Méthodes moléculaires en Microbiologie M1 nutraceutique UE9 Gestion du risque microbiologique 4 mars 2009 Emmanuel BERTRAND
Méthodes moléculaires en Microbiologie
M1 nutraceutiqueUE9 Gestion du risque microbiologique
4 mars 2009
Emmanuel BERTRAND
Besoins
Contraintes industrielles
Marché de l’analyse Microbiologique
Intérêt des outils de biologie moléculaire
Méthodes moléculaires
Exemples :• Secteur Agro-alimentaire : Détection• Secteur Pharmaceutique/Cosmétique : Identification• Secteur environnement : Quantification• Secteur vétérinaire : Screening
• Autres technologies
Plan
1- Besoins
A chaque secteur d’activité correspond une demande
particulière.
- Secteur Agro-alimentaire : Détection- Secteur Pharmaceutique/Cosmétique : Identification- Secteur environnement : Détection et Quantification- Secteur vétérinaire : Screening et Détection
1- Besoins – Secteur Agro-alimentaire
Détection (ex. Listeria monocytogenes, Salmonella, E. coli
O157:H7,…)
- Savoir si le produit est propre à la consommation
- Besoin d’avoir un résultat le plus rapidement possible
- Utiliser des outils accrédités
- Méthodes standardisées pour tous types de matrices et de
pathogènes
- Coûts d’analyse < 5€ (PCR) et < 1€ (Bactériologie classique)
Présence et Identification
- Savoir si le produit contient des micro-organismes
- Déterminer le genre et l’espèce du contaminant
- Pas de contraintes de temps d’analyse
- Utilisation de systèmes internes et commerciaux dans un
cadre normatif
- Coûts d’analyse > 50€
1- Besoins – Secteur Pharma/Cosmétique
Détection et quantification
- Recherche d’un genre et/ou d’une espèce
- Quantifier la flore recherche
- Contraintes de temps d’analyse (pb Santé publique)
- Utilisation de systèmes internes et commerciaux dans un
cadre normatif
- Coûts d’analyse = 30€
1- Besoins – Secteur Environnement
Détection et Screening
- Recherche d’une espèce et/ou identification du sérotype
- Contraintes de temps d’analyse (pb Santé publique)
- Utilisation de systèmes internes et commerciaux dans un
cadre normatif
- Coûts d’analyse = 20€
1- Besoins – Secteur Vétérinaire
2- Contraintes industrielles
Risque sanitaire potentiellement élevé en raison des volumes
produits
Une crise sanitaire = Coûts élevés voir une fermeture de site
Le coût d’analyse est fonction du PRI du produit
Le temps d’analyse (TTR) est déterminé par la durée de vie
du produit et les coûts de stockage
En fonction des secteurs d’activité, les niveaux d’expertise
sont très disparates.
Agroalimentaire < Vétérinaire < Pharma/Cosmétique
2- Contraintes industrielles - Matrices
Les outils doivent être adaptés pour une large gamme de matrices- Agroalimentaire : Produits carnés, ovo produits, produits
laitiers, produits de la mer, végétaux, …- Pharma/Cosmétique : Poudres, détergents, principes actifs, …- Environnement : Eaux, air, surfaces, …- Vétérinaire : Sang, organes, fèces, urines, …
Implique :- Robustesse vis-à-vis des agents inhibiteurs de PCR contenus dans les matrices (sels, détergents, phénol, matières grasses, colorants, nombreux facteurs protéiques, antibiotiques, …)- Protocoles adaptés aux différents types de matrices (Liquides, solides, gazeuses, …)
Prises d’essais standardisées ?- 25g de matrices (Matrices alimentaires)- 100mL à 1L de liquide (Matrices environnementales)- Véto: adaptées en fonction du statut de l’infection (sang,
organes, urines, lait, …)- Pharma/cosméto : adaptées en fonction de l’état physique
de la matrice et des normes internationales
L’enrichissement est nécessaire en dehors d’un statut d’infection
(à l’exception des eaux).
