Méthodes d’analyse de surface appliquées à Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence l’étude de protéines d’adhérence cellulaire cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et Propriétés d’Architectures Moléculaires
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Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire
Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire. Laurence Martel 19 décembre 2002. UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et Propriétés d’Architectures Moléculaires. Plan de l’exposé. Contexte : relations structure/fonction des protéines - PowerPoint PPT Presentation
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Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence cellulairede protéines d’adhérence cellulaire
Laurence Martel
19 décembre 2002
UMR 5819 CNRS-CEA-UJF
Structures et Propriétés d’Architectures Moléculaires
Plan de l’exposéPlan de l’exposé
• Contexte : relations structure/fonction des protéines
• Méthodes d’analyse de surface– Élaboration de monocouches de protéines
– Techniques d’étude expérimentale
• Réflectivité X
• Ellipsométrie
– Modélisation des courbes expérimentales
• Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire– Présentation des cadhérines
– Rôle du calcium
– Interaction entre fragments
• Conclusions et perspectives
C-Cadhérine : résolution 0,308 nm(T. Boggon et al. 2002)
Positions des atomes
Relations structure/fonction des protéinesRelations structure/fonction des protéines
• Structure cristallographique de protéines obtenues à partir de
• Cristaux 3D par Rayons X
résolution atomique (jusqu’à 0,1 nm)
Objectifs de cette étudeDévelopper une méthodologie pour étudier les interactions
entre protéines immobilisées et protéines en solution
• Cristaux 2D par microscopie électronique à transmission ou AFM résolution ~ 1 nm
Hypothèses sur la fonction de la protéine
• Formation de complexes de protéines
– Immobilisation des protéines sur une surface
Informations sur les interactions entre protéines
Reconstruction 3D de la structureEnveloppe de la protéine
Sticholysine II : résolution 1,5 nm(Martin-Benito et al. 2000)
1,2nm
Plan de l’exposéPlan de l’exposé
• Contexte : relations structure/fonction des protéines
• Méthodes d’analyse de surface– Élaboration de monocouches de protéines
– Techniques d’étude expérimentale
• Réflectivité X
• Ellipsométrie
– Modélisation des courbes expérimentales
• Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire– Présentation des cadhérines
– Rôle du calcium
– Interaction entre fragments
• Conclusions et perspectives
Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
1ère Étape : Formation d’une monocouche de lipides à la surface de l’eau– Dépôt de lipides ligands chélatant un ion Ni2+ : Ni-NTA-DLGE– + Lipides diluants pour la fluidité de la monocouche
lipides ligandslipides diluants
OO
O
O
O
O
NHO
N
O
OH
OOH
OOH
Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
2ème Étape : Injection de protéines
Ancrage par liaison de coordination
histidine-nickel
Exemple: Injection de cadhérines-His6
Exemple: Injection de fragments
Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase
Étude des interactions entre protéines
3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase
Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines
• Réflectivité X : Aire sous le profil de densité électronique, lipides soustraits
Comparaison ellipsomètrie et réflectivité X :Comparaison ellipsomètrie et réflectivité X :masse adsorbée par unité de surfacemasse adsorbée par unité de surface
dzRz
mmg emPOHP
OHelX
2
22 )()/(
Masse de C-cadhérine adsorbée aux lipidesEllipsométrie [Ca2+] = 0,5 mM Réflectivité X [Ca2+] = 5 mM
Après 2h : 6,0 ± 0,5 mg/m2 Après 4h : 8,1 mg/m2
Après 17h30 : 8,7 ± 0,5 mg/m2
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
Den
sité
éle
ctro
niqu
e (e
.Å-3
)
2252001751501251007550250Distance (Å)
C-EC1-5His Lipides Ni-NTA-DLGE
eau
<P> ~ 0,417 e.Å-3 : densité électronique moyenne de la protéine
Rem rapport masse / électron dans la protéine sèche
• Ellipsométrie : Approximation de De Feijter et al. (1978)
)Å()/( 22
POHP
el h
dcdn
nnmmg
dn/dc ~ 0,19 cm3/g : incrément d’indice de la solution de protéine
RésultatsRésultats
Mises au point1. Technique d’élaboration de monocouches de protéines2. Techniques expérimentales d’analyse de surface complémentaires3. Modélisation du système en multicouches
Ellipsométrie
• Mesure des angles ellipsométriques et
• Ajustement pour obtenir <n> et <h>
• Estimation de la masse adsorbée apparente de protéines ancrées aux lipides
• Mesures cinétiques : 1 point / 3 secondes
Réflectivité des rayons X
• Mesure de l’intensité réfléchie
• Ajustement pour obtenir le profil de densité électronique perpendiculaire à la surface
• Calcul de la masse de protéines adsorbée aux lipides
Application à l’étude des interactions entre protéines d’adhérence cellulaire
Plan de l’exposéPlan de l’exposé
• Contexte : relations structure/fonction des protéines
• Méthodes d’analyse de surface– Élaboration de monocouches de protéines
– Techniques d’étude expérimentale
• Réflectivité X
• Ellipsométrie
– Modélisation des courbes expérimentales
• Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire– Présentation des cadhérines
– Rôle du calcium
– Interaction entre fragments
• Conclusions et perspectives
Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérenceAdhérence cellulaire et molécules d ’adhérence
Exemple des cellules de l’endothélium vasculaire
Plusieurs familles de Protéines d’Adhérence Cellulaire
Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérenceAdhérence cellulaire et molécules d ’adhérence
Famille des cadhérines
– Glycoprotéines transmembranaires
– Sur tous types de cellules
– Différentes cadhérines selon les cellules :• VE-cadhérine humaine
(Vascular Endothelium)
• C-cadhérine de Xenopus
– 5 domaines extracellulaires homologues (EC)
– 12 ions Ca2+/cadhérine pour un bon repliement
~23nm
Interaction entre molécules d ’adhérenceInteraction entre molécules d ’adhérence
Interactions entre domaines extracellulaires de cadhérine
parallèles et anti-parallèles
Concentrations critiques en calciumPerz et al. 1999
mM [Ca2+]
0
0,05
0,5
1
pas d’interaction
dénaturation
cis
trans
Problématique : interaction entre cadhérines?Problématique : interaction entre cadhérines?
Quelle loi d’assemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ?
Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ?
Modèles actuels d’après résolutions de structure 3D et études en solution