Metabolismo do DNA Fidelidade da Replicação Regras fundamentais

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Metabolismo do DNAMetabolismo do DNA

• Replicação do DNA

• fidelidade + velocidade

• Reparo

• múltiplos processos - resolução de injúrias

• Recombinação

• rearranjo da informação genética

Fidelidade da ReplicaFidelidade da Replicaççãoão

• Conceito de “molde”

• Universalidade de processo e mecanismos de catálise para todos os organismos estudados.

• Universalidade de processo e mecanismos de catálise para todos os organismos estudados.

Regras fundamentaisRegras fundamentais

• A replicação do DNA é semiconservativa

• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente

• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua

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Watson & Crick

Meselsohn e Stahl,1958

.

A replicação do DNA ésemiconservativa

15N

15N + 14N

15N + 14N

14N

Regras fundamentaisRegras fundamentais

• A replicação do DNA é semiconservativa

• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente

• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua

OrigemOrigem de de replicareplicaççãoão

Fago λ• Seqüência nucleotídica

variável

• únicas X múltiplas

• múltiplas repetições curtas

• proteínas ligantes

(organização do sítio)

• ⇑ conteúdo AT

Características comuns

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Regras fundamentaisRegras fundamentais

• A replicação do DNA é semiconservativa

• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente

• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua

SSííntesentese semi semi descontdescontíínuanua: : diredireççãoão 55’’ →→ 33’’

SSííntesentese de DNA: as DNA de DNA: as DNA PolimerasesPolimerases

A. Kornberg 1955: DNA polimeraseI

Requerimentos:

fita molde

iniciador (oligo 3’ OH livre)

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DNA DNA PolPol I+ II e III: I+ II e III: pappapééisis definidosdefinidos

DNA Pol I -> 90% da atividade Polimerásica

Adição de nt ~20 x inferior ao movimento da forquilha

Processividade baixa

gene defectivo (DNA Pol I inativa) → linhagem viável (J. Cairns: 1969)

DNA polimerase II: reparo

DNA DNA polimerasepolimerase III: III: replicareplicaççãoão

A A precisãoprecisão do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão

• E. coli = 1 erro / 109-1010 nucleotídeos adicionados

• DNA polimerases: 1 erro / 104-105

• Erro in vivo: +++ mecanismos enzimáticos

• Atividade exonucleásica 3’→ 5’ = prova de leitura

• Outros sistemas de reparo

↓

1 erro/104-105

PolimerizaPolimerizaççãoão && DNA DNA PolimerasePolimerase

fita molde

fita nova

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DNA DNA polimerasespolimerases I, II, IIII, II, III

GENEESTRUTURAL

POL A POL B POL C

SUBUNIDADES 1 >4 >103’→5’ EXON. SIM SIM SIM

5’→3’ EXON. SIM NÃO NÃO

NT+/SEGUNDO

16-20 ~7 250-1000

PROCESSIVI// 3-200 >10.000 > 500.000

EmpacotamentoEmpacotamento X X precisãoprecisão funcionalfuncional

Principles Of Biochemistry (Second Edition)Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. CoxWorth Publishers

CompactaCompactaççãoão ddo DNA o DNA GenômicoGenômico

Precisão e dinâmica:replicação e transcrição

Principles Of Biochemistry (Second Edition)Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. CoxWorth Publishers

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NemNem ssóó de DNA de DNA polimerasepolimerase vive a vive a ssííntesentese de DNA. . .de DNA. . .

• Catálise: + um nucleosídeo (5’-PO) ao 3’OH livre da cadeia

“Toda” DNA polimerase necessita da presença de um iniciador

para catalisar a + de nucleotídeos

• A dupla fita é antiparalela (polaridade química)