2- Contraintes industrielles – Prises d’essais
1- Marché de l’analyse microbiologique
801 M$109 M tests
Volume et valeur marché global
Sur le plan mondial les méthodes immunoassay (PDM 35%) sont devant la PCR (PDM 10% = 15M tests)
1- Marché de l’analyse microbiologique
Méthodes utilisées sur le marché mondial
Pathogènes 2005 Pathogènes 2010
Méthode traditionelle 62Mtest (56,5%)
Immunoassay
37,8Mtest (34,4%)
PCR
10Mtest (9,2%)
Easy
Hard
Fast Slow
Easy
Hard
Fast Slow
Méthode traditionelle 64,7Mtest (44%)
Immunoassay
57,3Mtest (39,4%)
PCR
25Mtest (17,1%)
110M tests
1- Marché de l’analyse microbiologique
Croissance mondiale PCR +150% de 2005 à 2010
Tendance et demande marché sur Diagnostic microbiology Food
Performance désirée
En 2000 = sensibilité méthode et robustesse
Depuis 2005
Rapidité des tests (83%) tendance TTR 24h
Reconnaissance méthode
Diminution des coûts par test
Augmentation du nombre de tests
(pression client et réglementaire)
Tendance future 2010
Reconnaissance méthode
Ultra Rapidité des tests tendance TTR <24h, 8h
Diminution des coûts par test
Simplification méthode
1- Marché de l’analyse microbiologique
2- Intérêts des outils de biologie moléculaire
Avantages :
- Sensibilité > méthodes traditionnelles- Spécificité - TTR (Time to result) < méthodes traditionnelles- Automatisation possible
Inconvénients :
- Coûts- Praticabilité- Robustesse
2- Intérêts des outils de biologie moléculaire
Utilisation actuelle :
- Diagnostic d’urgence, de libération- Suivis de site (TAR, surface,…)- Suivi du produit dans son process de fabrication- Identification bactérienne
Utilisation souhaitée :
- Analyses de routine
2- Intérêts des outils de biologie moléculaire
PCR
Immuno
Méth. référence
PCR
ATP métrie
Méth. référence
PCR
Immuno
Méth. référence
PCR
Immuno
Méth. référence
Détection de E. coli O157:H7
Détection de Legionella pneumophila
8h 3h
24h 24h
240h (10 jours) …
3h
8h 5h
5h
3h5h
720h (30 jours) …
Détection de Mycoplasma spp
Détection de Mycobacterium paratuberculosis
24h 3h24h 5h
…504h (21 jours)
amorce
40 cyclesB) Amplification du signal
A) Spécificité du signal
gène cible
A) Trouver "une aiguille dans une botte de foin".B) Photocopieuse à ADN.
Pour 1 copie initiale on obtient en fin de PCR k.2n copies au final.240 = 1012 copies
2- Intérêts des outils de biologie moléculaire
3- Méthodes moléculaires
PCR Temps réel (vs PCR classique) Détection Quantification SuiviMarchés : Agroalimentaire et environnement
Identification (PCRs, Séquençage, Puces,…)Marchés : Pharmaceutique et cosmétique
PCR conventionnelle versus PCR quantitative
+ + +
PCR conventionnelle
PCR quantitative
Pièce n°1 Pièce n°2
3- Méthodes moléculaires – Détection
PCR conventionnelle versus PCR quantitative
Le résultat :
PCR conventionnelle PCR quantitative
M A B C
3
2
1
- PV automatique- Sauvegarde informatique de l’analyse et du résultat
+ -
3- Méthodes moléculaires – Détection
La PCR quantitative
Il existe plusieurs types de marquage
- Marquage non spécifique
- Marquage spécifique
- sondes d’hydrolyse
- sondes d’hybridation
3- Méthodes moléculaires – Détection
- Le choix des chimies s’effectue en fonction :- des licences- du coût- de l’application
3- Méthodes moléculaires – Détection
Marquage non spécifique
La chimie SyBr Green®
-Marquage non spécifique de l’ADN double brin- Augmentation du signal x1000 quand la molécule est liée-Produit par Molecular Probe-Possibilité réduite pour faire du multiplexage
3- Méthodes moléculaires – Détection
• Colorants non spécifiques• Se lient à l’ADN double brin (au
niveau du petit sillon)• Ne fixe pas l’ADN monobrin
– SYBR Green (x10,x25 plus sensible que le BET)
– Bromure d’éthidium• Souvent utilisé pour les courbes de
fusion
Intercalants de l’ADN3- Méthodes moléculaires – Détection
• Les sondes d’hydrolyse• Les sondes d’hybridation• Les amorces fluorescentes
Importance du moment de l’enregistrement du signal
Les sondes marquées3- Méthodes moléculaires – Détection
Les sondes marquées
R
« Reporter » « Quencher »
Q
nm
Abs
orbt
ion Fluorescence
475 550
R = FAM
nm550 600
Abs
orbt
ion Fluorescence
Q = TAMRA
3- Méthodes moléculaires – Détection
Les sondes marquées
R Q
Eloignement
Lyse
R Q
« Quenching »
QR
3- Méthodes moléculaires – Détection
• Utilisation d’une Taq polymerase avec une activité exonucléasique
• La sonde s’hybride avec la cible
• La polymerase clive la sonde
• Le reporter est éloigné du quencher et l’on observe une augmentation du signal.
