat gambar dibawah ini.

36

37

Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom Langkah-langkah untuk fraksinasi dengan kromatografi kolom adalah sebagai berikut:

– Silika gel sebanyak 75 kali bobot ekstrak kurkuminoid dimasukkan dalam Erlenmeyer dan ditambahkan dengan eluen 2 cm diatas permukaan silika gel, dikocok pelan hingga merata dan masukkan dengan hati-hati ke dalam kolom kromatografi yang pada bagian bawahnya telah diberi glass wool. Kolom tersebut kemudian didiamkan selama 1 hari untuk memampatkan dan melihat ada tidaknya keretakan (lihat gambar dibawah ini).

38

Apabila kolom tidak retak, tambahkan eluen 0,5 cm diatas permukaan silika gel dan bila retak ulangi langkah a. Kemudian ke dalam kolom ditambahkan ekstrak kurkuminoid (1% bobot silika) yang telah dicampur dengan silika gel.

Alirkan eluen dan tampung sebanyak 50 ml dalam Erlenmeyer (eluen ini belum membawa zat kimia tanaman sehingga dapat dibuang). Selanjutnya kran dibuka dan diatur penetesannya (1 tetes/detik) dan ditampung dalam vial atau tabung yang telah diberi nomor masing-masing vial 5 ml (lihat gambar dibawah ini).

Pada setiap vial dengan kelipatan 10 dilakukan uji KLT untuk melihat noda yang dihasilkan. Apabila menghasilkan noda yang sama vial-vial tersebut digabung. Penetesan dihentikan apabila vial sudah tidak memberikan noda saat diuji KLT.

39

PEMURNIANPEMURNIAN

Metode pemurnian: Rekristalisasi Sublimasi Kromatografi

Hasil ISOLAT (DIIDENTIFIKASI)

40

IDENTIFIKASI ISOLAT

Spektroskopi UV/Vis Spektroskopi IR Spektroskopi Massa Spektroskopi Resonansi Magnetik

Nuklir

41

Spektrometri UV/Vis

Data Kualitatif data sekunder Berdasarkan spektra yang dimiliki