• As DNA polimerases não desespiralizam o DNA

MaquinariaMaquinaria: DNA: DNA replicase/replissomoreplicase/replissomo

Separação das Fitas: Helicases

Estresse Topológico: Topoisomerases

Manutenção da “bolha”: SSB

Adição de Iniciadores: Primases

Retirada de Oligo-RNA: Polimerase I

Resolução dos “Nicks”: DNA Ligase

EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão

IniciaIniciaççãoão

Elongação

Terminação

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IniciaIniciaççãoão

Estágio que

controla a replicação

IniciaIniciaççãoãoDNA molde superespiralado

OriC

Tetrâmeros de DnaA+ sítios de ligação

Monômeros DnaA = + sítios de ligação

Monômeros de DnaAenrolados sobre OriC

DnaA: 20 a 40 monômeros

Complexo Inicial

Hexâmeros de DnaB e C

Subunidades de DnaC

Complexo Aberto

Região OriC aberta

Ligação de SSB às regiões fita simples

Complexo de pré iniciação

“liberação” da região com DnaA associada

Região OriC aberta

Iniciação e replicação

Sítio Replicador:3 x 13nt – GATCTNTTNTTTT4 x 9nt – TTATCCACA

IniciaIniciaççãoão

Estágio que controlaa replicação

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EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão

Iniciação

ElongaElongaççãoão

Terminação

Duas operações similares

Dois mecanismos distintos

fita líder (contínua)

fita lerda ou atrasada (descontínua)

Enzimas necessárias: DNA helicase, DNA topoisomerase,

SSB, primase, etc...

ElongaElongaççãoão

ElongaElongaççãoão

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ElongaElongaççãoão: : SSííntesentese dada fitafita atrasadaatrasada

ligase

DNA pol III +

DNA pol I

DNA pol III +

DNA pol I

primase(iniciase)

ElongaElongaççãoão

http://bcs.whfreeman.com/thelifewire/content/chp11/1102003.html

http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0

DNA DNA polimerasepolimerase II

Atividade exonucleásica 5’-3’

Síntese da fita lerda

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EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão

Iniciação

Elongação

TerminaTerminaççãoão

Sítios TER (E. coli) + proteína TUS (Helicase impedida)

Separação das moléculas completas: Topoisomerase IV (tipo 2)

Partição das duas moléculas (?) mecanismo pouco conhecido

TerminaTerminaççãoão

CCéélulaslulas EucariEucarióóticasticas

Características gerais da replicação são as mesmas em pró e eucariotos.

Outras Proteínas/fatores, funções ≅ , complexidade ⇑

Mapeamento de diversas origens sugerem:

regiões permissivas para iniciação (bidirecional)

heterogeneidade em tamanho e comportamento

Mamíferos: decisão sobre sítio de iniciação a cada fase S.

Seqüência X Estrutura

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EucariotosEucariotos X X ProcariotosProcariotos

Diferença: cromossomos lineares.

Telômeros: estrutura especializada na extremidade dos

cromossomos lineares.

Repetições em Tandem: TxGy

Replicação

Replicação do DNA é semi-conservativa;

Campisi et al. Experimental Gerontology 2001; 36: 1619-1637

Síntese pela telomerase (Transcriptase reversa)

Perda de extremidades a cada divisão celular;

(humanos 50-150pb por divisão)

TelômeroTelômero e telomerasee telomerase

5’

5’

3’

5’

3’

3’

3’

5’

E o cromossomo encurta progressivamente. . .

Falta molde na extremidade 3’ para síntese. . .

http://www.youtube.com/watch?v=AJNoTmWsE0s

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Telomerase

Transcriptase reversa

RNA (molde)

proteína

atividade células tumorais e germinativas

http://bioweb.wku.edu/courses/biol22000/13DNAreplication/Telomerase.html

Estrutura

LeBel, C. et al. J Cell Sci 2005;118: 2785-2788

Centrômero

Centrômero

TAS

TAS

T-loop

Humano

Camundongo

Griffith,JD. et al. Cell 1999; 97: 503-514

A replicação da extremidade gera 3’ fita simples – formação de estrutura de laço (T-loop);

TAS – seqüências associadas a telômeros

TelômeroTelômeross

FunçãoTelômeros são essenciais para a integridade do genoma

Protegem as regiões terminais de degradação

Distinguem a extremidade normal de região de dano

Organização funcional dos cromossomos no núcleo

Funciona como relógio molecular (replicações e senescência)

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Estrutura: proteínas associadas

Rodier et al/The international Journal of Biochemistry & Cell Biology 2005; 37:977-990

Tankirase- poly ADP-ribosilaseRMN- Complexo RAD50-MRE11-NSB1WRN- DNA helicase e exonuclease

TelômeroTelômeross