Système Taqman®3- Méthodes moléculaires – Détection
Technologie des sondesTaqMan® MGB
- MGB : Minor Groove Binder
- Sonde courte , Tm élevé
3- Méthodes moléculaires – Détection
Technologie des sondes LNA
• LNA : Locked Nucleic Acids
• Bases nucléotidiques modifiées.
• Présence d’un groupement méthylène
• Augmentation du Tm• Utilisés pour :
– Taqman– FRET– Molecular Beacons
3- Méthodes moléculaires – Détection
• Configuration en épingle à cheveu
• Hybridation avec la cible pendant la phase d’élongation
• Le reporter est éloigné du quencher et l’on observe une augmentation du signal
• Utilisés dans les kits IQ-Check, ADIAFood,…
Molecular beacons3- Méthodes moléculaires – Détection
• Fluorescent Resonance Energy Transfer
• Utilise deux sondes marquées
• L’énergie est transferrée entre les deux sondes marquées
• Technologie Roche
FRET3- Méthodes moléculaires – Détection
Scorpions ®3- Méthodes moléculaires – Détection
Scorpions ®3- Méthodes moléculaires – Détection
Quantification absolue
-Quantification avec une gamme étalon.
-Sur un même run PCR on analyse l’échantillon en même temps
que la gamme étalon.
-Pour plus de justesse, l’étalon doit être de même nature (ADN
génomique, plasmide, ARN, …) que la cible.
3- Méthodes moléculaires – Quantification
Quantification absolue
Equation de la gamme étalon : y = -3.49.Log(X) + 36.75Le Ct de l’échantillon est de 22.38 soit 13100 copies initialement présentes dans l’échantillon.La quantité peut être massique ou en copie, UG (unité génomique)…
2.5 105 2.5 104 2.5 103 2.5 102
3- Méthodes moléculaires – Quantification
L’identification
3- Méthodes moléculaires – Identification
Les techniques dérivées de la PCR
Nested PCR
-1ère PCR « consensus » du gène cible (ex. Genre)-2ème PCR « spécifique » de la cible recherchée (ex. Espèce)-Augmentation de la sensibilité-Risque de contamination
3- Méthodes moléculaires - Identification
PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)
-Utilisation du polymorphisme des sites de restriction
Listeria monocytogenes
Listeria ivanovii
Escherichia coli O157H7
BglII
BglII
BamHI
SalI
BamHI
BglII BamHI
SalI
HindIII
BglII + BamHI BglII + SalI
Produit de PCR
Les techniques dérivées de la PCR
3- Méthodes moléculaires - Identification
Multiplex PCR
M. synoviae (FAM) M. gallisepticum (Cy5) IPC (HEX)
Exemple : Triplex Mycoplasmes aviaires (ADIAVET)
Ce système permet l’amplification de plusieurs cibles dans un même tube réactionnel.Le mix comprend :-1 à plusieurs jeux d’amorces -Une sonde par cible-Attention aux compétitions et au choix des fluorophores
Les techniques dérivées de la PCR
3- Méthodes moléculaires - Identification
PCR RAPDPolymorphisme d’amplification des génomes
Individu A Individu B
Les techniques dérivées de la PCR
3- Méthodes moléculaires - Identification
Le séquençage
3- Méthodes moléculaires - Identification
- Séquençage automatisé- Haut débit- Niveau d’expertise moyen- Equipement lourd- Utilisé par le Pharma/Cosméto/Prestataires de service
Le séquençage
3- Méthodes moléculaires - Identification
Préparation de l’échantillon Enrichissement Isolement
Le Pyroséquençage
3- Méthodes moléculaires - Identification
Biotage
Préparation de l’échantillon Enrichissement Isolement
- Faible débit d’analyse- Niveau d’expertise moyen- Coûts moyens - Utilisé par le Pharma/LNR/Prestataires de service
3- Méthodes moléculaires - Identification
Le Pyroséquençage
3- Méthodes moléculaires - Identification
Les puces
Les puces : Macroarray (Faible débit)
3- Méthodes moléculaires - Identification
- Matériel de base- Niveau d’expertise moyen- Utilisée par certains LVD et LNR
