-
09.03.2015
1
Metode de
analiz a genelor
Expresia genelor
ADN ARNm Protein Caracter
5-ATTGCAAGATTACCATGT-3 Catena codogen
(netranscris)3-TAACGTTCTAATGGTACA-5 Catena anticodogen
(transcris)
Transcripie
5-AUUGCAAGAUUACCAUGU-3 ARNm
Translaie
Leu Ala Arg Leu Pro Cys polipeptid
Maturizare
Caracter fenotipic normal
Expresia genelor
ADNmut ARNmmut Proteinan Caracteran
5-ATTACAAGATTACCATGT-3 mutaie G4A3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
Transcripie
5-AUUACAAGAUUACCAUGU-3 ARNmmut
Translaie
Leu Thr Arg Leu Pro Cys polipeptidan
Caracter fenotipic anormal
-
09.03.2015
2
Analiza genelor
Secveniere
PCR
Southern-blot
Hibridare in situ
ADN ProteineARN
Northern-blot
RTPCR
Hibridare in situ
Western-blot
Secveniere
Analiza funciei
Analiza
histochimic
Utilizarea tehnicilor de analiz a acizilornucleici n medicin
Analiza ADN:
depistarea mutaiilor genice diagnostic precis al bolilorgenetice
(prenatal, postnatal precoce);
identificarea polimorfismului individual dactiloscopiegenomic
(analiza filiaiei);
depistarea ADN strin (bacterian, viral) diagnosticul
bolilorinfecioase i gradului de infectare.
Analiza ARNm:
analiza expresiei genice esut-specific;
evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice;
Depistarea agenilor infecioi (ribovirusuri).
Obinerea FR fragmentelor de restricie prinaciunea specific a ER
(enzimelor de restricie)
-
09.03.2015
3
RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z
M
-
+
10 kb
8 kb
6 kb
4 kb
2 kb
12 kb
10 kb
6 kb
5 kb
2,5 kb
2,5 kb
10 kb
6 kb
5 kb
-
09.03.2015
4
PCR reacia de polimerizare n lan
Principiile PCR clonarea in vitro = amplificare
Replicare semiconservativ, repetat
Specificitatea primerilor sintetici pentru genaint
Hibridizarea ADN-int primer complementar:
Denaturare termic a ADN - de cercetat
Modificarea ciclic a temperaturii:
Denaturare
Renaturare
Sintez
Componentele necesare pentruclonarea in vitro (PCR):
ADN de cercetat
Primeri specifici secvenei de clonat
Complimentari secvenelor flancante
Taq-polimeraza ADN-polimeraz termostabil
Dezoxiribonucleozidtrifosfai (dNTP)
Instalaie de modificare ciclic a temperaturii:
- t de denaturare ADN
- t de renaturare (ADN+primer)
- t de polimerizare (elongarea catenelor noi de ADN)
Etapele tehnicii PCR
Denaturarea ADN la 96oC
A. Pregtirea amestecului cu toate componentele reactante
Rcirea pn la temperatura de renaturare a primerilor
Elongarea catenelor ADN la 72oC
B. Repetarea automat a procedurilor de
denaturare-renaturare-elongare de 30-35 ori
C. Analiza produilor PCR- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor
-
09.03.2015
5
Extragerea ADN Pregtirea componentelor pentru
PCR
Amplificarea
ADN-int
Electroforeza
produilor PCR
Colorarea i vizualizarea produilor
PCR
Interpretarea
rezultatelor
Avantajele PCR
Metod rapid
Metod ieftin
Utilizarea cantitilor mici de material analizat
Nu necesit izotopi radioactivi
Interpretarea uoar a rezultatelor
Dezavantajele PCR
Necesitatea cunoaterii secvenei nucleotidiceamplificate
Necesitatea primerilor sintetici, specifici
secveneianalizate
-
09.03.2015
6
Utilizarea PCR Identificarea inseriilor/deleiilor
nucleotidice
Identificarea mutaiilor punctiforme(substituiile
nucleotidice)
Identificarea expresiei genice (RT-PCR)
Dactiloscopia genomic (filiaie)
Identificarea agenilor infecioi
Identificarea gradului de infecie (quantitative PCR)
Identificarea produselor PCR n timp real (Real-Time PCR)
Identificarea inseriilor / deleiilor
Identificarea mutaiilor punctiforme
-
09.03.2015
7
Identificarea agenilor infecioi
Stabilirea paternitii (filiaiei)
-
09.03.2015