- Taille des spots : 100µm- 1000 à 10 000 spots/cm²- Colorimétrie ou fluorescence
Préparation de l’échantillon
Enrichissement facultatif
Extraction et purification
Reverse Transcription
Analyse sur puce
Les puces : Microarray spottée (Haut débit)
3- Méthodes moléculaires - Identification
- Equipement lourd- Niveau d’expertise élevé- Qqs Laboratoires prestataires maîtrisent cet outil
- Taille des spots : 100µm- 1000 à 10 000 spots/cm²- Fluorescence
Préparation de l’échantillon
Enrichissement facultatif
Extraction et purification
Reverse Transcription
Analyse sur puce
Les puces : GeneChips Affimetrix
Préparation de l’échantillon
Enrichissement facultatif
Extraction et purification
Reverse Transcription
Analyse sur puce
3- Méthodes moléculaires - Identification
- Equipement lourd- Niveau d’expertise élevé
- Taille des spots : 20µm- 250 000 spots/cm²- Fluorescence
- Risques de contamination
- Risques d’inhibitions
Faux positifs
Faux négatifs
3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR
Les faux positifs
-Peuvent intervenir à tous les stades de la PCR :
-Préparation de l’échantillon
-Préparation du mélange pré-PCR
-Ajout de l’échantillon
3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR
ADN amplifié : quel risque ?
100 µl de produits amplifiés= 1012 copies d’ADN
Bassin olympique(50 x 25 x2)
100 µl =400 copies d’ADN
3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR
Les contaminations inter échantillons
- Lors de la préparation des échantillons
- Lors de la détection
3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR
Comment décontaminer ?
3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR
-Isopsoralen
-U.V.
-Eau de javel
-Produits commerciaux
-Système Uracyl-N-Glycosylase / dUTP
3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR
Comment décontaminer ?
Par Irradiation
3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR
Comment décontaminer ?
Inactivation par utilisation de l’UNG
Les faux positifs : les contrôles
-Lors de la préparation de l’échantillon (lyse cellulaire) : contrôle négatif d’extraction
-Lors de la préparation du mélange d’amplification : contrôle négatif d’amplification
Absence de faux positifs
3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR
Les faux négatifs
Origines
-Erreur dans le mélange pré-PCRoudysfonctionnement du thermocycleur
- Présence d’inhibiteurs dans l’échantillon
Solutions
-Contrôle positif d’amplification
- Contrôle interne d’amplification
Absence de faux négatifs
3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR
Le contrôle interne
-Un contrôle interne est une molécule d’ADN ou d’ARN qui va être amplifié en même temps que la cible recherchée
-contrôle interne d’amplification
-contrôle interne de purification
-contrôle interne d’extraction
3- Méthodes moléculaires - IPC
Le contrôle interne
3- Méthodes moléculaires - IPC
IPC Type Moment d'ajout Contrôle
Contrôle interne d'amplification
ADN génomique, Plasmide, Nucléotide
Présent dans le mix PCR
Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR
Contrôle interne de purification
ADN génomique, Plasmide, Nucléotide
Ajouter lors de l'étape de lyse ou de purification
Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR, de l'absence de dégradation d'ADN, de l'absence de perte lors de la purification
Contrôle interne d'extraction
ADN de l'échantillon (Cellules hôtes, tissus,…)
Contenu dans l'échantillon
Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR, de l'absence de dégradation d'ADN, de l'absence de perte lors de la purification, de l'efficacité de lyse sur l'échantillon.
Le contrôle interne : Construction
3- Méthodes moléculaires - IPC
la molécule d ’ADN cible
Modification de la molécule d ’ADN cible
Co-amplification des deux molécules avec les mêmes amorces
Mélange PCR Hybridation Amplification
Le contrôle interne : Construction (2)
3- Méthodes moléculaires - IPC
3- Méthodes moléculaires - Compétition
Compétition
Contrôle interne 500 pb
Cible PCR 221 pb
Quantité constante de contrôle interne = 2000 molécules
Quantité croissance de bactéries de 0 à 106
0 10010 103 104 105 1061
3- Méthodes moléculaires - Compétition
Compétition
Cas d’une PCR où la cible et l’IPC sont co-amplifiés avec le même couple d’amorces mais une sonde différente.
Cible marquée en FAM IPC marqué en VIC
3- Méthodes moléculaires - Normalisation
R : sans normalisation
dRn : avec normalisationSignal fluorescent normalisé par une référence fluorescente passive
3- Méthodes moléculaires - Normalisation
Fam
ROX
Flu
ore
scen
ce
Echantillon 1
Rn
Rn
Fam
ROX
Echantillon 2
Flu
ore
scen
ce
reporter (Fam)
Référence passive (Rox)Rn =
3- Méthodes moléculaires - Normalisation
Intérêt de la normalisation :
-Harmonisation pour le positionnement du Threshold
-Quantification absolue et relative
4- Exemples – Secteur Agroalimentaire
- Recherche de E. coli O157:H7 en viande hachée- Seuil de détection 1 UFC/25g matrice
Production Transformation Distribution Consommation
2 – 10 jours5 – 10 jours (temps de maturation)
4- Exemples – Secteur Agroalimentaire
Enrichissement
1CFU dans 25g
PCR
Croissance sélective
Enrichissement
2h30
1 jour
8h
Etape 1Enrichissement
Etape 2Extraction d’ADN
Etape 3 Amplification ADN & analyse
4- Exemples – Secteur Agroalimentaire
Collecte de l’échantillon
(25g)
BroyageMilieu d’enrichissement
(225mL)
Incubation (8h)
25 g
Etape 1 : ENRICHISSEMENT
Etape 2 : EXTRACTION
4- Exemples – Secteur Agroalimentaire
Lyse thermique (10 à 30 minutes 95°C) Lyse physique : Broyage, sonication, … Lyse chimique avec détergents ou résines (avec ou non une incubation) Lyse enzymatique (Protéinase K, Lysozyme,…) avec une étape d’incubation
Le choix de la lyse : en fonction du pathogène recherché Pour certains pathogènes, on a recours à différentes méthodes de lyse Des étapes de clarification et de concentration peuvent être ajoutées en fonction de la matrice et de la vitesse de croissance bactérienne
Prélèvement de 1ml de bouillon
Centrifugation 2min à 500g
Prélever 500µL du surnageant
Eliminer le surnageant Reprendre le culot dans 100µL Tp lyse
Utilisation de tubes au format 96
4- Exemples – Secteur Agroalimentaire
Etape 2 : EXTRACTION
Centrifugation 5min à 5000g
Mix PCR Distribution (15µL)
Transfert 10µL ADN extrait
Etape 3 : DETECTION
4- Exemples – Secteur Agroalimentaire
4- Exemples – Secteur Agroalimentaire
Etape 4 : Analyse
En dehors d’expertise dans les IAA, l’analyse des données ne doit pas être fonction du facteur humain.