8
Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR
Dependena cantitii de produse amplificate de concentraia ADN
genomic utilizat n PCR. S-a utilizat ADN n cantitate de: 1 0,5 g, 2
0,25 g, 3 0,1 g, 4 0,02 g
Concentraiile critice ale substanelor pentru inhibarea activitii
Taq-polimerazei
Substana Concentraia critic
SDS >0.005% (m/v)
Fenol >0.2% (v/v)
Etanol >1% (v/v)
Isopropanol >1% (v/v)
CH3COONa >5 mM
NaCl >25 mM
EDTA >0.5 mM
Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR
Caracteristica primerilor utilizai n PCR
Gena Secvena Lungimea, baze % G+C Tm, oC
ACE5-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3 24 54 59
5-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3 25 48 58
AT1 R5-CTGGCTCCTTGCTGGTGTGG-3 20 65 58
5-GGGCAAGCGTATATTTTCTGGTG-3 23 48 55
NOS5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3' 22 55 57
5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3' 24 54 59
Dependena cantitii produselor PCR de temperatura de renaturare a
primerilor. n condiiile PCR s-a utilizat: 1 toC optimal -5oC; 2 toC
optimal; 3 toC optimal +5oC.
Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR
Dependena cantitii produselor PCR de concentraia ionilor Mg2+.
Concentraia utilizat de MgCl2: 1 2,5mM; 2 5mM.
Dependena cantitii de ADN amplificat de numrul de cicluri PCR. 1
30 cicluri; 2 35 cicluri; 3 40 cicluri.
-
09.03.2015
9
Analiza polimorfismului I/D pentru gena ACE
Analiza electroforetic n gel de agaroz de 2% a produselor PCR
rezultate din amplificarea ADN uman cu primeri corespunztori genei
ACE.
M marcher al lungimii; 1 genotip I/D; 2 genotip D/D; 3 genotip
I/I.
I
D
Analiza polimorfismului G/T pentru gena NOS
M 1 2 3
Rezultatele amplificrii ADN uman cu primeri corespunztori genei
NOS. M marcher al lungimii; 1 genotip G/G; 2 genotip T/T; 3 genotip
G/T.
G
T
Analiza polimorfismului A/C pentru gena AT1 R
Rezultatele amplificrii ADN uman cu primeri corespunztori genei
AT1 R digerate cu ajutorul enzimei Dde I.
M marcher al lungimii; 1 genotip A/A; 2 genotip A/C
A
C
-
09.03.2015
10
Tehnica Real-time-PCR
ARMS-PCR
Utilizarea tehnicii microarray
Izolarea ARN din diferite esuturi
Izolarea ARNm
Amplificarea prin intermediul RT-PCR
Marcarea cu ageni fluoresceni
Hibridarea cu ADN fixat n micocipuri
Analiza rezultatelor
-
09.03.2015
11
Tehnica Southern-blot
Bazat pe RFLPs
Hibridizare cu sonde marcate
Cu transferul FR din gel-electroforez pe un suport solid (pe
membrane de nitroceluloz)
Hibridarea acizilor nucleici
Unirea complementar a fragmentelor(moleculelor) de acizi
nucleici:
ADN de cercetat cu
sonda oligonucleotidic
n reacie particip molecule monocatenare
Moleculele ADN-int sunt fixate
Moleculele-sonde sunt marcate radioactivsau fluorescent
Identificarea complexelor hibride se realizeaz prin intermediul
autoradiografiei
Tehnica Southern-blot
Extragerea ADN Restriia ADN Electroforeza ADN
Denaturarea i
transferul ADN
pe membrane
AutoradiografiaHibridare cu sonda
Vizualizarea i
interpretarea
rezultatelor
-
09.03.2015
12
Utilizarea tehnicii Southern-blot
Identificarea inseriilor / deleiilor mari
Identificarea mutaiilor punctiforme ceafecteaz SR
Dactiloscopia genomic RFLPs
RFLPs i analiza genotipului
Electroforeza FR a 3 persoane A,B i C
Alela Normal cu 3 SR Alela mutant cu 2 SR, mutaie n SR2
B (Nm)
C (mm)
A (NN)
-
09.03.2015
13
Dezavantajele Southern-blot
Necesit cunoaterea hrii de restricie a genei int
Necesit cantiti mari de material biologic
Metod ndelungat, cu multe etape
Necesit izotopi radioactivi
Necesit materiale costisitoare
Avantajele Southern-blot