4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto
- Recherche de germes dans une crème de soin- Altération du produit- Santé du consommateur
4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto
Dilution au 1/10 en milieu liquide
Etape 1 : ENRICHISSEMENT
Incubation (24h)
Etape 2 : Filtration
4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto
Filtration de 10 à 100mL sur membrane (porosité de 0.45µm)
Etape 3 : Extraction et purification
Récupération des cellules collectées sur la membrane
Lyse à l’aide d’automate Purification sur colonne de Silice
4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto
4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto
Etape 4 : Amplification
Préparation des mix PCR en automate
Amplification de l’ADN extrait avec des amorces universelles pour Eucaryotes et Procaryotes (16S, 23S, …). Détection par électrophorèse ou par fluorescence non spécifique (SybrGreen)
Si présence
Etape 5 : Séquençage
Préparation des mix PCR avec Dyes pour le séquençage
Amplification et détection Obtention du spectre
4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto
Etape 6 : Analyse de séquence
4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto
Extraction de la séquence Interrogation des banques de données
Identification
4- Exemples – Secteur Environnement
- Détection Legionella pneumophila et Quantification de Legionella spp- Legionella spp est un indicateur de présence de Legionella pneumophila- La présence de L. pneumophila entraine une action curative immédiate- Réglementation sur la quantité de L. spp / Litre
- si < 1000 UFC/litre = pas d’action- si compris entre 1000 et 10 000 UFC/litre = Action curative- si > 100 000 UFC/litre = fermeture du site
PrélèvementFiltration de 100mL à 1L sur membrane (porosité de 0.45µm)
4- Exemples – Secteur Environnement
4- Exemples – Secteur Environnement
1ml Tampon de lyse LB
Ajouter la membrane pliée
Incubation 20 min à 95°C
Vortexer 15sLaisser à T° ambiante
Déposer 550µl de lysat dans la colonne « Cleaning unit »
Centrifugation 3 min à 7000g
1ère Etape : Lyse
2ème Etape : Clarification
Déposer 500µl de filtrat dans la colonne
Centrifugation 5 min à 7000g
Ultrafiltration Lavage
200µL de Tampon CB1
Centrifugation 5 min à 7000g
Compléter à 100µl avec le Tampon CB2
Stocker à +4°C ou à -20°C
Lavage
200µL de Tampon CB1
Centrifugation 5 min à 7000g
3ème Etape : Purification et Concentration
4- Exemples – Secteur Environnement
4- Exemples – Secteur Environnement
Réalisation d’une gamme étalon d’ADN génomique de L. pneumophila Run PCR avec en parallèle la gamme et les échantillons
2.5 105 2.5 104 2.5 103 2.5 102
4- Exemples – Secteur Vétérinaire
4- Exemples – Secteur Vétérinaire
Diagnostique de la Fièvre Catarrhale Ovine Recherche du virus (Sentinelle) Identification du sérotype (Campagne de vaccination)
Novembre 2007 Novembre 2008
Préparation du prélèvement (Sang sur EDTA)
Extraction et purification de l’ARN
PCR avec Mix de Groupe
Si l’échantillon est positif en Groupe, il faut alors le typer
PCR avec Mix de Type
Détermination du sérotype
5- Autres technologies
Cibles : Génome Transcriptome Protéome Phénotype
5- Autres technologies
Cytométrie en flux : sur la cellule entière
Marqueurs de viabilité (substrats couplés à des fluorophores : FITC, …) Marqueurs spécifiques par germe recherché (Recherche par AC marqués) Très rapide Coûts élevés
5- Autres technologies
Puces à Protéines, Peptides, Anticorps
Principe basé sur le test ELISA Marqueurs spécifiques par germe recherché (Recherche par AC marqués) Rapide Coûts fonction du nombre de spots
5- Autres technologies
Spectromètrie de masse
Reconnaissance en partie du Protéome Avec ou sans électrophorèse 2D Analyse de spectres En vogue Coûts élevés
5- Autres technologies
Biolog : Analyse du phénotype
Reconnaissance par le métabolisme Plaques 96 contenant différentes sources (sucres, sulfates, …)