Este metod foarte precis
Nu necesit cunoaterea secvenei nucleotidiceanalizate
Nu necesit primeri sintetici
Tehnica Northern-blot
Extragerea ARN din esutul int
Electroforeza ARN ncondiii de denaturare
Transfer pe membran de nailon
Hibridarea cu sondamarcat
Autoradiografia
Tehnica Northern-blot
Extragerea ARN Electroforeza ARN
Transferul ARN
pe membrane
AutoradiografiaHibridare cu sonda
Vizualizarea i
interpretarea
rezultatelor
-
09.03.2015
14
Utilizarea tehnicii
Northern-blot
Identificarea expresiei genice nanumite esuturi, anumite
condiii
Identificarea variantei de splicing a proARNm
Identificarea nivelului de expresie
Identificarea agenilor infecioi(ribovirusuri)
Identificarea nivelului
de expresie i a variantei de splicing
-
09.03.2015
15
Secvenierea ADN
Stabilirea secvenei de nucleotide
Metoda chimic (tehnica Maxam-Gilbert, 1973)
Metoda dideoxi (tehnica Sanger, 1975)
Metoda automat (cu utilizarea agenilorfluoresceni)
Tehnica dideoxi
Sinteza enzimatic a ADN
Utilizarea n paralela nucleotidelor ceconin deoxiribozi
dideoxiriboz
Stoparea sintezei ncazul incorporriiddNTP
5-ATTACAAGATTACCATGT-3 catena codogen3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
catena anticodogen (matri)
3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTAC-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACAA-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACAAG-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACAAGA-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACAAGATT-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACA-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-55-ATTACAAGAT-3
A, T, C, T ddNTP (2,3-ddNTP)
pentru stoparea sintezei
5-ATTA -- primer marcat P32
pentru ADN-polimeraz
A, T, C, T dNTP (2-dNTP)
pentru sinteza noilor catene
-
09.03.2015
16
5-ATTACAA-3
5-ATTACAAG-3
5-ATTACAAGA-3
5-ATTACAAGATT-3
5-ATTACA-3
5-ATTACAAGAT-3
5-ATTACAAGATTA-3
5-ATTACAAGATTACCA-3
5-ATTACAAGATTACCAT-3
5-ATTACAAGATTACCATG-3
5-ATTACAAGATTACCATGT-3
+
-A T C G
5-ATTAC-3
5-ATTACAAGATTAC-3
5-ATTACAAGATTACC-3 5-ATTACAAGATTACCATGT-3
A
T
G
C
Tehnica dideoxi
Extragerea ADN
Denaturarea ADN
Sinteza catenelor complementare utiliznd primeri marcai cu 32P n
prezena dNTP i ddNTP
Electroforeza n condiii de denaturare
Vizualizarea fragmentelor marcate prin autoradiografie
+
-
(+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-)
-
09.03.2015
17
Metoda automat
Hibridarea
in situ
Pregtirea preparatelor de cromozomi
Denaturarea ADN
Hibridarea cu sonda marcat
Vizualizarea la microscopul optic
Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
de cromozomi metafazici
Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
cu nuclei interfazici
Hibridarea in situ pentru depistarea secvenelor ADN
-
09.03.2015
18
Hibridarea in situ cu
utilizarea probei sens (stnga)
i antisens (dreapta)
Hibridarea in situpentru depistarea secvenelor ARN
Analiza
histochimic
identificarea
proteinelor n esut
-
09.03.2015
19
Rolul practic al tehnicilor de analiz a acizilor nucleici:
Cercetare secvenierea ADN, formarea bibliotecilor de gene,
studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul
consecinelor mutaiilor.
Depistarea persoanelor purttoare de mutaii patologice - prenatal
sau postnatal, cu scop de prevenire a naterii copiilor cu anomalii
genetice sau manifestrii unor patologii severe.
Terapie genic (alegerea genei int, construirea vectorilor de
gene etc.).
Depistarea ADN strin (viral sau bacterian) n diagnosticul
bolilor infecioase.
Identificarea polimorfismelor individuale n analiza filiaiei, n
criminalistic.